Name: 배양 예쁜 꼬마 선충 미세 폭격에 의한 무균 액체 미디어 및 형질 전환 웜의 생성에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 배우세요 C. elegans를 무균 액체 배지에서 배양하고 동기화하는 방법을. CeHR 배지를 사용하여 세균 대사산물 없이 영양학적 요구를 정확히 연구할 수 있습니다.

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이 작품은 HealthGrants DK85035 및 DK074797 (IH)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. 웜 변종 <ol><li> C. 구하는 엘레은 Caenorhabditis의 유전학 센터 (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc)에서 브리스톨 N2 균주를 야생형과 NGM 플레이트에 그들을 유지 E. 시드 대장균 균주 OP50 7. 참고 : 유전자 변형 웜은 IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) 이전 11 기술로 활용이 생성 된 종자는. IQ6011는 해당 저자의 요청하실 수 있습니다. </li></ol> 수정 C. 2. 준비 엘레 해비 및 재생 매체 (mCeHR) 12 아래에 설명 된대로 mCeHR 액체 매체를 준비합니다. 이 무균 액체 매체는 벌레가 추가 음식 소스없이 증가 할 수 있습니다. 이러한 층류 후드로 엄격히 멸균 조건을 사용하여 무균 액체 매질 및 무균 벌레의 모든 조작을 수행한다. <ol><li> 식료품 점에서 매우 저온 살균 무 지방 우유를 얻습니다. 냉장 프로를 사용덕트 아닌 실온 품. mCeHR 매체 행진에 판 한천 뇌 심장 주입 (BHI)에 우유를 사용하고 무균 상태를 확인하기 위해 30 ° C, 37 ° C에서 3 일 동안 배양하기 전에. -80 ° C에서 50 ㎖ 멸균 튜브 및 저장소에 우유를 이동 </li><li> 다음과 같은 구성 요소를 각각 준비하고 순서와 mCeHR 1 L를 준비하기 위해 주어진 양 (표 1A)의 결합 : 2 mM의 콜린 이산 구연산 10 ㎖, 비타민과 성장 인자 믹스 10 ㎖ (표 1B의 레시피 참조) 2.4 MM의 미오 - 이노시톨 10 ㎖, 10 ㎖의 2 mM의 헤민 클로라이드, 탈 이온수 250 ㎖. 0.22 μm의 필터 장치를 통해 흡입하고 필터를 적용합니다. </li><li> 핵산 혼합물을 20 ㎖ (표 1c에 레시피), 미네랄 믹스 100 ㎖ (표 1d에 레시피), 170 ㎎ / ㎖ 락트 알부민 가수 분해물 20 ㎖의 필수 아미노산을 20 ㎖, 비 필수 아미노산 10 ㎖를 추가 산, 450 mM의 KH 2 PO 4 20 ㎖,1.45 M D-글루코스, 1 M HEPES 10 ㎖, 나트륨 염, 250 ㎖의 탈 이온수 50 ㎖. </li><li> 구성 요소를 살균 필터링 흡입을 적용합니다. 필터를 제거하고 5 ㎎ / ㎖ 콜레스테롤의 1 ML을 추가합니다. 미디어의 pH는 약 6-6.5 있는지 확인합니다. 참고 :이 솔루션은 최대 1 년 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 사용하기 전에 mCeHR 매체에 20 % (V / V) 매우 저온 살균 유기 탈지 우유를 추가합니다. 우유를 열고 분취 때 (층류 후드 예를 들면) 양심적으로 멸균 기술을 사용합니다. 4 ℃에서 미디어를 저장 </li></ol> 3. C.에게 준비 무균 mCeHR 액체 배지에서 문화 엘레 <ol><li> 많은 임신하는 웜과 OP50 E. 최소한의 양이 될 때까지 열 60mm NGM 플레이트에 벌레를 성장 접시에 대장균. </li><li> M9 버퍼 (표 1 층에있는 레시피) 5 ㎖로 세척하여 각 판에서 벌레를 제거하고 50 ML 원뿔 튜브에 결합한다. </li><li> s의 벌레를 허용ettle 5 ~ 10 분 동안 서 튜브를 남겨 조심스럽게 E.를 포함 뜨는을 제거 대장균. </li><li> 반복 절차를 계속 진행하기 전에 가능한 잔여 박테리아의 많은을 제거하기 위해 3.2 및 3.3 배 단계를 반복합니다. </li><li> 세의 배수 부피 0.1 N 염화나트륨있는 웜에 resuspend 예컨대 1.5 ㎖, 3 ㎖ 또는 10 ㎖를되는 개별 웜 튜브에서 볼 수있다. </li><li> 5 N NaOH를 5 % 차아 염소산 나트륨 웜 현탁액 1시 2분 6초 비율 (표백) 용액을 첨가함으로써 웜 표백. 예를 들어, 1 ml의 5 N NaOH를 2 ml의 5 % 차아 염소산 나트륨 : 웜 현탁액 6 ㎖. 웜 현탁액에 추가하기 전에 수산화 나트륨과 표백제를 혼합. </li><li> 소용돌이 솔루션을 적극적으로 임신하는 웜이 용해 될 때까지 만 계란 서스펜션 (약 5 ~ 10 분) 내에서 볼 수 있습니다. 10X 대물 렌즈와 위상차 현미경을 사용하여 프로세스를 모니터링. </li><li> 벌레가 완전히 용해 된 후, 즉시 펠렛계란 45 초 동안 800 XG에 4 ° C에서 뜨는을 제거하고 4 ℃에서 45 초 동안 800 XG에서 펠렛을 원심 분리하여 멸균 물 10 ㎖로 두 번 펠릿을 씻어 </li><li> 표백 후, 100 ㎍ / ㎖의 테트라 사이클린 보충 mCeHR 미디어 10 ㎖를 포함하는 25cm 2 조직 문화 플라스크에 계란 펠렛을 전송합니다. 무균 기술을 사용하여이 절차를 수행합니다. 원하는 경우, 무균 액체 배양에서 박테리아의 성장을 방지하기 위해, 250 ㎍ / ㎖의 날 리딕 산 등 추가적인 항균제를 추가한다. </li><li> 약 70 rpm으로 진탕 배양기에서 20 ° C에서 액체 문화를 품다. </li><li> 개발 단계 및 성장 속도에 유의 매일 벌레를 확인합니다. 참고 : 웜은 처음에 천천히 성장하고 임신하는가 7 10 일이다이 필요합니다. 벌레가 액체 매질에 순응 그러나, 생성 시간은 야생형 (N2) 웜 약로부터 4 일 감소합니다. </li><li> 벌레는 deve을이 후원뿔 튜브에 웜 문화를 전송하고 스윙 버킷 로터를 사용하여 4 ° C에서 5 분 800 XG에 벌레를 펠렛, 액체 매체에서 임신하는 단계로 loped. </li><li> 뜨는을 제거하고 부드럽게 0.1 M의 NaCl의 동일한 볼륨 웜 펠렛을 재현 탁. 예를 들어, mCeHR 10 ㎖에서 배양 벌레를 0.1 M의 NaCl 10 ㎖를 사용합니다. 벌레가 얼음에 5 분 동안 정착 할 수 있습니다. </li><li> 3.5-3.8 단계에서 전술 한 바와 같이 표백 절차를 수행하고, 웜 무균 액체 매질에 2 대째 성장하는 것을 허용한다. 필요한 경우, 세균의 성장을 억제하기 위해 다시 항생제를 추가합니다. </li><li> 다시 동기화 인구를 생산하는 단계 3.5-3.8에 설명 된대로 다시 표백 단계 3.12 및 3.13에 설명 된대로 다음 0.1 M의 NaCl에 벌레를 펠렛 및 재현 탁 웜은 임신이 될 수 있습니다. 지금부터 항생제없이 액체 매체의 L1 애벌레 벌레를 성장. </li></ol> 액체에서 4. 동기화 웜문화 <ol><li> 펠렛 및 단계 3.12 및 3.13에서 상술 한 바와 같이 0.1 M의 NaCl에있는 벌레를 재현 탁. 단계 3.5-3.8에서 상술 한 바와 같이 블리치. </li><li> M9 버퍼 10 ㎖에 계란 펠렛을 재현 탁하고 유충이 회전 플랫폼 통에 20 ° C에서 O / N을 부화 할 수 있습니다. 참고 : 계란 L1 애벌레로 부화하지만, 추가로 개발하지 않을 것이다, L1 단계에서 벌레를 동기화. </li><li> 유지 및 배양 웜, 5 분 800 XG에 펠릿 L1 유충, 다음 10 mCeHR ml의 25cm 2 플라스크로 전송의 유충을 재현 탁합니다. 벌레가 회전 플랫폼에서 20 ° C로 증가 할 수 있습니다. 벌레에 충분한 영양을 보장하기 위해 3000 웜 / ㎖ / ㎠의 최대 밀도를 유지한다. 주의 :이 단계에서, 항생 물질이 절차는 층류 후드에서 무균 기술을 사용하여 수행 될 때 무균 상태를 유지하기 위해 요구되지 않는다. 웜은 성장을 모니터링하기 위해 매일 점검해야한다. </li></ol> 5. 무료무균 중간 문화에 대한 쌩쌩 및 해동 웜 <ol><li> 무균 비동기 웜 문화 또는 액체 질소에 동기화 L1 유충을 동결. 5 분 800 XG에 펠렛 웜은 각각의 병에 대한 0.5 ㎖를 사용하여 S 버퍼 (6.45 mM의 KHPO 4, 43.55 mM의 KHPO 4, 146.25 mM의 염화나트륨)을 재현 탁. 각각의 병에 30 % V / V 글리세롤과 S 버퍼의 동일한 볼륨을 추가 및 액체 N 2의 장기 보관하기 전에 -80 ° C로 웜을 전송합니다. 각각의 병에 ML 당 약 1 × 10 6 벌레를 동결. </li><li> 거의 모든 얼음이 녹을 때까지 약 2 분 동안 37 ° C에서 튜브를 배양하여 벌레를 해동. 층류 후드에서 mCeHR을 포함하는 멸균 플라스크에 웜을 전송하고 20 ℃에서 그들을 배치 </li></ol> 6. mCeHR의 성장과 재생에 헤민 농도의 효과를 결정 <ol><li> C.의 영양소에 의존 성장을 검정 무균 mCeHR 미디어를 사용 엘레. 효과 (을)를 확인하려면벌레의 성장과 발전에 F 헤민 농도는 무균 N2 웜 또는 관심의 다른 변종을 동기화 사용합니다. 4 장에서 상술 한 바와 같이 L1 애벌레를 동기화합니다. </li><li> 다음 날, 펠릿 및 동기화 L1 애벌레를 계산하고 무균 미디어 μL 당 1 웜에 희석에. 0.3 M NH 4 OH 10 ㎜ 헤민 염화을 확인하고 진한 염산을 사용하여 pH를 8로 조정합니다. </li><li> 24 웰 플레이트에 mCeHR 매체 800 μl를 추가합니다. 미디어의 100 ㎕를 각 웰에 100 벌레를 추가합니다. 0 μM에서 1.5 μM 세중 1,000 μM까지의 농도로 각 웰에 헤민 염화을 추가합니다. 모든 우물이 0.3 M NH 4 OH의 동일한 농도가 포함되어 있는지 확인합니다. 조심스럽게 100 L1 유충이 각 웰에 첨가되는 것을 보장하기 위해 피펫 팅 전에 벌레를 재현 탁. </li><li> 매일 벌레를 검사하고 각 웰의 각 농도의 성장을 확인합니다. 배양 9 일 후에 벌레의 수를 계산하고 각 헴에 해당하는 웜 / ㎖의 수를 음모농도 (그림 1). </li></ol> 헴 센서 웜에 헤민 농도의 7. 효과 <ol><li> 4를 포함 mCeHR에 동기화 L1 헴 센서 웜 (Phrg-1 :: GFP)을 품다 μM, 13 μM, 10 μM, 20 μM 헤민. </li><li> 형광 공 초점 현미경, 48 시간 포스트 배양 (그림 2)를 사용하여 이미지 웜. </li></ol> 8. 형질 전환 C.를 생성 할 mCeHR 활용 엘레 미세 사격을 사용하여 참고 : 그림 3 (13)에 설명되어 생성 및 UNC-119 (ED3) mCeHR에서 자란 벌레를 사용하여 미세 충격을 수행하기위한 절차를. <ol><li> 웜 준비 <ol><li> 175cm 2 플라스크 일주 전에 폭격에 mCeHR 미디어의 90 ㎖에 약 1 × 10 6 비동기 UNC-119 (ED3) 웜을 전송합니다. 벌레가 20 ° C의 O로 성장 할 수 있도록 허용NA는 70 분당 회전 수 (그림 3-1) ~에 플랫폼을 흔들어. 참고 : 일주일 후, 벌레 밀도가 많은 성인 임신하는 벌레와 상당히 커야합니다. 약 3 × 10 7 웜은 미세 충격에 필요합니다. </li><li> 칠 JM109 E. 대장균 얼음에 10cm의 NGM 플레이트 시드. </li><li> 두 50 ML 원뿔 튜브에 무균 웜을 전송하고 2 분 동안 800 XG에서 벌레를 원심 분리기. 뜨는을 기음과 M9 버퍼 (그림 3-2) 50 ㎖에 각 관 벌레를 재현 탁. </li><li> 어른 벌레가 얼음에 10 ~ 15 분 동안 중력에 의해 펠릿 할 수 있습니다. 참고 : 2 ㎖ 펠릿은 지금&gt; 90 %의 성인 벌레를 포함해야합니다. 이 2 ㎖ 펠릿은 약 5 × 10 6 웜이 하나의 미세 충격에 충분해야합니다. </li><li> 코트는 냉장 JM109의 전체 표면은 웜의 2 ㎖ 펠릿과 NGM 플레이트를 시드. 완전히 흡수 될 수있는 액체가 다음 판을 남길 수 있습니다(그림 3-3)를 진행하기 전에 얼음에 30 분. </li></ol></li><li> 금 입자의 제조 <ol><li> 실리콘 처리 microcentrifuge 관에 금 입자의 30 밀리그램 무게. 1 ㎖의 70 % 에탄올을 추가하고 5 분 동안 튜브를 소용돌이. </li><li> 관은 금 입자를 펠렛 10 초 동안 6,000 XG에서 원심 분리 한 후, 15 분 동안 앉아 수 있습니다. 주의 깊게 금 입자에 튜브 반대의 측면에 끝을 터치하여 피펫 팁을 사용하여 상층 액을 제거합니다. </li><li> 1 분 동안 멸균 물 1 ㎖, 소용돌이와 금 입자를 세척하고 짧게 10 초 동안 6,000 XG에서 튜브를 원심 분리기. 다음 멸균 50 % 글리세롤 0.5 ㎖에 금 입자를 재현 탁, 두 번 세척 단계를 반복합니다. 참고 : 금 입자의 최종 농도는 60 ㎎ / ㎖이있을 것이고, 4 ℃에서 1~2개월 저장할 수 있습니다 </li></ol></li><li> DNA - 금 입자 믹스를 준비합니다 <ol><li> 10 &amp;으로 원하는 플라스미드 DNA의 10 μg을 결합# 956; 실리콘 처리 1.5 ML microcentrifuge 관에서 UNC-119 구조 플라스미드의 g. DI 물 50 μL 잘 재현 탁 금 입자 용액 1 분 후 소용돌이의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 2.5 M 염화칼슘 150 μl를 추가하고 1 분 동안 솔루션을 다시 소용돌이. 이 용액에 3 ~ 5 분 동안 0.1 M 스퍼 미딘과 소용돌이의 60 μl를 추가합니다. </li><li> 펄스는 10 초 동안 6,000 XG에서 솔루션을 원심 분리, 상층 액을 제거하고 70 % 에탄올 300 μl를 추가합니다. 소용돌이 아니라 1 분 동안 6,000 XG에 펄스 원심 분리기는, 100 % 에탄올 170 μL에 뜨는에 resuspend를 제거합니다. 적극적으로 5 ~ 10 분 후 원심 분리기를 펄스와 뜨는을 제거하기위한 솔루션을 소용돌이. </li></ol></li><li> 사격 (그림 3-3) 주 :이 프로토콜은 자재 / 장비의 표에 지정된 입자 전달 시스템으로 수행된다. 사용할 수있는 입자 전달 기기에 대한 지침을 따르십시오. <ol> &lt;리&gt; 15cm 접시에 조직의 용지를 넣습니다. 핀셋을 사용하여, 각각 100 % 에탄올에 일곱 macrocarriers을 찍어 건조 조직에 그들을 배치. </li><li> 철저하게 70 % 에탄올로 biolistic 실, 마크로 캐리어 홀더 및 대상 플레​​이트를 청소합니다. 깨끗하고 각각의 폭격 절차 이전에 정지 화면을 압력솥. </li><li> 좌석 도구를 사용하여 홀더에 핀셋과 프레스를 사용하여 홀더에 macrocarrriers를 넣습니다. </li><li> 균등하게 각 마크로 캐리어의 중심에있는 DNA 코팅 된 금 입자의 20 μl를 확산하고 용액이 완전히 건조 할 수 있습니다. </li><li> 에탄올 압력 분배의 두 부분을 청소하고 에탄올 청소 파열 디스크를 조립합니다. 사격 실에 조립 된 압력 분배기 및 파열 디스크를 고정합니다. </li><li> 마크로 캐리어 홀더 멸균 정지 화면을 조립하고 금속 필요한 선반과 장소에 잠금에 장치를 배치합니다. </li><li> 조립 MACR를 삽입ocarrier 압력 분배기 아래에 할당 된 슬롯에 biolistic 실에 장치 및 압력주기에 맞 춥니 다. </li><li> 표적 판 선반 위에 벌레와 오픈 NGM 플레이트를 테이프와 실의 문을 닫습니다. </li><li> , 웜 도배 파열 디스크를 파괴하는 데 필요한 그에게 압력을 조정합니다. , 수은 압력 28 인치에 진공을 켭니다 디스크가 파열 될 때까지 화재 버튼을 누릅니다. </li><li> 진공을 해제하고 장치에서 NGM 플레이트를 제거합니다. 접시에서 벌레를 씻어 JM109 E. 시드 스물 10cm의 NGM 플레이트에 다시 배포 대장균 (그림 3-4). </li><li> 벌레가 25 ° C에 최대 10 내지 14 일 동안 성장하고 판을 굶어 수 있습니다. UNC-119의 결함에서 구출 웜은 보통 운동을하고이 시간에 식별 할 수 있습니다. 이러한 독립적 인 유전자 변형 라인 (Figur를 대표로 추가 분석을 위해 별도의 플레이트에서 적어도 10 &quot;야생형&quot;벌레를 선택전자 3-5). </li></ol></li></ol>

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<li>Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+gene+targeting+in+Caenorhabditis+elegans+by+biolistic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation.</a> Nucleic acids research. 32, e40(2004).</li>
<li>Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+transgenic+nematodes+by+bombardment+and+antibiotic+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection.</a> Nature Methods. 9, 118-119 (2012).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익 또는 이익의 충돌이없는 선언합니다.

이 프로토콜에서 우리는 빠른 C.를 허용하는 수정 된 무균 액체 미디어 mCeHR을 제시 웜의 다수의 생산 elegans의 생성. 벌레가 E.을 오염하지 않고 재배로이 매체는 몇 가지 장점을 보여줍니다 대장균이나 세균의 부산물 및 영양 및 독성 학적 연구에 이용 될 수있다. E.의 사용 대장균 또는 연구에서 다른 박테리아는 몇 가지 단점이있다. 예를 들어, 박테리아의 성장은 다양한 조건 하에서 변경 및 박테리아 결과의 해석을 혼동, 정량되는 분자를 대사 할 수있다. 따라서, 이러한 연구를 수행 할 수있는 정의 된 매체의 개발은 매우 유리하다. 비록 C. 엘레는 이전의 연구 (15), C.에서 자란 벌레 액체 매체에서 재배 된 엘레 유지 보수 매체 (CeMM) 우리가 obse 무엇 달리 세대 16...

토양 선충은 예쁜 꼬마 선충은 독극물에 유전학에서 많은 연구에 사용되는 강력한 모델 생물이다. 그 1mm 크기, 사일, 배양 용이성의 신속한 생성 시간 및 큰 자손 번호 따라서 이러한 선충 유전자 및 약리학 화면 1, 2의 호에 이용되어왔다. 연구팀은 척추 시스템에서 보존 분자 경로를 식별하기 위해이 웜을 활용. 이러한 경로는 세포 죽음 신호, 노화 및 대사 경로, 신경계 3-6 (가) 있습니다. 또한, C.의 투명성 엘레 직접 유전자 발현 패턴과 단백질의 현지화를 분석하기 위해 시각화 할 수있는 형광 단백질 기자를 사용하여 유전자 변형 라인의 생성 할 수 있습니다. 많은 연구에서이 선충은 선충의 성장 배지 (NGM) 판을 사용하여 고체 한천 기반 표면 또는 L에서 배양iquid 문화는 음식 소스 7,8로 대장균 시드. 이러한 세균의 음식 소스는 부산물 결과의 해석에 영향을 미치는 세균의 간섭과 생화학 및 독성학 연구를 혼동 할 수 있습니다. , C. 이러한 배합 효과를 피하기 위하여 엘레 음식 소스로 세균없는 상태입니다 무균 액체 매체에서 배양 할 수있다. 이 미디어를 사용하여, 우리는 성공적으로 많은 표준 C에 대한 높은 동기 웜의 수백만을 배양 C.에 차등 규제 유전자의 마이크로 어레이 분석을 포함한 엘레 프로토콜 엘레 다른 헴 농도에 노출, 및 유전자 폭격을 이용한 형질 전환 웜의 제작. 이 매체는 화학적으로 박사 에릭 클레 9 공식화 원래 레시피에서 수정됩니다. 이 mCeHR 미디어를 사용하여, 우리는 성공적으로 헴 항상성에 관여하는 유전자를 발견했습니다, 10 (HRG의)와 같은 헴 반응 유전자를 언급하는 것E. 시드 NGM 한천 플레이트를 사용 정규 성장 조건에서 불가능했다 대장균. 이 프로토콜에서 우리는 C.를 도입하고 유지하기위한 절차를 설명 E. 성장 엘레 콜라이 무균 mCeHR 및 트랜스 제닉 C. 제조 웜의 다수를 구하는 방법이 활용 미세 충격을 사용하여 엘레 라인. C.의 영양 소요량을 결정하기위한 무균 매체 사용의 실용성을 보여 우리 또한 본 연구 엘레 예로 헴을 사용. 이러한 연구는 mCeHR 매체를 사용하여 C. 다수의 급속한 성장을 허용한다는 것을 보여 웜 연구자에 의해 사용 많은 다운 스트림 애플리케이션을위한 엘레.

<table><tbody><tr><td>MgCl2&#8226; 6H2O</td><td>시그마</td><td>M-2393</td><td></td></tr><tr><td>구연산 나트륨</td><td>시그마</td><td>S-4641</td><td></td></tr><tr><td>구연산 칼륨 수화물</td><td>시그마</td><td>P-1722</td><td></td></tr><tr><td>CuCl2&#8226; 2H2O</td><td>피셔</td><td>C455-500</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&#8226; 4H2O</td><td>Fisher</td><td>M87-100</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma</td><td>Z-0152</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NH4)2(SO4)2&#8226; 6H2O</td><td>시그마</td><td>F-1018</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&#8226; 2H2O</td><td>Fisher</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>아데노신 5-모노포스페이트, 나트륨 염</td><td>시그마</td><td>A-1752</td><td></td></tr><tr><td>시티딘 5-인산</td>염 <td>시그마</td><td>C-1006</td><td></td></tr><tr><td>구아노신 2' - 및 3' -모노포스페이</td>트 <td>시그마</td><td>G-8002</td><td></td></tr><tr><td>유리딘 5-인산염, 다이소듐 염</td><td>시그마</td><td>U-6375</td><td></td></tr><tr><td>티민</td><td>시그마</td><td>T0376</td><td></td></tr><tr><td>N-아세틸글루코사민</td><td>시그마</td><td>A3286</td><td></td></tr><tr><td>DL-알라닌</td><td>피셔</td><td>S25648&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>p-아미노벤조산</td><td>, 시그마</td><td>A-9878</td><td></td></tr>, <tr><td>비오틴</td>, <td>시그마</td><td>B-4639</td><td></td></tr>, <tr><td>시아노코발라민(B-12),</td> <td>시그마</td><td>V-2876</td><td></td></tr>, <tr><td>폴리네이트(Ca)</td><td>시그마</td>, <td>F-7878</td><td></td></tr>, <tr><td>나이아신</td>, <td>시그마</td><td>N-0761</td><td></td></tr>, <tr><td>나이아신아마이드</td>, <td>시그마</td><td>N-3376</td><td></td></tr>, <tr><td>판테테인</td><td>시그마</td><td>P-2125</td><td></td></tr><tr><td>판토텐산 (Ca)</td><td>시그마</td><td>P-6292</td><td></td></tr><tr><td>프테로일글루탐산(엽산)</td><td>ACRCS</td><td>21663-0100</td><td></td></tr><tr><td>피리독살 5'-인산</td>염 <td>시그마</td><td>P-3657</td><td></td></tr><tr><td>피리독사민 2HCl</td><td>시그마</td><td>P-9158</td><td></td></tr><tr><td>피리독신 HCl</td><td>시그마</td><td>P-6280</td><td></td></tr><tr><td>리보플라빈 5-PO4(Na)</td><td>Sigma</td><td>R-7774</td><td></td></tr><tr><td>티아민 HCl</td><td>시그마</td><td>T-1270</td><td></td></tr><tr><td>DL-6,8-티옥트산</td><td>시그마</td><td>T-1395</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>콜린 이산 구연산</td><td>시그마</td><td>C-2004</td><td></td></tr><tr><td>myo-Inositol</td><td>시그마</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>D-글루코스</td><td>시그마</td><td>G-7520</td><td></td></tr><tr><td>락트알부민 효소 가수분해물</td><td>시그마</td><td>L-9010</td><td></td></tr><tr><td>뇌 심장 주입</td><td>BD</td><td>211065</td><td></td></tr><tr><td>염화헤민</td><td>프론티어 사이언티픽</td><td>H651-9</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 나트륨 염</td><td>시그마</td><td>H-3784</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>J.T. Baker</td><td>F676-05</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산</td><td>Invitrogen</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>MEM 아미노산 용액</td><td>Invitrogen</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>Nalidixic acid sodium salt</td><td>Sigma</td><td>N4382</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline Hydrochloride</td><td>MP Biomedicals</td><td>2194542</td><td></td></tr><tr><td>Biolistic Delivery System</td><td>BioRad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>금 입자 (Au 분말)&nbsp;</td><td>&nbsp; Ferro Electronic Material Systems</td><td>6420 2504, JZP01010KM</td><td></td></tr><tr><td>또는</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>금 입자 1.0 &mu; m</td><td>바이오라드</td><td>&nbsp; 165-2263</td><td></td></tr></tbody></table>년

배양 예쁜 꼬마 선충 미세 폭격에 의한 무균 액체 미디어 및 형질 전환 웜의 생성에

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

이 프로토콜에서는, 우리는 필요한 자료를 제시하고 수정 C를 만들기위한 절차. 전자 legans 요법 이니 및 재생 미디어 (mCeHR). 또한, C.를 노출하고 순응하는 단계 E. 성장 엘레 액체 매체를 무균하는 대장균이 설명되어 있습니다. 무균 C.를 활용 마지막으로, 하류 실험 엘레이 절차의 장점을 설명한다. C.를 분석하고 결정하는 능력 엘레 영양소의 요구 사항은 다양한 헴 농도와 무균 액체 미디어에 N2 야생 형 웜 성장에 의해 설명되었다. 이 절차는 웜의 성장과 발전을위한 최적 농도를 결정하거나, 약물 치료의 독성 학적 효과를 결정하기 위해 다른 영양소와 함께 복제 할 수 있습니다. 야생 형 웜의 성장에 대한 다양한 헴 농도의 효과는 질적 현미경 관찰을 통해 T를 정량 측정 하였다각 헴 농도에서 성장 웜 그는 수. 또, 다양한 영양소 농도의 효과는 또한 영양소의 변화에​​ 대응 형광 센서를 표현 웜을 이용하여 정량 할 수있다. 또한, 웜의 다수 용이 미립자 포격을 사용하여 트랜스 제닉 C. elegans의 생성을 위해 제작 하였다.

C.를 배양 E.에 의해 생산 차 대사 산물의 간섭없이, 웜에 필요한 영양소의 결정에 무균 액체 배지 에이즈 엘레 대장균. 야생형 N2 웜은 세 세대 내 mCeHR 미디어에 순응하고 NGM 박테리아 접시에서 자란 벌레에 비해 성장을 보여줍니다. 사실, 이러한 웜은 OP50 박테리아 성장 웜 3.5 일에 비해 4 일 안에 임신하는이된다. mCeHR 사용의 한 가지 이점은이 웜 (14)의 정확한 영양 요구를 조사 연구에서 관찰되었다. 그림 1 웜은 mCeHR 1 ㎜까지, 헴의 양을 증가 보충 성장했다. 이러한 웜의 관측 벌레가 L4 유충 단계로 개발하지만 mCeHR 아홉 일 후에 임신하는 단계로 발전 할 수 없습니다와 함께, 4 μM 아래 헴 농도에서 성장에 현저한 지연을 보여 주었다. 10 μM, 20의 농도에서56, M 헴은 웜 4 일 임신하는 단계로 개발하고 자손의 많은 수를 ...

C. elegans의는 일반적으로 고체 한천 플레이트에 성장 또는 액체 문화에서 E. 씨앗을 품고있다 대장균. 독성 및 영양 연구를 혼동에서 세균의 부산물을 방지하기 위해, 우리는 다운 스트림 응용 프로그램의 범위에 대한 웜의 수가 증가하고 동기화, 무균 액체 배지, CeHR을 이용했다.

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

이 절차의 전반적인 목표는 수많은 다운스트림 응용 분야를 위해 CENIC 액체 매체에서 바다의 우아함을 도입하고 성장시키는 것입니다. 이것은 굶주린 한천 판에서 무덤 벌레를 먼저 표백함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 방출된 난자를 항생제와 함께 M-C-E-H-R로 옮기고 7일에서 10일이 걸릴 수 있는 무덤 단계까지 발달하도록 하는 것입니다.세 번째 단계는 무덤을 표백하고 추가 항생제 없이 무덤 단계로 두 번째로 발전할 수 있도록 하는 것입니다. 마지막 단계는 도끼 벌레를 동기화하고 벌레의 성장과 발달을 조사하는 영양 연구에 활용하는 것입니다. 궁극적으로, 결과는 야생의 C형 우아함이 Axe Liquid 매체에서 잘 자라며 M-C-E-H-R 매체를 사용하여 박테리아 부산물 없이 벌레의 영양 요구 사항을 조사할 수 있음을 보여줍니다.한천 판이나 박테리아가 있는 액체 매체에서 벌레를 키우는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 박테리아 부산물을 혼동하지 않고 영양 성분 또는 독소의 효과를 테스트할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 배지 준비와 EMIC 액체 배지에 대한 웜의 초기 적응으로 인해 어려움을 겪을 것입니다. 이 절차는 박테리아 식품 공급원 없이 C elegance가 성장할 수 있도록 하는 M-C-E-H-R-A 액체 매체의 준비에 대해 설명합니다.후드 아래에서 엄격한 멸균 기술을 사용하여 M-C-E-H-R의 구성 요소를 다음 순서로 혼합합니다. 콜린, 다이악산 시트레이트로 시작하여 비타민과 성장 인자로 이어집니다. myo acetol, human chloride를 혼합하고 마지막으로 DI 정수 필터를 0.22 미크론 필터를 통해 흡입하여 M-C-E-H-R 혼합물을 여과합니다.다음 순서로 핵산을 첨가하고 미네랄 믹스, 젖산, 알부민, 가수분해물, 필수 아미노산, 비필수 아미노산, 인산칼륨, deg, 포도당 더미, 나트륨 염 및 DI 물을 혼합합니다. 이제 흡입으로 혼합물을 다시 걸러냅니다. 여과 후 매체에 콜레스테롤을 첨가한 다음 매체 분취액의 pH를 확인합니다.pH는 6에서 6.5 사이여야 합니다. 용액이 올바르게 만들어진 경우 꼼꼼한 멸균 기술을 사용하여 저온 살균 우유의 20% 부피를 M-C-E-H-R 매체에 추가합니다. 미디어를 섭씨 4도에서 보관하십시오.사용 가능한 OP 50 E coli의 대부분을 소비한 GR 웜으로 가득 찬 10개의 60mm NGM 플레이트를 준비하십시오. 이 벌레를 50ml 원뿔형 튜브로 헹굽니다. 플레이트당 5ml의 M nine 버퍼를 사용하여 벌레가 가라앉도록 한 다음 상층액을 조심스럽게 제거합니다.이것을 반복하고십시오, M 9 완충액을 추가해서 2 번 더 헹구고, 벌레가 침전하는 것을 허용하고 상등액을 제거하고, 그 후에 벌레 현탁액에 비교된 벌레 응집체에 0.1 정상적인 염화나트륨의 6개 부피를 지금 추가하고, 5개의 정상적인 수산화나트륨의 1개 부피 및 신선한 표백제의 2개의 부피의 혼합물을 준비하십시오. 해결책: 이 혼합물을 현탁액에 첨가하여 벌레를 표백합니다. 다음 소용돌이, 무덤 벌레가 용해되고 계란 만 현탁액에 남을 때까지 혼합합니다.이 작업은 5분에서 10분 정도 걸립니다. 10 x 대물렌즈와 함께 위상차 현미경을 사용하여 튜브에서 이러한 반응을 모니터링합니다. 난자가 분리되면 800G에서 45초 동안 섭씨 4도에서 펠릿화하고 상등액을 흡인하고 후드에 있는 10ml의 멸균수에 펠릿을 두 번 헹구고 이러한 헹굼을 위해 원심분리와 흡인을 반복합니다.다음으로, 난자를 M-C-E-H-R 배지로 재현탁하고 방출된 난자를 조직 배양 플라스크로 옮깁니다. 테트라사이클린 밀리리터당 100마이크로그램을 플라스크의 난자에 추가합니다. 이 단계는 층류 후드에서 수행해야 합니다.엄격한 멸균 기술을 사용하여 액체 배양물을 섭씨 20도의 인큐베이터로 옮기고 안와 플랫폼에서 배양합니다. 70RPM의 셰이커는 매일 웜 발달을 모니터링합니다. 7일에서 10일 후, 지렁이는 라비 단계로 발달하여 원뿔형 튜브로 옮기고 800G에서 섭씨 4도에서 5분 동안 스윙 버킷 로터로 펠릿화해야 합니다.상등액을 흡입한 후 0.1몰 염화나트륨을 한 부피로 웜 펠릿에 다시 현탁시키고 웜이 5분 동안 얼음 위에 정착하도록 합니다. 이제 앞서 언급 한 표백 절차를 반복하고 cenic 액체 배지에서 계란을 배양하십시오. 이전과 마찬가지로 동맹 지렁이를 배양할 때 멸균 기술을 활용하는 것이 필수적입니다.항생제 사용을 피하면 바다 엘레강스 문화에 실제로 오염 박테리아가 없다는 것을 보장할 수 있습니다. 배양 과정이 과거에도 반복되면 2세대는 배지에서 테트라사이클린을 방출합니다. 이 시점에서 동기화를 위해 동기화된 culture를 준비할 수 있습니다.GR 웜의 백화 후 방출된 알에 10ml의 M nine 버퍼를 추가하고 궤도 플랫폼에서 섭씨 20도에서 밤새 부화하도록 합니다. 다음날 셰이커를 만들고 유충을 800G에서 5분 동안 펠릿화하고 L 유충 하나를 다시 현탁시킵니다. 10ml의 M-C-E-H-R에 현탁액을 25제곱센티미터 플라스크로 옮기고 최대 밀도까지 성장시킵니다.며칠에 한 번씩 기생충의 성장을 점검하는 것은 기생충이 너무 붐비지 않고 매체에서 사용 가능한 영양분을 고갈시키지 않도록 하는 데 필요합니다. axen 벌레 배양액을 저장하기 위해 저장 바이알에 0.5ml의 S 완충액에 벌레 펠렛을 현탁시키고 30% 글리세롤이 함유된 S 완충액 1부피를 추가합니다. 그런 다음 바이알을 섭씨 영하 80도로 옮긴 다음 액체 질소에 장기간 보관하여 벌레를 해동하고 거의 모든 얼음이 녹을 때까지 섭씨 37도에서 바이알을 배양하는 데 약 2분이 걸립니다.그런 다음 멸균 상태에서 M-C-E-H-R 매체로 다시 옮깁니다. M-C-E-H-R 사용의 한 가지 이점은 기생충 발달에 대한 정확한 영양 요구 사항을 조사하는 연구에서 나타났습니다. 웜은 헴의 낮은 최적 및 독성 수준을 결정하기 위해 점점 더 많은 양의 헴이 보충된 M-C-E-H-R에서 성장했습니다.또한, 역헴 반응성 리포터 균주를 사용하여 더 작은 농도 범위에서 기생충의 헴 상태를 간접적으로 평가했습니다. 4마이크로몰 헴에서 자란 이 벌레는 높은 형광을 보였는데, 이는 벌레가 헴이 낮은 환경에 있음을 나타냅니다. 헴 농도가 8 micromolar에 증가될 때, GFP 표정은 감소했다.헴의 농도가 10 마이크로 몰로 증가했을 때, 웜은 GFP 발현이 거의 없었고 헴 20 마이크로 몰에서는 GFP 발현이 나타나지 않았습니다. 이 절차를 시도하는 동안 배양이 에믹인지 확인하고 박테리아 오염을 방지하기 위해 철저한 멸균 기술을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 M-C-E-H-R이 많은 바다의 우아함을 필요로 하는 다양한 응용 분야에 활용할 수 있는 제넥스 바다 우아함 문화를 확립하고 유지할 수 있어야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 유전자 변형 동물을 만들 C. 엘레간스의 생식선에 microinjection의 기법을 보여줍니다.

Microinjection을 사용하여 안정적인 트렌스​​ 제닉 C. 엘레간스의 생성

유전자 변형 벌레는 일반적으로...

트렌스 제닉의 생성 C. 엘레간스 Biolistic 변환에 의해

이 비디오는 예쁜꼬마선충에서 RNAi 처리의 원리를 설명하고 형질전환 웜 균주에서 lin-35를 knockdown하는 프로토콜을 보여줍니다.

예쁜꼬마선충 공급을 위한 RNAi 도금: 대장균에서 표적 dsRNA 발현을 유도하는 기술

우리는 벌레에 amylopathies의 양상을 연구하는 방법을...

<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</emAmylopathy 연구에 대한&gt; 모델 시스템

우리는 배아 C. 대규모 문화 여기 수정 된 프로토콜을 설명 세포 엘레 간스. 배아 C. 엘레이 방법을 사용하여 시험 관내에서 배양 된 세포는, 셀 특정 방식으로 유전자 발현을 차별화하고 다시 요약 나타난다. 직접 셀에 접속하거나, 다른 조직으로부터 특정 세포 유형의 분리를 요구 C. 기법에 적용될 수있다 배양 된 세포 엘레 간스.

배아 배양하는 방법<em&gt; C. 엘레</em&gt; 셀

이 프로토콜은 자외선(UV) 조사를 사용하여 형질전환 염색체 외 배열을 Caenorhabditis elegans 게놈에 통합하기 위한 빠르고 낮은 재료 소모 절차를 설명합니다. 또한, 이 프로토콜은 염색체 외 어레이를 높은 비율로 전송하는 형질전환 라인에 특히 적합합니다.

높은 투과 속도를 가진 염색체 외 배열을 예쁜꼬마선충 게놈에 통합하기 위한 빠른 프로토콜

이 프로토콜에는 꼬마 선 충에서 vivo에서 세포 운명 변환 중 세포질 과정을 공부 하는 방법을 설명 합니다. 유전자 변형 동물, 신경 운명을 유도 하는 전사 인자 체 1의 열 충격 발기인 구동 overexpression와 염색 질 조절 요소 린-53 세균 세포의 신경 프로그래밍을 고갈 RNAi 중재를 사용 하 여 관찰 될 수 있다 vivo에서.<br...

C. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 RNAi 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용

유전적으로 통할 수 있는 선충성 Caenorhabditis elegans는 약물 발견을 위한 간단하고 저렴한 모델로 사용될 수 있습니다. 여기에 설명된 RAS 및 EGFR 단백질의 하류 신호를 억제하는 항암 치료제를 식별하는 프로토콜이 있다.

Caenorhabditis elegans를 사용하여 EGFR 및 RAS 억제제의 식별

Entomopathogenic 선충류는 박테리아와 공생하며 함께 선천적 인 면역 체계를 손상시켜 곤충을 성공적으로 감염시킵니다. 선충류 감염의 유전 적 기초에 대한 연구를 촉진하기 위해 엔토모 병원성 선충류를 유지하고 유 전적으로 조작하는 방법이 설명됩니다.

Entomopathogenic Nematodes 배양 및 유전자 조작

이 프로토콜은 외부 박테리아를 제거하기 위해 감기 마비 및 표면 표백에 이어 박테리아 식민지화 된 Caenorhabditis elegans의 96-well 파괴를 설명합니다. 생성 된 현탁액은 한천 플레이트에 도금되어 많은 수의 개별 웜에서 박테리아 부하의 정확하고 중간 처리량 정량화를 허용합니다.

단일 웜 데이터를 사용하여 예쁜꼬마선충-박테리아 상호작용의 이질성 정량화

여기에서 우리는 평생 생리학적 매개변수 추적 및 형광 정량화를 위해 고체 배지에서 분리된 개별 선충을 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이 배양 시스템에는 동물이 도망가는 것을 방지하기 위해 단일 벌레 우물 주위에 팔미트산 장벽이 포함되어 있어 병원성 박테리아 및 화학적 스트레스 요인을 포함한 혐오적인 개입을 사용할 수 있습니다.

Longitudinal Fluorescence Monitoring and Averseive Interventions를 위한 고체 배지에서 개별 Caenorhabditis elegans 의 장기 배양

배우세요 C. elegans를 무균 액체 배지에서 배양하고 동기화하는 방법을. CeHR 배지를 사용하여 세균 대사산물 없이 영양학적 요구를 정확히 연구할 수 있습니다.

배양 예쁜 꼬마 선충 미세 폭격에 의한 무균 액체 미디어 및 형질 전환 웜의 생성에

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