Name: 마우스 고환의 생체 내 미세 주입 및 Electroporation에에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 학습하세요 마우스 고환 생체 내 미세주입 및 전기천공법을 이용한 정자형성 연구 방법입니다. 이 기술은 유전자 분석과 남성 생식 생물학 연구에 효과적인 도구를 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 고환 미세 주입 방법을 가르쳐 뮌스터 대학의 생식 의학 및 남성 의학의 센터되었습니다 Birgit Westernstroeer 감사합니다. 게다가, 우리는 어슐러 Antkewitz 및 기술 지원 페트라 Reckling에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는이 작품 (WE2458 / 10-1)를 지원하기 위해 독일 연구 재단 (DFG)을 감사드립니다. &#160;

모든 수행 동물 실험은 로컬 윤리위원회 (Landesamt 엘리제 Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit 싶게 Fischerei, 메 클렌 부르크 - 포어 포메 른, 독일)에 의해 승인되었습니다. 1 플라스미드 준비 <ol><li> 플라스미드 제제를 들어, 플라스미드 정제 키트 (재료 표 참조) 또는 동물의 면역 반응을 피할 수 있도록 독소 제거 버퍼와 유사한 방법을 사용한다. 설명서의 지시 사항을 따르십시오. 플라스미드 용액을 희석 DDH O 2를 사용한다. </li><li> 최대 속도 (20,000 XG)에서 DNA 용액을 회전시켜 이물질을 제거합니다. 그런 다음 상층 액을 수집합니다. </li><li> 분광 광도계 (자료 참조) 플라스미드 농도를 결정합니다. </li><li> 1-3 μg (DNA) / μL로 DDH 2 O 플라스미드 농도를 조정합니다. 참고 : 높은 농도가 너무 점성 주사액이 발생할 수 있습니다 동안 낮은 농도는 형질 전환 효율을 감소시킬 것이다. 게다가형질 전환 효율은 플라스미드의 크기에 따라 개별적으로 시험되어야한다. </li><li> 주사 이전에, 함께 혼합 용액을 제조 5 ㎕의 PBS (10 배) 및 5 μL 패스트 그린 (0.5 %)과 함께 예 40 μL 플라스미드 대. 패스트 그린 사출 공정의 추적이 필요하다. 바람직하게는, 얇은 벽 PCR 튜브 또는 파라 필름을 사용합니다. 주 : 정소의 크기 따라 20-50 μL의 부피는 각각의 정소에 필요한 것이다. </li></ol> 미세 주입 피펫의 2 준비 <ol><li> 미세 주입 피펫을 제조 붕 규산염 모세관 (재료 표 참조)를 사용합니다. </li><li> 수직 모세관 풀러 유리 모세관을 당겨 (재료 표 참조). </li><li> 부드럽게 밴딩에 의해 집게로 모세관 팁을 휴식. 팁은 보통 50 ~ 80 μm의 직경이 약 1cm 길이입니다. 이러한 조직을 관통 할만큼 딱딱하지 너무 오래 팁을 피하기 위해보십시오. </li><li> 마지막으로, 샤에서마이크로 피펫의 beveler을 (재료 표 참조)를 사용하여 45 ° 각도 30 °에서 팁을 rpen. </li><li> 주사액 믹스와 미세 주입 피펫을로드 (플라스미드 준비 참조). 작은 주사기와 유리 모세관의 뒷면에 솔루션을 적용합니다. 참고 : 전도성을 줄일뿐만 아니라 가능성이 조직 손상의 원인이됩니다 따라서, 그렇지 않으면 이러한 플라스미드 용액과 함께 정 세관에 주입되며,로드하는 동안 공기 방울을 피하기 위해보십시오. </li></ol> 3 마취 및 수술 <ol><li> 멸균 (즉, 주사기, 바늘, 수술기구 등) 소재를 이용하여 무균 조건 하에서 작업을 수행한다. 이는 동물의 감염을 감소시키고 좋은 생존율을 보장 할 것이다. </li><li> 6~8주의 나이에 전기 천공 법 (electroporation)에 대한 수컷 마우스를 사용합니다. </li><li> 수술후 진통제 처리를 초기화하기 위해, 진통제와 마우스가 수술 전에 날 식수 추가 제공한다. 이 엉덩이가능성이 매우 높은 수술 후 hypodipsia (감소 물 섭취량) 가지 경우에 선제 진통제를 유레스. 이를 위해, 예를 들면 소아 이부프로펜 현탁액 (20 ㎎ / ㎖)로 식수 노출. 약용 마시는 물은 일 하나와 동일한 농도의 두 가지 복구에 공급한다. 이 C57BL / 6J 세 팔주에 대한 25g의 5 ㎖ / D 마시는 물과 체중에 대한 유효한 7.5 밀리그램 / kg의 투여 량을 의미한다. 이 진통제 처방은 근본적인 통증 완화와 높은 복지 (26)와 함께 가속 복구를 보장합니다. </li><li> (재료 표 참조) : 1의 비율로 수술 당일 작업 액 마취의​​ 제조, 1 Ketamin 10 % 및 2 %의 자일 라진을 섞는다. </li><li> 마취 솔루션 피하의 0.25 ㎖ / 100 mg을 체중 적용, 동물을 마취 (Ketamin = 0.125 g / kg을, 자일 라진 = 0.025 g / kg)를. 생쥐의 기관 손상 및 손상을 방지하기 위하여 골반과 다리 사이의 주사 부위를 사용한다. 일반적으로, 10 분을 필요때까지 마우스는 깊이 마취됩니다. </li><li> 마취 동안 건조를 방지하기 위해 수의사 연고 마우스 눈을 감아 라. </li><li> 응답의 총 부족에 의한 눈에 띄는 깊은 마취 체포를 테스트합니다. 이를 위해, 단지 동물의 발가락을 꼬집어. </li><li> 수술을 시작하려면 전기 면도기 또는 유사한 복부와 머리를 제거하고 sterilium 또는 유사한로 작업 영역을 소독. </li><li> 직접 복부의 중앙에 preputial 분비 이상으로 복부 절개를합니다. 그 곳에서, 첫번째 떨어져 피부를 당겨 약 8-14mm의 작은 횡단 피부 상처를 실시하고 있습니다. 그런 다음, 복부 근육 층을 따라 계속합니다. 주 : 동물에게 피해를 감소시키기 위해 가능한 한 병변이 작아야한다. </li><li> 첨부 된 고환을 노출 단지 절개 사이트 (그림 2A) 옆에 사전 준비 방수 일회용 종이 드레이프에 배치 조심스럽게 복부 지방 패드를 당깁니다. </li><li> F에 쌍안경을 사용하여주입 대상의 원심성 덕트 산업사. 동맥관 원심성은 고환과 부고환의 미세 혈관 접합으로 식별됩니다. 그것은 눈에 띄는 고환 동맥에 인접 해 있습니다. 동맥관은 동맥에 45 °의 각도로 거의 실행하고 눈에 띄게 CAPUT의 epididymidis 들어갑니다. 참고 : 마우스의 연령에 따라, 동맥관은 일반적으로 지방 조직에 묻혀있다. </li><li> 이 지방 조직의 원심성 덕트를 취소 미세 집게를 사용합니다. 그 후, 주변 환경을 손상시키지 않고 덕트의 명확한 가시성을 보장하기 위해 무균 종이 스트립에 출시 된 동맥관을 배치합니다. </li></ol> (4) 미세 주입 및 DNA 응용 프로그램 <ol><li> 미세 조작기 / 인젝터 장치에 플라스미드 솔루션과 함께로드되는 미세 주입 피펫을 연결합니다. </li><li> 끝이 RETE의 정소 (그림 2B)를 가리키는 원심성 덕트에 미세 주입 바늘 평행하게 배치합니다. </li><li> 미세 핀셋을 사용하여미세 주입 피펫을 통해 덕트를 제거. 이를 통해 당기면서 모세관 덕트에 평행하게 유지되어 있는지 확인합니다. 참고 :이 절차는 미세 조작기로 바늘을 이동하여 배를 관통보다 편리합니다. </li><li> 고환을 향해 조심스럽게 바늘을 지시하고의 Tunica albuginea (그림 2C) 바로 아래에 RETE의 고환을 관통로 그만. 주 : RETE의 정소를 과한의 경우, 플라스미드 용액 격자 간 공간으로 누출된다. 이것은 일반적으로 정 세관을 형질의 실패로 이어집니다. </li><li> PI : 100 고전력 증폭기, TI : 0.2 초 및 pc : 0 고전력 증폭기 (그림 2D) 플라스미드 용액의 주입을 위해 다음과 같은 설정으로 microinjector를 사용합니다. </li><li> 녹색의 도움으로 충전 상태를 관찰하여 정소 전체 주입 프로세스를 모니터링. 고환에만 PL과의 볼륨의 2/3까지 가득주의해야asmid 솔루션 (그림 2E). 주 : 분사량을 초과하면, 정소 조직을 다치게 할 수있다. </li></ol> 고환의 5 일렉트로 <ol><li> 효과적인 일렉트로 수 있도록 PBS (1 배)에 트위터 전극을 담가합니다. 이것은 충분한 전도성을 보장합니다. </li><li> 부드럽게 젖은 전극 (그림 2 층) 사이의 고환을 짠다. electroporator와 전기 저항을 측정합니다. </li><li> 고환에 현재 적용합니다. 50 밀리 초 펄스 시간 950 밀리 초 간격 시간의 일정 기간에 4 개의 고환 사이트에서 40 V의 팔 사각형 펄스를 수행합니다. </li></ol> (6) 상처 봉합하고 수술 후 <ol><li> 전기 천공이 완료되면 다시 원래 위치에 배치 정소. </li><li> 수술 봉합 (자료 참조) 내부 근육 층을 바느질. </li><li> 봉합 클립 (재료 표 참조) 이용하여 피부를 닫습니다. 피부까지 재치를 당겨시간 핀셋. 근육 층을 제외해야합니다. 하게는 5 mm 이하의 거리에서 클립, 각 놓습니다. 주 : 외과 용 봉합이 마우스 삼킬 수 있으므로, 봉합 클립 피부 병변을 폐쇄 선호된다. </li><li> 마우스가 37 ° C 따뜻한 패드에 강화 된 무균 빈 마우스 케이지에 넣고 멸균 종이 타월에 마취에서 회복 할 수 있습니다. 패드는 열 구배를 생성 케이지의 절반의 온난화를 확인해야합니다. 동물의 경우이 때문에 케이지의 온도 다양한 개인, 가장 편안한 지역을 검색 할 수 있습니다. 또한, 응력이 더욱 감소 될 수 있도록 멸균 종이 타월 시트와 마우스를 포함한다. 주 : 마우스의 신체 표면은 체질량과 관련된 대단히 높기 때문에 더 큰 동물과 비교했을 때, 열 지원 설치류의 성공적인 복구에 특히 중요하다. </li><li> 운영하는 동물이 완전히 깨어 때, 난을 전송완전히 장착 된 새로운 마우스 케이지을 추가로 복구 t. 옛 케이지 또는 쥐의 그룹에 다시 동물을 넣지 마십시오. 케이지는 상처의 감염을 방지하기 위해 가능한 한 깨끗하고 무균 있는지 확인하십시오. 전체 복구 프로세스를 모니터링합니다. 완전히 회복하고 정상적으로 작동하도록 나타납니다 때까지 다시 동물 보호 시설에 마우스를 전송하려면 기다립니다. 주 : 추가 당과 수술 후 전략 (Pritchett)의 코닝 KR 외 (6)에 의해 설명되어 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Reuter, K., Schlatt, S., Ehmcke, J., Wistuba, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fact+or+fiction%3A+In+vitro+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Fact or fiction: In vitro spermatogenesis.</a> Spermatogenesis. 2, 245-252 (2012).</li>
<li>Hunter, D., Anand-Ivell, R., Danner, S., Ivell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+in+vitro+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Models of in vitro spermatogenesis.</a> Spermatogenesis. 2, 32-43 (2012).</li>
<li>Zizzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+as+indicator+of+nonviral+transient+transfection+efficiency+in+endometrial+and+testicular+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein as indicator of nonviral transient transfection efficiency in endometrial and testicular biopsies.</a> Microsc. Res. Tech. 73, 229-233 (2010).</li>
<li>Williams, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+foreign+genes+into+tissues+of+living+mice+by+DNA-coated+microprojectiles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Introduction of foreign genes into tissues of living mice by DNA-coated microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2726-2730 (1991).</li>
<li>Bockmann, R. A., de Groot, B. L., Kakorin, S., Neumann, E., Grubmuller, H., Kinetics, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((statistics%2C+and+energetics+of+lipid+membrane+electroporation+studied+by+molecular+dynamics+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">statistics, and energetics of lipid membrane electroporation studied by molecular dynamics simulations.</a> Biophys. J. 95, 1837-1850 (2008).</li>
<li>Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+rodent+surgery+for+the+new+surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Principles of rodent surgery for the new surgeon.</a> J. Vis. Exp. (47), (2011).</li>
<li>Brinster, R. L., Avarbock, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+of+donor+haplotype+following+spermatogonial+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11303-11307 (1994).</li>
<li>Schlatt, S., Von, S. V., Schepers, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+germ+cell+transplantation%3A+an+experimental+approach+with+a+clinical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Med.+Bull%22%5BJournal%5D)">Male germ cell transplantation: an experimental approach with a clinical perspective.</a> Br. Med. Bull. 56, 824-836 (2000).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), (2007).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), (2011).</li>
<li>Blackshaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+developing+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of developing mouse retina.</a> J. Vis. Exp. (52), (2011).</li>
<li>Yomogida, K., Yagura, Y., Nishimune, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporated+transgene-rescued+spermatogenesis+in+infertile+mutant+mice+with+a+sertoli+cell+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Electroporated transgene-rescued spermatogenesis in infertile mutant mice with a sertoli cell defect.</a> Biol. Reprod. 67, 712-717 (2002).</li>
<li>Ryoki, S., Park, H., Ohmori, Y., Shoji-Tanaka, A., Muramatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrase+facilitates+long-lasting+foreign+gene+expression+in+vivo+in+mouse+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">An integrase facilitates long-lasting foreign gene expression in vivo in mouse spermatogenic cells.</a> J. Biosci. Bioeng. 91, 363-367 (2001).</li>
<li>Umemoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+to+mouse+testes+by+electroporation+and+its+influence+on+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Androl%22%5BJournal%5D)">Gene transfer to mouse testes by electroporation and its influence on spermatogenesis.</a> J. Androl. 26, 264-271 (2005).</li>
<li>Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foreign+gene+expression+in+the+mouse+testis+by+localized+in+vivo+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 45-49 (1997).</li>
<li>Hibbitt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+transfer+by+electroporation+allows+expression+of+a+fluorescent+transgene+in+hamster+testis+and+epididymal+sperm+and+has+no+adverse+effects+upon+testicular+integrity+or+sperm+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vivo gene transfer by electroporation allows expression of a fluorescent transgene in hamster testis and epididymal sperm and has no adverse effects upon testicular integrity or sperm quality.</a> Biol. Reprod. 74, 95-101 (2006).</li>
<li>Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+transfer+to+mouse+spermatogenic+cells+using+green+fluorescent+protein+as+a%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a.</a> J. Exp. Zool. 286, 212-218 (2000).</li>
<li>Dhup, S., Majumdar, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+via+permanent+integration+of+genes+in+repopulating+spermatogonial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Transgenesis via permanent integration of genes in repopulating spermatogonial cells in vivo.</a> Nat. Methods. 5, 601-603 (2008).</li>
<li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+transfection+of+testicular+germ+cells+and+transgenesis+by+using+the+mitochondrially+localized+jellyfish+fluorescent+protein+gene%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">In vivo transfection of testicular germ cells and transgenesis by using the mitochondrially localized jellyfish fluorescent protein gene.</a> FEBS Lett. 487, 248-251 (2000).</li>
<li>Majumdar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+rapid+generation+of+transgenic+animals+to+evaluate+testis+genes+during+sexual+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A method for rapid generation of transgenic animals to evaluate testis genes during sexual maturation.</a> J. Reprod. Immunol. 83, 36-39 (2009).</li>
<li>Yomogida, K., Yagura, Y., Tadokoro, Y., Nishimune, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+expansion+of+germinal+stem+cells+by+ectopically+expressed+human+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+in+mouse+Sertoli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Dramatic expansion of germinal stem cells by ectopically expressed human glial cell line-derived neurotrophic factor in mouse Sertoli cells.</a> Biol. Reprod. 69, 1303-1307 (2003).</li>
<li>Ike, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+analysis+of+the+mouse+ornithine+decarboxylase+antizyme+haploid-specific+promoter+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Transient expression analysis of the mouse ornithine decarboxylase antizyme haploid-specific promoter using in vivo electroporation.</a> FEBS Lett. 559, 159-164 (2004).</li>
<li>Gonzalez-Gonzalez, E., Lopez-Casas, P. P., Del, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+RNAi+in+mouse+Sertoli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by RNAi in mouse Sertoli cells.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 6, 29(2008).</li>
<li>Tang, H., Kung, A., Goldberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+murine+lactate+dehydrogenase+C+%28Ldhc%29+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Regulation of murine lactate dehydrogenase C (Ldhc) gene expression.</a> Biol. Reprod. 78, 455-461 (2008).</li>
<li>Yomgogida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+testis%3A+a+target+of+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Mammalian testis: a target of in vivo electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 50, 513-515 (2008).</li>
<li>Hayes, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Evaluation+of+Analgesic+Regimens+for+Abdominal+Surgery+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">An Evaluation of Analgesic Regimens for Abdominal Surgery in Mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 6, 18-23 (2000).</li>
</ol>

마틴 미카엘, 알렉산더 Sobczak, 요아킴 M. WEITZEL는 생식 생물학 연구소, 가축 생물학에 대한 라이프니츠 연구소 (FBN), Dummerstorf에서 독일 고용 그들은 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

특히 남성 불임 필연적으로 정자의 지역에서 생식 생물학 분야의 연구는 살아있는 유기체에 의존합니다. 고환의 기능을 검사하기 위해, 어떠한 적절한 세포 배양 / 시험 관내 시스템은 반수체 성숙한 정자에 1,2 이배체 spermatogonium 모든 중요한 형태 학적 변화를 반영 할 수있는 확립되지 않았다. 따라서, 유전자 변형 동물의 발생이 종종 필요하고 남성 생식 생물학 등으로 유용한 도구이다. 이를 형질 전환의 상당한 수에, 아웃 노크 노크 남성 불임에 대한 통찰력을 제공 생성 된 쥐. 그럼에도 불구하고, 트랜스 제닉 마우스의 생성은 일반적으로 수정란의 전핵에 유전자 구조를 주입함으로써 수행된다. 그러나,이 방법은 시간 소모적이며 전문 실험실에서 수행 할 예정이다. 절차는 노크 아웃을 생성하거나 노크에서 동물더욱 정교한이다. 모델 생물체의 유전자 기능을 연구하는 또 다른 방법은 일시 발현하는 것입니다. 그러나...

포유 동물은 성숙한 정자 반수체 정자로 개발하기 위해서는 순차 유사 분열, 감수 분열 및 분화를 겪고 자기 갱신 줄기 세포의 복잡한 과정으로 간주된다. 이러한 형태 학적 변화는 다양한 세포 유형에 의해 조율되는 중후 시도에도 불구하고, 세포 배양 1,2에서 이러한 프로세스를 모방 여전히 불가능하다. 따라서, 지금까지의 정자에 대한 연구는 생체 내 모델로 살아있는 유기체에 의존한다. 일반적으로, 유전자 기능 연구는 일반적으로 형질 전환 동물에 기초한다. 그러나, 생성하여 동물 모델이 종류를 유지하는 것은 시간 소모적이고 비용 집약적 꽤 정교하다. 이것은 생성하고 세대 위에 유전자를 유지하기위한 필수 사육 긴 프로세스에 기인한다. 또한, 형질 전환 또는 녹아웃 방법에 의해 전체 유기체의 유전자 조작은 g을 타겟팅 생리적 장애를 유발하는 경향이있다예를 들어 여러 지역에서 필수적인 기능, 고환 외부 또는 체계적으로 ENES. 또한, 일부 과도 형질 전환 방법은 몇 가지 중요한 단점과 연관되어 있습니다. 리포 펙 3 및 마이크로 입자 충돌 (4) 조직을 손상시킬 수있는 충분한 형질 전환 효율을위한 특정 세포 깊이로 제한되어있는 반면 예를 들어, 바이러스 매개 유전자 전달의 일반적인 단점은, 면역 반응 및 추가 안전 규정의 가능한 도발이다. 대조적으로, 일시 발현의 또 다른 일반적인 방법으로 전기 천공 (EP)은 생체 내 형질 감염과 일관된 생체 유전자 분석에서 활성화하는 유망한 기술을 구성하는 것으로 보인다. 일반적으로, EP는 나노초 이내 결과적 매개 기공 로컬 막 관통 전압에 따라 동적 현상이라한다. 이러한 갭은 밀리 초 동안 유지 될 수 있고, 충분한 tO DNA, RNA 또는 작은 분자 (5)에 대한 액세스 권한을 부여. 인가 전압이 너무 높으면, 일반적으로 EP의 과도 특성은 열에 의한 생산과 셀 (5)의 결과적으로 돌이킬 수없는 손상이 너무 광범위한 permeabilization 유도로 상쇄된다. 여기서는 일렉트로가 생체 내에서 고환 유전자 특성을 규명하기 위하여 유전 정소 변환을 위해 이용 될 수있는 효과적이고 경제적 인 형질 전환 시스템임을 보여준다. 이 문서에서는 원심성 덕트 및 마우스 고환의 후속 일렉트로을 통해 플라스미드 준비, 미세 주입을 해결합니다. 이 절차는 정자 생성의 과정을 조사하기 위해 생체 내 마우스 고환의 정 세관의 신속하고 효율적인 특정 형질 감염을 달성하기 위해 선택하는 수단이 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>원심분리기</td><td>Sigma</td><td>1-15 PK</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Nanodrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>수직 모세관 풀러</td></tr><tr><td>마이크로사출 모세관</td><td>Clark</td><td>GC100-10</td><td>붕규산 표준 벽</td></tr><tr><td>마이크로피펫 베벨러</td><td>Bachofer</td><td>Typ 462</td><td>회전 디스크 beveler</td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Nepagene</td><td>CUY 21EDIT</td><td>구형파 전기자극기</td></tr><tr><td>핀셋 전극</td><td>Nepagene</td><td>CUY 650P5</td><td>5 mm &Oslash; 디스크 전극</td></tr><tr><td>스테레오 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>차가운 광원</td><td>Zeiss</td><td>KL 1500LCD</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection pump</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>수제</td><td></td><td>XYZ 크로스 테이블</td></tr><tr><td>수술 기구</td><td>FST</td><td></td><td>가위, 집게, 바늘 홀더</td></tr><tr><td>미세 집게</td><td>FST</td><td>Dumont # 5, # 7</td><td>원심성 덕트 준비</td></tr><tr><td>Michel 클립 적용 스테이플러</td><td>FST</td><td>Michel, 12029-12</td><td></td></tr><tr><td>Michel 봉합 클립</td><td>FST</td><td>Michel, 12040-01</td><td>7.5 x 1.75 mm</td></tr><tr><td>외과용 봉합사</td><td>Catgut, Markneukirchen, Germany</td><td>Catgut 00</td><td></td></tr><tr><td>주사기(30G 바늘</td><td>포함) B. Braun</td><td>Omnican 40</td><td>마이크로피펫 적재 및 마취용</td></tr><tr><td>플라스미드 분리 키트</td><td>Promega</td><td>Cat. # A2495</td><td>플라스미드 Midiprep</td></tr><tr><td>플라스미드 pEGFP-C1</td><td>클론텍</td><td>Cat. #6084-1</td><td>CMV-프로모터 + EGFP</td></tr><tr><td>플라스미드 pDsRed2-N1</td><td>클론텍</td><td>카탈로그 #6084-1</td><td>CMV-프로모터 + DsRed2</td></tr><tr><td>패스트 그린 염료</td><td>시그마</td><td>F7258-25G</td><td>ddH2O</td></tr><tr><td>10% 케타민</td><td>혈청 Werk, Bernburg, 독일</td><td>자일라진과 1:1</td>비율로 우<td>로타민</td> 믹스 자일라</tr>진 <tr>2<td>% 자일라</td>진 <td>혈청 Werk, 베른부르크, 독일</td><td>자일라진</td> 혼합물 케타민 스테리움 Bode Chemie<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>와 1:1 비율로 혼합Sterillium</td><td>소독</td></tr><tr><td>수의사 연고</td><td>S & K Pharma, GmbH</td><td>Kerato Biciron 5%, 안</td><td>구 건조를 예방하는</td>Augensalbe 안연</tr><tr><td>To-Pro-3 요오드화물</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">10x PBS, pH 7.4</strong</td></tr><tr><td>>1.37 M NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>이부프로펜, Dolormin</td><td>Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany</td><td>01094902</td><td>수술 후 통증 완화를 위한 진통제 소아과 솔루션(NSAID)</td></tr><tr><td>27 mM KCl</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>100 mM Na2HPO4&middot; 2H2O</td><td>Carl Roth</td><td>T106.2</td><td></td></tr><tr><td>18 mM KH2PO4</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 고환의 생체 내 미세 주입 및 electroporation에에서

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

이 비디오 및 문서 기여 미세 주입 및 생체 내에서 마우스 고환의 일렉트로의 포괄적 인 설명을 제공합니다. 고환 마우스 셀이 특정 형질 전환 기술은 정자의 고유 한 프로세스의 연구를 할 수 있습니다. 다음 프로토콜 플라스미드 구성체와 마우스 정소 세포의 형질 전환에 초점을 맞추고있다. 특히, 우리는 적색 형광 단백질 (DsRed2)을 표현하는 녹색 형광 단백질 (eGFP는) 또한 pDsRed2-N1 벡터를 강화 표현하는 기자 벡터 pEGFP-C1을 사용했다. 두 부호화 리포터 유전자는 인간 사이토 메갈로 바이러스의 즉시 초기 프로모터 (CMV)의 제어하에 있었다. 마우스 정소에 유전자 전달을 수행하기 위해, 리포터 플라스미드 구성체는 살아있는 마우스의 고환에 주입된다. 이를 위해, 마취 동물의 정소는 노출 및 마이크로 인젝션의 사이트가 제조된다. 우리의 선호하는 장소주입은 고환과 부고환의 정자의 해부학 전송 경로와 궁극적으로 연결 RETE의 고환과, 원심성 덕트입니다. 이러한 방식으로, 마이크로 인젝션 후 정 세관의 충전은 양호 인해 DNA 염색 용액의 사용을 관리하고 제어한다. 그 컬러 세관 구조 정소의 충분한 충전을 관찰 한 결과, 기관은 전기 천공이다. 이는 고환 세포 내로 DNA 용액의 전송을 가능하게한다. 배양 3 일 후, 정소 제거하고, 형질 전환의 성공을 나타내는, 녹색 또는 적색의 형광 현미경으로 조사 하였다. 일반적으로,이 프로토콜은 DNA- 또는-RNA를 전달하기 위해 이용 될 수는하기 위해 살아있는 마우스 정소로 구성한다 (위에) 표현 또는 생체 내 유전자 기능 분석에 용이하게 유전자를 노크. 또한, 리포터 구조 또는 추정되는 유전자 REGULA 공부 적합토리 요소입니다. 따라서, 전기 천공 기술의 주요 장점은 다른 기술에 비해 낮은 필요한 노력뿐만 아니라 적당한 기술 장비 및 기술과 함께 빠른 성능이다.

그것이 사용되는 바와 같이 생체 내에서 마우스 정소의 미세 주입 및 전기 천공을 수행하는 프로토콜에 따라 대한 실험 환경은 그 공업 적 제조 마이크로 피펫을 획득 할 수있다하더라도.도 1에 도시되어, 우리는 (도 1a 당기는 자체 피펫을 생성하는 것이 바람직 있도록) 및 베벨 (그림 1B) 유리 모세관 그들은 우리의 요구를 장착. 마이크로 인젝션 용 및 전기 천공 장치는도 1c에 도시되어있다. 형질 감염 효율의 이유로, 구형파 electroporator를 이용하는 중요하다. 이 표시 원심성 덕트의 준비에 특별한 초점을 마우스 수술의 주요 단계를 그림. Figur (고환이 노출이 컨텍스트 (그림 2A)와 원심성 덕트에서 양안 관찰에 의해 식별 및 지방 ...

고환 마우스 세포에 대한 형질 전환 기술은 정자의 고유 한 프로세스를 공부로이 문서에서는 생체 내에서 미세 주입 및 마우스 고환의 일렉트로에 대해 설명합니다. 제시된 프로토콜은 전기 천공 법 (electroporation)에 의해 유리 모세관 준비, 원심성 덕트를 통해 미세 주입하고, 형질 전환의 단계를 포함한다.

마우스 고환의 생체 내 미세 주입 및 Electroporation에에서

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

이 절차의 목적은 유전자 구조를 마우스 고환에 미세주입한 후 InVivo 전기천공법을 수행하는 것입니다. 이를 통해 정자 형성 및 고환 기능에 중점을 둔 포괄적인 유전자 분석을 수행할 수 있습니다. 이것은 먼저 PrepU 땀샘 바로 위의 복부 절개를 통해 고환에 접근함으로써 이루어집니다.두 번째 단계는 지방 조직에서 혈관을 방출하여 미세 주입을 위해 고환에 부착된 원심성 덕트를 준비하는 것입니다. 다음으로, 장전된 미세주입 피펫으로 이비인후과에 구멍을 뚫고 염색 유전자 구성 용액을 고환 철세뇨관에 투여합니다. 마지막 단계는 고환의 다측 전기천공(electroporation) 형질주입(transfection)입니다.궁극적으로, 형광 현미경 또는 광도계 측정에 의한 형질 주입을 평가하기 위해 3일 후에 형질주입된 고환을 추출합니다. 일시적인 형질주입 방법으로서의 마우스 고환에 대한 이러한 미세주입 지능 작동 기술의 조합은 형질전환 동물 또는 녹아웃 마우스와 같은 기존 접근 방식에 비해 많은 이점을 제공할 것입니다. 빠른 성능, 저렴한 비용 및 중간 정도의 기술만 필요합니다.이 방법론적 접근은 남성 생식력 연구 분야에서 사용 가능한 기술에 현명할 수 있기를 바랍니다. 이는 실험적 유전자 및 불임 과정에 관한 광범위한 문제를 해결하는 데 본질적으로 도움이 될 수 있습니다. 이것은 모든 기능 상실 실험의 이득 형태로 유전자 분석을 위해 이 방법을 사용할 때 특히 가능합니다.아마도, 예를 들어, 정자 형성 특정 유전자의 조절 요소를 조사하는 데에도 매우 유용할 것입니다. 절차를 시작하려면 6-8주 된 수컷 쥐를 10% 케타민과 2% 자일라진을 일대일로 혼합하여 피하로 마취합니다. 그런 다음 마우스가 발가락을 꼬집어 깊은 마취 상태에 있는지 확인합니다.건조를 방지하기 위해 눈에 연고를 바르십시오. 그런 다음 전기 면도기로 복모를 제거하고 수술 부위를 소독합니다. 복부 중앙의 PrepU 땀샘 바로 위에 복부 절개를 만듭니다.이를 위해 피부를 당기고 작은 가로 피부 절단을 수행합니다. 그런 다음 복부 근육층을 따라 계속하십시오. 복부 지방 패드를 조심스럽게 당겨 부착된 고환이 드러나도록 하고 복부의 멸균 종이에 놓습니다.그런 다음 실체 현미경을 사용하여 미세 주입을 위한 이비인후과 덕트를 찾습니다. 고환과 부고환 사이의 미세한 혈관 접합부이며 고환 동맥에 인접 해 있습니다. 이비인후과를 덮고 있는 지방 조직을 가는 집게로 제거

in-vivo-microinjection-and-electroporation-of-mouse-testis

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

E15 마우스 태아의 Utero의 심실 주입 및 Electroporation에

우리는 electroporation과 형광 현미경을 사용하여 단백질 표현의 후속 시각화를 사용하여 라이브 생쥐의 발 근육의 섬유에 플라스미드 DNA의 transfection 효율에 대한 자세한 절차를 설명합니다.

사용 포유류 골격 근육의 유전자 Transfection VIVO에서 Electroporation

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

이득 또는 기능 연구의 손실 중 하나를 수행하기위한 목적으로 murine 망막 세포에 플라스미드 DNA의 결합을위한...

개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

개발 뇌 마우스로 유전자 전송 방법은 고유한 수술 방법과 전극의 특별한 모양을 사용하여 설명합니다. 이 독특한 기술은 두뇌 개발을 공부에 많은 도움이됩니다 neuroscientists temporally과 공간 플라스미드 DNA의 transfection 수 있습니다.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

마우스 내이 (内耳)는 누구의 발달 프로그램의 회임 기간 동안 정교하고 있습니다 placode 파생 감각 기관이다. 우리를...

에 의해 개발 마우스 내이 (内耳)에 진 전송<em&gt; VIVO에서</em&gt; Electroporation

Midgestation 마우스 태아의 아래쪽 사방 정계 립의 시험 관내 Electroporation에

마우스 방광에서 vivo에서 요도 도관 법 및 electroporation 통해의 urothelial 세포로 DNA 플라스 미드의 배달에 대 한 새로운 방법을 설명합니다. 그것은 방광 질환의 학위 마우스 모델을 생성 하기 위한 신속 하 고 편리한 방법을 제공 합니다.

새로운 방식의 마우스 방광 Urothelium Electroporation에 의해 플라스 미드 DNA 전달

여기, 선물이 testes에 눌린 FITC를 주입 하 여 혈액 고환 방 벽 완전성을 평가 하는 프로토콜. 이것은 유전과 환경 요소에 의해 손상 될 수 있습니다 혈액 고환 방 벽 무결성 공부 효율적인 vivo에서 방법.

Vivo에서 하는 방법 마우스 혈액 고환 방 벽 완전성을 공부

이 기사는 남성 감수 분열에 대한 귀중한 모델인 복부 수술과 GSK923295의 고환 주사를 통한 CENP-E의 생체 내 억제를 보고합니다. 면역형광, 유세포 분석 및 투과 전자 현미경 분석을 사용하여 CENP-E 억제가 마우스 정자세포에서 염색체 정렬 불량 및 게놈 불안정성을 초래한다는 것을 보여줍니다.

In Vivo Inhibition, Immunofluorescence 및 Flow Cytometry를 이용한 정자 세포 내 Kinesin-7 CENP-E의 기능 평가

이 프로토콜은 마우스 난관에서 국소적으로 제한된 CRISPR 매개 게놈 편집을 위한 미세주입 및 생체 내 전기천공을 설명합니다.

생체 내 미세주입 및 전기천공을 사용한 체세포 게놈 공학 마우스 모델

학습하세요 마우스 고환 생체 내 미세주입 및 전기천공법을 이용한 정자형성 연구 방법입니다. 이 기술은 유전자 분석과 남성 생식 생물학 연구에 효과적인 도구를 제공합니다.

마우스 고환의 생체 내 미세 주입 및 Electroporation에에서

더 많은 동영상 탐색