Name: 생화학 적 분석에 대한 감각 뉴런에서 생산 및 축삭의 분리는 다공성 필터를 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-08T23:45:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: 배우세요 다공성 필터를 사용하여 배아 DRG 뉴런의 축삭을 분리하는 방법을. 이 기술은 순수한 축삭 샘플을 얻어 생화학 및 면역세포화학 분석을 가능하게 하며, 축삭 생리와 신경퇴행성 질환의 신호전달 경로 연구에 활용됩니다.

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이 프로젝트는 캐나다 보건 연구소(Canadian Institutes of Health Research)의 보조금 MOP62827 지원받았습니다.

참고 : 다음 절차는 동물 보호의 캐나다 협의회의 승인 지침에 따라 수 있습니다. 모든 노력이 과정에서 고통과 동물의 고통을 최소화 할 수 있습니다. 필터 1. 코팅 참고 : 문화 필터 삽입이 멀티 웰 플레이트의 우물에 배치하는 경우, 두 개의 구획이 정의되어있다 : 최고 구획은 삽입 위의 지역이며, 아래 칸은 삽입 그림 1A.ab 아래의 하나입니다. 이식편들은 필터의 상부 측에 부착 상부 구획에 시딩; 많은 축삭은 필터를 통해 성장하고 하부 격실도 1A.c 이내에, 필터의 하부 측에 연장되어있다. (즉, 코팅 용액, 액체, 배양액 등을인가하는) 표준 작업 볼륨은 하부 구획 2 ㎖ 및 상부 구획 대 1 ㎖이며 &quot;로 프로토콜로 지칭 될 예정; 표준 볼륨 &quot;. 삽입 및 웰의 측면 사이의 간극에 피펫 팁을 배치하여 하부 격실로 시작 솔루션을 추가. 필터의 하단에 갇히는 기포를 방지하는 용액을 분배하면서 또, 한쪽으로 기울 인서트. <ol><li> 필터 도금 전날 코팅 시작합니다. 무균 조직 문화 후드에서 6 잘받는 판에 24mm 필터 삽입을 배치합니다. 맨 아래 칸에 2 ㎖ 및 상단에 1 ㎖ : 표준 볼륨을 사용하여 실온에서 1 시간 동안 물에 폴리-D-라이신 (1 ㎎ / ㎖)로 삽입을 품어. </li><li> 기음 폴리-D-라이신과 물에 한 번 씻어. 대기음 물, 뚜껑을 닫고 후드 O / N.에 건조 플레이트를 남겨 액체를 흡입하는 동안, 직접 필터 아래에 갇혀되어 액체의 잔재를 제거해야합니다. </li><li> 다음 날 아침, 물에 라미닌 (10 ㎍ / ml)에 희석 혼합 따뜻한 37 ℃에서 CEL에 1 시간을 라미닌으로 삽입을 품어표준 볼륨을 사용하여 37 ° C에서 L 인큐베이터. </li><li> 기음 라미닌 물에 콜라겐 (0.1 ㎎ / ㎖)을 추가하고 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 이 경우 최고 구획을위한 바닥 구획을위한 2 ㎖ 및 2 ㎖를 사용합니다. </li><li> 기음 콜라겐과 멸균 물에 한 번 씻는다. STEP 3에서 설명한 바와 같이 필터 해주기 배양 배지 및 DRG 이식편을 수신 할 준비가되어있다. </li></ol> 2. 해부 배아 배근 신경절 (DRG)의 Explants <ol><li> 에버 틴 (250 ㎎ / ㎏)의 IP 주입하여 13 일간의 임신 여성 마우스를 마취. 10 ~ 15 분을 기다린 후 각막 및 페달 철수 반사의 부족을 확인합니다. 반사 신경이 결석하면, 자궁 전위를 수행합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 모든 수술기구와 여성의 복부를 소독. 악기를 건조하도록 허용합니다. 복부의 피부를 잡고 복강을 노출 피부와 근육 레이어를 잘라. </li><li> 자궁 경부와​​ 난소에서 분리하여 자궁을 제거합니다. steri에서르 후드, 가위로 자궁에서 배아를 제거하고 얼음처럼 차가운 L15 매체로 가득 페트리 접시에 그들을 수집합니다. 얼음에 보관하십시오. 참고 : 임신 17, 18 13 일 배아를 얻는 방법에 대한 자세한 내용은 이전의 기술 보고서를 참조하십시오. </li><li> 현미경, 옆에있는 배아를 놓고 머리를 제거하는 작은 봄 가위를 사용합니다. 측면을 따라 절개 가슴, 배, 사지와 꼬리를 취소 할 수 있습니다. 모든 내장 기관을 복부 측면을 놓고 제거, 척추가 들어있는 백을 유지합니다. </li><li> 작은 봄 가위, 정중선을 따라 복부 측면에서 척추를 절단하여 전체 척수를 노출합니다. 집게 일쌍 (# 3)와 함께 시체를 누른 상태에서 가장 주동이의 측면에 의해 척수를 개최하는 두 번째 쌍을 사용합니다. </li><li> 천천히 그리고 부드럽게 떨어져 척추 공동의 코드를 뽑아 초박형 집게 (# 5)를 이용하여 척수 개의 DRG를 꼬집어. 그룹 개의 DRG를 수집 할접시의 바닥. </li><li> 의 개방을 확대 절단 된 200 μL 피펫 팁과 흡입에 의해 그룹화 개의 DRG를 수집합니다. 튜브 개의 DRG를 놓고 DRG 수집이 완료 될 때까지 얼음에 둡니다. 참고 : 개의 DRG이 팁의 벽에 붙어 있지 않기 때문에 (표준 노란색 팁에 비해) 화이트 / 투명 팁이 바람직하다. 미디어 플러싱 팁을 사용하기 전에 더 이상의 벽에 달라 붙는 개의 DRG를 방지 할 수 있습니다. </li></ol> 필터 3. 시드와 배근 신경절 외식 유지 <ol><li> 표준 볼륨을 사용하여 코팅 인서트에 37 ° C에서 전체 DRG 미디어를 추가합니다. NGF가없는 최고 구획을 유지하면서, NGF의 15 겨 / ㎖로 바닥 구획 미디어를 보충합니다. 참고 : NGF 효율​​적으로 필터를 통해 확산과 농도가 시간 이내에 평형을하지만, 우리는 직접 파종하기 전에 아래 칸에 NGF를 적용하는 것은 상당히 B의 축삭의 수율을 증가시키는 것으로 관찰필터의 ottom면. </li><li> 의 개방을 확대 손질 끝으로 1000 μL 피펫을 사용하여 필터에 튜브에서 DRG를 대체 전송합니다. </li><li> 개의 DRG를 수집하기 전에 팁 2 - 3 배에 용지를 그립니다. 이 팁의 안쪽에 달라 붙는 것을 방해. 같은 팁은 모든 우물에 다시 사용할 수 있습니다. (표준 블루 팁 대) 무색 팁의 사용 팁 표면에 DRG의 고집을 줄일 수 있습니다. </li><li> DRG를 대체 전송 800 μL에 피펫을 설정합니다. 기음 필터의 상단의 용지 약 200 μL는 다음 DRG 함유 튜브로 이동 위아래로 작은 볼륨을 피펫 - 바닥에 침몰 한 개의 DRG를 재현 탁 할 수 있습니다. 전체 볼륨과 삽입의 중간에 끝을 잠수 피펫 개의 DRG를 대기음. </li><li> 일단 모든 삽입이로드, 플레이트 뚜껑을 닫고 판 10 배 소용돌이, 각각의 소용돌이 사이의 후드 벤치에 가볍게 두드리는. 이러한 움직임을 지원하여 축삭 수율을 증가 DRG 외식 싱크 및필터에 부착합니다. 이것은 또한 다른 이식편에서 축삭 겹치지 않도록 균등 이식편을 분배 돕는다. 참고 : 이전 단계에서 설명하는 이식편 파종 절차는 크게 기판 (최대 75 %)로 이식편 첨부의 전반적인 속도를 증가시킨다. 가장 중요한 것은, 피펫 절차는 쉽게 미디어 표면에 떠있는 대신 삽입의 바닥에 가라 앉는에서 외식을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 생화학 적 분석을 위해, 필터 당 (30 정도) 하나의 배아에서 시드 개의 DRG. 형태 학적 분석을 위해, 절반 또는 하나의 배아 (10 ~ 15)에서 개의 DRG의 제 중 하나를 사용합니다. 관의 모든 개의 DRG는 (은 30, 15, 또는 10 개의 DRG 여부) 하나의 우물에 씨앗을 품고되도록이 결정은, 튜브에 개의 DRG를 수집하기 전에 이루어져야합니다. </li><li> 2-3 일마다 미디어를 변경, 37 ° C에서 세포 배양기에서 문화를 유지한다. 미디어를 변경 먼저 최고 구획을 대기음하려면 아래 구획 하였다. 표준 볼륨에 추가 신선한 미디어맨 아래 칸부터 시작이야. 참고 : 건조 세포 / 축삭을 방지하기 위해, 동시에 3 개 이상 삽입 미디어를 변경하지 않습니다. NGF의 존재에 필터에 성장 개의 DRG 문화 2 일 후에 2mm까지 도달하는 긴 축삭을 확장 할 것입니다. </li></ol> 4. 영양 인자 탈퇴 처리 NGF 철수는 먼저 철수 후 약 12​​ 시간을 표시 (IF 상 대비 및 β-III-tubulin에 의해 결정) 축삭 조각화 축삭 변성을 유도한다. 전체 조각은 36 시간에 의해 달성된다. 변성는 실험 디자인에 따라 최종 사용자에 의해 선택되어야 동안 진행하도록 방치 얼마나. <ol><li> 2 일 축삭 확장 단계 후, NGF가 부족하고, 나머지 (또는 내생 적 생산) NGF를 격리시키는 안티-NGF 항체 (1 ㎍ / ㎖)에 포함 된이 미디어에 상단과 하단 구획에서 미디어를 변경합니다. </li><li> 수 있도록 세포 배양기 (37 ° C)에 번호판을 반환원하는 시간 동안 진행 NGF 탈퇴 유도 변성. </li><li> 서양 얼룩 검진 단백질 추출 (6 단계)로 이동하거나 직접 IF (7 단계)에 의해 필터를 검사합니다. </li></ol> 5. 축삭 절개는 Wallerian 변성을 유도하는 이 절차는 전지 본체로부터 분리 필터의 하부 측에 축삭을 남겨 두지 만, 그렇지 않으면 그대로. 그 후,이 축삭이 빠르게 Wallerian 변성을 시작합니다. 첫 번째 절개 후 3 시간으로 나타납니다 (IF 상 대비 또는 β-III-tubulin에 의해 입증) 축삭 분열; 9 시간으로, 축삭이 완전히 분할되어 필터에서 분리됩니다. 변성는 실험 디자인에 따라 최종 사용자에 의해 선택되어야 동안 진행하도록 방치 얼마나. <ol><li> 셀 스크레이퍼로 재배 DRG 이식편을 함유하는 필터의 상부 측 긁어. X-, Y-원형에 스크레이퍼를 이동하여 최고 물자의 완전한 제거를 확인방향. </li><li> 필터에서 긁어 NGF (10 NG / ML)를 포함 예열 완료 DRG 미디어 1 ㎖로 교체 된 부동 외식을 포함하는 상위 함에서 용지를 버리십시오. </li><li> Wallerian 변성는 최종 사용자가 선택한 시간 동안 진행 할 수 있도록 인큐베이터 (37 ° C)를 셀에 플레이트를 반환합니다. </li><li> 서양 얼룩 검진 단백질 추출 (6 단계)로 이동하거나 직접 IF (7 단계)에 의해 필터를 검사합니다. </li></ol> 축삭 샘플 6. 단백질 추출 <ol><li> 램리 샘플 버퍼 75 μL로 수집 튜브 (1.5 ㎖)를 입력합니다. 필터의 전체 집합에서 축삭을 수확하는 동안 얼음에 튜브를 유지합니다. </li><li> PBS에서 DRG 외식으로 필터를 세척하고 필터의 상단을 다 쳤어요. 플레이트에서 삽입물을 분리면 팁 어플리케이터 필터의 상단을 청소하고 상단과 하단 측면에서 여분의 PBS를 대기음. </li><li> 삽입 거꾸로 배치벤치에 예리한 메스를 사용하여 삽입 밖으로 필터를 잘라. 집게, 바닥을 위로 필터를 누릅니다. 가위로 필터의 중심 주위에서 상처를 확인합니다. </li><li> 포집 관의 상단에 장소 필터 및 집게와, 다운 튜브 필터의 가운데를 누르십시오. 이 일을하는 동안, 깔때기 형성한다. 이 램리 샘플 버퍼에 빠져들도록 튜브의 바닥에 깔때기 모양의 필터를 밀어 넣습니다. </li><li> 4 분 동안 튜브를 자비 완전한 단백질을 추출합니다. 튜브의 상단에 거꾸로 배치하는 집게를 사용하여 간단한 스핀 (15 초 동안 2,000 XG)를 수행하는 필터를 제거합니다. 건조 된 필터를 폐기하십시오. </li><li> 관심의 단백질을 감지하는 서양 얼룩 뒤에 SDS-PAGE에있는 축삭 단백질 제제의 10 μl를 해결합니다. 참고 : 참고로, 2 일 동안 성장과 RIPA 100 μL에 용해 (20) 외식에서 축삭 준비 버퍼가 4-6의 단백질 농도를해야합니다 용해㎍ / μL. </li></ol> 필터에 축삭의 7. 면역 형광 시험 다음 단계는 β-III-튜 불린의 검출에 의해 예시 필터 삽입에 염색 경우 수행 할 수있는 일반적인 조작을 설명합니다. 정착액, 배양 시간, 농도와 다른 내용이 다른 항원 - 항체 쌍에 최적화되어야한다. <ol><li> 삽입의 다음 세척 및 배양을 위해 철저하게 청소 이전에 사용 된 6 - 웰 플레이트를 활용. </li><li> 간단히 PBS에 삽입을 씻는다. 셰이커에 실온에서 10 분 동안 PBS에서 갓 준비 4 % 파라 포름 알데히드에 수정합니다. </li><li> 고정 후, 긁어 필터의 저면에 독점적 성장 축삭을 수집 인서트의 위쪽면을 청소한다. IF 표준 배양을 진행합니다. </li><li> 부드럽게 진탕하면서 실온에서 1 시간 동안의 표준 볼륨을 사용하여, (TBS, 0.05 % 트윈 20, 5 % 탈지 우유) 용액을 블로킹 인서트를 배양한다. </li><li> 전송 표준 볼륨을 사용, 버퍼 (안티 - β-III-튜 불린, 1:5,000)를 차단에 희석 차 항체에 삽입합니다. 부드러운 흔들림으로 4 ° C에서 O / N (~ 18 시간)을 품어. </li><li> PBS (RT에서 2 X 10 분)에 두 번 첫 번째 항체를 씻으십시오. </li><li> 전송 표준 볼륨을 사용, (1:2,000을 염소 항 - 마우스) 버퍼를 차단에 희석 형광 - 복합 이차 항체에 삽입합니다. 부드러운 흔들림과 실온에서 2 시간 동안 빛에서 적용을 품어. </li><li> PBS (RT에서 3 × 10 분)의 차 항체의 3 배를 씻으십시오. </li><li> IF가 완료되면, 삽입물 가지고 마지막 세척에서 PBS를 멀리 부어면 - 팁 어플리케이터 필터의 상단을 청소합니다. 위쪽과 아래쪽에서 액체를 대기음. </li><li> 장소는 벤치에 거꾸로 삽입하고 날카로운 메스 삽입 밖으로 필터를 잘라. </li><li> , 집게와 필터를 잡고 위로 하방 및 현미경 슬라이드에 배치합니다. coverslip에 형광 호환 양해 각서 (MOU)와 오버레이nting 미디어. 빛에 덮여 차가운 방에서 건조 평면을 보자. 검사와 형광 현미경을 사용하여 이미지를 캡처합니다. 참고 : 4 ° C에 저장하고 빛으로부터 보호 할 때, 이러한 준비는 형광의 손실을 최소화 주 동안 유지 될 수있다. </li><li> 옵션 : 또한, IF는 삽입에서 제거 된 필터를 수행 할 수 있습니다. 이를 위해 긁어 직접 고정 후 필터의 상단면을 청소합니다. <ol><li> 여섯 잘 플레이트의 바닥에 날카로운 메스와 장소 필터 축삭 업에 삽입의 필터링을 가져 가라. </li><li> 7.4-7.8 7.11에 표시된대로 그 후, I​​F에 대한 배양을 수행합니다. 이 대안의 장점은 예를 들어, 배양 볼륨 (7.1-7.11 같이 필터를 직접 삽입에 염색 할 때 사용되는 3 ㎖에 비해) 500 μL까지 갈 수 있기 때문에이 시약을 절약 할 수 있다는 것입니다. </li></ol></li></ol>

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이 기술을 채택 할 때 고려해야 할 중요한 매개 변수는 공부한다 신경 세포의 인구, 기판, 필터의 기공 크기 및 표면 영역을 포함한다. 이러한 모든 파라미터가 얻어 신경 돌기 제제의 특이성, 질 및 양에 영향을 미칠 것이며, 최종 사용자에 의해 신중하게 고려되어야한다. 이 프로토콜에 제시된 예에서, DRG 신경 세포의 사용, 따라서 순수 (특정) 축삭 제제를주는 유일한 축삭 연장되는 이점이있다. 배아 개의 DRG의 축삭 성장은 매우 빠른 축삭 샘플 문화 단지 2 일 이후에 준비 할 수 있도록, 중추 신경계에서 뉴런과 비교된다. 1 μM의 기공 크기가 증가 축삭 효율적인 통로를 허용하면서 바닥면으로 이주에서 균체를 방지하기 위해 충분히 작은 입증되었다. 가능한 작은 크기 (즉, 0.4 μM)에 비해 얇은 축삭에 대한 선택을 강요하지 않습니다.DRG 이식편의 연구를 위해, (6 - 웰 플레이트에 사용) 24mm 필터 삽입물은 종종 단백질 입력 많이 필요 면역 포함...

신경 세포의 축삭 구획 somato-돌기 실에서 기능적 독립의 큰 정도를 보여줍니다. 투사 뉴런의 축삭은 신경 세포의 단백질 1,2의 대부분을 포함하고 있습니다. 최근의 연구는 초기 축삭 장애는 신경 퇴행성 질환 및 신경 정신 장애 3의 공통적 인 특징이 나타납니다 것으로 나타났습니다 때문에 축삭의 생리와 병리 생리학의 연구 결과는 신경 과학 사회에서 힘을 얻고있다. 그것은 정상 및 병적 인 조건에서 축삭 독점 메커니즘에 대한 이해가 장애를 구동 초기 이벤트에 빛을 발산 할 것으로 보인다. 이 의정서는 생화학에 적합하며 면역 세포 화학 분석 순수 축삭 물질의 많은 양을 얻기 위해 다공성 막 (필터) 베어링 문화 삽입물을 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 필터의 사용은 축삭 생물학 처음 스튜 워드에 의해 구현 된 공부를 삽입하고또한 현재의 구성에 Twiss의 동료 (5)에 의해 개발 된 동료 4. 기술은 연구 뉴런의 인구를 수용하는 각각의 경우에 약간의 수정과 함께, 축삭과 수상 돌기 생물학의 다양한 측면을 연구 그룹에 의해 현재 사용중인 지금, 수행먼트와 생화학 적 분석의 유형 6-9을 사용했다. 본 프로토콜은 응용 프로그램 같은 다양한 모든 대안을 수용 할 생각입니다 만, 오히려 대부분의 응용 프로그램에 적합한 간단한 방법을 제공하지 않습니다. 특히, 여기에서 설명하는 프로토콜은 철회 및 영양 요인 9 박탈 때 더 빨리 퇴화 적은 축삭을 생산 생화학 적 분석에 대한 축삭의 수율을 극대화하고, 문헌에 기술 된 축삭 변성 - 다른 코팅을 공부하기에 최적 인 트리플 코팅을 사용합니다. 이 과정에서 신경 세포 기관은 필터 WH 꼭대기에 고립 된 상태로 유지일의 축색 돌기가 모공을 통과 및 바닥면을 따라 성장한다. 필터의 저면에 성장 (아교 및 신경 세포체 오염물) 순수한 축삭 생화학 분석을 위해 수집하거나 반응계에서 고정 및 면역 세포 화학 기법 (9)에 의해 조사 될 수있다. 절차는 후근 신경절 (DRG)에서 배아 감각 뉴런의 사용에 의존한다. 이 요인을 박탈 때 빠르게 퇴보를 받아야하기 때문에 배아 개의 DRG 널리 신경 성장 인자 (NGF)에 유지하면 이들 세포에서 신경 돌기는 체외에서 빠르고 강력한 성장을 받아야하기 때문에 축삭 생물학을 연구하는 데 사용하고있다. 이 방법에 의해 수집 된 모든 신경 돌기가 순수 축삭 수 있도록 또한, DRG의 신경 세포는 수상 돌기 부족합니다. 필터 삽입은 축삭을 연구하는 데 다른 방법에 비해 큰 이점을 나타냅니다. 프로세스 에서와는 셀 ​​소마에서 발생 차별화 현미경의 사용에 의존 연구xons 제한 생화학 적 정보를 제공합니다. 다른 예로서, 구획화 배양 시스템 (예 Campenot 챔버 (10) 또는 미세 유동 장치 (11))은 촬상 방법 및 세포 구획 차동 치료에 유용하지만 필요 생화학 적 분석에 대한 이러한 기술의 사용을 배제, 축삭 물질의 소량 만 제공 샘플의 비교적 다량. 또한, 자신의 사용은 중요한 교육뿐만 아니라 전문 장비를 필요로하고, 그들은 시간이 소요됩니다. 종종 이식편에서 축삭을 분리하는 데 사용하는 또 다른 방법은 수동 축삭 시료 채취 전에 (신경 세포의 세포체 함유) 이식편 센터를 제거하는 것이다. 이 축삭 농축 제제의 대량 생산 할 수 있지만,이 준비 축삭이 아교에 싸여 빠르게 (최소 실험의 예를 들어) 6 우물에서 연속 20 이식편의 몸을 제거 할 수있는 시간이 오래 걸릴하고 가능성의 한계에. 대조적으로, 여기에 제시된 방법은 서양 얼룩, 면역 6, 북부 오점 5 질량 분석 6, RNA 정화와 같은 일반적으로 전체 세포 용 해물을 분석하는 데 사용되는 거의 모든 생화학 적 기법에 의해 분석 될 수있다 풍부하고 순수 축삭 준비를 생산 7,12,13, 다른 사람의 사이에서. 또한, 프로토콜은 상기 IF에서이를 검사하는 필터의 바닥 측에서 성장하는 축삭을 고정 할 수있는 한, (IF)를 면역 형광 기법에 적용될 수있다. 제공된 세포체는 최종 준비가 없기 때문에이 접근법은 크게 축삭 특정 프로세스의 분석을 용이하게한다. 세포 기관에서 높은 면역 신호가 자주 검사와 같은 축삭 얇은 구조에서 발생하는 약한 신호의 분석을 저해하기 때문에 이것은 큰 장점이다. 축삭 변성 AR을 연구하는 배양 방법의 두 가지 응용 프로그램전자 기술; 발달 전정 부상 유도 퇴화 모델의 모델 (통상 Wallerian 변성 함). 발달 전정의 모델링은 생체 내 감각 뉴런 타겟 유래 NGF의 양 및 충분한 신경성지지 축퇴 (14)를 수신하지 못하고 그 제한에 대해 경쟁한다는 사실에 근거한다. 이 현상은 생체 내에서 일어나는로서, 균체 파괴 다음에 축삭 변성을 시작, 배양 배지에서 NGF를 철수하여 배아 DRG의 문화에서 모방 할 수 있습니다. Wallerian 변성을 모델링하기 위해, 균체와 함께 필터의 상부 측이 긁어된다. 물리적으로 균체로부터 분리 한 후, 제 1850 16 현상을보고 A. 월러 따서 Wallerian 변성 (15)로서 알려진 신속하고 진부한 퇴행성 과정을 거칠되어 필터의 바닥 측 상에 성장한 축삭.

<table><tbody><tr><td>CD-1 마우스, E13 시간 지정 임신</td><td>Charles River</td><td></td><td>집에서 시간 지정 임신은 쥐를 짝짓기하고 질 플러그를 확인하여 수행 할 수 있습니다 (E0 일)</td></tr> <tr><td>팔콘 세포 배양 삽입</td><td>Corning</td><td>353102</td><td>1 &micro; m 기공 크기, 6웰 수용 플레이트에 적합</td></tr><tr><td>Falcon 세포 배양 컴패니언 플레이트</td><td>Corning</td><td>353502</td><td>인서트용 수용 플레이트</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>물에서 1mg/ml로 사용됩니다. 한 번 재사용 할 수 있습니다.</td></tr><tr>10 &micro에서 사용되는 <td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>; 물에 있는 g/ml. -80에서 100배 재고를 가져옵니다. C 및 해동 O/N 4 &deg; 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>PureCol 소 콜라겐 용액</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz의 L-15 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11415-064</td><td>로 대체 가능 DMEM</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 무혈청 보충제</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-2&prime;-deoxyuridine (FDU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>NGF (2.5S, 베타 서브 유닛)</td> <td>Cedarlane</td><td>CLMCNET-001</td><td></td></tr><tr><td>안티 NGF 항체</td><td>사내에서</td><td></td> 준비 <td>: Acheson, A. et al. 섬유 아세포 및 슈반 세포에서 뇌 유래 신경 영양 인자와 같은 활성의 검출 : NGF에 대한 항체에 의한 억제. 신경세포. 7, 265-75, (1991).</td></tr><tr><td>Alomone Labs</td><td>AN-240</td><td>상용 옵션</td><td></td></tr>: <tr><td>항 튜불린 항체</td><td>Millipore</td><td>MAB5564</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 염소 항 마우스 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td colspan = "4 ">DRG 배양 매체 </td></tr><tr><td colspan = "4">Neurobasal Medium 2% B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-글루타민 1% 페니실린-스트렙토미신 10 &마이크로; M FDU 15ng/ml NGF(하단 구획만 해당)</td></tr><tr><td colspan="4">1x Laemmli 샘플 버퍼</td></tr><tr><td colspan="4">2% SDS 50mM DTT 60mM Tris(pH 6.8) 5% 글리세롤 0.01%(w/v) 브로모페놀 블루</td></tr></tbody></table>

생화학 적 분석에 대한 감각 뉴런에서 생산 및 축삭의 분리는 다공성 필터를 사용하여

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

신경 축삭은 특정 메커니즘을 사용하여 확장을 중재하고 무결성을 유지하며 퇴행을 유도합니다. 기능적인 신경 회로를 형성하기 위해서는 이러한 사건의 적절한 균형이 필요합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 다공성 멤브레인(필터)이 있는 세포 배양 삽입물을 사용하여 기존의 생화학 또는 면역세포화학 기술로 검사하기에 적합한 다량의 순수 축삭 제제를 얻는 방법을 설명합니다. 이러한 필터 삽입물의 기능은 배아 등쪽 뿌리 신경절의 외식법을 사용하여 발달 가지치기 및 Wallerian 변성 모델을 통해 입증될 것입니다. 축삭돌기의 무결성과 기능은 다양한 신경퇴행성 병리학에서 손상됩니다. 실제로, 축삭 기능 장애는 여러 신경 퇴행성 질환에서 신경 세포 소실 손실보다 질병 과정에서 훨씬 더 일찍 나타나며, 이는 축삭 특이적 과정이 주로 이러한 장애를 표적으로 한다는 것을 나타냅니다. 분자 및 생화학적 기법으로 분석하기 위한 순수한 축삭 샘플을 얻음으로써, 이 기술은 축삭돌기의 생리학 및 병태생리학을 조절하는 메커니즘에 새로운 빛을 비출 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이것은 차례로 신경계의 퇴행성 질환을 유발하는 과정에 대한 우리의 이해에 영향을 미칠 것입니다.

E13.5 마우스에서 후근 신경절 외식 문화 2 일 이내에 2mm에 도달, 필터에 광범위하게 폴리-D-라이신, 라미닌 및 콜라겐 (그림 1B, 왼쪽)와 코팅을 순차적으로 성장한다. 이 기판의 조합이 특히 풍부한 성장을 수득; 다른 조합은 상당히 짧은 축삭 수익률 (그림 1B를, 오른쪽). 또한, 필터를 유지 개의 DRG 플라스틱 그림 1C에 성장 개의 DRG보다 더 긴 축삭을 확장합니다. 이 프로토콜에서 사용되는 직경이 1 μM, 신경 돌기가 기공을 통해 성장하고 저면에​​ 연장하도록 허용하면서, 필터의 상측에 균체를 유지의 기공 필터. 이것은 명확하게 핵 (DAPI) 및 β-III-tubulin의 그림 1D 스테인드 필터의 표면 형광 현미경으로 표시됩니다. 그대로 필터에서는 뉴런에서 비 두, 세포 핵을 관찰 할 수있다그것에서 이식편 센터와 약간의 조사에 ...

이 기사에서는 생화학 및 면역세포화학 분석을 위해 대량의 순수 축삭 샘플을 얻는 데 사용할 수 있는 신경 세포 배양 시스템에 대해 설명합니다. 이 기술을 통해 정상적인 축삭 생리학 및 신경 퇴행으로 이어지는 신호 경로에 대한 이해를 높일 수 있습니다.

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

이 절차의 목표는 기존, 생화학 또는 면역 세포 화학 기술로 검사하기에 적합한 순수한 축삭 제제를 얻는 것입니다. 이는 DRG 뉴런이 축삭돌기를 확장함에 따라 다공성 멤브레인 필터가 있는 배양 삽입물에서 배아 등뿌리 신경절 세포를 먼저 배양함으로써 이루어집니다. 일부 축삭돌기는 필터의 공극을 통해 성장하고 세포체는 위쪽 표면에 고립된 상태로 유지되는 동안 아래쪽 표면에서 확장됩니다.원하는 실험적 조작 후, 아래쪽에서 자란 축삭돌기를 유지하면서 필터의 위쪽에 있는 세포를 물리적으로 제거하여 축삭 준비를 얻습니다.궁극적으로, 분리된 축삭돌기는 기존의 생화학적 기술에 의한 분석에 적합한 순수한 축삭 샘플을 생성함으로써 생화학적 분석을 위해 놓이거나 면역화학적 검사를 위해 고정될 수 있습니다. 이 절차는 축삭돌기의 생리학 및 병태생리학을 조사하는 데 매우 유용한 것으로 입증되었습니다. 앞으로 살펴보겠지만 이 기법은 구현이 비교적 간단하며 특정 실험 설정에 적용할 수 있습니다.우리는 도금 전날 축삭 변성 메커니즘을 연구하는 데 그 사용법을 시연할 것입니다. 먼저 멸균 조직 배양 후드 아래에 필터를 코팅합니다. 1위, 24mm 필터가 6웰 수용 플레이트에 삽입됩니다.그런 다음 밀리리터당 1밀리그램 2밀리리터, 물 속의 폴리 드 리신을 하단 구획에, 상단 구획에 1밀리리터를 추가하고 삽입물을 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그녀의 다음 흡인 폴리 드 리신은 필터 바로 아래에 갇힌 액체의 잔여물을 제거해야 합니다. 그런 다음 물을 흡입한 후 물로 한 번 헹구고 뚜껑을 닫고 접시를 후드에서 밤새 건조시킵니다.다음날 아침, 라미네이트와 물 용액을 섞어 섭씨 37도에서 데웁니다. 라미닌 용액에 주입된 삽입물을 섭씨 37도의 세포 배양기에서 표준 부피를 사용하여 1시간 동안 배양합니다. 흡인 후.라미닌은 밀리리터 당 0.1 밀리그램을 추가하고, 물에 콜라겐을 넣고, 실온에서 1 시간 동안 잠복화하고, 그 후에 콜라겐을 흡인하고 메마른 물로 한 번 씻습니다. 이제 필터는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 E 13 마우스 배아를 해부하고 참수한 후 배양 배지 및 DRG 설명을 수신할 준비가 되었습니다. L 15 배지로 채워진 페트리 접시에 배아를 옆으로 눕히고 해부 현미경을 통해 관찰하면서 측면을 따라 절개하여 가슴, 배, 팔다리 및 꼬리를 버립니다.척추 복부 쪽이 포함된 등을 위로 향하게 놓고 작은 스프링 가위를 사용하여 내장 장기를 모두 제거합니다. 배쪽 척추에서 정중선을 따라 척추를 절단하여 척수 전체를 노출시킵니다. 3번 집게 한 쌍으로 시체를 잡고 두 번째 쌍을 사용하여 척수의 가장 위쪽 측면을 잡습니다.이제 척추강에서 탯줄을 천천히 부드럽게 당겨 빼냅니다. DRG가 노출되면 초박형 5번 집게를 사용하여 척수에서 집습니다. 확대하기 위해 자른 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 분리된 DRG를 접시 바닥에 놓습니다.그 오프닝. 수집된 DRG를 흡인하고 얼음 위의 튜브에 넣습니다. 하단 격실 매체에 NGF 밀리리터당 15나노그램을 보충하면서 상단 격실 NGF를 자유롭게 유지합니다.다음으로, 섭씨 37도에서 표준 볼륨을 사용하여 코팅된 인서트에 완전한 DRG 여과지를 추가합니다. 그런 다음 팁 트림이 있는 1000마이크로리터 피펫을 사용하여 개구부를 확대합니다. 피펫을 800마이크로리터로 설정합니다.그런 다음 약 200마이크로리터의 여과지를 필터 상단에서 튜브 피펫이 들어 있는 DRG로 위아래로 소량 이동시켜 바닥으로 가라앉은 D RRG를 회수합니다. Repåreú가 전체 부피를 흡인하면 이제 인서트 중간에 피펫 팁을 담그고 DRG를 배출하여 DRG를 필터로 옮깁니다.세포 배양기에서 배양액을 섭씨 37도로 유지합니다.미디어를 변경하려면 2-3일마다 미디어를 교체합니다. 상단 구획을 먼저 흡인하고 하단 구획을 흡인합니다. 축삭돌기에 대한 영양 인자 인출의 영향을 연구하기 위해 하단 구획부터 시작하여 표준 부피에 새로운 배지를 추가합니다.축삭 확장을 허용하려면 이틀을 기다립니다. 그런 다음 상단 및 하단 구획에서 미디어를 제거합니다. 그런 다음 잔류 또는 내인성으로 생산된 모든 것을 격리하고 GF는 NGF가 결핍되고 항 NGF 항체를 포함하는 매체를 추가합니다.플레이트를 섭씨 37도의 세포 배양기로 되돌려 NGF 철수로 인한 변성이 아리안 변성 동안 원하는 시간 동안 연구할 수 있도록 합니다. NGF에서 2일 동안 유지되는 DRG 익스플랜이 포함된 필터를 사용합니다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 필터 상단에서 DRG를 긁어냅니다.스크레이퍼를 x 및 y 방향과 원을 그리며 앞뒤로 움직여 신경 세포체를 완전히 제거하십시오. 필터에 X 식물이 붙어 있지 않은지 확인하여 긁기의 성공 여부를 확인하십시오. 다음으로, 상단 구획에서 부유 외식이 포함된 배지를 버리고 밀리리터 및 gf당 10나노그램을 포함하는 예열 완전 DRG 배지 1ml를 추가합니다.그런 다음 플레이트를 섭씨 37도의 세포 배양기로 다시 가져와 축삭 샘플에서 단백질을 추출하기 위해 원하는 시간 동안 월러관 변성이 진행되도록 합니다. 먼저 1.5ml의 채취 튜브에 75마이크로리터의 양잎 샘플 버퍼를 채우고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. PBS에서 DRG 엑스플란이 포함된 필터를 세척하고 이전과 같이 필터의 윗면을 긁어냅니다.플레이트에서 인서트를 제거한 후 면 팁 애플리케이터를 사용하여 필터 상단을 청소합니다. 그런 다음 위쪽과 아래쪽에서 여분의 PBS를 흡인합니다. 그런 다음 인서트를 벤치에 거꾸로 놓고 날카로운 메스를 사용하여 인서트에서 필터를 잘라냅니다.그런 다음 집게로 필터를 잡습니다. 상향식. 가위를 사용하여 필터 둘레에서 중앙까지 자릅니다.이제 필터를 수집 튜브 위에 놓고 집게로 필터 중앙을 튜브 아래로 누릅니다. 이 작업을 수행하는 동안 깔때기가 형성되어 깔때기 모양의 필터를 튜브 바닥으로 밀어 얇은 샘플 버퍼에 잠기게 합니다. 이제 튜브를 덮고 끓는 물에 4분 동안 넣어 단백질 추출을 완료합니다.집게를 사용하여 필터를 제거하고 튜브 상단에 거꾸로 놓고 잠시 원심분리합니다. 완료되면 면역 형광을 위해 건조된 필터를 폐기합니다. 6개의 웰 플레이트에서 PBS의 인서트를 세척합니다.그런 다음 고정 후 셰이커에서 PBS의 갓 준비된 4% 파라폼 알데히드에 인서트를 실온에서 10분 동안 고정하고 인서트의 윗면을 긁어내고 청소하여 필터의 바닥 표면에서만 자란 축삭돌기만 염색되도록 합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 표준 면역형광을 수행합니다. 모든 면역형광 배양이 완료되면.마지막 세탁에서 PBS를 붓습니다. 면봉 어플리케이터로 필터의 윗면을 청소하고 윗면과 아랫면에 남아 있는 액체를 흡인합니다. 인서트를 벤치에 거꾸로 놓고 날카로운 메스를 사용하여 인서트에서 필터를 잘라냅니다.그런 다음 집게가 위로 향하게 하여 필터를 잡습니다. 현미경 슬라이드에 놓습니다. 형광등 호환 장착 매체를 사용하여 필터 위에 커버 슬립을 놓고 필터를 섭씨 4도의 어둠 속에서 평평하게 건조시킵니다.형광 현미경을 사용하여 이미지를 검사하고 캡처하여 마무리합니다. 폴리리신, 라미닌 및 콜라겐으로 필터를 순차적으로 코팅하면 동일한 기질 아래에서 폴리리신만 또는 폴리리신과 콜라겐으로 자란 축삭돌이에 비해 식물 내에서 더 많고 더 긴 축삭돌기가 자랍니다. 코팅 조건.필터에서 유지되는 DRG Explan은 플라스틱에서 자란 X 식물보다 훨씬 더 풍부한 축삭 성장을 보여줍니다. 필터의 윗면을 긁어낸 후 얻은 축삭 제제에는 세포핵이 없어 표시된 필터의 아래쪽에서 세포체가 제외되었음을 보여줍니다. 다음은 약 17개의 엑스플란에서 유래한 축삭돌기의 예로, 필터 기공을 통해 확장되어 24mm 필터의 바닥에서 자랍니다.필터 상단과 하단에서 수집된 용해물의 면역 블롯은 핵 마커인 히스톤 H 3이 필터 상단에만 국한되어 있음을 보여줍니다. 총 단백질 함량은 서로 다른 샘플에서 정규화되었습니다. NGF 박탈 실험은 NGF에서 유지되거나 12 시간 또는 36 시간 동안 NGF가 박탈 된 explan의 축삭 제제의 다양한 배율에서 이러한 이미지에서 입증됩니다.벽 아리안 축삭 변성 연구는 월러식 변성의 다른 모델과 마찬가지로 손상되지 않은 외식에서 또는 절개 후 3-7.5 시간의 축삭 제제의 이러한 이미지에서 볼 수 있습니다. 5 밀리몰 NAD plus는 일단 마스터되면 횡단으로 인한 변성으로부터 보호합니다. 이 기술은 견고하고 재현하기 쉽습니다.그것은 2001년에 트위스트와 동료들에 의해 처음으로 기술된 이래로 신뢰할 수 있는 축삭 제제의 대량의 생성을 허용합니다. 이 기술의 변형은 축삭돌기와 수상돌기 생리학의 여러 측면을 탐구하는 데 사용되었습니다. 텍스트 프로토콜의 인용을 참조하여 이 기술의 다른 응용 프로그램을 찾아보십시오.

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우리는 myelin를 공개하고 나머지 축삭 - 풍부한 자료의 추출 다음 비 axonal 구조를 lyse에 hypotonic 매체 신경 fascicles과 부화 해부에 따라 성인 쥐의 좌골 신경에서 axoplasm 절연을위한 프로토콜을 보여줍니다.

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표현 이온 채널 연구에 대한 특정 감각 신경 세포 인구의 식별

여기에서는 척수의 수압압출과 동일한 설치류에서 특정 등뿌리 신경절(DRG)의 식별 및 격리를 위한 프로토콜을 제시합니다. 표준 척수 분리 방법과 비교하여 이 방법은 훨씬 빠르고 조직 손상 위험을 줄입니다.

설치류의 등쪽 뿌리 신경절의 척수 및 절연의 유압 압출

여기서는 체외에서 감각 및 운동 신경에서 섬유아세포와 슈완 세포를 정화하는 방법을 제시합니다.

체외에서 감각 및 모터 신경에서 섬유 아세포와 슈완 세포의 정화

본 프로토콜은 미세유체 챔버에서 뉴런 미토콘드리아의 파종 및 염색을 기술한다. 이 챔버의 유체 압력 구배는 축삭에서 미토콘드리아를 선택적으로 처리하여 세포체 구획에 영향을 미치지 않고 약리학적 문제에 대응하여 특성을 분석할 수 있도록 합니다.

축삭 미토콘드리아의 미세 유체 보조 선택적 탈분극

이 프로토콜은 축삭 손상 후 신경 대사 역학을 모델링하는 미세유체 시스템을 설명하여 내재 대사 리모델링의 이미징, 다중 오믹스 분석 및 기계론적 연구를 가능하게 합니다.

축삭 손상 모델 구성 및 다중 오믹스 분석 가능을 위한 미세유체 칩

신경 막 프로테아좀(NMP)은 최근 체감각 뉴런의 하위 집합에서 촉각, 통증 및 가려움증 인식의 주요 조절자로 확인되었습니다. 이 기사에서는 세포 분류, 전사체 프로파일링 및 배양 기반 면역형광 분석을 사용하여 세포 유형 특이적 NMP 발현 및 기능을 분석하기 위한 강력한 워크플로우를 제시합니다.

체감각 뉴런에서 신경막 프로테아좀의 세포 아형 특이적 분석

본 연구는 다공성 막 삽입물을 이용해 축삭 mRNA를 분리하는 견고한 방법을 제시하여, 전체 뉴런과 신경돌의 분리 및 RNA 정제를 가능하게 합니다. RTddPCR과 결합하여 저복제 전사체의 절대적 정량화를 가능하게 하여, 높은 민감도, 재현성, 광범위한 실험적 적용성을 가진 mRNA 수송 및 국소 번역 연구를 용이하게 합니다.

다공성 막 삽입물과 RTddPCR을 이용한 축삭 mRNA의 분리 및 정량

배우세요 다공성 필터를 사용하여 배아 DRG 뉴런의 축삭을 분리하는 방법을. 이 기술은 순수한 축삭 샘플을 얻어 생화학 및 면역세포화학 분석을 가능하게 하며, 축삭 생리와 신경퇴행성 질환의 신호전달 경로 연구에 활용됩니다.

생화학 적 분석에 대한 감각 뉴런에서 생산 및 축삭의 분리는 다공성 필터를 사용하여

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