생화학 적 분석에 대한 감각 뉴런에서 생산 및 축삭의 분리는 다공성 필터를 사용하여

이 절차의 목표는 기존, 생화학 또는 면역 세포 화학 기술로 검사하기에 적합한 순수한 축삭 제제를 얻는 것입니다. 이는 DRG 뉴런이 축삭돌기를 확장함에 따라 다공성 멤브레인 필터가 있는 배양 삽입물에서 배아 등뿌리 신경절 세포를 먼저 배양함으로써 이루어집니다. 일부 축삭돌기는 필터의 공극을 통해 성장하고 세포체는 위쪽 표면에 고립된 상태로 유지되는 동안 아래쪽 표면에서 확장됩니다.원하는 실험적 조작 후, 아래쪽에서 자란 축삭돌기를 유지하면서 필터의 위쪽에 있는 세포를 물리적으로 제거하여 축삭 준비를 얻습니다.

궁극적으로, 분리된 축삭돌기는 기존의 생화학적 기술에 의한 분석에 적합한 순수한 축삭 샘플을 생성함으로써 생화학적 분석을 위해 놓이거나 면역화학적 검사를 위해 고정될 수 있습니다. 이 절차는 축삭돌기의 생리학 및 병태생리학을 조사하는 데 매우 유용한 것으로 입증되었습니다. 앞으로 살펴보겠지만 이 기법은 구현이 비교적 간단하며 특정 실험 설정에 적용할 수 있습니다.

우리는 도금 전날 축삭 변성 메커니즘을 연구하는 데 그 사용법을 시연할 것입니다. 먼저 멸균 조직 배양 후드 아래에 필터를 코팅합니다. 1위, 24mm 필터가 6웰 수용 플레이트에 삽입됩니다.

그런 다음 밀리리터당 1밀리그램 2밀리리터, 물 속의 폴리 드 리신을 하단 구획에, 상단 구획에 1밀리리터를 추가하고 삽입물을 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그녀의 다음 흡인 폴리 드 리신은 필터 바로 아래에 갇힌 액체의 잔여물을 제거해야 합니다. 그런 다음 물을 흡입한 후 물로 한 번 헹구고 뚜껑을 닫고 접시를 후드에서 밤새 건조시킵니다.

다음날 아침, 라미네이트와 물 용액을 섞어 섭씨 37도에서 데웁니다. 라미닌 용액에 주입된 삽입물을 섭씨 37도의 세포 배양기에서 표준 부피를 사용하여 1시간 동안 배양합니다. 흡인 후.

라미닌은 밀리리터 당 0.1 밀리그램을 추가하고, 물에 콜라겐을 넣고, 실온에서 1 시간 동안 잠복화하고, 그 후에 콜라겐을 흡인하고 메마른 물로 한 번 씻습니다. 이제 필터는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 E 13 마우스 배아를 해부하고 참수한 후 배양 배지 및 DRG 설명을 수신할 준비가 되었습니다. L 15 배지로 채워진 페트리 접시에 배아를 옆으로 눕히고 해부 현미경을 통해 관찰하면서 측면을 따라 절개하여 가슴, 배, 팔다리 및 꼬리를 버립니다.

척추 복부 쪽이 포함된 등을 위로 향하게 놓고 작은 스프링 가위를 사용하여 내장 장기를 모두 제거합니다. 배쪽 척추에서 정중선을 따라 척추를 절단하여 척수 전체를 노출시킵니다. 3번 집게 한 쌍으로 시체를 잡고 두 번째 쌍을 사용하여 척수의 가장 위쪽 측면을 잡습니다.

이제 척추강에서 탯줄을 천천히 부드럽게 당겨 빼냅니다. DRG가 노출되면 초박형 5번 집게를 사용하여 척수에서 집습니다. 확대하기 위해 자른 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 분리된 DRG를 접시 바닥에 놓습니다.

그 오프닝. 수집된 DRG를 흡인하고 얼음 위의 튜브에 넣습니다. 하단 격실 매체에 NGF 밀리리터당 15나노그램을 보충하면서 상단 격실 NGF를 자유롭게 유지합니다.

다음으로, 섭씨 37도에서 표준 볼륨을 사용하여 코팅된 인서트에 완전한 DRG 여과지를 추가합니다. 그런 다음 팁 트림이 있는 1000마이크로리터 피펫을 사용하여 개구부를 확대합니다. 피펫을 800마이크로리터로 설정합니다.

그런 다음 약 200마이크로리터의 여과지를 필터 상단에서 튜브 피펫이 들어 있는 DRG로 위아래로 소량 이동시켜 바닥으로 가라앉은 D RRG를 회수합니다. Repåreú가 전체 부피를 흡인하면 이제 인서트 중간에 피펫 팁을 담그고 DRG를 배출하여 DRG를 필터로 옮깁니다.세포 배양기에서 배양액을 섭씨 37도로 유지합니다.

미디어를 변경하려면 2-3일마다 미디어를 교체합니다. 상단 구획을 먼저 흡인하고 하단 구획을 흡인합니다. 축삭돌기에 대한 영양 인자 인출의 영향을 연구하기 위해 하단 구획부터 시작하여 표준 부피에 새로운 배지를 추가합니다.

축삭 확장을 허용하려면 이틀을 기다립니다. 그런 다음 상단 및 하단 구획에서 미디어를 제거합니다. 그런 다음 잔류 또는 내인성으로 생산된 모든 것을 격리하고 GF는 NGF가 결핍되고 항 NGF 항체를 포함하는 매체를 추가합니다.

플레이트를 섭씨 37도의 세포 배양기로 되돌려 NGF 철수로 인한 변성이 아리안 변성 동안 원하는 시간 동안 연구할 수 있도록 합니다. NGF에서 2일 동안 유지되는 DRG 익스플랜이 포함된 필터를 사용합니다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 필터 상단에서 DRG를 긁어냅니다.

스크레이퍼를 x 및 y 방향과 원을 그리며 앞뒤로 움직여 신경 세포체를 완전히 제거하십시오. 필터에 X 식물이 붙어 있지 않은지 확인하여 긁기의 성공 여부를 확인하십시오. 다음으로, 상단 구획에서 부유 외식이 포함된 배지를 버리고 밀리리터 및 gf당 10나노그램을 포함하는 예열 완전 DRG 배지 1ml를 추가합니다.

그런 다음 플레이트를 섭씨 37도의 세포 배양기로 다시 가져와 축삭 샘플에서 단백질을 추출하기 위해 원하는 시간 동안 월러관 변성이 진행되도록 합니다. 먼저 1.5ml의 채취 튜브에 75마이크로리터의 양잎 샘플 버퍼를 채우고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. PBS에서 DRG 엑스플란이 포함된 필터를 세척하고 이전과 같이 필터의 윗면을 긁어냅니다.

플레이트에서 인서트를 제거한 후 면 팁 애플리케이터를 사용하여 필터 상단을 청소합니다. 그런 다음 위쪽과 아래쪽에서 여분의 PBS를 흡인합니다. 그런 다음 인서트를 벤치에 거꾸로 놓고 날카로운 메스를 사용하여 인서트에서 필터를 잘라냅니다.

그런 다음 집게로 필터를 잡습니다. 상향식. 가위를 사용하여 필터 둘레에서 중앙까지 자릅니다.

이제 필터를 수집 튜브 위에 놓고 집게로 필터 중앙을 튜브 아래로 누릅니다. 이 작업을 수행하는 동안 깔때기가 형성되어 깔때기 모양의 필터를 튜브 바닥으로 밀어 얇은 샘플 버퍼에 잠기게 합니다. 이제 튜브를 덮고 끓는 물에 4분 동안 넣어 단백질 추출을 완료합니다.

집게를 사용하여 필터를 제거하고 튜브 상단에 거꾸로 놓고 잠시 원심분리합니다. 완료되면 면역 형광을 위해 건조된 필터를 폐기합니다. 6개의 웰 플레이트에서 PBS의 인서트를 세척합니다.

그런 다음 고정 후 셰이커에서 PBS의 갓 준비된 4% 파라폼 알데히드에 인서트를 실온에서 10분 동안 고정하고 인서트의 윗면을 긁어내고 청소하여 필터의 바닥 표면에서만 자란 축삭돌기만 염색되도록 합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 표준 면역형광을 수행합니다. 모든 면역형광 배양이 완료되면.

마지막 세탁에서 PBS를 붓습니다. 면봉 어플리케이터로 필터의 윗면을 청소하고 윗면과 아랫면에 남아 있는 액체를 흡인합니다. 인서트를 벤치에 거꾸로 놓고 날카로운 메스를 사용하여 인서트에서 필터를 잘라냅니다.

그런 다음 집게가 위로 향하게 하여 필터를 잡습니다. 현미경 슬라이드에 놓습니다. 형광등 호환 장착 매체를 사용하여 필터 위에 커버 슬립을 놓고 필터를 섭씨 4도의 어둠 속에서 평평하게 건조시킵니다.

형광 현미경을 사용하여 이미지를 검사하고 캡처하여 마무리합니다. 폴리리신, 라미닌 및 콜라겐으로 필터를 순차적으로 코팅하면 동일한 기질 아래에서 폴리리신만 또는 폴리리신과 콜라겐으로 자란 축삭돌이에 비해 식물 내에서 더 많고 더 긴 축삭돌기가 자랍니다. 코팅 조건.

필터에서 유지되는 DRG Explan은 플라스틱에서 자란 X 식물보다 훨씬 더 풍부한 축삭 성장을 보여줍니다. 필터의 윗면을 긁어낸 후 얻은 축삭 제제에는 세포핵이 없어 표시된 필터의 아래쪽에서 세포체가 제외되었음을 보여줍니다. 다음은 약 17개의 엑스플란에서 유래한 축삭돌기의 예로, 필터 기공을 통해 확장되어 24mm 필터의 바닥에서 자랍니다.

필터 상단과 하단에서 수집된 용해물의 면역 블롯은 핵 마커인 히스톤 H 3이 필터 상단에만 국한되어 있음을 보여줍니다. 총 단백질 함량은 서로 다른 샘플에서 정규화되었습니다. NGF 박탈 실험은 NGF에서 유지되거나 12 시간 또는 36 시간 동안 NGF가 박탈 된 explan의 축삭 제제의 다양한 배율에서 이러한 이미지에서 입증됩니다.

벽 아리안 축삭 변성 연구는 월러식 변성의 다른 모델과 마찬가지로 손상되지 않은 외식에서 또는 절개 후 3-7.5 시간의 축삭 제제의 이러한 이미지에서 볼 수 있습니다. 5 밀리몰 NAD plus는 일단 마스터되면 횡단으로 인한 변성으로부터 보호합니다. 이 기술은 견고하고 재현하기 쉽습니다.

그것은 2001년에 트위스트와 동료들에 의해 처음으로 기술된 이래로 신뢰할 수 있는 축삭 제제의 대량의 생성을 허용합니다. 이 기술의 변형은 축삭돌기와 수상돌기 생리학의 여러 측면을 탐구하는 데 사용되었습니다. 텍스트 프로토콜의 인용을 참조하여 이 기술의 다른 응용 프로그램을 찾아보십시오.