마우스 고환의 생체 내 미세 주입 및 Electroporation에에서

고환 마우스 세포에 대한 형질 전환 기술은 정자의 고유 한 프로세스를 공부로이 문서에서는 생체 내에서 미세 주입 및 마우스 고환의 일렉트로에 대해 설명합니다. 제시된 프로토콜은 전기 천공 법 (electroporation)에 의해 유리 모세관 준비, 원심성 덕트를 통해 미세 주입하고, 형질 전환의 단계를 포함한다.

이 절차의 목적은 유전자 구조를 마우스 고환에 미세주입한 후 InVivo 전기천공법을 수행하는 것입니다. 이를 통해 정자 형성 및 고환 기능에 중점을 둔 포괄적인 유전자 분석을 수행할 수 있습니다. 이것은 먼저 PrepU 땀샘 바로 위의 복부 절개를 통해 고환에 접근함으로써 이루어집니다.

두 번째 단계는 지방 조직에서 혈관을 방출하여 미세 주입을 위해 고환에 부착된 원심성 덕트를 준비하는 것입니다. 다음으로, 장전된 미세주입 피펫으로 이비인후과에 구멍을 뚫고 염색 유전자 구성 용액을 고환 철세뇨관에 투여합니다. 마지막 단계는 고환의 다측 전기천공(electroporation) 형질주입(transfection)입니다.

궁극적으로, 형광 현미경 또는 광도계 측정에 의한 형질 주입을 평가하기 위해 3일 후에 형질주입된 고환을 추출합니다. 일시적인 형질주입 방법으로서의 마우스 고환에 대한 이러한 미세주입 지능 작동 기술의 조합은 형질전환 동물 또는 녹아웃 마우스와 같은 기존 접근 방식에 비해 많은 이점을 제공할 것입니다. 빠른 성능, 저렴한 비용 및 중간 정도의 기술만 필요합니다.

이 방법론적 접근은 남성 생식력 연구 분야에서 사용 가능한 기술에 현명할 수 있기를 바랍니다. 이는 실험적 유전자 및 불임 과정에 관한 광범위한 문제를 해결하는 데 본질적으로 도움이 될 수 있습니다. 이것은 모든 기능 상실 실험의 이득 형태로 유전자 분석을 위해 이 방법을 사용할 때 특히 가능합니다.

아마도, 예를 들어, 정자 형성 특정 유전자의 조절 요소를 조사하는 데에도 매우 유용할 것입니다. 절차를 시작하려면 6-8주 된 수컷 쥐를 10% 케타민과 2% 자일라진을 일대일로 혼합하여 피하로 마취합니다. 그런 다음 마우스가 발가락을 꼬집어 깊은 마취 상태에 있는지 확인합니다.

건조를 방지하기 위해 눈에 연고를 바르십시오. 그런 다음 전기 면도기로 복모를 제거하고 수술 부위를 소독합니다. 복부 중앙의 PrepU 땀샘 바로 위에 복부 절개를 만듭니다.

이를 위해 피부를 당기고 작은 가로 피부 절단을 수행합니다. 그런 다음 복부 근육층을 따라 계속하십시오. 복부 지방 패드를 조심스럽게 당겨 부착된 고환이 드러나도록 하고 복부의 멸균 종이에 놓습니다.

그런 다음 실체 현미경을 사용하여 미세 주입을 위한 이비인후과 덕트를 찾습니다. 고환과 부고환 사이의 미세한 혈관 접합부이며 고환 동맥에 인접 해 있습니다. 이비인후과를 덮고 있는 지방 조직을 가는 집게로 제거합니다.

그런 다음 이완관을 멸균 종이 스트립에 놓고 주변 환경을 손상시키지 않고 이관이 쉽게 보이도록 합니다. 더 나아가, 이전에 착색된 플라스미드 용액이 로드된 미세주입 피펫을 마이크로 매니퓰레이터 주입기 장치에 연결합니다. 그런 다음 끝이 REIT 고환을 가리키도록 마이크로 주사 바늘을 EENT 덕트와 평행하게 놓습니다.

그런 다음 가는 핀셋을 사용하여 미세주입 피펫 위의 덕트를 벗겨냅니다. 피펫을 당기는 동안 덕트와 평행을 이루는지 확인하십시오. 바늘을 고환 쪽으로 조심스럽게 향하게 하고 tunica albuginea 바로 아래에 있는 REIT 고환을 관통할 때 멈춥니다.

다음으로 마이크로 인젝터의 매개변수를 설정합니다. 그 후, 유전자 구성 용액을 주입하기 시작합니다. 고환 충전 상태를 관찰하여 전체 주입 과정을 모니터링합니다.

유색 플라스미드 용액의 도움으로 고환은 부피의 2/3까지만 만들 수 있습니다. 효과적인 electroporation를 가능하게 하기 위하여. 적절한 전도도를 보장하기 위해 핀셋 전극을 한 번 PBS에 담그십시오.

그런 다음 젖은 전극 사이에 약간 테스트를 짜내고 전기 파라타로 전기 저항을 측정합니다. 다음으로, 총 8개의 사각 펄스 수로 고환에 전류가 가해질 수 있도록 전기를 적절하게 설정합니다. 4개의 서로 다른 고환 부위에서 전체 고환 주위에서 전기천공을 종합적으로 수행합니다.

전기천공법이 끝난 후, 고환을 가능한 한 원래 위치에 가깝게 복부에 다시 놓습니다. 그래서 안쪽 근육층은 흡수성 수술 봉합사였습니다. 그런 다음 봉합사 클립으로 피부를 닫습니다.

마우스가 마취에서 회복될 때까지 기다립니다. 섭씨 37도의 열 패드로 데운 멸균 상자에 종이 타월로 준비했습니다. 패드는 케이지의 절반만 데워지도록 하여 열 구배를 생성해야 합니다.

또한 스트레스를 더욱 줄이기 위해 다른 종이 타월로 마우스를 덮으십시오. 동물이 완전히 깨어난 후 깨끗하고 완벽한 장비를 갖춘 새 우리로 옮깁니다. 그러나 추가 복구는 마침내 마우스를 동물 시설로 되돌릴 때까지 복구 과정을 모니터링하십시오.

이 그림은 형광 검출에 의한 생체 내 전기천공법 3일 후 전체 마운트 고환을 보여주며, C 57 블랙 식스 마우스의 형질 주입된 고환은 향상된 녹색 형광 단백질 또는 적색 형광 단백질을 보여줍니다. 다음은 고환의 조직학적 부분입니다. PE eeg, FPC one을 사용한 일방적 전기천공법 3일 후, 형질주입된 정액 난관 세포는 전형적인 구형으로 조직된 구조와 함께 녹색 형광으로 설명됩니다.

그들의 핵은 파란색의 2 개의 프로 3으로 대조 염색되었습니다. 이 절차를 수행하는 동안 이비인후과를 식별하고 지방 조직을 방출하는 과정이 매우 정교하다는 점을 명심하는 것이 중요합니다. 따라서 실제 생체 내 경험을 하기 전에 먼저 죽은 동물을 대상으로 연습할 수 있습니다.

microinjection, electroporation 및 마지막 시험 수확의 반대로 진행에 따라, Q-R-T-P-C-R 배 및 서쪽 blotting와 같은 많은 기술은 실행될 수 있습니다. 그러므로, tester 유전자의 xining은 단백질 발현 패턴일 뿐만 아니라 post-translational modification은 당연한 것입니다. 따라서 이러한 도구를 통해 예를 들어 정자 형성과 같은 매우 다양한 주제가 그 기저의 복잡한 메커니즘 및 규정과 함께 공격받을 수 있습니다.