쥐과 림프절 기질 세포의 분리

림프절 기질 세포의 분리는 섬유아세포 망상 세포, 림프 및 혈액 내피 세포를 얻기 위한 효소 분해 및 기계적 분해를 포함하는 다단계 절차입니다. 설명된 절차에서는 짧은 분해와 자동화된 기계적 분해를 결합하여 생존 가능한 림프절 기질 세포의 표면 마커 저하를 최소화합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 림프절 기질 세포를 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 림프절 캡슐을 파괴함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 림프절 단편을 콜라겐분해효소 4와 D nase 1로 분해합니다.

그런 다음 효소를 콜라겐분해효소 D 및 D nase 1로 대체하고 단편을 자동화된 다채널 피펫으로 기계적으로 분해합니다. 궁극적으로, 분리된 림프절 세포의 세포 표면 분자 발현은 유세포 분석으로 특성화할 수 있습니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 방법을 사용하면 세포의 생존력과 표면 분자 발현을 보존하는 기계적 분해로 보완된 표준화된 효소 절차를 사용하여 림프절 SHR 세포를 소화할 수 있다는 것입니다.

먼저 절개된 림프절을 2밀리리터의 얼음처럼 차가운 배지가 들어 있는 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 25게이지 바늘이 장착된 1밀리리터 주사기 2개를 사용하여 림프절 캡슐을 파괴합니다. 다음으로, 파괴된 조직을 콜라겐분해효소 4와 DNA 1 및 자기 교반이 보충된 750마이크로리터의 배지가 들어 있는 5밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 자석 교반기에 섭씨 37도로 예열된 물이 담긴 비커에 튜브를 넣고 30분 동안 1초에 한 번씩 세포 슬러리를 저어줍니다. 교반 후 림프절 단편을 가라앉힌 다음 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 이제 비 기질 세포를 위해 풍성하게 해, 림프절 파편에 신선한 매체의 750 마이크로리터를 옮기고, collagenase D와 D nase 1로 보충하고, 그 후에 37 섭씨 온도에 또 다른 5 분 동안 조직을 약동한다.

다음으로, 자동 멀티채널 피펫을 사용하여 700마이크로리터 용량의 림프절 조직 조각을 최대 속도로 10회 동안 분해한 다음 10분 후에 조직 조각을 다시 교반합니다. 또한 최대 속도로 99회 동안 자동화된 멀티 채널 피펫으로 조직 덩어리를 분해합니다. 그런 다음 7.5마이크로리터의 0.5몰 EDTA를 튜브에 추가하고 조직 현탁액을 자동 피펫으로 99회 더 혼합합니다.

마지막 분해 주기 후, 세포 용액에 750마이크로리터의 배지를 추가하고 70마이크로미터 나일론 메쉬를 통해 세포를 여과합니다. 그런 다음 1500Gs 및 섭씨 4도에서 5분 동안 셀을 펠릿화합니다. 유세포 분석으로 림프절 기질 세포 집단을 시각화하려면 어두운 곳에서 섭씨 4도에서 최소 20분 동안 2%FCS를 함유한 100마이크로리터의 HBSS에 있는 살아있는 죽은 추적기와 관심 항체로 적절한 세포 샘플을 염색합니다.

그런 다음 FCS로 500마이크로리터의 HBSS에서 세포를 세척하고 재현탁합니다. HBSS 및 FCS 100마이크로리터의 펠릿은 조혈 세포를 배제하기 위해 CD 45 양성 세포를 게이팅하는 유세포 분석기에서 세포를 실행한 다음 살아있는 단일 세포 집단에서 보행합니다. 마지막으로, GP 38 대 CD 31을 플롯하여 T-zone 망상 세포, 림프 내피 세포, 혈액 내피 세포 및 이중 음성 세포를 시각화합니다.

세포 집단. 림프절 기질 세포 하위 집합의 소화 후 회복된 총 세포 수는 링크 및 플레처 프로토콜에 비해 방금 시연된 프로토콜에서 약간 더 높았으며, 이는 이 프로토콜에 의한 분리 후 림프절 기질 세포의 생존력이 발표된 프로토콜을 사용하여 회복된 것과 유사함을 보여줍니다. 이것과 링크 및 플레처 프로토콜을 통해 분리된 T-zone 망상 세포 및 림프 내피 세포를 IAB CD 1, CD 80, PD L 1 및 CD 40 발현에 대해 비교했습니다.

5개 표면 분자 모두의 발현은 방금 제시된 프로토콜과 두 기질 세포 부분 집합에 대한 링크 프로토콜로 소화 시 더 높았으며, 이는 콜라겐분해효소 4 및 D에 의한 일부 표면 분자의 분해가 콜라겐분해효소 p 및 DYS 공간보다 덜 강력하다는 것을 시사합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 림프절 기질 세포의 4가지 주요 하위 집단을 성공적으로 분리하는 동시에 추가 특성 분석 및 분석에 유용한 여러 표면 분자의 발현을 보존하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.