해부하고, 상상 디스크의 면역 염색에서 초파리

이 절차의 전반적인 목표는 초파리 유충에서 상상의 디스크를 해부하는 것입니다.면역조직화학을 위해 먼저 유충에서 입, 갈고리, 눈, 1열 디스크로 구성된 머리 복합체와 뇌를 제거하여 이를 수행합니다. 두 번째 단계는 머리 복합체를 고정하고 1차 및 2차 항체로 배양하는 것입니다. 다음으로, 눈과 1개 디스크를 두부 복합체에서 분리합니다.

마지막 단계는 유리 슬라이드에 표백 방지제에 담긴 상상의 디스크를 장착하는 것입니다. 궁극적으로 형광 또는 LAC Z 리포터 및 항체 염색은 형광 현미경을 사용하여 상상 조직 내 유전자 및 단백질의 공간적 및 시간적 발현을 밝힐 수 있습니다. 이 기술은 enten imaginal disc에서 유전자 및 단백질 국소화에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용할 수 있습니다.

또한 날개, 다리 및 정지와 같은 다른 상상 조직에 적용할 수 있습니다. 여기. 실험을 시작하려면 35mm 페트리 접시에 해부 버퍼를 채웁니다. 페트리 접시에 10-20마리의 유충을 넣고 5분 동안 헤엄치게 합니다.

해충을 자가 청소하기 위해 피펫은 실리콘 기반 박리 플레이트의 중간에 하나의 큰 해부 버퍼 풀을 만듭니다. 큰 웅덩이 주위에 세 개의 작은 웅덩이를 놓고 집게를 사용하여 유충을 아래쪽 웅덩이로 옮깁니다. 다음으로, 5번 집게를 사용하여 작은 웅덩이에서 한 마리의 청소된 유충을 해부 완충액의 더 큰 웅덩이로 옮깁니다.

거친 해부를 시작하려면 한 쌍의 집게를 사용하여 입 고리를 잡고 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 유충을 부드럽게 잡습니다. 몸 길이의 3분의 1은 입 갈고리를 안정적으로 유지합니다. 두 번째 집게로 몸의 나머지 부분을 빠르게 당겨 빼냅니다.

집게에서 유충을 풀어주고 내장이 쏟아져 나오도록 하여 상상의 원반이 정상적인 확인 상태를 유지할 수 있도록 합니다. 그런 다음 입 고리를 잡고 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 내부 내장을 포함하여 유충의 아래쪽 2/3를 제거합니다. 그런 다음 침샘, 다리 디스크 및 기타 조직을 부드럽게 제거합니다.

유일하게 남아야 하는 조직은 위에 있는 소량의 큐티클입니다. 입 고리, 눈 및 건추 디스크, 뇌 반구, 복부 신경절. 최대 20분 후, 절개된 모든 조직을 파라폼 알데히드 라이신 파리아로 옮깁니다.

날짜 고정제 또는 PLP. 가상 디스크를 해부 버퍼에 20분 이상 두지 마십시오. 그렇지 않으면 해부 후 성능이 저하됩니다. 절개된 조직을 100마이크로리터 단위로 차가운 PLP가 들어 있는 시계 유리로 옮깁니다.

한 쌍의 집게를 사용하여 절개된 조직이 완전히 잠겼는지 확인합니다. 절개된 조직을 저온 PLP 고정액으로 교반 없이 실온에서 45분 동안 배양합니다. 다음으로, PLP에서 100마이크로리터의 절개된 조직을 세척 버퍼로 옮깁니다.

조직이 완전히 잠겼는지 확인하고 45분 동안 흔들지 않고 실온에서 배양합니다. 그런 다음 절개된 조직을 1.5ml 마이크로 퍼지 튜브로 옮깁니다. 세척 버퍼를 제거하고 100마이크로리터의 차단 용액으로 교체하십시오.

실온에서 탁상용 로테이터에서 10분 동안 부드럽게 회전시키며 조직을 배양합니다. 차단 후 용액을 제거하고 10% 정상 염소 혈청에 100마이크로리터의 1차 항체 용액으로 교체합니다. 항체의 강도에 따라 16시간 동안 부드럽게 회전하면서 실온에서 조직을 배양합니다.

다음으로, 1차 항체를 제거하고 750마이크로리터의 세척 버퍼로 교체합니다. 튜브를 실온에서 10분 동안 돌연변이원에 놓습니다. 돌연변이체에서 튜브를 제거하고 헤드가 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다.

그런 다음 세척 버퍼를 제거하고 100% 일반 혈청에 100마이크로리터의 2차 항체 용액을 추가합니다. 항체의 강도에 따라 최소 2시간 동안 부드럽게 회전하면서 실온에서 튜브를 배양합니다. 배양 후 조직에서 2차 항체 용액을 제거합니다.

500마이크로리터의 세척 버퍼로 교체하고 조직이 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 실리콘 해부 플레이트에 세척 완충액 3개를 놓습니다. 해부된 모든 조직을 해부 접시에 놓인 큰 세척 완충액 풀로 옮깁니다.

이것은 과도한 2차 항체를 제거하여 미세 해부를 시작하고, 머리 복합체를 복부 쪽이 아래로 향하게 배치하고, 입 고리로 큐티클을 잡는 데 도움이 됩니다. 뇌와 안구 디스크 사이의 공간에 두 번째 집게를 놓고 입 고리를 계속 유지하면서 두 개의 뇌엽을 제거하기 위해 입 고리에서 뇌를 빠르게 당겨 빼냅니다. 눈 안테나 디스크의 안테나 부분과 입 고리 사이의 연결에 최대한 가깝게 조직을 집어 제거합니다.

원하는 모든 조직이 절개될 때까지 계속합니다. 다음으로, 해부 접시에 커버 슬립 크기의 작은 티슈 페이퍼 두 개를 3인치 간격으로 추가합니다. 슬라이드가 해부 접시의 실리콘 바닥에 달라붙는 것을 방지하기 위해 이 종이 조각에 유리 슬라이드를 놓습니다.

P 20 피펫 맨을 사용하여 유리 현미경 슬라이드의 중간에 9 마이크로 리터의 표백제를 첨가하여 동일한 자르지 않은 팁으로 조직의 형광등 표백을 방지하고 모든 I 및 tenal 디스크를 모아 표백 방지 시약의 방울에 추가합니다. 다음으로, 겸자를 사용하여 가상 디스크가 닿지 않을 때까지 표백 방지 시약을 한 방울 떨어뜨려 눈과 테널 디스크를 분리하고 펼칩니다. 미세한 페인트 브러시를 사용하여 기포 형성을 방지하기 위해 표백 방지제 방울에 커버 슬립을 부드럽게 내립니다.

마지막으로, 광이나 형광 현미경을 사용하여 이온 텐널 디스크를 보고 이미지화할 준비가 될 때까지 슬라이드를 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 이 방법은 상상 디스크의 이러한 컨포칼 이미지가 전달하는 분석을 위한 고품질 자료를 안정적으로 생성합니다. 디스크는 foid와 jugated fluoro four로 치료되었는데, 이는 f actin에 결합하여 각 세포의 윤곽을 그립니다.

이빨 추간판의 가장 두드러진 특징 중 하나는 형태발생학적 고랑(morphogenetic furrow)으로, 이는 등쪽 배쪽 축을 따라 달리는 조직 내의 움푹 들어간 곳으로 볼 수 있습니다. 고랑이 안구를 가로질러 진행됨에 따라 무질서한 세포의 바다는 주기적으로 간격을 둔 단위 눈 또는 오마 테디아(Oma Tedia)의 질서 정연한 배열로 변형됩니다. 클론 발현의 검증 및 I 상상 디스크의 분석은 이 방법의 다운스트림 응용이 가능합니다.

상단 3개의 패널에는 ilis, A DPP, LAC Z 전사 리포터와 같은 다양한 항체와 배아, 치명적, 비정상 시력 또는 범 신경 세포, RNA 결합 단백질을 암호화하는 vy와 같은 세포 특이적 마커로 염색된 디스크가 표시됩니다. 아래쪽 3개의 패널은 GFP가 세포 집단을 표시하는 데 사용되는 디스크를 보여줍니다. 이 과정을 마스터하면 10-20마리의 유충에서 머리 복합체를 분리하는 데 약 10분이 소요되며, 추가로 이러한 복합체에서 이온 텐널 디스크를 미세하게 분리하는 데도 약 10분이 소요됩니다.