Name: 라벨없는 DNA의 혼성화 분석 용 미세 유체 기반 전기 바이오칩 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: 배우세요 미세 유체 기반 전기 바이오칩을 이용한 라벨없는 DNA 혼성화 분석 방법입니다. 전기화학 임피던스 분광법으로 3.8 nM의 검출 한계를 달성하며 높은 민감도와 특이성을 제공합니다.

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저자는 금융 지원을위한 로버트 W. 독일어 재단, 국방 위협 감소 기관 (DTRA), 연구의 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 신흥 프론티어와 혁신 (EFRI)을 인정합니다. 저자는 또한 클린 룸 시설 지원을 위해 메릴랜드 Nanocenter과 Fablab 감사합니다.

미세 유체 칩의 1 미세 <ol><li> 전기 칩을 준비 <ol><li> 패턴 골드 ​​전극 <ol><li> 아세톤, 메탄올, 이소프로판올 ( &quot;AMI&quot;청소)와 빈 사 &#39;&#39;실리콘 웨이퍼 (프라임 등급의 품질을) 씻어. N이 총을 건조하여 탈 이온수 (DI)과 웨이퍼의 이소프로판올을 씻어. </li><li> 플라즈마 강화 화학 기상 증착 (PECVD) 도구 1 μm의 두께의 SiO2 보호 층을 성장한다. DC 스퍼터링 도구로 금 2,000 두꺼운 층 다음에 크롬 200 두꺼운 층을 증착. </li><li> 스핀 &quot;PR1&quot;긍정적 인 포토 레지스트 (회전 매개 변수 : 3,000 rpm으로, 1000 RPM / 초, 30 초) 1.6 μm의 두께 균일 한 막 ~을 만들 수 있습니다. 전 빵을 핫 플레이트에 100 ° C에서 1 분 동안 웨이퍼. </li><li> 190 엠제이 / 포토 마스크를 통해 405 nm 파장에서 cm 2 웨이퍼를 노출. DEV (352)에서 30 초 동안 웨이퍼를 개발eloper는 N이 총 DI와 웨이퍼 건조를 씻어. </li><li> 1.5 분 동안 골드 에칭액 금을 에칭. ~ 30 초 동안 크롬에 천트와 크롬 에칭. DI와 웨이퍼를 씻어 N이 총을 건조. </li><li> &quot;AMI&quot;청소 절차에 포토 레지스트를 벗겨. 참고 : 강산 화제 및 폭발 위험. </li><li> 한 H 2 SO 4 : 4 : 4로 웨이퍼를 청소 H 2 O 2 혼합물 ( &quot;피라&quot;클린)을 1 분 동안. DI와 웨이퍼를 씻어 N이 총을 건조. </li></ol></li><li> 패턴 백금 전극 <ol><li> 스핀 &quot;PR2&quot;긍정적 인 포토 레지스트 (회전 매개 변수 : 3,000 rpm으로, 1000 RPM / 초, 30 초) 1.4 μm의 두께 균일 한 막 ~을 만들 수 있습니다. 전 빵을 핫 플레이트에 100 ° C에서 1 분 동안 웨이퍼. </li><li> 30 엠제이 / 포토 마스크를 통해 405 nm 파장에서 cm 2 웨이퍼를 노출. 핫 플레이트에서 125 ° C에서 45 초 동안 웨이퍼를 굽는다. 홍수에 노출1000 엠제이 / 포토 마스크없이 405 nm 파장에서 cm 2 웨이퍼. 6에서 2 분 동안 웨이퍼를 개발 : 1 AZ400K 개발자 및 DI와 웨이퍼를 씻어 N이 총을 건조. </li><li> E-빔 증착 시스템을 이용하여 백금의 1600 두꺼운 층이어서 티탄의 (400)의 두꺼운 층을 증착. </li><li> 아세톤 및 이소프로판올로 세척 한 다음 5 분간 초음파 아세톤 욕조에 포토 레지스트를 들어 올립니다. DI와 웨이퍼를 씻어 N이 총을 건조. </li></ol></li></ol></li><li> 분석 채널을 준비 <ol><li> 분석 채널에 대한 금형을 준비 <ol><li> &quot;AMI&quot;청소 절차에 빈 사 &#39;&#39;실리콘 웨이퍼 (테스트 수준의 품질을) 씻어. DI와 웨이퍼의 이소프로판올을 씻어 것은 N이 총을 건조 하였다. </li><li> 스핀 &quot;PR3&quot;네가티브 포토 레지스트 (2 단계 회전 매개 변수 :. 단계 일 - 600 회전, 120 회전 / 초, 10 초 두 단계 - 1,150 rpm으로, 383 회전 / 초,27 초) 균일 한 막 ~ 100 μm의 두께를 만들 수 있습니다. 전 빵을 핫 플레이트 (2 단계 베이킹 매개 변수에 대한 웨이퍼 :. 단계 일 - 300 ° C / 시간에서 65 ° C로 실온에서 진입로와 10 분 동안 온도를 유지 2 단계 - 95 ° C까지 상승 300 ° C에서 / 시간 30 분 동안 대기 온도). </li><li> 2500 엠제이 / 포토 마스크를 통해 405 nm 파장에서 cm 2 웨이퍼를 노출. 포스트 - 빵을 300 ° C / 시간에서 95 ° C까지 올렸와에 의해 웨이퍼 핫 플레이트에서 10 분 동안 온도를 유지. 프로필렌 글리콜 모노 메틸 에테르 아세테이트 (PGMEA) 개발자에서 10 분 동안 웨이퍼를 개발한다. N이 총을 이소프로판올 건조와 웨이퍼를 씻어. </li></ol></li><li> 분석 채널을 제작합니다 <ol><li> 20 분 동안 진공 챔버에서 1 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 혼합물 (엘라스토머 20g, 경화제 2g)과 완전히 탈기 : 10을 준비한다. </li><li> 알루미늄 호일로 몰드 웨이퍼 주위 인클로저를 정의하고 천천히 부어 PDMS 비경금형 이상. </li><li> 상자로에서 PDMS 몰드와 구우 (2 단계 베이킹 매개 변수 :. 한 단계 - 5 분​​ 80 °로 실온에서 진입로 C 2 단계 - 17 분 동안 80 ° C에서 개최). </li><li> 알루미늄 호일에 금형과 장소에서 껍질 멀리 PDMS. 생검 펀치 도구로 구멍을 정의하고, 외과 의사의 칼을 분석 칩을 잘라. </li></ol></li></ol></li></ol> 2 장치를 조립 <ol><li> 수동으로 전기 칩에 작업 전극 PDMS 분석 채널을 맞 춥니 다. PDMS는 채널을 밀봉하고 누설을 방지, 전기 화학적 칩에 잘 스틱. </li><li> 플라스틱 또는 직쇄 엘보 커넥터 어댑터 (0.1875 OD &#39;및 ID 0.0625&#39;)로 짧은가요 성 관을 사용하여가요 성 호스 (0.087 OD &#39;및 ID 0.015&#39;)에 연결. 장치의 구멍을 천공 입구 각 커넥터를 연결합니다. </li><li> 의 타단에 주사기를 연결튜브 및 주사기 펌프에 주사기를 배치합니다. 교대 부 (3)에서 요구되는 절차 단계 및 해당 용액에 의한 주사기의 세트, 튜브와 커넥터를 변경. </li></ol> 3 DNA 하이브리드 분석 NOTE : 전체 채널이 채워질 때까지 200 μL / hr의 유속으로 각 채널에 천천히 용액을 소개. <ol><li> 다른 ssDNA를 프로브 서열과 각각 수직 마이크로 채널을 기능화 (3 별도 수직 마이크로 평행 수행) <ol><li> 각각 다른 ssDNA를 프로브 배양 용액 마이크로 채우기 (10 mM의 인산 완충액을 100 mM의 염화나트륨, 10 μM 트리스 (2 - 카르복시 에틸) 포스 핀 (TCEP), 및 1 μM 프로브 ssDNA를), 및 마이크로 세정 뒤에 1 시간 동안 배양 PBS와 함께. </li><li> 10 mM의 PBS, 100 mM의 염화나트륨 및 1.395 mM의 TCEP의 버퍼에 6 - 머 캅토 -1 - 헥산 올 (MCH)의 1 ㎜를 포함하는 용액과 함께 인큐 마이크로 채우기1 시간 동안 BATE는 PBS와 마이크로 채널을 세정 하였다. </li></ol></li><li> , PDMS를 들어 올려 수평 방향으로 90 ° 회전하고, 고유의 카운터 및 기준 전극 (그림 S1)를 포함하는 각 행과 반응 챔버의 별도의 행을 노출 아래로 배치합니다. </li><li> 4 배의 제어 계측 솔루션 마이크로는 생리 식염수 구연산 나트륨 (SSC) 버퍼를 집중 입력하고 20 분 동안 배양한다. </li><li> 배경 측정 : (작업, 카운터에 접속 텐쇼을 사용하여, 참조 전극 5 밀리미터가 PBS 용액 / 5 mM의 페로을 시안화하여 마이크로 채우고 (EIS 전기 화학 임피던스 분광법) 다른 주파수에 대한 전기 시스템의 임피던스 값을 기록 EIS 파라미터 : 1 MHz의 0.1 Hz에서, 10 년대 당 주파수 데이터 포인트 25 MV 진폭, 기준 전극에 비해 5 MV 편광) 주파수 범위. 마이크로 채널의 각 작동 전극이 측정을 반복합니다. </리&gt; <li> (각 비 보완 및 보완 ssDNA의 목표를 위해 수행) DNA 혼성화를 측정한다. <ol><li> 4X의 대상 ssDNA를 측정 용액 마이크로 채우기 대상 ssDNA를 1 μM을 포함하는 SSC 완충액을 농축시키고, 20 분 동안 배양한다. 단계 3.4에 기재된 DNA를 측정한다. </li></ol></li></ol>

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우리의 절차는 마이크로 유체 기반의 전기 화학적 바이오 칩의 제조 및 DNA 혼성화 이벤트 분석에 대한 활용도를 보여줍니다. 고 수율 제어 미세 공정을 통해 우리는 전기 화학 센서의 배열과 통합 마이크로 채널로 구성된 장치를 개발한다. 우리는 반복적 인 접근을 통해 전기 화학 칩 및 마이크로 유체 몰드의 포토 리소그래피 절차를위한 제어 처리 파라미터를 고안 하였다. 이 단계는 다른 소형화 분석 장치의 미래 창조에 대한 지침을 제공합니다. 중요한 것은 이러한 신호 대 잡음비, 안정성 및 감도 바이오 센서 등의 각종 파라미터를 최적화하는 방법을 제공한다. 장치의 제조에 이어, 우리 고유 분석 목적을 제공 bioreceptor로 프로브 ssDNA를 가진 전기 화학 센서를 기능화. 이 절차는 낮은 장치 실패율을 입증하지만, 액 누설 majo 것으로 도시장치 및 DNA 혼성화 분석의 성능 동안 조립 다음과 같은 연구에 문제가있을 수 있습니다. 이러한 장치의 결합 실패의 추가 조사는 공정의 수율을 개선하고 마이크로 바이오 시스템 연구에 ...

미세 유체 랩 온어 칩 (LOC) 장치는 임상 진단, 환경 모니터링과 생물 의학 연구에 많은 장점을 제공한다. 이러한 장치는 다양한 절차 1-4 배양 시약 혼합, 결합 친화도 기반, 신호 전달, 세포를 포함하여 이루어질 수있는 칩의 영역에 유체 유동을 제어하기 위해 마이크로 유체 채널을 이용한다. 마이크로 유체는 마이크로 웰 플레이트 판독기 또는 전기 영동 겔 쉬프트 분석 같은 종래의 임상 진단 도구에 비해 많은 장점을 제공한다. 유사한 분석을 수행하기 위해 더 적은 시약 (㎕의 반대로 나노 리터) 미세 유동 장치는 크기가 2 ~ 3 명령을 필요로한다. 또한, 이러한 장치는 어떤 이벤트가 생물학적 5,6 채널 내의 종의 작은 한정으로 인해 발생할 수있는 속도를 증가시킬 수있다. 셋째, 센서는 라벨없는 detectio를 제공 할 수 리소그래피 및 에칭 기술을 이용하여 미세 유동 장치 내에 통합 될 수있다명. 마지막으로, 이러한 장치는 생산 및 7-10를 작동 할 수있는 기술자의 입장에서 약간의 작업을 필요로 저렴하다. 라벨없는 검출은 일반적으로 광학 또는 전기 변환기를 사용하여 수행됩니다. 광학 장치에 의한 샘플 분석 물과 저급 간섭 나은 감지 성능을 제공 할 수있다. 그럼에도 불구하고, 그 성능은 샘플의 배경 센서 (11)와 동일한 공진 파장을 갖는 경우에 노출된다. 마이크로 유체 시스템에서 생물학적 및 화학적 검출을 수행하는 전기적인 신호를 이용하여 여러 가지 장점이있다. 이러한 센서는 일반적으로 만 작동 전극 패턴을 필요로하기 때문에 제조는 본질적으로 덜 복잡하다. 다른 양상 신호가 신호 12-15 변환 변환기를 동시에 요구할 수있다 또한, 전기 신호는 대부분 직접 측정 장비와 인터페이스 될 수있다. 전기 센서는 일반적으로 impedanc 변화를 측정전자 (16, 17), 용량 (18), 또는 산화 환원 활동 19. 이러한 시스템의 소형화 아르 그러나 새로운 도전이되게됩니다. 극복하는 가장 중요한 과제는 포함한다 : 샘플 준비 및 (인해 낮은 샘플 볼륨과 레이놀즈 수에) 유체의 혼합, 물리적 및 화학적 효과 (모세관 력을 포함하여, 표면 거칠기, 건축 자재 및 분석 간의 화학적 상호 작용), 낮은 신호 대를 복잡한 생물학적 시료 (예, 혈액 및 타액)에서 전기 활성 분석에서 20-23, 및 잠재적 인 간섭 (감소 된 표면적과 체적에 의해 제조) 잡음비. 이러한 효과의 추가 조사는 전반적인 성능을 개선 할 재현 방식으로이 장치의 정확한 제조 및 운영 가이드 라인에서 발생합니다. DNA 혼성화 검출 유전 질환과 24,25 canc 다양한 형태를 진단하기 위해 광범위하게 사용된다어 26. 매년 독감의 여러 균주 DNA 하이브리드 기술 (27)의 결과를 사용하는 환자에서 식별됩니다. 인플루엔자 바이러스는 미국에서만 28에서 36,000 사망자 매년를 차지한다. 이러한 예는 민감도 나 특이도를 희생하지 않고 낮은 샘플 볼륨 플레이트 리더 또는 젤 시프트 분석으로하고 적은 비용으로 동일한 분석 기법을 수행 할 수있는 벤치 탑 미세 유체 장치에서 혜택을 누릴 수 있습니다. 인해 라벨없는 전기 화학 센싱 많은 장점으로이를 DNA 혼성화 29,30 이벤트의 검출을 위해 광범위하게 사용되고있다. (mm 범위에서) 매크로 스케일 전극 관심 커 용액에 침지되어 설치 그들의 상보 서열과 일치하는 단일 가닥 DNA 서열의 결합 동력학에 대하여 매우 중요한 데이터를 제공하는데 사용될 수있다. 최근 MICR에서 전기 화학적 감지 기능을 통합의 몇 가지 발전이 있었다DNA 혼성화 용 ofluidics. 연구는 혼성화 반응 속도 (31)과 미세 유체 채널에서 검출 (15)에 대한 센서의 통합에 대해 수행되었다. 그러나, 여전히 복잡한 샘플 준비 단계없이 병렬 DNA 혼성화 이벤트를 분석 할 수있는 빠른 처리량 미세 유체 소자에 대한 요구가 존재한다. 본 연구에 제시된 장치는 다수의 상호 작용이 평행 복잡한 샘플 준비 단계없이 상영 할 수있는 플랫폼을 제공한다. 우리 프로토콜은 전기 화학적 바이오 칩은 미세 전자 기계 시스템 (MEMS) 기술 (32, 33)와 마이크로 제조되는 방법 마이크로 유체 기반 나타낸다. 우리는 전극 어레이로 구성 (PDMS), 폴리 디메틸 실록산으로 만들어진 마이크로 유체 칩, 및 전기 화학 칩 모두의 제조 공정을 설명한다. ssDNA의 프로브와 바이오 칩의 화학 작용도 해결됩니다. 마지막으로, ABIL구체적 ssDNA를 타겟을 검출하고 분석하는 바이오 센서의 성만이 설명된다. 전반적으로, 마이크로 유체 기반 전기 화학적 바이오 칩은 신속하고 높은 처리량 분석 기술이다. 이는 생물학적 분자와 전도성 센서 사이의 상호 작용을 조사하기 위해 사용될 수 있고, 랩 온어 칩 다양한 애플리케이션에 이용 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>4 "실리콘 웨이퍼</td><td>Ultrasil</td><td>4-5664</td><td>단면 연마; P 형; 붕소 도핑; 방향 1-0-0; 두께 500 미크론; 저항 10-20 옴&미드닷; cm</td></tr><tr><td>Shipley 1813 포토레지스트 ("PR1")</td><td>Microchem</td><td></td><td>포지티브 포토레지스트</td></tr><tr><td>AZ5214 포토레지스트 ("PR2")</td><td>Hoechst Celanse</td><td></td><td>포지티브 포토레지스트</td></tr><tr><td>SU-8 50 포토레지스트 ("PR3")Microchem</td><td></td><td></td> <td>네거티브 포토레지스트</td></tr><tr><td>Gold etchant</td><td>Transene</td><td>TFA</td><td>No dilution</td></tr><tr><td>Chromium etchant</td><td>Transene</td><td>1020AC</td><td>희석 없음</td></tr><tr><td>PDMS 엘라스토머</td><td>Dow Corning</td><td>3097366 1004</td><td></td></tr><tr><td>PDMS 경화제</td><td>Dow Corning</td><td>3097358 1004</td><td></td></tr><tr><td>생검 펀칭 도구</td><td>Healthlink</td><td>BP20</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 유연한 튜빙</td><td>Cole Parmer&nbsp;</td><td>R 3603</td><td>0.015"</td></tr><tr><td>Tygon 유연한 어댑터</td><td>Cole Parmer&nbsp;</td><td>06417-41</td><td>0.0625"</td></tr><tr><td>1 ml 주사기</td><td>Beckton-Dickenson</td><td>301025</td><td></td></tr><tr><td>일염기성 인산칼</td>륨 <td>플루카</td><td>1551139</td><td></td></tr><tr><td>인산이염기성 무수</td><td>시그마</td><td>RES20765-A7</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>트리스(2-카르복시에틸)포스핀</td><td>알드리치</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>6-메르캅토-1-헥산올</td><td>알드리치</td><td>451088</td><td></td></tr><tr><td>20x 농축 식염수-구연산나트륨 완충액</td><td>시그마</td><td>93017</td><td></td></tr><tr><td>칼륨 헥사시아노페레이트(III)</td><td>알드리치</td><td>455946</td><td></td></tr><tr><td>상보적 ssDNA #1</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>100 nmole DNA oligo</td><td>5'-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3'</td></tr><tr><td>표적 ssDNA #2</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>100 nmole DNA oligo</td><td>5'-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3'</td></tr><tr><td>상보적인 ssDNA #2</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>100 nmole DNA oligo</td><td>5'-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3'</td></tr><tr><td>표적 ssDNA #3</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>100 nmole DNA oligo</td><td>5'-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3'</td></tr><tr><td>상보적 ssDNA #3</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>100 nmole DNA oligo</td><td>5'-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3'</td></tr><tr><td colspan="4">Instrument</td></tr><tr><td>Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD)</td><td>Oxford Instruments</td><td>PlasmaLab System 100</td><td>챔버 압력 1,000 mTorr, Tempreture 200 &#176; C, RF 전력 20W, 가스: a) N2O 유량 710sccm; b) 5 % SiH 4 및 95 % N2 가스 유량 170 sccm, SiO2 성장률 690 &# 197; / min.</td></tr><tr>크롬을 위한 <td>DC 침을 튀기기 단위</td><td>AJA 국제적인</td><td>ATC 1800-V</td><td>: 약실 압력 10 mTorr, 아르곤 흐름율 20 sccm, 공급된 DC 힘 200 W, 스퍼터링 속도 10 nm/min. 금의 경우: 챔버 압력 10mTorr, 아르곤 유량 20sccm, 공급 DC 전원 200W, 스퍼터 속도 36nm/min.</td></tr><tr><td>E-빔 증발 시스템</td><td>Denton</td><td>티타늄용 맞춤 제작</td><td>: 챔버 압력 < 2 x 10-6 Torr, e-gun에 전원 공급 7.5 kW, 필라멘트 전류 150-200 mA, 증발 속도 6-10 &#197;/sec. 백금의 경우: 챔버 압력 < 2 x 10-6 Torr, e-gun에 전원 공급 7.5 kW, 필라멘트 전류 150-200 mA, 증발 속도 2-3 &#197;/sec.</td></tr><tr><td>Potentiostat</td><td>CH Instruments</td><td>660D</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>KD Scientific</td><td>KDS230</td><td></td></tr></tbody></table>

라벨없는 dna의 혼성화 분석 용 미세 유체 기반 전기 바이오칩

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

마이크로 규모로 분석 벤치 탑 절차의 소형화는, 반응 시간, 비용, 및 사전 처리 단계의 통합에 관해서 상당한 이점을 제공한다. 그것은 치료 시점에서 각종 질병에 대한 바이오 마커의 실시간 평가를위한 기술을 제공하기 때문에 DNA 혼성화 사건의 분석으로 이들 장치를 이용하는 것이 중요하다. 그러나, 디바이스 풋 프린트는 다양한 물리적 현상 증가의 지배력을 감소시킨다. 이러한 현상은 가공 정밀도 및 장치의 작동 안정성에 영향을 미친다. 따라서, 정확하게 전반적인 성능을 개선하기 위해 재생 가능한 방식으로 이러한 장치를 제작하고 운영하는 중대한 필요성이 존재한다. 여기서, 우리는 프로토콜과 제조 및 DNA 혼성화 사건의 정확한 분석 용 미세 유체 기반 전기 화학적 바이오 칩의 동작에 사용되는 방법을 설명한다. 바이오 칩은 두 부분으로 구성되어있다 : 미세 유체 칩세 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)로 이루어지는 병렬 마이크로 채널, 3 × 3 배열 된 전기 마이크로 칩. DNA 혼성화 이벤트는 전기 화학 임피던스 분광법 (EIS) 분석을 이용하여 검출된다. EIS 분석이 길이 규모에서 지배적 인 전기 시스템의 특성의 모니터링 변화를 가능하게한다. 바이오 센서와 양 전하 전송 및 diffusional 저항의 변화를 모니터링 할 수있는 능력으로, 우리는 20 분 다음 상보 ssDNA를 대상으로 선택성, 3.8 ㎚의 계산 된 검출 한계, 및 다른 비 - 상보 ssDNA를 가진 13 % 교차 반응성을 보여 배양. 이 방법론은 마이크로 스케일 레짐에서 확산 동작에 의해 해명 및 DNA 혼성화 사건의 조사를 가능하게하여 소형화 된 장치의 성능을 향상시킬 수있다.

실험 장치의 제어 및 정확한 제조 공정이 연구에서 중요하다. 이 연구원은 재현성 및 높은 처리량 실험을 얻을 수 있습니다. 여기에서 우리는 마이크로 유체 기반의 전기 화학적 바이오 칩 (그림 1)의 높은 수율, 높은 재현성의 미세 공정을 증명하고있다. 낮은 실패율로, 몇몇 디바이스는 액 유출로 이어질 접합 문제를 보였다. 바이오칩의 전기 화학적 활성을 검증하기 위해, 순환 전압 전류 법 측정은 전기 활성 산화 환원 커플 페리 시안화 / 페로로 채워진 마이크로 채널에서 수행된다. 2 칩상의 구 다른 작용 극의 재생 가능한 전기 화학 반응을 보여준다. 이러한 결과는 전기 화학적 활성이 높은 처리량 측정을 허용하는 바이오칩의 모든 구 챔버에서 동일한 것을 나타낸다. 대부분의 DNA 혼성화 센서 ss​​DNA를 고정화센서 표면에 프로브. 금 패턴에 마이크로 유체 장치를위한 감지 전극을 사용함에...

우리는 DNA 혼성화 검출을위한 미세 유체 기반 전기 바이오칩을 제시한다. ssDNA를 프로브 작용에 따라, 특이도, 민감도 및 검출 한계 보완 및 비 보완 ssDNA를 목표로 공부하고 있습니다. 결과는 3.8 nm의 검출 한계와 함께, 전기 화학적 시스템의 DNA 혼성화 이벤트의 영향을 예시한다.

라벨없는 DNA의 혼성화 분석 용 미세 유체 기반 전기 바이오칩

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

다음 실험의 전반적인 목표는 미세유체 전기화학 장치를 사용하여 임피던스 스펙트럼에 대한 DNA 혼성화 이벤트의 영향을 관찰하는 것입니다. 이를 위해 전극 센서 어레이를 가능하게 하는 전기화학 칩을 제작하고 미세유체 PDMS 칩을 제작합니다. 마이크로 볼륨 샘플의 도입을 용이하게 하기 위해 두 개의 칩이 함께 결합되고 단일 가닥 DNA 프로브로 기능화됩니다.그런 다음 DNA 혼성화 시 표적 단일 가닥 DNA가 추가되며, 음전하를 띤 이중 가닥 DNA와 음전하를 띤 시안화물 페리스 시안화물 분자 사이의 더 강한 반발력으로 인해 더 높은 전하 전달 저항이 발생합니다. 궁극적으로 DNA 혼성화 이벤트는 전기화학적 임피던스 스펙트럼의 변화를 측정하여 감지할 수 있습니다. 플레이트 리더 또는 J 시프트 분석법 사용과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 장치가 감도나 특이성을 희생하지 않고 적은 비용으로 적은 시료량으로 동일한 기술을 수행할 수 있다는 것입니다.이 방법은 단일 가닥 DNA 염기서열의 이원 역학에 대한 빠른 특이적 DNA 염기서열 스크리닝 및 조사를 가능하게 함으로써 암 연구, 인플루엔자 검출 및 유전 공학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 신속한 고처리량 DNA 혼성화 분석 방법은 복잡한 시료 준비 단계 없이 적은 시료 부피로 수행할 수 있기 때문에 이 기술의 의미는 유전 질환, 다양한 형태의 암 또는 인플루엔자와 같은 특정 DNA 마커가 있는 질병의 진단으로 확장됩니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 마이크로 장치의 개발에는 제어 처리 매개변수와 용액 누출과 같은 문제를 해결하기 위한 반복적인 접근 방식이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.장치 조립 후 전기화학 칩에 금 전극을 패턴화하려면 핀셋으로 빈 프라임 등급 4인치 실리콘 웨이퍼를 잡고 세척 병을 사용하여 웨이퍼 양면 표면을 아세톤, 메탄올, 이소프로판올로 헹굽니다. 이 공정은 이하부터 탈이온수 흐름 하에서 A MI 세척이라고 합니다. 웨이퍼에서 이소프로판올을 헹군 다음 질소 건을 사용하여 웨이퍼를 건조시킵니다.웨이퍼를 플라즈마 강화 화학 기상 증착 또는 P-E-C-V-D 장비에 로드합니다. 매개 변수를 입력하여 1 마이크로 미터 두께의 이산화 규소 층을 생성하고 DC 스퍼터링 도구를 사용하여 200 옹스트롬 두께의 크롬 층을 웨이퍼에 증착 한 다음 2000 스트롬 두께의 금 층을 증착하여 자동화 된 프로세스를 시작하십시오. 웨이퍼를 스피너에 로드하고 질소 건으로 표면을 닦고 페이스트르 피펫을 사용하여 스핀 PR 하나의 포지티브 포토 레지스트 스핀을 적용하여 약 1.6마이크로미터 두께의 균일한 필름을 만듭니다.그런 다음 핫 플레이트에서 섭씨 100도에서 1분 동안 웨이퍼를 미리 굽습니다. 포토 레지스트가 있는 웨이퍼를 마스크 얼라이너 장비에 로드합니다. 그런 다음 405나노미터에서 센티미터당 190밀리줄의 노출을 시작하며, 이 경우 마스크 정렬기가 셔터를 열고 설계된 기능을 가진 마스크를 통해 포토 레지스트를 빛에 노출시킵니다.노출 후 3 5 2 현상액이 들어있는 유리 접시에 웨이퍼를 담그고 부드럽게 흔들면서 30 초 동안 배양합니다. 그런 다음 웨이퍼를 물 흐름으로 헹구고 이전과 같이 질소 건으로 건조시킵니다. 다음으로, 금 에칭 용액이 들어있는 유리 접시에 웨이퍼를 담그고 부드럽게 흔들면서 1.5 분 동안 배양합니다.그런 다음 웨이퍼를 언급된 크롬이 포함된 유리 접시에 옮기고 웨이퍼의 크롬 자국이 사라질 때까지 부드럽게 흔들면서 배양합니다. 이 작업은 약 30초 정도 걸립니다. 웨이퍼를 디워터로 헹구고 핀셋으로 웨이퍼를 고정하는 질소 건으로 건조시킵니다.MI 청소 절차를 사용하여 포토 레지스트를 벗겨냅니다. 그런 다음 DI 물로 헹구고 두 겹의 장갑을 착용하고 질소 건으로 말리십시오. 웨이퍼를 피라냐 클린 용액과 함께 테프론 접시에 1분 동안 담급니다.그런 다음 웨이퍼를 디워터로 헹구고 질소 건으로 건조시킵니다. 다음으로 백금 전극을 패턴화하려면 웨이퍼를 스피너에 로드합니다. 질소 건을 사용하여 표면을 먼지로 만들고 페이스트르 피펫을 사용하여 표면 스핀에 PR 2 개의 포지티브 포토 레지스트를 분배하여 약 1.4 마이크로 미터 두께의 균일 한 필름을 만듭니다.웨이퍼를 섭씨 100도의 핫 플레이트에 놓고 1분 동안 미리 굽습니다. 사전 베이크 후 포토 마스크를 통해 405나노미터당 30밀리줄의 웨이퍼를 노출시킵니다. 그런 다음 웨이퍼를 섭씨 125도의 핫 플레이트에 놓고 45초 동안 굽습니다.마스크에서 마스크를 제거하고 정렬기를 사용하여 플러드합니다. 포토 마스크 없이 405나노미터 파장에서 센티미터당 1000밀리줄의 웨이퍼를 노출시킵니다. 노출 후, 6:1 Z 400 K 현상액이 들어있는 유리 접시에 웨이퍼를 담궈 현상합니다.부드럽게 흔들어 2분 동안 배양합니다. 그런 다음 웨이퍼를 디워터로 헹구고 질소 건으로 건조시킵니다. E-beam 증발 시스템을 사용하여 400 옹스트롬 두께의 티타늄 층을 증착한 다음 웨이퍼에 1600 옹스트롬 두께의 백금 층을 증착합니다.아세톤으로 채워진 유리 접시에 웨이퍼를 놓고 접시를 초음파 욕조에 5분 동안 넣어 사진을 들어 올립니다. 그런 다음 핀셋으로 웨이퍼를 잡는 것을 저항합니다. 세척 병을 사용하여 웨이퍼의 양쪽 표면을 아세톤으로 헹군 다음 이소프로판올로 헹굽니다.웨이퍼를 디워터로 헹구고 질소 건으로 건조시킵니다. 분석 채널용 금형을 준비하려면 MI clean 절차로 빈 4인치 테스트 등급 품질 실리콘 웨이퍼를 헹굽니다. 이전과 마찬가지로 웨이퍼의 이소프로판올을 디워터로 헹구고 질소 건으로 건조시킵니다.웨이퍼를 스피너에 로드하고 질소 건으로 웨이퍼 표면을 닦아내고 파스티 피펫을 사용하여 표면에 PR 3 네거티브 포토 레지스트를 분배하여 약 100마이크로미터 두께의 균일한 필름을 만듭니다. 웨이퍼를 핫 플레이트에 올려 놓고 2단계 베이킹 절차를 사용하여 미리 굽습니다. 먼저 시간당 섭씨 300도에서 실온에서 섭씨 65도까지 온도를 높입니다.그런 다음 섭씨 65도에서 10분 동안 유지합니다. 시간당 섭씨 300도에서 섭씨 95도까지 상승한 다음 30분 동안 유지합니다. 포토 마스크를 통해 405 나노 미터 파장에서 센티미터 당 2, 500 밀리 줄로 웨이퍼를 노출시킵니다.그런 다음 웨이퍼를 핫 플레이트에 놓고 시간당 섭씨 300도에서 실온에서 섭씨 95도까지 램프업하여 웨이퍼를 사후 굽습니다. 섭씨 95도에서 10분 동안 유지합니다. 프로필렌 글리콜, 모노메틸 에테르 아세테이트 또는 P-G-M-E-A 현상액이 포함된 유리 접시에 웨이퍼를 담그고 10분 동안 현상시킵니다.웨이퍼를 이소프로판올로 헹구고 질소 건으로 건조시켜 분석 채널을 제작하여 알루미늄 호일로 금형 웨이퍼 주변의 인클로저를 찾고 경화되지 않은 폴리 디메틸 수복산 또는 PDMS를 금형 위에 천천히 붓습니다. PDMS로 금형을 박스 용광로에서 5분에 걸쳐 실온에서 섭씨 80도까지 온도가 상승하고 17분 동안 섭씨 80도를 유지하는 2단계 베이킹 절차를 사용하여 베이킹합니다. 금형이 냉각된 후 금형에서 PDMS를 떼어내고 알루미늄 호일에 놓습니다.수술용 칼로 분석 칩을 자르고 여기에 표시된 대로 생검 펀칭 도구로 구멍을 정의합니다. PDMS 분석 채널을 전기화학 칩의 작동 전극에 수동으로 정렬합니다. PDMS는 전기화학 칩에 잘 달라붙어 채널을 밀봉하고 누출을 방지합니다.수직 마이크로 채널을 기능화하기 위해 짧고 유연한 튜브를 어댑터로 사용하여 유연한 튜브를 플라스틱 엘보우 또는 직선 커넥터에 연결합니다. 단일 가닥 DNA 프로브가 들어 있는 주사기를 튜브에 연결하고 주사기 펌프에 넣습니다. 장치의 펀칭된 전체 입구 각각에 커넥터를 부착합니다.이 절차의 가장 어려운 측면은 기포를 생성하지 않고 마이크로 채널에서 용액을 흐르게 하는 것입니다. 성공을 보장하려면 용액을 매우 천천히 흐르게 하십시오.채널의 균일한 충전을 달성하려면 시간당 200마이크로리터의 유속으로 펌프를 시작하여 3개의 개별 마이크로 채널 각각을 서로 다른 단일 가닥 DNA 프로브 배양 솔루션으로 천천히 채웁니다. 1시간 동안 배양한 후, 주사기 튜브와 커넥터를 교체하여 마이크로 채널을 PBS로 헹굽니다.다음으로, 주사기 튜브와 커넥터를 교환하여 마이크로 채널을 10 밀리몰 PBS 100 밀리몰 나트륨 및 1.395 밀리몰 TCEP로 구성된 용액으로 마이크로 채널을 채웁니다.그런 다음 핀셋을 사용하기 전과 같이 PBS로 헹굽니다. PDMS를 수평 방향으로 90도 회전하여 들어 올려 아래로 놓습니다. 이렇게 하면 DNA 혼성화 분석을 위한 고유한 카운터와 기준 전극이 포함된 별도의 반응 챔버 열이 노출됩니다.Forex 농축 식염수 구연산 나트륨 SSC 버퍼의 제어 측정 솔루션으로 마이크로 채널을 채우는 교환, 주사기 튜브 및 커넥터는 주사기 교환 후 20 분 동안 주사기를 교환하여 마이크로 채널을 PBS 용액에서 5 밀리 몰 페리스 시안화물로 채웁니다. 그런 다음 전기화학 임피던스 분광법 또는 EIS를 통해 다양한 주파수에 대한 전기화학 시스템의 배경 임피던스 값을 기록하려면 프로브 팁을 사용하여 전위 통계를 작동 카운터 및 기준 전극에 연결합니다. EIS 측정 매개변수를 컴퓨터 소프트웨어에 입력한 다음 측정을 시작합니다.마이크로 채널의 각 작업 전극에 대해 이 측정을 반복하여 각 non-complimentary 및 complimentary single stranded DNA 타겟 교환에 대한 DNA 혼성화를 측정합니다. 주사기 튜브 및 커넥터. 표적 단일 가닥 DNA의 1마이크로몰을 포함하는 4 x 농축 SSC 버퍼로 마이크로 채널을 채우고 20분 동안 배양합니다.bio chipp cyclic vol의 전기화학적 활성을 검증하기 위해 각 대상 단일 가닥 DNA 용액에 대해 컴퓨터의 소프트웨어로 EIS 측정을 시작하여 측정합니다. 원격 측정 측정은 전기 활성 산화 환원 커플 시안화물 시안화물로 채워진 마이크로 채널에서 수행되었으며, 여기에 표시된 것은 9개의 작동 전극의 고리 부피 텔레그램입니다. 모든 전극에 대한 유사한 모양, 피크 높이 및 피크 분리는 DNA 혼성화 이벤트를 검출하는 바이오칩의 능력을 입증하는 높은 재현성을 보여줍니다.3개의 단일 가닥 DNA 프로브와 무료 및 비무료 단일 가닥 DNA 표적 사이의 혼성화 이벤트에 대해 전기화학적 임피던스 변화를 측정했으며, 바이오센서의 민감도를 입증하기 위해 무료적 단일 가닥 DNA 표적을 도입하고 프로브와 혼성화할 때 더 높은 전하 전달 저항 변화가 관찰되었습니다. 상보적 단일 가닥 DNA 표적의 다양한 농도가 감지 프로브에 도입되었으며, 여기에 표시된 것은 그래프의 화살표로 표시된 표적 단일 가닥 DNA 농도 증가를 도입한 후 전기화학적 임피던스 분광법 측정의 나이퀴스트 플롯입니다. 증가된 임피던스 값은 이중 가닥 DNA와 페로 시안화물 페리스 시안화물 분자 사이의 더 강한 반발력으로 인해 더 높은 표적, 단일 가닥 DNA 농도에 대해 약 15Hz의 저주파에서 관찰되었습니다.전반적으로 BIOCHIPS는 DNA 혼성화 이벤트의 존재를 빠르게 감지할 수 있는 능력을 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 미세유체 전기화학 장치를 개발 및 제작하고 DNA 혼성화 이벤트를 감지하는 데 사용하는 방법을 잘 이해해야 합니다. 이 절차를 시도하는 동안 이 절차에 따라 신호 대 간호사 비율, 안정성 및 감도와 같은 다양한 BIOS 매개변수를 최적화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.DNA 돌연변이 조합 및 경쟁과 같은 추가 질문에 답하기 위해 약간 다른 핵산 염기서열을 가진 단일 가닥 DNA 표적의 도입과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 마이크로 제작 공정 솔루션으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 신체의 눈과 손 보호구가 항상 경고해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 미래의 핵산 기반 치료제를위한 균일한 및 사용자 정의 polyplexes보다 제어하고 합성을 제공하는 것으로 예상된다 고분자 전해질의 polyplexes의 형성을 조사하기 위해 nanophotonics (QD - 걱정)와 microfluidics의 소설과 강력한 통합을 제시한다.

결합 QD - 걱정과 Microfluidics 실시간으로 DNA의 Nanocomplex 자체 어셈블리를 모니터하기 위해

"E - DNA"센서는 reagentless, 혈액 및 기타 복잡한 매트릭스에서 직접 도전 경우에도 실적이 전기 biosensors은 핵산, 단백질과 작은 분자 analytes 다양한 범위의 감지 적응되었습니다. 여기에는 센서의 제조 및 사용에 대한 일반적인 절차를 제시한다.

핵산, 단백질과 작은 분자의 Reagentless 감지를위한 전기 -의 DNA Biosensors의 제작

이 비디오에서는 자동화된 모세관 전기영동을 사용하여 cell-free DNA 또는 cfDNA 단편의 크기 분포를 분석합니다. 이 기술은 세포사멸 중에 암세포에서 방출되는 DNA 단편의 프로파일에 대한 통찰력을 얻는 데 도움이 됩니다.

CFDNA의 자동화된 모세관 전기영동 기반 단편 크기 분포 분석: 생체 유체에서 분리된 DNA 단편의 크기 분포를 연구하기 위한 DNA 마이크로칩 기반 방법

이 비디오는 희귀 전사체 변이체를 검출하는 데 유용한 디지털 PCR 기술의 변형인 칩 기반 디지털 PCR을 보여줍니다. PCR 반응은 나노유체 칩의 챔버로 분할되며, 각 챔버는 독립적인 반응으로 작용합니다. 증폭된 표적이 있는 챔버에서 형광 신호를 감지하면 샘플에 희귀한 전사체 변이체가 존재함을 확인할 수 있습니다.

나노유체 칩을 사용하여 희귀한 전사체 변이체를 검출하는 칩 기반 디지털 PCR

통합 마이크로 열가소성 칩은 분자 진단으로 사용하기 위해 개발되었습니다. 이 칩은 핵산 추출, 역 transcriptase 및 PCR을 수행합니다. 제조 및 칩을 실행하기위한 방법은 설명되어 있습니다.

마이크로 유체 칩 제작 및 인플루엔자을 감지하는 방법

이 문서에서 우리는 단일 세포 분석을위한 마이크로 유체 칩을 제시한다. 그것은 수있는 세포 내 단백질, 효소, 조효소, 형광 분석이나 면역에 의해 두 번째 메신저의 정량화.

단일 세포의 다목적 화학 분석을위한 미세 유체 칩

우리는 순차적으로 온 - 칩 bioorthogonal 사이클로 화학 및 항체 - 항원 캡처를 사용하여 작은 분자의 빠른 가역적 고정화 및 표면 플라스 몬 공명 (SPR) 연구를위한 기능화 나노 입자 어셈블리에 대한 방법을 제시한다.

역으로 작은 분자 또는 바이오 센서 애플리케이션을위한 다중 구성 요소 구조를 무력화하는 미세 유체 온칩 캡처 - 고리 화 반응

이 비디오 문서는 두 개의 구성 요소 시스템 응답 레귤레이터 유전자 표적 및 결합 부위를 결정하기 위해 시험 관내 마이크로 어레이 기반의 방법을 설명한다.

세균에 대한 두 개의 구성 요소 규제 시스템을 유전자 표적을 확인하는 DNA 친화력 - 정제 칩 (DAP-칩) 방법

우리는 다수의 미세 채널에서 입자의 검출 및 사이징 다중화, 코드 분할 다중 접속 (CDMA)과 저항 펄스 센서 (RPS)를 결합하는 집적 표면 전극 네트워크와 미세 유체 플랫폼을 보여준다.

입자의 공간 추적을위한 멀티 플렉스 전자 감지와 미세 유체 플랫폼

미세 바이오 센서 플랫폼 설계 및 다양 한 analytes의 신속 하 고 민감한 정량화에 대 한 낮은 비용 드라이 필름 포토 레지스트 기술을 사용 하 여 조작. 이 단일 사용 시스템 중지 흐름 기술에 의하여 효소 연결 된 분석 실험에-칩-움직일의 전기 판독을 허용합니다.

드라이 필름 포토 레지스트 기반 전기 화학 미세 바이오 센서 플랫폼: 장치 제작, 온 칩 시험 준비 및 시스템 운영

전기 습윤 기반 디지털 미세 유체는 마이크로 리터 볼륨 액적의 명백한 접촉 각도에서 전압 구동 변화를 활용하여 조작을 용이하게하는 기술입니다. 이를 기능화된 자기 비드와 결합하면 효소 연결 면역흡착 분석(ELISA)을 사용하여 병원균의 시료 준비 및 식별을 위한 여러 실험실 단위 작업의 통합이 가능합니다.

자동화된 효소 연계 면역흡착제 분석기용 전기습식 기반 디지털 미세유체 분석 플랫폼

배우세요 미세 유체 기반 전기 바이오칩을 이용한 라벨없는 DNA 혼성화 분석 방법입니다. 전기화학 임피던스 분광법으로 3.8 nM의 검출 한계를 달성하며 높은 민감도와 특이성을 제공합니다.

라벨없는 DNA의 혼성화 분석 용 미세 유체 기반 전기 바이오칩

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