라벨없는 DNA의 혼성화 분석 용 미세 유체 기반 전기 바이오칩

다음 실험의 전반적인 목표는 미세유체 전기화학 장치를 사용하여 임피던스 스펙트럼에 대한 DNA 혼성화 이벤트의 영향을 관찰하는 것입니다. 이를 위해 전극 센서 어레이를 가능하게 하는 전기화학 칩을 제작하고 미세유체 PDMS 칩을 제작합니다. 마이크로 볼륨 샘플의 도입을 용이하게 하기 위해 두 개의 칩이 함께 결합되고 단일 가닥 DNA 프로브로 기능화됩니다.

그런 다음 DNA 혼성화 시 표적 단일 가닥 DNA가 추가되며, 음전하를 띤 이중 가닥 DNA와 음전하를 띤 시안화물 페리스 시안화물 분자 사이의 더 강한 반발력으로 인해 더 높은 전하 전달 저항이 발생합니다. 궁극적으로 DNA 혼성화 이벤트는 전기화학적 임피던스 스펙트럼의 변화를 측정하여 감지할 수 있습니다. 플레이트 리더 또는 J 시프트 분석법 사용과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 장치가 감도나 특이성을 희생하지 않고 적은 비용으로 적은 시료량으로 동일한 기술을 수행할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 단일 가닥 DNA 염기서열의 이원 역학에 대한 빠른 특이적 DNA 염기서열 스크리닝 및 조사를 가능하게 함으로써 암 연구, 인플루엔자 검출 및 유전 공학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 신속한 고처리량 DNA 혼성화 분석 방법은 복잡한 시료 준비 단계 없이 적은 시료 부피로 수행할 수 있기 때문에 이 기술의 의미는 유전 질환, 다양한 형태의 암 또는 인플루엔자와 같은 특정 DNA 마커가 있는 질병의 진단으로 확장됩니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 마이크로 장치의 개발에는 제어 처리 매개변수와 용액 누출과 같은 문제를 해결하기 위한 반복적인 접근 방식이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

장치 조립 후 전기화학 칩에 금 전극을 패턴화하려면 핀셋으로 빈 프라임 등급 4인치 실리콘 웨이퍼를 잡고 세척 병을 사용하여 웨이퍼 양면 표면을 아세톤, 메탄올, 이소프로판올로 헹굽니다. 이 공정은 이하부터 탈이온수 흐름 하에서 A MI 세척이라고 합니다. 웨이퍼에서 이소프로판올을 헹군 다음 질소 건을 사용하여 웨이퍼를 건조시킵니다.

웨이퍼를 플라즈마 강화 화학 기상 증착 또는 P-E-C-V-D 장비에 로드합니다. 매개 변수를 입력하여 1 마이크로 미터 두께의 이산화 규소 층을 생성하고 DC 스퍼터링 도구를 사용하여 200 옹스트롬 두께의 크롬 층을 웨이퍼에 증착 한 다음 2000 스트롬 두께의 금 층을 증착하여 자동화 된 프로세스를 시작하십시오. 웨이퍼를 스피너에 로드하고 질소 건으로 표면을 닦고 페이스트르 피펫을 사용하여 스핀 PR 하나의 포지티브 포토 레지스트 스핀을 적용하여 약 1.6마이크로미터 두께의 균일한 필름을 만듭니다.

그런 다음 핫 플레이트에서 섭씨 100도에서 1분 동안 웨이퍼를 미리 굽습니다. 포토 레지스트가 있는 웨이퍼를 마스크 얼라이너 장비에 로드합니다. 그런 다음 405나노미터에서 센티미터당 190밀리줄의 노출을 시작하며, 이 경우 마스크 정렬기가 셔터를 열고 설계된 기능을 가진 마스크를 통해 포토 레지스트를 빛에 노출시킵니다.

노출 후 3 5 2 현상액이 들어있는 유리 접시에 웨이퍼를 담그고 부드럽게 흔들면서 30 초 동안 배양합니다. 그런 다음 웨이퍼를 물 흐름으로 헹구고 이전과 같이 질소 건으로 건조시킵니다. 다음으로, 금 에칭 용액이 들어있는 유리 접시에 웨이퍼를 담그고 부드럽게 흔들면서 1.5 분 동안 배양합니다.

그런 다음 웨이퍼를 언급된 크롬이 포함된 유리 접시에 옮기고 웨이퍼의 크롬 자국이 사라질 때까지 부드럽게 흔들면서 배양합니다. 이 작업은 약 30초 정도 걸립니다. 웨이퍼를 디워터로 헹구고 핀셋으로 웨이퍼를 고정하는 질소 건으로 건조시킵니다.

MI 청소 절차를 사용하여 포토 레지스트를 벗겨냅니다. 그런 다음 DI 물로 헹구고 두 겹의 장갑을 착용하고 질소 건으로 말리십시오. 웨이퍼를 피라냐 클린 용액과 함께 테프론 접시에 1분 동안 담급니다.

그런 다음 웨이퍼를 디워터로 헹구고 질소 건으로 건조시킵니다. 다음으로 백금 전극을 패턴화하려면 웨이퍼를 스피너에 로드합니다. 질소 건을 사용하여 표면을 먼지로 만들고 페이스트르 피펫을 사용하여 표면 스핀에 PR 2 개의 포지티브 포토 레지스트를 분배하여 약 1.4 마이크로 미터 두께의 균일 한 필름을 만듭니다.

웨이퍼를 섭씨 100도의 핫 플레이트에 놓고 1분 동안 미리 굽습니다. 사전 베이크 후 포토 마스크를 통해 405나노미터당 30밀리줄의 웨이퍼를 노출시킵니다. 그런 다음 웨이퍼를 섭씨 125도의 핫 플레이트에 놓고 45초 동안 굽습니다.

마스크에서 마스크를 제거하고 정렬기를 사용하여 플러드합니다. 포토 마스크 없이 405나노미터 파장에서 센티미터당 1000밀리줄의 웨이퍼를 노출시킵니다. 노출 후, 6:1 Z 400 K 현상액이 들어있는 유리 접시에 웨이퍼를 담궈 현상합니다.

부드럽게 흔들어 2분 동안 배양합니다. 그런 다음 웨이퍼를 디워터로 헹구고 질소 건으로 건조시킵니다. E-beam 증발 시스템을 사용하여 400 옹스트롬 두께의 티타늄 층을 증착한 다음 웨이퍼에 1600 옹스트롬 두께의 백금 층을 증착합니다.

아세톤으로 채워진 유리 접시에 웨이퍼를 놓고 접시를 초음파 욕조에 5분 동안 넣어 사진을 들어 올립니다. 그런 다음 핀셋으로 웨이퍼를 잡는 것을 저항합니다. 세척 병을 사용하여 웨이퍼의 양쪽 표면을 아세톤으로 헹군 다음 이소프로판올로 헹굽니다.

웨이퍼를 디워터로 헹구고 질소 건으로 건조시킵니다. 분석 채널용 금형을 준비하려면 MI clean 절차로 빈 4인치 테스트 등급 품질 실리콘 웨이퍼를 헹굽니다. 이전과 마찬가지로 웨이퍼의 이소프로판올을 디워터로 헹구고 질소 건으로 건조시킵니다.

웨이퍼를 스피너에 로드하고 질소 건으로 웨이퍼 표면을 닦아내고 파스티 피펫을 사용하여 표면에 PR 3 네거티브 포토 레지스트를 분배하여 약 100마이크로미터 두께의 균일한 필름을 만듭니다. 웨이퍼를 핫 플레이트에 올려 놓고 2단계 베이킹 절차를 사용하여 미리 굽습니다. 먼저 시간당 섭씨 300도에서 실온에서 섭씨 65도까지 온도를 높입니다.

그런 다음 섭씨 65도에서 10분 동안 유지합니다. 시간당 섭씨 300도에서 섭씨 95도까지 상승한 다음 30분 동안 유지합니다. 포토 마스크를 통해 405 나노 미터 파장에서 센티미터 당 2, 500 밀리 줄로 웨이퍼를 노출시킵니다.

그런 다음 웨이퍼를 핫 플레이트에 놓고 시간당 섭씨 300도에서 실온에서 섭씨 95도까지 램프업하여 웨이퍼를 사후 굽습니다. 섭씨 95도에서 10분 동안 유지합니다. 프로필렌 글리콜, 모노메틸 에테르 아세테이트 또는 P-G-M-E-A 현상액이 포함된 유리 접시에 웨이퍼를 담그고 10분 동안 현상시킵니다.

웨이퍼를 이소프로판올로 헹구고 질소 건으로 건조시켜 분석 채널을 제작하여 알루미늄 호일로 금형 웨이퍼 주변의 인클로저를 찾고 경화되지 않은 폴리 디메틸 수복산 또는 PDMS를 금형 위에 천천히 붓습니다. PDMS로 금형을 박스 용광로에서 5분에 걸쳐 실온에서 섭씨 80도까지 온도가 상승하고 17분 동안 섭씨 80도를 유지하는 2단계 베이킹 절차를 사용하여 베이킹합니다. 금형이 냉각된 후 금형에서 PDMS를 떼어내고 알루미늄 호일에 놓습니다.

수술용 칼로 분석 칩을 자르고 여기에 표시된 대로 생검 펀칭 도구로 구멍을 정의합니다. PDMS 분석 채널을 전기화학 칩의 작동 전극에 수동으로 정렬합니다. PDMS는 전기화학 칩에 잘 달라붙어 채널을 밀봉하고 누출을 방지합니다.

수직 마이크로 채널을 기능화하기 위해 짧고 유연한 튜브를 어댑터로 사용하여 유연한 튜브를 플라스틱 엘보우 또는 직선 커넥터에 연결합니다. 단일 가닥 DNA 프로브가 들어 있는 주사기를 튜브에 연결하고 주사기 펌프에 넣습니다. 장치의 펀칭된 전체 입구 각각에 커넥터를 부착합니다.

이 절차의 가장 어려운 측면은 기포를 생성하지 않고 마이크로 채널에서 용액을 흐르게 하는 것입니다. 성공을 보장하려면 용액을 매우 천천히 흐르게 하십시오.채널의 균일한 충전을 달성하려면 시간당 200마이크로리터의 유속으로 펌프를 시작하여 3개의 개별 마이크로 채널 각각을 서로 다른 단일 가닥 DNA 프로브 배양 솔루션으로 천천히 채웁니다. 1시간 동안 배양한 후, 주사기 튜브와 커넥터를 교체하여 마이크로 채널을 PBS로 헹굽니다.다음으로, 주사기 튜브와 커넥터를 교환하여 마이크로 채널을 10 밀리몰 PBS 100 밀리몰 나트륨 및 1.395 밀리몰 TCEP로 구성된 용액으로 마이크로 채널을 채웁니다.

그런 다음 핀셋을 사용하기 전과 같이 PBS로 헹굽니다. PDMS를 수평 방향으로 90도 회전하여 들어 올려 아래로 놓습니다. 이렇게 하면 DNA 혼성화 분석을 위한 고유한 카운터와 기준 전극이 포함된 별도의 반응 챔버 열이 노출됩니다.

Forex 농축 식염수 구연산 나트륨 SSC 버퍼의 제어 측정 솔루션으로 마이크로 채널을 채우는 교환, 주사기 튜브 및 커넥터는 주사기 교환 후 20 분 동안 주사기를 교환하여 마이크로 채널을 PBS 용액에서 5 밀리 몰 페리스 시안화물로 채웁니다. 그런 다음 전기화학 임피던스 분광법 또는 EIS를 통해 다양한 주파수에 대한 전기화학 시스템의 배경 임피던스 값을 기록하려면 프로브 팁을 사용하여 전위 통계를 작동 카운터 및 기준 전극에 연결합니다. EIS 측정 매개변수를 컴퓨터 소프트웨어에 입력한 다음 측정을 시작합니다.

마이크로 채널의 각 작업 전극에 대해 이 측정을 반복하여 각 non-complimentary 및 complimentary single stranded DNA 타겟 교환에 대한 DNA 혼성화를 측정합니다. 주사기 튜브 및 커넥터. 표적 단일 가닥 DNA의 1마이크로몰을 포함하는 4 x 농축 SSC 버퍼로 마이크로 채널을 채우고 20분 동안 배양합니다.

bio chipp cyclic vol의 전기화학적 활성을 검증하기 위해 각 대상 단일 가닥 DNA 용액에 대해 컴퓨터의 소프트웨어로 EIS 측정을 시작하여 측정합니다. 원격 측정 측정은 전기 활성 산화 환원 커플 시안화물 시안화물로 채워진 마이크로 채널에서 수행되었으며, 여기에 표시된 것은 9개의 작동 전극의 고리 부피 텔레그램입니다. 모든 전극에 대한 유사한 모양, 피크 높이 및 피크 분리는 DNA 혼성화 이벤트를 검출하는 바이오칩의 능력을 입증하는 높은 재현성을 보여줍니다.

3개의 단일 가닥 DNA 프로브와 무료 및 비무료 단일 가닥 DNA 표적 사이의 혼성화 이벤트에 대해 전기화학적 임피던스 변화를 측정했으며, 바이오센서의 민감도를 입증하기 위해 무료적 단일 가닥 DNA 표적을 도입하고 프로브와 혼성화할 때 더 높은 전하 전달 저항 변화가 관찰되었습니다. 상보적 단일 가닥 DNA 표적의 다양한 농도가 감지 프로브에 도입되었으며, 여기에 표시된 것은 그래프의 화살표로 표시된 표적 단일 가닥 DNA 농도 증가를 도입한 후 전기화학적 임피던스 분광법 측정의 나이퀴스트 플롯입니다. 증가된 임피던스 값은 이중 가닥 DNA와 페로 시안화물 페리스 시안화물 분자 사이의 더 강한 반발력으로 인해 더 높은 표적, 단일 가닥 DNA 농도에 대해 약 15Hz의 저주파에서 관찰되었습니다.

전반적으로 BIOCHIPS는 DNA 혼성화 이벤트의 존재를 빠르게 감지할 수 있는 능력을 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 미세유체 전기화학 장치를 개발 및 제작하고 DNA 혼성화 이벤트를 감지하는 데 사용하는 방법을 잘 이해해야 합니다. 이 절차를 시도하는 동안 이 절차에 따라 신호 대 간호사 비율, 안정성 및 감도와 같은 다양한 BIOS 매개변수를 최적화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

DNA 돌연변이 조합 및 경쟁과 같은 추가 질문에 답하기 위해 약간 다른 핵산 염기서열을 가진 단일 가닥 DNA 표적의 도입과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 마이크로 제작 공정 솔루션으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 신체의 눈과 손 보호구가 항상 경고해야 한다는 것을 잊지 마십시오.