TIRF 현미경을 통해 단일 ​​이벤트 해상도에서 G 단백질 결합 수용체의 Clathrin 매개 엔도 시토 시스를 시각화

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 세포에서 개별 clathrin이 코팅된 피트의 역학을 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 형광 표지된 내포성 및 화물 단백질을 부착 세포주에 transection함으로써 이루어집니다. 다음 단계는 내부 전반사, 형광 또는 잔디 현미경으로 세포를 이미지화하는 것입니다.

그런 다음 작은 세트의 clathrin 코팅 피트의 수명은 이미지 처리 및 분석 프로그램을 사용하여 수동으로 정량화됩니다. 마지막 단계는 객관적인 자동 검출 및 분석을 통해 clathrin 코팅 피트의 수명을 정량화하는 것입니다. 궁극적으로, 잔디 현미경 검사는 단일 이벤트 해상도에서 개별 클라트린으로 코팅된 피트의 역학을 정량화하여 G-단백질 결합 수용체의 클라트린 매개 세포내이입증을 조사하는 데 사용됩니다.

이 방법은 존재하는 다양한 내포세포 단백질과 화물 단백질에 따라 세포내이입의 조립 및 역학이 어떻게 변할 수 있는지와 같은 막 수송 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저, HEC 2 93 세포를 태그 G 단백질 결합 수용체 또는 GPCR을 인코딩하는 플라스미드 및/또는 Claro 기계의 구성 요소로 transfection합니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 12웰 플레이트에 transfection 다음 날 0.5ml의 인산염 완충 식염수 또는 PBS와 1ml몰 EDTA를 각각 추가합니다.

그런 다음 세 개의 라운드를 무균 25mm 덮개 슬립을 6의 별도 우물에 넣습니다. 웰 플레이트: 각 웰에 2ml의 매체를 채웁니다. 커버 슬립을 웰 바닥으로 부드럽게 밀어 커버 슬립 아래쪽에서 세포가 자라는 것을 방지합니다.

다음으로, 12웰 플레이트의 웰을 수동으로 교반하여 웰 바닥에서 세포를 들어 올립니다. 10%FBS가 포함된 DM EM 1밀리리터를 추가하여 다시 보낼 수 있습니다. 그런 다음 하나의 웰에서 들어 올려진 세포를 세 개의 커버 슬립에 고르게 분배합니다.

이미징 전에 최소 48시간 동안 커버 슬립에서 세포가 자랄 수 있도록 합니다. 또한 clathrin coated pit 및 cargo dynamics의 이미징을 위해 세포가 퍼져 있고 평평한지 확인합니다. 먼저, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 항체로 세포를 사전 배양합니다.

그런 다음 한 쌍의 집게와 끝이 구부러진 25게이지 바늘을 고리에 삽입하여 커버 슬립을 라이브 셀 이미징 챔버로 옮길 준비를 합니다. 주로 사용하는 손으로 집게를 잡습니다. 구부러진 바늘을 다른 쪽으로 잡습니다.

후크가 유리를 향해 아래쪽으로 구부러질 때까지 바늘을 돌립니다. 바늘 고리 쪽이 커버 슬립에 걸릴 때까지 6웰 플레이트의 바닥을 가로질러 아래로 부드럽게 끕니다. 커버 슬립의 표면이 긁히지 않도록 주의하면 세포가 분리됩니다.

우물 바닥에서 덮개 슬립을 부드럽게 들어 올립니다. 지지를 위해 덮개 슬립을 우물 벽에 대고 균형을 잡습니다. 집게를 사용하여 커버 슬립의 가장자리 근처를 잡고 커버 슬립 셀 쪽을 이미징 챔버까지 위로 이동합니다.

챔버를 조립하고 700마이크로리터의 예열 이미징 매체를 추가합니다. 챔버를 현미경으로 옮긴 후 잔디 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 기존 에피, 형광 또는 컨포칼 조명 모드의 세포를 이미지화하여 중요한 안전 예방 조치로 적절한 구조를 발현하는 세포를 식별하여 세포에 초점을 맞춥니다. 항상 레이저 빔의 각도를 인식하고 항상 관찰자로부터 멀어지도록 하십시오.

다음으로, 세포 주위의 원형질막의 윤곽이 사라지고 세포의 바닥 표면이 나타날 때까지 발현 세포의 바닥 표면으로 초점을 맞춥니다. 이것은 뮤 오피오이드 수용체(mu opioid receptor)와 같은 원형질막(plasma membrane)에 국한된 화물 단백질에서 가장 분명하게 나타납니다. 기존의 epi 형광에서 이미징에 동일한 레이저를 사용하는 경우 초점을 벗어날 때까지 레이저의 입사각을 증가시킵니다.

세포 내부의 형광이 사라지고 세포 주변의 원형질막의 윤곽이 보이지 않습니다. m 잔디에 들어가면 여기 레이저가 대물렌즈를 통해 다시 반사되고 대물렌즈 위에서 보이지 않는지 확인합니다. 레이저 스폿이 보이는지 확인하여 초점을 다듬어 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다.

세포가 확인되면 10분 동안 최소 3초마다 이미지를 획득합니다. 모든 단계를 반복하여 추가 셀을 이미지화합니다. 내포역학 분석을 시작하려면 이미지 J.Images에서 파일을 엽니다.

인터리프 채널 포함. 팝업 창에서 이미지 하이퍼 스택 및 스택 투 하이퍼 스택을 선택하여 이미지를 하이퍼 스택으로 변환합니다. 획득한 채널 수를 입력합니다.

Zack에 대해 하나를 입력하고 동영상 프레임 수를 입력합니다. 하이퍼 스택 형식은 두 개의 스크롤 막대가 있는 창을 생성합니다. 상단 바를 사용하여 채널을 이동하고 하단 바를 사용하여 시간을 이동합니다.

수명이 분석될 단백질의 채널로 스크롤합니다. 영화의 첫 번째 프레임을 넘어 전체 지속 시간이 보이지 않는 기존 클라트린 코팅 구덩이 또는 CCP의 포함을 줄입니다. 무작위로 선택한 지점 주위에 관심 영역 또는 ROI를 그립니다.

스폿이 표시되는 프레임 수를 계산합니다. 물체 인식으로 분석을 시작하려면 기본적으로 이머지된 이미지 분석 소프트웨어에서 원시 이미지 파일을 엽니다. 컬러 이미지가 나타납니다.

디스플레이 조정 창을 사용하여 채널의 밝기를 조정합니다. 채널 이름을 클릭하여 표시되는 색상을 변경합니다. 채널 옆에 있는 확인란의 선택을 취소하여 표시되지 않도록 합니다.

주황색 반점이 있는 아이콘을 클릭하여 반점을 만듭니다. 이를 사용하여 셀 주변의 ROI를 선택하여 밝은 앞 가장자리와 플라크를 잘못 감지하는 영역을 제외합니다. 알고리즘에 대한 초기 추정치를 제공하기 위해 스폿의 지름을 측정합니다.

슬라이스 모드로 전환하고 스폿의 극 끝을 클릭하여 지름을 측정합니다. 항복 전 형성 후 안정성의 높이에서 CCP를 나타내는 것처럼 보이는 4개 또는 5개의 둥근 반점에 대해 이 작업을 수행하고, 이러한 측정을 사용하여 미크론의 가장 가까운 10분의 1까지 평균 직경을 계산합니다. 스폿을 감지하려면 초과 모드로 돌아가는 지점을 감지하려면 적절한 감지 채널을 선택하십시오.

측정된 평균 직경(일반적으로 0.3 또는 0.4미크론)을 입력합니다. 파란색 앞으로 화살표를 클릭하여 스팟을 수량화합니다. 배경 없이 가능한 한 많은 스팟을 캡처하도록 필터를 조정하여 품질별로 스팟을 필터링합니다.

품질 필터는 기본적으로 선택되어 있습니다. 품질 곡선을 지침으로 사용하여 적절한 임계값을 설정합니다. 마우스 왼쪽 버튼으로 필터의 아래쪽 임계값을 곡선의 첫 번째 딥으로 이동합니다.

이것은 필터의 좋은 시작점입니다. 이 위치는 일반적으로 눈에 보이는 지점으로만 감지를 구체화하기 때문입니다. 편집 스폿에서 arant 스폿 제거 화면 모드로 전환하고 해당 스폿을 클릭합니다 노란색으로 바뀐 후 삭제를 클릭합니다.

그런 다음 파란색 화살표를 클릭하여 알고리즘 빌드를 계속합니다. 움직이는 브라우니에 트랙을 설정하여 트랙을 측정합니다. CCP는 어떠한 지시된 움직임도 나타내지 않아야 하며, 원형질막을 가로지르는 최소한의 표류만 보여야 합니다.

이 알고리즘은 해당 모션에 가장 적합합니다. 그런 다음 최대 거리를 0.7미크론과 같은 작은 값으로 설정합니다. 거리를 작게 설정하면 인접 스폿의 연결이 최소화되고 CCP 또는 세포 이동을 통해 셀 스폿을 계속 추적할 수 있습니다.

그런 다음 최대 간격 크기를 1로 설정합니다. 이렇게 하면 프레임이 하나만 누락된 경우 트랙을 계속할 수 있습니다. 연속적으로 갭 크기가 3개 이상이면 서로 다른 트랙이 잘못 연결됩니다.

다음 단계는 트랙 보기를 드래곤 테일로 전환하는 것입니다. 동영상을 스크롤하여 감지 품질을 관찰합니다. 인접한 스폿이 연결되어 있는 경우 최대 거리를 0.7미크론 미만으로 줄이십시오.

스팟이 너무 쉽게 분해되는 경우 최대 간격 크기를 늘리십시오. 파란색 화살표를 클릭하여 트랙을 만듭니다. 이렇게 하면 트랙을 필터링하는 필터 트랙 화면이 나타납니다.

강도 필터를 사용하여 추가로 밝은 플라그를 제거합니다. 그런 다음 변위 필터를 사용하여 잔디밭에 들어가는 엔도솜을 제거합니다. 지점이 길면 변위도 길어지므로 주의하십시오.

녹색 이중 화살표를 클릭하여 프로토콜을 완료합니다. 데이터를 내보내려면 통계 탭으로 이동합니다. 단일 플로피 디스크 아이콘을 클릭하여 선택한 통계를 내보냅니다.

일련의 플로피 디스크처럼 보이는 아이콘을 클릭하여 모든 통계를 내보냅니다. A 부착 원형질막과 컨포칼 모드에 초점을 맞추면 희미한 형광으로 채워진 세포가 나타납니다. 대조적으로, 세포의 중심에 초점을 맞추면 원형질막이 세포 주위의 형광 고리로 드러납니다.

초점에서 벗어난 형광은 기존의 epi, 형광 또는 잘못된 각도로 잔디로 전환할 때 분명해집니다. 잔디 각도가 정확하면 원형질막이 매우 선명하고 선명하며 밝으며 초점이 맞지 않습니다. 형광은 더 이상 이미지를 방해하지 않습니다.

beta arrestin이 cytosolic 수영장에 있을 때, 잔디 분야에는 거의 없으며 흐릿하고 외부 초점으로 보입니다. MOR이 agonist, beta에 의해 활성화되면, arrestin이 원형질막으로 모집되고 beta arrestin과 수용체가 모두 CCP로 재분배됩니다. 이러한 클러스터의 수명은 수동으로 정량화됩니다.

완료된 세포내이입에 대한 세 가지 매개변수를 사용하면 CCP를 나타내는 반점이 완전히 사라지거나, 깜박였다가 꺼지거나, 더 큰 구조를 끼울 수 있습니다. 여기에 표시된 바와 같이 MA를 사용하여 감지된 CCP는 비동적 플라크 구조를 제거하기 위해 필터링한 후, 오버레이된 흰색 구, 감지된 반점을 나타내고, 전체 수명 동안 감지할 수 없는 더 어두운 반점도 품질 필터로 제외되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 잔디 현미경을 사용하여 개별 카테터로 코딩된 구덩이를 시각화하는 방법을 정말 잘 이해하게 될 것입니다.