Name: TIRF 현미경을 통해 단일 이벤트 해상도에서 G 단백질 결합 수용체의 Clathrin 매개 엔도 시토 시스를 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: 배우세요 TIRF 현미경을 이용해 살아있는 세포에서 클라트린 매개 엔도시토시스의 단일 이벤트 역학을 시각화하고 정량화하는 방법을. G단백질 결합 수용체의 세포내 수용 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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저자는 기술적인 도움과 조언을 제공해 준 Imaris, R. Vistein, D. Shiwarski 박사, 그리고 시약과 유익한 토론을 해준 Dr. M von Zastrow, Dr. T Kirchhausen, Dr. D Drubin, and Dr. W Almers에게 감사의 뜻을 전한다. T32에서 제공하는 자금은 SLB와 NIH DA024698에 NS007433하고 MAP에 DA036086 제공합니다.

<ol><li>McMahon, H. T., Boucrot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+and+physiological+functions+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).</li>
<li>Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular+Design+for+the+Clathrin-+and+Actin-Mediated+Endocytosis+Machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery.</a> Cell. 123 (2), (2005).</li>
<li>Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High+Precision+Survey+of+the+Molecular+Dynamics+of+Mammalian+Clathrin-Mediated+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis.</a> PLoS Biology. 9 (3), (2011).</li>
<li>Ungewickell, E., Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+units+of+clathrin+coats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly units of clathrin coats.</a> Nature. 289 (5796), 420-422 (1981).</li>
<li>Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-like+protein+encoded+by+the+Drosophila+shibire+gene+associated+with+vesicular+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic.</a> Nature. 351 (6325), (1991).</li>
<li>Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+self-assembles+into+rings+suggesting+a+mechanism+for+coated+vesicle+budding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding.</a> Nature. 374 (6518), (1995).</li>
<li>Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+between+Clathrin-Coated-Pit+Invagination%2C+Cortactin+Recruitment%2C+and+Membrane+Scission+Observed+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells.</a> Cell. 121 (4), 593-606 (2005).</li>
<li>Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SH3+domain+of+amphiphysin+binds+the+proline-rich+domain+of+dynamin+at+a+single+site+that+defines+a+new+SH3+binding+consensus+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence.</a> The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).</li>
<li>Tosoni, D., Puri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTP+Specifically+Regulates+the+Internalization+of+the+Transferrin+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor.</a> Cell. 123 (5), 875-888 (2005).</li>
<li>Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+Regulates+Clathrin-Coated+Pit+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics.</a> Cell. 127 (1), 113-124 (2006).</li>
<li>Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+modes+for+cargo-mediated+control+of+clathrin-coated+pit+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).</li>
<li>Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+endocytosis+by+phosphatidylinositol-3%2C4-bisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate.</a> Nature. 10, (2013).</li>
<li>Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+accessory+proteins+are+functionally+distinguished+by+their+differential+effects+on+the+maturation+of+clathrin-coated+pits%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).</li>
<li>Loerke, D., Mettlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+and+dynamin+regulate+clathrin-coated+pit+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation.</a> PLoS Biology. 7 (3), (2009).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).</li>
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<li>Ehrlich, M., Boll, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+by+random+initiation+and+stabilization+of+clathrin-coated+pits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits.</a> Cell. 118 (5), 591-605 (2004).</li>
<li>Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+actin+cytoskeleton+functions+at+multiple+stages+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).</li>
<li>Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+clathrin+and+adaptor+proteins+during+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis.</a> American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).</li>
<li>Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+clathrin-mediated+endocytosis+revealed+in+genome-edited+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).</li>
<li>Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Short+Polypeptide+Marker+Sequence+Useful+for+Recombinant+Protein+Identification+and+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Bio%2FTechnology%22%5BJournal%5D)">A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification.</a> Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
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<li>Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo-Mediated+Regulation+of+a+Rapid+Rab4-Dependent+Recycling+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway.</a> Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).</li>
<li>Batchelder, E. M., Yarar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Requirements+for+Clathrin-dependent+Endocytosis+at+Sites+of+Cell-Substrate+Adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).</li>
<li>Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Single+Endocytic+Events+Reveals+Diversity+in+Clathrin%2C+Dynamin+and+Vesicle+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics.</a> Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).</li>
<li>Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+analysis+of+low+signal-to-noise+images+link+dynamin+and+AP2+to+the+functions+of+an+endocytic+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint.</a> Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).</li>
<li>Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redistribution+of+caveolae+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Redistribution of caveolae during mitosis.</a> J Cell Sci. 124, 1965-1972 (2011).</li>
<li>Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+in+bacteria+and+archaea%3A+versatile+small+RNAs+for+adaptive+defense+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation.</a> Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).</li>
<li>Boch, J., Scholze, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+Code+of+DNA+Binding+Specificity+of+TAL-Type%5BTitle%5D)+AND+%22III+Effectors.+Science%22%5BJournal%5D)">Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type.</a> III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).</li>
</ol>

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여기에서 우리는 실시간으로 살아있는 세포에서 개별 CCPS의 수준에서 clathrin 매개 엔도 시토 시스 (CME)를 시각화하는 TIRFM의 사용을 설명합니다. CME는 많은 공간적으로 시간적으로 별도의 개별 이벤트의 누적 효과에 의해 매개 신속하고 매우 동적 인 이벤트입니다. 이러한 내재화의 생화학 적 측정과 같은 현재 사용되는 대부분의 분석법, 표면 바이오 티 닐화 또는 리간드 결합, 유동 세포 계측법 또는 내부화 단백질, 또는 단백질의 전자 현미경 지역화의 양을 측정 고정 세포 분석법을 사용하여, 고정 된 시점에서 단백질 지역화의 앙상블 변화를 모니터링 . 이러한 기존 방법은 CME 필요하지만 CME 혹은 다른 동적 막 거래 프로세스 생리 비늘 일치 공간 및 시간 해상도 부족 단백질을 확인하는데 매우 유용왔다. 최근의 증거는 CCPS가 단백질 구성 및 역학 9-1에서 이종 것을 알 수 있듯이이 중요하다2 및 CME 가능성 급속 공간적 이산 방식으로 조절된다. 생균 TIRFM은 살아있는 세포에서 실시간...

clathrin 매개 엔도 시토 시스 (CME)의 과정은 소체 1-3에화물을 수집하고 세포막을 조작 clathrin-매개 된 세포 내 이입 기계의 다양한 컴포넌트뿐만 도착 타이밍에 의존한다. CME는 엔도 시토 시스 1의 초기 사이트에서 함께 와서 막 변형 및화물 어댑터 단백질에 의해 시작된다. 이러한 단백질은 clathrin 코팅 피트 (CCP) (4)을 형성 새장 형 구조로 어셈블 외피 단백질 clathrin를 모집. CCP가 완전히 주로 큰 GTPase, dynamin의 작용을 통해 구형, 막 분열로 조립되면, 무료 clathrin 코팅 소포 (CCVS) 5,6를 생성합니다. 이러한 내재화는 구성 요소의 여러 CME 라운드 동안 재사용 될 수 있도록 clathrin 코트의 신속한 분해를 트리거한다. CME에 관여하는 단백질의 발견 및 특성화는 전통적인 생화학 뿌리되었습니다emical, 유전 및 현미경 기술 4-6,8. 이러한 분석법은 이러한 세포 내 이입 컴포넌트 역할과 상호 작용 지점을 해명 하였다. 인신 매매 기계의 필수 구성 요소를 정의하기위한 매우 유용하지만, 이러한 분석은 매우 CME 구성 요소 나화물 농도의 동적 동작을 캡처 제한됩니다. CME 정의 단계에서 단백질의 모듈 세트의 안무 조립체에 의해 구동되기 때문에 이것은 중요한 제한이 있으며, 개개의 세포 내 이입 이벤트 역학의 작은 변화는 세포 내 이입에 큰 누적 결과를 초래할 수 있기 때문이다. 또한, 최근의 데이터는 개별 CCPS이 과정의 생리적 조절이 높은 공간과 시간적으로 9-14 제약을 시사 조성과 행동 모두 다를 수 있음을 나타냅니다. 각각의 세포 내 이입 이벤트를 시각화 따라서, CME에 관련된 여러 중복 단백질과 방법이 단백질을 제어 할 수 있습니다 B가 이유를 이해하는 것이 필수적입니다Y 생리 학적 신호는화물 국제화를 조절합니다. 여기에서 우리는 살아있는 세포의 개별 CCPS의 역학의 수준에서 CME를 관찰하는 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)의 사용을 설명합니다. TIRFM는 유리 커버 슬립 셀 (15, 16)의 유체 환경 사이의 굴절율의 차이에 의존한다. 여기 광이 임계각 이상에서 세포쪽으로 이동 될 때, 내부적으로는 커버 슬립 위에 약 100 nm의 연장 조명 얇은 필드를 유지 소멸 파를 생성 반사된다. 이것은이 좁은 필드 내에서만 형광 분자가 흥분 보장합니다. 실제적으로, 이것은 나 세포막 근처 형광 물질의 여기를 허용하고, 셀의 내부 부분으로부터 형광을 최소화한다. 이것은 세포막 공동에서 이벤트를 시각화하는 상당히 높은 신호 대 잡음비 및 z 축 해상도를 제공종래의 표면 형광 또는 공 초점 형광 현미경으로 더 일반적으로 사용되는 모드로 mpared. 우리는 또한 입문 실용 레벨에서 설명하는, 일반적으로 사용되는 이미지 분석 플랫폼의 사용을 분석하고 간단한 형태 학적 특징 및 개별화물 세포 내 이입 이벤트 역학을 정량한다.

<table><tbody><tr><td>L-글루타민 및 피루브산 나트륨이 함유된 DMEM/고포도</td>당 <td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>SH3024301</tr><tr><td>Dulbecco의 인산 완충 식염수(DPBS), 칼슘 없음, 마그네슘</td><td>없음 Gibco, Life Technologies</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Free Acid</td><td>Amresco</td><td>0322-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco, Life Technologies 10437-028</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz의 L-15 배지, 페놀 레드</td><td>Gibco 없음, Life Technologies</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>CellPURE Fisher Scientific</td><td>BP2937-100</td><td></td></tr><tr><td>Effectene</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td>Transfection 시약</td></tr><tr><td>25mm 커버 글라스</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-86</td><td></td></tr><tr><td>Corning 세포 배양 처리 플라스크, 25cm2</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-28</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 6웰 플레이트</td><td>Greiner Bio-One, by VWR</td><td>82050-896</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal ANTI-FLAG M1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3040-5MG[</td><td></td></tr><tr><td>D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7384-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 단백질 라벨링 키트</td><td>Life Technologies</td><td>A20173</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Imaris 이미지 분석 소프트웨어</td><td>BitPLane</td><td></td><td>http://www.bitplane.com/imaris/imaris, 자동 분석용</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti 도립 현미경 및 필터 큐브 및 필터를 포함한 필수 액세서리</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon TIRF 암(필요한 어댑터 포함) Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td></td><td>입사각 조정용</td></tr><tr><td>iXon+ EMCCD 카메라 및 어댑터</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tirf 현미경을 통해 단일 ​​이벤트 해상도에서 g 단백질 결합 수용체의 clathrin 매개 엔도 시토 시스를 시각화

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

많은 중요한 신호 수용체는 잘 연구된 클라트린 매개 세포내이입(CME) 과정을 통해 내재화됩니다. 세포내이입의 전반적인 변화를 측정하는 기존의 세포 생물학적 분석법은 CME에 참여하는 30개 이상의 알려진 성분을 확인했으며, 생화학 연구를 통해 이러한 성분 중 다수의 상호 작용 맵을 생성했습니다. 그러나 CME가 매우 역동적인 프로세스이며 규제가 복잡하고 미묘하다는 사실이 점점 더 분명해지고 있습니다. 이 원고에서는 TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용하여 이 과정을 매개하는 개별 이벤트 수준에서 살아있는 세포에서 실시간으로 clathrin 매개 내세포 세포 메커니즘 구성 요소의 역학을 직접 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 접근법은 생리학적 조절에서 볼 수 있듯이 세포내이입(endocytosis)을 전체적으로 차단하지 않고 세포내이입(endocytosis)을 변경할 수 있는 미묘한 변화를 밝히는 데 필수적입니다. 우리는 이 기술을 사용하여 새로운 관심 영역, 즉 뚜렷한 클라트린 코팅 피트(CCP)의 역학을 조절하는 화물 구성의 역할을 분석하는 데 중점을 둘 것입니다. 이 프로토콜은 널리 사용 가능한 다양한 형광 프로브와 호환되며 세포 표면에서 내재화된 많은 화물 분자의 역학을 시각화하는 데 적용할 수 있습니다.

사용 라이브 셀 TIRF 현미경 우리는 μ-오피오이드 수용체 (MOR)의 세포 내 이입 역학을 녹음 한, G-단백질 결합 수용체 (GPCR)와 세포 내 이입 어댑터 단백질 β-arrestin. β-arrestin 구조체는 일시적으로도 1에 설명 된 프로토콜을 사용하여 안정하게 발현하는 MOR 세포주에 형질 전환하고, 96 시간 후 묘화 하였다. 안정적인 세포주의 MOR은 N-말단의 pH에​​ 민감한 GFP 태그입니다. 이 형광 단백질은 중성 세포 외액에서 형광. 또한, MOR 번만 endocytoses 작용제에 의해 활성화하고, 그렇지 않으면 균일 원형질막을 가로 질러 분산 된 상태로 유지. 희미한 형광으로 채워진 셀에 공 초점 모드 결과에 커버 유리에 앉아 부착 세포막에 초점을 맞추고. 이것은 세포막 만 셀 주위 형광 링으로 볼 셀의 중심에 집중 다르다. 왼쪽 비교그림 2A에서 오른쪽 패널. 잘못된 각도로 기존의 표면 형광 또는 TIRF로 전환 그림 ...

Clathrin-mediated endocytosis는 빠르고 매우 역동적인 과정으로 신호 수용체를 포함한 많은 단백질을 내부화합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 개별 내포세포 이벤트의 동역학을 직접 시각화합니다. 이는 내포세포 기전의 핵심 구성원이 서로 어떻게 협력하는지, 그리고 단백질 화물이 이 과정에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 데 필수적입니다.

TIRF 현미경을 통해 단일 ​​이벤트 해상도에서 G 단백질 결합 수용체의 Clathrin 매개 엔도 시토 시스를 시각화

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 세포에서 개별 clathrin이 코팅된 피트의 역학을 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 형광 표지된 내포성 및 화물 단백질을 부착 세포주에 transection함으로써 이루어집니다. 다음 단계는 내부 전반사, 형광 또는 잔디 현미경으로 세포를 이미지화하는 것입니다.그런 다음 작은 세트의 clathrin 코팅 피트의 수명은 이미지 처리 및 분석 프로그램을 사용하여 수동으로 정량화됩니다. 마지막 단계는 객관적인 자동 검출 및 분석을 통해 clathrin 코팅 피트의 수명을 정량화하는 것입니다. 궁극적으로, 잔디 현미경 검사는 단일 이벤트 해상도에서 개별 클라트린으로 코팅된 피트의 역학을 정량화하여 G-단백질 결합 수용체의 클라트린 매개 세포내이입증을 조사하는 데 사용됩니다.이 방법은 존재하는 다양한 내포세포 단백질과 화물 단백질에 따라 세포내이입의 조립 및 역학이 어떻게 변할 수 있는지와 같은 막 수송 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저, HEC 2 93 세포를 태그 G 단백질 결합 수용체 또는 GPCR을 인코딩하는 플라스미드 및/또는 Claro 기계의 구성 요소로 transfection합니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 12웰 플레이트에 transfection 다음 날 0.5ml의 인산염 완충 식염수 또는 PBS와 1ml몰 EDTA를 각각 추가합니다.그런 다음 세 개의 라운드를 무균 25mm 덮개 슬립을 6의 별도 우물에 넣습니다. 웰 플레이트: 각 웰에 2ml의 매체를 채웁니다. 커버 슬립을 웰 바닥으로 부드럽게 밀어 커버 슬립 아래쪽에서 세포가 자라는 것을 방지합니다.다음으로, 12웰 플레이트의 웰을 수동으로 교반하여 웰 바닥에서 세포를 들어 올립니다. 10%FBS가 포함된 DM EM 1밀리리터를 추가하여 다시 보낼 수 있습니다. 그런 다음 하나의 웰에서 들어 올려진 세포를 세 개의 커버 슬립에 고르게 분배합니다.이미징 전에 최소 48시간 동안 커버 슬립에서 세포가 자랄 수 있도록 합니다. 또한 clathrin coated pit 및 cargo dynamics의 이미징을 위해 세포가 퍼져 있고 평평한지 확인합니다. 먼저, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 항체로 세포를 사전 배양합니다.그런 다음 한 쌍의 집게와 끝이 구부러진 25게이지 바늘을 고리에 삽입하여 커버 슬립을 라이브 셀 이미징 챔버로 옮길 준비를 합니다. 주로 사용하는 손으로 집게를 잡습니다. 구부러진 바늘을 다른 쪽으로 잡습니다.후크가 유리를 향해 아래쪽으로 구부러질 때까지 바늘을 돌립니다. 바늘 고리 쪽이 커버 슬립에 걸릴 때까지 6웰 플레이트의 바닥을 가로질러 아래로 부드럽게 끕니다. 커버 슬립의 표면이 긁히지 않도록 주의하면 세포가 분리됩니다.우물 바닥에서 덮개 슬립을 부드럽게 들어 올립니다. 지지를 위해 덮개 슬립을 우물 벽에 대고 균형을 잡습니다. 집게를 사용하여 커버 슬립의 가장자리 근처를 잡고 커버 슬립 셀 쪽을 이미징 챔버까지 위로 이동합니다.챔버를 조립하고 700마이크로리터의 예열 이미징 매체를 추가합니다. 챔버를 현미경으로 옮긴 후 잔디 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 기존 에피, 형광 또는 컨포칼 조명 모드의 세포를 이미지화하여 중요한 안전 예방 조치로 적절한 구조를 발현하는 세포를 식별하여 세포에 초점을 맞춥니다. 항상 레이저 빔의 각도를 인식하고 항상 관찰자로부터 멀어지도록 하십시오.다음으로, 세포 주위의 원형질막의 윤곽이 사라지고 세포의 바닥 표면이 나타날 때까지 발현 세포의 바닥 표면으로 초점을 맞춥니다. 이것은 뮤 오피오이드 수용체(mu opioid receptor)와 같은 원형질막(plasma membrane)에 국한된 화물 단백질에서 가장 분명하게 나타납니다. 기존의 epi 형광에서 이미징에 동일한 레이저를 사용하는 경우 초점을 벗어날 때까지 레이저의 입사각을 증가시킵니다.세포 내부의 형광이 사라지고 세포 주변의 원형질막의 윤곽이 보이지 않습니다. m 잔디에 들어가면 여기 레이저가 대물렌즈를 통해 다시 반사되고 대물렌즈 위에서 보이지 않는지 확인합니다. 레이저 스폿이 보이는지 확인하여 초점을 다듬어 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다.세포가 확인되면 10분 동안 최소 3초마다 이미지를 획득합니다. 모든 단계를 반복하여 추가 셀을 이미지화합니다. 내포역학 분석을 시작하려면 이미지 J.Images에서 파일을 엽니다.인터리프 채널 포함. 팝업 창에서 이미지 하이퍼 스택 및 스택 투 하이퍼 스택을 선택하여 이미지를 하이퍼 스택으로 변환합니다. 획득한 채널 수를 입력합니다.Zack에 대해 하나를 입력하고 동영상 프레임 수를 입력합니다. 하이퍼 스택 형식은 두 개의 스크롤 막대가 있는 창을 생성합니다. 상단 바를 사용하여 채널을 이동하고 하단 바를 사용하여 시간을 이동합니다.수명이 분석될 단백질의 채널로 스크롤합니다. 영화의 첫 번째 프레임을 넘어 전체 지속 시간이 보이지 않는 기존 클라트린 코팅 구덩이 또는 CCP의 포함을 줄입니다. 무작위로 선택한 지점 주위에 관심 영역 또는 ROI를 그립니다.스폿이 표시되는 프레임 수를 계산합니다. 물체 인식으로 분석을 시작하려면 기본적으로 이머지된 이미지 분석 소프트웨어에서 원시 이미지 파일을 엽니다. 컬러 이미지가 나타납니다.디스플레이 조정 창을 사용하여 채널의 밝기를 조정합니다. 채널 이름을 클릭하여 표시되는 색상을 변경합니다. 채널 옆에 있는 확인란의 선택을 취소하여 표시되지 않도록 합니다.주황색 반점이 있는 아이콘을 클릭하여 반점을 만듭니다. 이를 사용하여 셀 주변의 ROI를 선택하여 밝은 앞 가장자리와 플라크를 잘못 감지하는 영역을 제외합니다. 알고리즘에 대한 초기 추정치를 제공하기 위해 스폿의 지름을 측정합니다.슬라이스 모드로 전환하고 스폿의 극 끝을 클릭하여 지름을 측정합니다. 항복 전 형성 후 안정성의 높이에서 CCP를 나타내는 것처럼 보이는 4개 또는 5개의 둥근 반점에 대해 이 작업을 수행하고, 이러한 측정을 사용하여 미크론의 가장 가까운 10분의 1까지 평균 직경을 계산합니다. 스폿을 감지하려면 초과 모드로 돌아가는 지점을 감지하려면 적절한 감지 채널을 선택하십시오.측정된 평균 직경(일반적으로 0.3 또는 0.4미크론)을 입력합니다. 파란색 앞으로 화살표를 클릭하여 스팟을 수량화합니다. 배경 없이 가능한 한 많은 스팟을 캡처하도록 필터를 조정하여 품질별로 스팟을 필터링합니다.품질 필터는 기본적으로 선택되어 있습니다. 품질 곡선을 지침으로 사용하여 적절한 임계값을 설정합니다. 마우스 왼쪽 버튼으로 필터의 아래쪽 임계값을 곡선의 첫 번째 딥으로 이동합니다.이것은 필터의 좋은 시작점입니다. 이 위치는 일반적으로 눈에 보이는 지점으로만 감지를 구체화하기 때문입니다. 편집 스폿에서 arant 스폿 제거 화면 모드로 전환하고 해당 스폿을 클릭합니다 노란색으로 바뀐 후 삭제를 클릭합니다.그런 다음 파란색 화살표를 클릭하여 알고리즘 빌드를 계속합니다. 움직이는 브라우니에 트랙을 설정하여 트랙을 측정합니다. CCP는 어떠한 지시된 움직임도 나타내지 않아야 하며, 원형질막을 가로지르는 최소한의 표류만 보여야 합니다.이 알고리즘은 해당 모션에 가장 적합합니다. 그런 다음 최대 거리를 0.7미크론과 같은 작은 값으로 설정합니다. 거리를 작게 설정하면 인접 스폿의 연결이 최소화되고 CCP 또는 세포 이동을 통해 셀 스폿을 계속 추적할 수 있습니다.그런 다음 최대 간격 크기를 1로 설정합니다. 이렇게 하면 프레임이 하나만 누락된 경우 트랙을 계속할 수 있습니다. 연속적으로 갭 크기가 3개 이상이면 서로 다른 트랙이 잘못 연결됩니다.다음 단계는 트랙 보기를 드래곤 테일로 전환하는 것입니다. 동영상을 스크롤하여 감지 품질을 관찰합니다. 인접한 스폿이 연결되어 있는 경우 최대 거리를 0.7미크론 미만으로 줄이십시오.스팟이 너무 쉽게 분해되는 경우 최대 간격 크기를 늘리십시오. 파란색 화살표를 클릭하여 트랙을 만듭니다. 이렇게 하면 트랙을 필터링하는 필터 트랙 화면이 나타납니다.강도 필터를 사용하여 추가로 밝은 플라그를 제거합니다. 그런 다음 변위 필터를 사용하여 잔디밭에 들어가는 엔도솜을 제거합니다. 지점이 길면 변위도 길어지므로 주의하십시오.녹색 이중 화살표를 클릭하여 프로토콜을 완료합니다. 데이터를 내보내려면 통계 탭으로 이동합니다. 단일 플로피 디스크 아이콘을 클릭하여 선택한 통계를 내보냅니다.일련의 플로피 디스크처럼 보이는 아이콘을 클릭하여 모든 통계를 내보냅니다. A 부착 원형질막과 컨포칼 모드에 초점을 맞추면 희미한 형광으로 채워진 세포가 나타납니다. 대조적으로, 세포의 중심에 초점을 맞추면 원형질막이 세포 주위의 형광 고리로 드러납니다.초점에서 벗어난 형광은 기존의 epi, 형광 또는 잘못된 각도로 잔디로 전환할 때 분명해집니다. 잔디 각도가 정확하면 원형질막이 매우 선명하고 선명하며 밝으며 초점이 맞지 않습니다. 형광은 더 이상 이미지를 방해하지 않습니다.beta arrestin이 cytosolic 수영장에 있을 때, 잔디 분야에는 거의 없으며 흐릿하고 외부 초점으로 보입니다. MOR이 agonist, beta에 의해 활성화되면, arrestin이 원형질막으로 모집되고 beta arrestin과 수용체가 모두 CCP로 재분배됩니다. 이러한 클러스터의 수명은 수동으로 정량화됩니다.완료된 세포내이입에 대한 세 가지 매개변수를 사용하면 CCP를 나타내는 반점이 완전히 사라지거나, 깜박였다가 꺼지거나, 더 큰 구조를 끼울 수 있습니다. 여기에 표시된 바와 같이 MA를 사용하여 감지된 CCP는 비동적 플라크 구조를 제거하기 위해 필터링한 후, 오버레이된 흰색 구, 감지된 반점을 나타내고, 전체 수명 동안 감지할 수 없는 더 어두운 반점도 품질 필터로 제외되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 잔디 현미경을 사용하여 개별 카테터로 코딩된 구덩이를 시각화하는 방법을 정말 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

따라서, 그것이 관여 단백질의 공간적 및 시간적 행위를 파악하는 것이 중요 신호 전달 이해하기 위해, 플라즈마 막 내에서 또는 세포 내 위치에 두 단백질의 compartmentalization 크게 신호 결과에 영향을 미칠 수있는 규제 메커니즘입니다. 우리는 여기서 T 세포의 신호 전달을 연구하는 TIRF 현미경 기반 시스템을 설명하지만, 광범위하게 적용됩니다.

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 가까이 높은 콘트라스트와 시간적 해상도의 세포 표면 구조를 관찰하기위한 강력한 방법입니다. 우리는 TIRF은 세포 벽 - 동봉된 세균과 곰팡이 세포의 피질에서 단백질 역학을 공부 고용 수있는 방법을 보여줍니다.

미생물에 접속 조직 및 역학 시각화, 총 내부 반사의 형광 현미경을 사용하여

이 동영상은 액틴 및 미세소관 중합 역학을 시각화하기 위한 전반사 현미경 기반 기술인 TIRF에 대해 설명합니다. 이 방법을 사용하면 액틴과 미세소관 결합 역학의 고해상도 이미징을 실시간으로 수행할 수 있으며, 이는 세포 누화를 이해하는 데 필수적입니다.

액틴과 미세소관 결합 역학을 시각화하기 위한 TIRF 현미경 검사

이 비디오는 유리 바닥 접시 표면에 부착된 IgG-opsonized 적혈구(RBC)의 대식세포 매개 식세포작용 중 식체(phagosome) 형성 및 폐쇄를 실시간으로 시각화하기 위한 고해상도 TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경 기술을 보여줍니다. 대식세포는 적혈구 주위로 가성족(pseudopodia)을 확장하고 식체(phagosome) 내부를 삼켜 유리 표면에서 분리합니다.

TIRF 현미경 기반 식체 형성 및 폐쇄 시각화

출처: Winkle, CC, et al. 축삭 분지 및 신경 형태 형성 동안 원형질막 전달의 역할을 정의하기 위해 결합된 방법론을 활용합니다. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 피질 뉴런의 엑소 사이크 이벤트를 시각화하기 위한 TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 보여줍니다. pH에 민감한 녹색 형광 단백질(GFP) 마커는 소포 융합 시 형광을 발하며, 선택적 TIRF 여기는 타임랩스 이미징에서 막-근위 엑소사이토시스를 포착합니다.

엑소 세포 사건의 시각화를 위한 전반사 형광 현미경 

이 프로토콜은 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포 표면의 단일 수용체를 시각화 및 추적하여 수용체 측면 이동성, 수용체 복합체의 크기를 분석하고 일시적인 수용체-수용체 상호 작용을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 막 단백질로 확장될 수 있습니다.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

이 논문은 synaptobrevin2-pHluorin 구조체 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 신경모세포종 세포의 신경전달물질 소포 역학을 조사하는 방법을 제공합니다. 이미지 처리 및 데이터 분석을 위해 개발된 전략도 보고됩니다.

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

우리는 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 대식세포에서 전례 없는 고해상도 phagosome formation 및 close를 3차원으로 시각화하는 실험 설정을 설명합니다. 이를 통해 phagocytic cup의 기저부, 확장된 pseudopods, phagosome scission의 정확한 위치를 모니터링할 수 있습니다.

&quot;Phagosome 폐쇄 분석은&quot;사용하여 입체적으로 Phagosome 형성을 시각화하는 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)

pH가 민감한 형광으로 막 단백질의 세포 외 도메인에 레이블, superecliptic pHluorin (-9 월), 세포 내 현지화, 표현, 인신 매매를 결정할 수 있습니다. 촬상 전반사 형광 현미경 (TIRFM)으로 단백질을 -9 월 표지 주연 ER 및 세포막에서 단백질 농도의 정량 분석을 가능하게한다.

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

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배우세요 TIRF 현미경을 이용해 살아있는 세포에서 클라트린 매개 엔도시토시스의 단일 이벤트 역학을 시각화하고 정량화하는 방법을. G단백질 결합 수용체의 세포내 수용 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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