Name: 쥐과 림프절 기질 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: 배우세요 쥐 림프절 기질 세포 분리법을 효소 소화와 기계적 분해를 통해 세포 생존율과 표면 마커를 보존하는 방법입니다. 이 기술은 면역학 연구에 필수적인 표준화된 세포 분리 절차를 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 현재의 림프절 소화 프로토콜을 확립하는 데 도움이 되는 토론을 해준 Sanjiv Luther와 동료들에게 감사를 표합니다. 이 작업은 SNF 보조금 PPOOA-_119204 및 S.W.R에 PPOOP3_144918의 지원을 받았습니다.

이 비디오를 게시 및 프로토콜에서 모든 동물의 절차는 분할 한 기관 바젤 슈타 트, 스위스의 승인을 동물의 프로토콜에 따라 실시 하였다. 1 림프절 준비 및 소화 <ol><li> 가열 플레이트 자석 교반기 37 ° C에 비커 초기 가열 물. </li><li> 다음과 같은 기본 미디어를 준비 : DMEM 배지 (피루 베이트 제외) 2 % FCS로 보충, 1.2 mM의 염화칼슘 및 펜 / 연쇄상 구균 (페니실린의 100 단위, 스트렙토 마이신 100 μg). </li><li> 사용하기 전에 모든 해부 도구를 소독. </li><li> CO 2 질식 당 림프절 공여 쥐를 안락사 및 무균 적으로 림프절을 해부하다. 주위의 지방을 해부하지 마십시오. 참고 :이 프로토콜은 주변 피부 배수 림프절 (사타구니, 상완, 겨드랑이)에 최적화되어 있습니다. </li><li> 2 ㎖의 차가운 얼음 기본적인 매체를 포함하는 멸균 페트리 접시에 림프절을 놓습니다. </li><li> 림프절 캘리포니아를 중단1 ML의 주사기에 고정이 25 G 바늘을 사용하여 psule. </li><li> 1 밀리그램 / ㎖의 콜라게나 제 IV 및 40 μg / ml의 DNase의 I. 보충 된 750 ㎕의 배지를 함유 염기성 5 ㎖ 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브에 방해 림프절 조직을 이동시켜 </li><li> 각 튜브에서 하나의 멸균 자석 교반기를 추가합니다. </li><li> 37 ° C로 비커에 넣어 튜브는 물을 예열하고 30 분 동안 느린 속도 (1 라운드 / 초)에서 튜브를 저어. </li><li> 가열 플레이트 자석 교반기에서 튜브를 제거하고 림프절 조각이 정착 할 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 &quot;비 기질 세포&quot;풍부한 뜨는을 제거합니다. 참고 : T, B, 수지상 세포와 CD45의 분석 경우 - gp38 - CD31가 - 예상된다 &quot;비 기질 세포&quot;부분을 저장합니다. </li><li> 워시는 750 ㎕를 기본 매체로 한번 림프절 조직을 나머지. 참고 :이 단계는 면역 능력 마우스로 작업하는 경우에만 필요합니다. </li><li> 림프절 조각이 정착하자. </li><li> 제거비 기질 세포 부동 분수. </li><li> 750 ㎕의 기본 매체가 3.5 mg을 보충 림프절 조각에 추가 / ㎖ 콜라게나 D 40 μg / ml의 DNase의 I. </li><li> 다시 37 ° C가 들어있는 비커에 넣어 튜브는 물을 예열. </li><li> 천천히 교반하면서 5 분 동안 림프절 조직 다이제스트. </li><li> 피펫 및 자동화 된 멀티 채널 피펫을 사용하여 최대한의 속도로 10 회 700 μl를 혼합하여 해리하는 림프절 조직 조각. NOTE :이 소화를 향상시키기 림프절 조직을 방해. </li><li> 37 ° C 예열 된 물을 다시 비커에 튜브를 놓습니다. </li><li> 천천히 교반하면서 또 10 분간 다이제스트 림프절 조직 단편. </li><li> 피펫에 의해 림프절 조직 조각을 해리하는 자동화 된 멀티 채널 피펫을 사용하여 최대한의 속도로 99 사이클 혼합. </li><li> 단일 세포 현탁액의 유지 보수를 보장하기 위해 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 7.5 μl를 추가합니다. </li><li> 파이프에 의해 해리하는 림프절 조직 절편tting 및 자동화 된 멀티 채널 피펫을 사용하여 최대한의 속도로 99 사이클 혼합. </li><li> 750 ㎕의 기본 매체를 추가하고 70 μm의 나일론 메쉬를 통해 세포를 전달합니다. </li><li> 원심 분리기 세포 현탁액 1500 XG에 5 분, 4 ° C에서. </li><li> 간질 세포를 추가 분석을 위해 이제 사용될 수있다. </li></ol> 림프절 기질 세포의 2 염색 <ol><li> 성공적 TRC, LEC, BEC 및 DN 세포를 인식하는 항-CD45, 항 podoplanin (gp38), 항-CD31 항체의 조합을 사용한다. </li><li> , 안티 gp38-PE (1 : 200), 항 CD31-APC (1 : 200) 100 ㎕를 HBSS의 2를 포함 : 라이브 / 죽은 추적기, 항 CD45-FITC (200 일)로 소화 림프절 조직을 품어 어둠 속에서 20 분 이상, 4 ° C에 대한 % FCS. </li><li> 2 % FCS를 포함 HBSS의 5백리터를 추가 세포를 씻으 </li><li> 원심 분리기 세포 현탁액 1500 XG에 3 분, 4 ° C에서. </li><li> 2 % FCS를 포함 HBSS 100 ㎕에 다시 일시 중지합니다. </li><li> equipp 플로우 사이토에 염색 된 세포를 실행다음 광학 에드 : 여기까지 세 레이저를 소스 : 청색 (488 nm의, 공기 냉각, 20 mW의 고체 상태), 적색 (파장 633 nm, 17 mW의 헬륨 네온), 바이올렛 (405 나노 미터, 30 mW의 고체 상태) . </li><li> 게이트 CD45 - 세포는 조혈 세포를 제외합니다. </li><li> 게이트 단봉 (FSC-W) 및 살아있는 세포 (LIVE / DEAD 추적기) 이중선과 죽은 세포를 제외합니다. </li><li> , LEC (gp38 + CD31 +), BEC (gp38 - CD31 +) 및 DN (gp38 - CD31 -) 세포 (그림 1 참조) - CD31 대 플롯 gp38는 TRC (gp38 + CD31)를 시각화합니다. </li></ol>

<ol><li>Mueller, S. N., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+stroma+in+the+initiation+and+control+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses.</a> Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).</li>
<li>Roozendaal, R., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+Cell+-+Immune+Cell+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stromal Cell - Immune Cell Interactions.</a> Annual Review of Immunology. 29 (1), 23-43 (2011).</li>
<li>Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stromal+and+haematopoietic+antigen-presenting+cells+that+reside+in+secondary+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (12), (2010).</li>
<li>Bajénoff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell+networks+regulate+lymphocyte+entry%2C+migration%2C+and+territoriality+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes.</a> Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).</li>
<li>Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+fibroblastic+reticular+cells+construct+the+stromal+reticulum+via+contact+with+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 200 (6), 783-795 (2004).</li>
<li>Link, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+in+lymph+nodes+regulate+the+homeostasis+of+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells.</a> Nature Immunology. 8 (11), 1255-1265 (2007).</li>
<li>Malhotra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+stroma+from+inflamed+and+resting+lymph+nodes+defines+immunological+hallmarks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks.</a> Nature Immunology. 13 (5), 499-510 (2012).</li>
<li>Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph-borne+chemokines+and+other+low+molecular+weight+molecules+reach+high+endothelial+venules+via+specialized+conduits+while+a+functional+barrier+limits+access+to+the+lymphocyte+microenvironments+in+lymph+node+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex.</a> The Journal of experimental medicine. 192 (10), 1425-1440 (2000).</li>
<li>Sixt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conduit+system+transports+soluble+antigens+from+the+afferent+lymph+to+resident+dendritic+cells+in+the+T+cell+area+of+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node.</a> Immunity. 22 (1), 19-29 (2005).</li>
<li>MartIn-Fontecha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendritic+cell+migration+to+the+draining+lymph+node%3A+impact+on+T+lymphocyte+traffic+and+priming%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming.</a> The Journal of experimental medicine. 198 (4), 615-621 (2003).</li>
<li>Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexpression+of+the+chemokines+ELC+and+SLC+by+T+zone+stromal+cells+and+deletion+of+the+ELC+gene+in+the+plt%2Fplt+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (23), 12694-12699 (2000).</li>
<li>Braun, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Afferent+lymph-derived+T+cells+and+DCs+use+different+chemokine+receptor+CCR7-dependent+routes+for+entry+into+the+lymph+node+and+intranodal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration.</a> Nature Immunology. 12 (9), 879-887 (2011).</li>
<li>Fletcher, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+isolation+of+lymph+node+stromal+cells+reveals+site-dependent+differences+in+fibroblastic+reticular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells.</a> Frontiers in immunology. 2, 35(2011).</li>
<li>Lukacs-Kornek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+release+of+nitric+oxide+by+nonhematopoietic+stroma+controls+expansion+of+the+activated+T+cell+pool+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes.</a> Nature Immunology. 12 (11), 1096-1104 (2011).</li>
<li>Siegert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+from+lymph+nodes+attenuate+T+cell+expansion+by+producing+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide.</a> PLoS ONE. 6 (11), e27618(2011).</li>
<li>Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T+cell+priming+by+lymphoid+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Regulation of T cell priming by lymphoid stroma.</a> PLoS ONE. 6 (11), e26138(2011).</li>
<li>Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+direct+local+differentiation+of+regulatory+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells.</a> Immunity. 21 (6), 805-816 (2004).</li>
<li>Onder, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-specific+lymphotoxin-%CE%B2+receptor+signaling+is+critical+for+lymph+node+and+high+endothelial+venule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation.</a> The Journal of experimental medicine. 210 (3), 465-473 (2013).</li>
<li>Fletcher, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+fibroblastic+reticular+cells+directly+present+peripheral+tissue+antigen+under+steady-state+and+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions.</a> The Journal of experimental medicine. 207 (4), 689-697 (2010).</li>
<li>Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+stroma+broaden+the+peripheral+tolerance+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm.</a> Trends in Immunology. 32 (1), 12-18 (2011).</li>
<li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node-resident+lymphatic+endothelial+cells+mediate+peripheral+tolerance+via+Aire-independent+direct+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).</li>
<li>Lee, J. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+antigen+display+by+lymph+node+stroma+promotes+T+cell+tolerance+to+intestinal+self%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self.</a> Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).</li>
<li>Nichols, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletional+self-tolerance+to+a+melanocyte%2Fmelanoma+antigen+derived+from+tyrosinase+is+mediated+by+a+radio-resistant+cell+in+peripheral+and+mesenteric+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes.</a> J Immunol. 179, 993-1003 (2007).</li>
<li>Gardner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletional+tolerance+mediated+by+extrathymic+Aire-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells.</a> Science. 321, 843-847 (2008).</li>
<li>Gardner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymic+Aire-expressing+cells+are+a+distinct+bone+marrow-derived+population+that+induce+functional+inactivation+of+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells.</a> Immunity. 39, 560-572 (2013).</li>
<li>Magnusson, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+presentation+of+antigen+by+lymph+node+stromal+cells+protects+against+CD8+T-cell-mediated+intestinal+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity.</a> Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).</li>
<li>Tewalt, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+endothelial+cells+induce+tolerance+via+PD-L1+and+lack+of+costimulation+leading+to+high-level+PD-1+expression+on+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells.</a> Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

림프절 기질 세포의 연구는 최근에 의한 소화 작용이 발행 프로토콜 6,13의 개발에 연구 초점이되었다. 두 프로토콜은 단일 림프절 간질 세포를 획득하기에 적절하지만, 소화 효소의 이용과 소화의 시간 차이가있다. 기질 세포와 그 표면 마커 효소 소화와 기계적 스트레스에 민감하기 때문에, 최적화 된 프로토콜이 필요합니다. 갓 해부 림프절에서 가능한 림프절 기질 세포의 분리는 표현형 및 기능 분석을 수행하기 위해 첫 번째 단계이다. 따라서 신중 안정된 온도에서 지시 된 시간 동안, 효소의 농도 다이제스트 정의하는 것이 중요하다. 두 소화 프로토콜 그러나 약간 긴 소화 단계, 6,13를 설명 하였다. 소화 시간을 줄이기 위해 기계적 세분화 포함하고 멀티 채널 피펫을 사용하여 표준화 하였다. 에<html> 현재 프로토콜의 장점은 전자 따라서 소화 효소와의 배양 시간을 최소화, 45 분에서 기질 세포의 분리를 허용하는 것이다. 또한, 소화 동안 일...

림프절은 외국과 자기 항원에 대한 적응 면역 반응이 시작되고 조정되는 전문 구획입니다. 여기에 제시된 절차 림프절 단일 세포 현탁액을 수득하고 여러 분자의 표면 발현을 유지 가능한 림프절 기질 세포에 접근하기 위해 자동화 된 기계적인 피펫 결합 단편의 효소 소화를 설명한다. 림프절 기질 세포가 세 가지 주요 기능을 림프 노드의 골격을 형성하고 이행 : 첫째가 체액 항원, 병원균과 병원균 관련 분자 패턴 (PAMPS)뿐만 아니라, 사이토 카인 및 위험 관련 분자 패턴을 샘플링 필터 (감쇠) 본 몸에. 둘째, 상호 작용 및 적응 면역 반응을 시작하는 항원 제시 세포 (APC)와 림프구를 유치하고 지시; 셋째, 이들은 하나의 림프구 항상성 및 분화 구조 환경을 제공-3입니다. 염증 림프절 기질 세포는 성장 인자, 사이토 카인 및 케모카인을 생산하는 동안, 수지상 세포 간의 상호 작용을 편성함으로써, T- 및 B- 세포 종기에 적응. 면역 반응의 오케스트레이션으로 인해 서로 다른 기질 세포 집단에 의해 형성되는 복잡한 구조 아키텍처에만 가능합니다. 림프절 간질 세포가 CD45 음성 세포와 섬유 모세포하며 내피 세포 1-6에서 CD31의 발현 또는 gp38에 의해 구별 될 수있다. CD31 + 혈액 내피 세포를 정의 (BEC)를 - gp38 + CD31 + 림프 내피 세포 (LEC), gp38를 정의 - Gp38 + CD31는 (섬유 모세포 망상 세포 또한 FRC로 알려진 TRC) T 존 망상 세포를 정의합니다. 또한, 특정 집단의 특성은 다른 림프절 기질 세포의 존재를 한 것으로 밝혀졌습니다. 실제로 작은 주연 세포와 같은 세포 집단은 내에 특성화시켰다gp38 - CD31 - 인구 7. 따라서, 분리 절차의 적응은 다른 림프절 기질 세포의 기능적 특성의 확인 및 특성화를 위해 유리하다. 림프절 기질 세포 소화 개발 전에 림프절 기질 세포의 연구는 조직 절편 및 현미경을 이용한 관찰에 시츄로 제한 프로토콜. 그럼에도 불구하고, 구조적 및 기능적 연구는 림프절 기질 세포의 중요한 특성을 보였다. 림프절 기질 세포는 높은 내피로 림프절의 낭하 부비동에서 림프와 연관된 낮은 분자량 단백질을 수송 도관 시스템이라고 복잡한 3 차원 구조를 형성하기 위해 podoplanin, 콜라겐과 세포 외 기질 (ECM) 단백질과 연결된 T 세포 영역에서 8 세정맥. 수지상 세포는 간질에 밀착되고 관형 콘으로 돌출 관찰 될 수있다duit 구조는 유체 샘플 8 및 항원을 검출한다. 수지상 세포와 림프절 기질 세포 (TRC를 사용해 및 수정체 상피)의 상호 작용은 케모카인의 CCL21와 CCL19 9, 10의 출시와 프리젠 테이션에 의해 매개된다. CCL19와 CCL21은 림프절의 T 세포 영역 4,11로 이전 수지상 및 T 세포를 촉진 CCR7 수용체에 의해 인식됩니다. 비슷한 케모카인을 사용에도 불구하고, 수지상와 T 세포는 림프절 (12)에 서로 다른 이동 경로를 가지고있다. 나중에, 림프절 및 순수한 림프절 기질 세포의 분리의 소화 효소를 사용하여 기능적 연구는 상이한 림프절 간질 세포의 역할과 수지상 세포와 T / B 세포 6,13와 상호 작용하는 그들의 능력에 대해 수행 하였다. 우선, IFN-γ 생산 효과기 T 세포 및 림프절 기질 세포 사이의 크로스 토크는 보조 림프 기관 14-16에서 T 세포 반응과 확산을 저해하는 것으로 대사 산화 질소의 생산을 유도한다. 둘째, 림프 N송시 기질 세포는 IL-10 (17)의 생산을 통해 규제 DC 서브 세트들의 분화를 지원하기 위해, 및 IL-7의 제조 6,18 통해 나이브 T 세포의 항상성을 조절하는 것으로보고되었다. 셋째, 림프절 기질 세포의 TLR 발현은 간질 세포가 조직 손상 중에 방출 감염 또는자가 유래의 분자 신호에 민감한 것을 시사한다. 실제로, TLR3 폴리 리간드와 림프절 기질 세포의 치료 (I는 : C)의 결과, 주요 조직 적합성 복합체 클래스 I 발현 및 공동 억제 분자 PD-L1의 상향 조절의 완만 한 상향 조절을 유도하고 있지만 보조 자극 분자 주변 조직의 극적인 변화는 식 (19) 항원. 몇몇 그룹은 림프절 기질 세포가 말초 조직 항원을 발현하고 자기 반응성 T 세포의 19,21-27 내성을 유도 보였다. 따라서, 림프절 기질 세포 및 다른 이동성 재 사이의 상호 작용을 이해sident 림프절 세포는 염증 동안에 활성 또는 면역 반응의 억제를 허용하는 새로운 표적 분자를 찾는 데 도움이 될 것이다. 따라서, 림프절의 발행 효소 분리의 구현이 필요하다. 이전에 게시 된 프로토콜은 낮은 기계적 스트레스 6,19,20와 콜라겐 기반의 효소 소화의 다른 조합을 사용합니다. 그러나 소화 효소 나 소화 효소의 상이한 조합을 가진 긴 인큐베이션 활성화 상태를 분석하고 새로운 림프절 기질 세포를 식별하기 위해 필요한 다양한 표면 분자를 저하 될. 간질 세포 분석의 유형에 따라, 링크 프로토콜 또는 프로토콜 플레쳐 더 적합 할 수도있다. 설명 된 절차에서 다소 짧은 효소 소화가 가능한 림프절 기질 세포 표면 마커의 열화를 최소화하기 위해 자동화 된 기계식 세분화와 결합된다. 이 절차는 재현성이 높은 절연을 가능하게하고낮은 변동성과 95 % 이상의 생존으로 림프절 간질 세포 집단의 차이. 갓 절연 림프절 기질 세포는 시험 관내에서 직접 작용 분석을 수행하는 기질 세포 라인의 표면 마커의 발현, 단백질 분석, 전사 연구뿐만 아니라 설정에 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>LifeTechnologies-Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td></td><td></td><td>최종 농도 2%</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>시그마</td><td>499609</td><td>최종 농도 1.2mM</td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 IV</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td></td><td>>mg 건조 중량당 160단위, 최종 농도 1mg/ml</td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 D</td><td>Roche</td><td>11088882001에서 사용</td><td>3.5 mg/ml</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Roche에서 사용&nbsp;</td><td></td><td>40 &micro에서 11284932001 사용; g/ml</td></tr><tr><td>교반 자석</td><td>FAUST</td><td></td><td>5mm 길이-2mm &oslash;</td></tr><tr><td>폴리스티렌 둥근 바닥 튜브 5ml</td><td>Falcon-BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>가열 기능이 있는 자기 교반기</td><td>IKA-RCT 표준</td><td>9720250</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 100mm, 멸균</td><td>TPP</td><td>6223201</td><td></td></tr><tr><td>25G 바늘</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD45 Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>클론 30-F11</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD11c Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone N418</td></tr><tr><td>안티 마우스 Podoplanin Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 8.1.1</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD31 Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone MEC13.3</td></tr><tr><td> Eppendorf Xplorer plus, Multichannel</td><td>Eppendorf</td><td>4861 000.821/830</td><td>1.250 &micro; l 최대 볼륨</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD140a</td><td>Biolegend</td><td></td><td>클론 APA5</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD80</td><td>Biolegend</td><td></td><td>클론 16-10A1</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD40</td><td>Biolegend</td><td></td><td>클론 1C10</td></tr><tr><td>안티 마우스 I-Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>클론 AF6-120.1</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD274 (PD-L1)</td><td>Biolegend</td><td></td><td>클론 10F.9G2</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 수정 가능 근적외선 사각 염색 키트</td><td>Invitrogen</td><td>L10119</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐과 림프절 기질 세포의 분리

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

림프절을 포함한 2차 림프 기관은 림프구의 항상성, 활성화 및 분화를 위한 구조적 환경을 제공하는 기질 세포로 구성되어 있습니다. 이중 음성 세포 집단 내에서 접착 분자 CD31 및 당단백질 포도플라닌(gp38), T 영역 망상 세포 또는 섬유아세포 망상 세포, 림프 내피 세포, 혈액 내피 세포 및 FRC 유사 주피 세포의 발현에 의해 다양한 기질 세포 하위 집합이 확인되었습니다. 모든 집단에 대해 서로 다른 구획의 분리 및 내벽, 다른 세포 유형의 인력 및 상호 작용, 배출 유체의 여과 및 림프관의 수축을 포함한 다양한 기능이 설명됩니다. 지난 몇 년 동안 여러 그룹에서 숙주에 잠재적으로 위험할 수 있는 세포독성 T 세포 반응을 조정하고 조절하는 기질 세포의 추가 역할을 설명했습니다. 
림프절은 다양한 세포 유형을 가진 복잡한 구조이므로 원하는 세포 집단을 분리하기 위한 적절한 절차가 필요합니다. 현재 림프절 기질 세포를 분리하기 위한 프로토콜은 다양한 배양 시간을 가진 효소 소화에 의존합니다. 그러나 기질 세포와 그 표면 분자는 이러한 효소에 민감하여 표면 마커 발현이 손실되고 세포가 사멸합니다. 여기에서는 표면 분자 발현을 유지하는 림프절 기질 세포의 생존 가능한 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 자동화된 기계적 파괴와 결합된 짧은 효소 분해 프로토콜이 제안됩니다.

본 프로토콜로 인해 자동화 된 멀티 채널 피펫 기계 세분화에 짧은 소화 시간 (45 분 최대)로 링크 등., 2007 (6)에 의해 발표 된 수정 소화 프로토콜입니다. 또한, 상기 절차는, 더 표준화 상이한 림프절 기질 세포에 표면 마커의 열화를 최소화하고 동시에 하나 이상의 샘플의 처리를 허용한다. 의 콜라겐 IV와 콜라게나 D는 플레처 프로토콜 13에서 링크 프로토콜 6 현재 프로토콜 또는 콜라게나 P와 디스 파제는 림프절 기질 세포의 생존 능력을 유지하고, CD45, gp38 및 CD31 등 여러 가지 표면 마커의 소화를 아끼지. 테스트하려면 현재 프로토콜, 겨드랑이, 서혜부와 위팔 림프절을 제거하고, 자신들의 간질 세포를 분리하기 위해 절단되었다. CD45, gp38 및 CD31 발현의 분석은 C57BL / 6m에서 격리 TRC, LEC, BEC 및 DN 세포의 존재를 입증얼음 (...

림프절 기질 세포의 분리는 섬유아세포 망상 세포, 림프 및 혈액 내피 세포를 얻기 위한 효소 분해 및 기계적 분해를 포함하는 다단계 절차입니다. 설명된 절차에서는 짧은 분해와 자동화된 기계적 분해를 결합하여 생존 가능한 림프절 기질 세포의 표면 마커 저하를 최소화합니다.

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

이 절차의 전반적인 목표는 림프절 기질 세포를 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 림프절 캡슐을 파괴함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 림프절 단편을 콜라겐분해효소 4와 D nase 1로 분해합니다.그런 다음 효소를 콜라겐분해효소 D 및 D nase 1로 대체하고 단편을 자동화된 다채널 피펫으로 기계적으로 분해합니다. 궁극적으로, 분리된 림프절 세포의 세포 표면 분자 발현은 유세포 분석으로 특성화할 수 있습니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 방법을 사용하면 세포의 생존력과 표면 분자 발현을 보존하는 기계적 분해로 보완된 표준화된 효소 절차를 사용하여 림프절 SHR 세포를 소화할 수 있다는 것입니다.먼저 절개된 림프절을 2밀리리터의 얼음처럼 차가운 배지가 들어 있는 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 25게이지 바늘이 장착된 1밀리리터 주사기 2개를 사용하여 림프절 캡슐을 파괴합니다. 다음으로, 파괴된 조직을 콜라겐분해효소 4와 DNA 1 및 자기 교반이 보충된 750마이크로리터의 배지가 들어 있는 5밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.그런 다음 자석 교반기에 섭씨 37도로 예열된 물이 담긴 비커에 튜브를 넣고 30분 동안 1초에 한 번씩 세포 슬러리를 저어줍니다. 교반 후 림프절 단편을 가라앉힌 다음 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 이제 비 기질 세포를 위해 풍성하게 해, 림프절 파편에 신선한 매체의 750 마이크로리터를 옮기고, collagenase D와 D nase 1로 보충하고, 그 후에 37 섭씨 온도에 또 다른 5 분 동안 조직을 약동한다.다음으로, 자동 멀티채널 피펫을 사용하여 700마이크로리터 용량의 림프절 조직 조각을 최대 속도로 10회 동안 분해한 다음 10분 후에 조직 조각을 다시 교반합니다. 또한 최대 속도로 99회 동안 자동화된 멀티 채널 피펫으로 조직 덩어리를 분해합니다. 그런 다음 7.5마이크로리터의 0.5몰 EDTA를 튜브에 추가하고 조직 현탁액을 자동 피펫으로 99회 더 혼합합니다.마지막 분해 주기 후, 세포 용액에 750마이크로리터의 배지를 추가하고 70마이크로미터 나일론 메쉬를 통해 세포를 여과합니다. 그런 다음 1500Gs 및 섭씨 4도에서 5분 동안 셀을 펠릿화합니다. 유세포 분석으로 림프절 기질 세포 집단을 시각화하려면 어두운 곳에서 섭씨 4도에서 최소 20분 동안 2%FCS를 함유한 100마이크로리터의 HBSS에 있는 살아있는 죽은 추적기와 관심 항체로 적절한 세포 샘플을 염색합니다.그런 다음 FCS로 500마이크로리터의 HBSS에서 세포를 세척하고 재현탁합니다. HBSS 및 FCS 100마이크로리터의 펠릿은 조혈 세포를 배제하기 위해 CD 45 양성 세포를 게이팅하는 유세포 분석기에서 세포를 실행한 다음 살아있는 단일 세포 집단에서 보행합니다. 마지막으로, GP 38 대 CD 31을 플롯하여 T-zone 망상 세포, 림프 내피 세포, 혈액 내피 세포 및 이중 음성 세포를 시각화합니다.세포 집단. 림프절 기질 세포 하위 집합의 소화 후 회복된 총 세포 수는 링크 및 플레처 프로토콜에 비해 방금 시연된 프로토콜에서 약간 더 높았으며, 이는 이 프로토콜에 의한 분리 후 림프절 기질 세포의 생존력이 발표된 프로토콜을 사용하여 회복된 것과 유사함을 보여줍니다. 이것과 링크 및 플레처 프로토콜을 통해 분리된 T-zone 망상 세포 및 림프 내피 세포를 IAB CD 1, CD 80, PD L 1 및 CD 40 발현에 대해 비교했습니다.5개 표면 분자 모두의 발현은 방금 제시된 프로토콜과 두 기질 세포 부분 집합에 대한 링크 프로토콜로 소화 시 더 높았으며, 이는 콜라겐분해효소 4 및 D에 의한 일부 표면 분자의 분해가 콜라겐분해효소 p 및 DYS 공간보다 덜 강력하다는 것을 시사합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 림프절 기질 세포의 4가지 주요 하위 집단을 성공적으로 분리하는 동시에 추가 특성 분석 및 분석에 유용한 여러 표면 분자의 발현을 보존하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

isolation-of-murine-lymph-node-stromal-cells

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Miltenyi 맥스 키트를 사용 lymphocytes의 격리는 전체 림프 조직 homogenates에서 세포를 정화하는 안정적인 방법입니다. Miltenyi 시스템을 사용하여 정화 세포는 일반적으로 ≥ 96% 순수하고 있습니다. 여기, 우리는 CD4 + T 세포, Miltenyi에서 제공하는 많은 키트 중 하나를 분리하기 위해 취한 단계를 보여줍니다.

CD4의 분리 + Miltenyi 맥을 정제를 사용하여 마우스 림프절에서 T 세포

마우스 성기 기관에서 림프구를 분리 할 수​​있는 효과적인 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 효율적으로 분리 할 수​​ 있도록 효소 분해와 Percoll 기울기 분리에 활용합니다. 이 기술은 다른 종에 사용하기 위해도에 적용 할 수...

마우스 성기 요로 점막에서 림프구의 분리

다른 T 세포의 하위 집합에서 별개의 이펙터 기능으로, TH17 세포는 중앙 염증성자가 면역 질환에 연루되어있다. 이 체외 TH17 분화 프로토콜은 순진 CD4 + T 림프구는 TH17 세포로 분화 할 수 있고, 또한자가 면역 및 호스트 응답에서 자신의 역할을 조사할지 여부를 결정하는 방법을 제공합니다.

분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

림프절 기질 세포 기원 연구를 위한 림프절/지방 패드 키메라의 생성이 설명됩니다. 이 방법은 신생아 마우스와 배아 지방 패드에서 림프절을 분리하고, 키메라 림프절 지방 패드를 생성하고, 숙주 마우스의 신장 캡슐 아래로 림프절을 옮기는 것입니다.

림프절 기질 세포 기원 연구를 위한 림프절 지방 패드 키메라의 생성

여기에서 우리는 분리, 식별 및 마우스 흉선 상피 세포 (TEC는) 정화용 효율적인 방법을 설명합니다. 프로토콜은 정상 T 세포의 발달, 흉선 기능 장애, 및 T 세포 재구성을위한 흉선 기능의 연구에 활용 될 수있다.

격리, 식별 및 쥐과 흉선 상피 세포의 정화

장 림프구의 정량적 특성화에 대한 관심이 높아지고 있는데, 이는 이러한 세포가 다양한 장 및 전신 질환에서 중요한 역할을 한다는 인식이 높아짐에 따라 발생합니다. 이 프로토콜에서는 후속 유세포 분석 특성 분석을 위해 다른 소장 구획에서 단일 세포 집단을 분리하는 방법을 설명합니다.

쥐 소장 림프구의 분리 및 유세포 특성

림프구는 적응 면역 반응의 주요 플레이어입니다. 여기에서는 in vitro 및 in vivo에서 원하는 분자의 림프구 활성화의 생리학적 기능을 결정하기 위한 림프구 정제 프로토콜을 제시합니다. 설명된 실험 절차는 대조군 림프구와 유전자 변형 림프구 간의 기능적 능력을 비교하는 데 적합합니다.

분리 및 쥐 림프구의 활성화

여기 창 자 연관 된 림프 조직 Peyer의 패치 및 배수 mesenteric 림프절을 포함 하 여 유도 사이트와 lamina propria 포함 이펙터 사이트에서 세포의 고립에 대 한 자세한 프로토콜 설명 및 작은 장 면역 시스템의 장 상피입니다.

마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

이 논문은 진피 림프 모세혈관에서 쥐 내피 세포의 자기 비드 기반 분리 방법을 설명합니다. 분리된 림프 내피 세포는 다운스트림 in vitro 실험 및 단백질 발현 분석에 사용할 수 있습니다.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation(Murine 피부 림프 내피 세포 분리)

여기에서는 쥐 뼈, 골수, 흉선 및 단일 세포 다생물체학(single-cell multiomics)과 호환되는 인간 흉선 조직에서 기질 세포를 분리할 수 있는 프로토콜을 제시합니다.

조혈 장기에서 기질 세포 분리(Stromal Cell Isolation from Hematopoietic Organs)

이 프로토콜은 장간막 림프절 사슬의 네 개 스테이션 각각에서 안전하고 잘 내약하는 쥐 장간막림프절 절제술의 생존 절차를 설명합니다. 이 절차는 원위 대장, 근위 대장 및/또는 소장과의 림프 통신을 선택적으로 방해할 수 있도록 조정 가능합니다.

특정 장과 관련된 림프 통신의 선택적 교란을 위한 쥐 장간막 림프절출술

배우세요 쥐 림프절 기질 세포 분리법을 효소 소화와 기계적 분해를 통해 세포 생존율과 표면 마커를 보존하는 방법입니다. 이 기술은 면역학 연구에 필수적인 표준화된 세포 분리 절차를 제공합니다.

쥐과 림프절 기질 세포의 분리

더 많은 동영상 탐색