PNA-FISH에 의해 마우스 B 림프구에서 염색체 이상을 신속하게 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 마우스 B 림프구의 게놈 불안정성을 정량화하는 것입니다. 이는 일차 세포 배양을 위해 먼저 B 세포를 분리함으로써 달성됩니다. 다음으로, 세포는 고정되어 중기 확산의 준비를 용이하게 합니다.

마지막으로, 텔로미어 PNA 물고기는 형광 표지된 텔로미어의 시각화를 위해 수행됩니다. 궁극적으로 다양한 유형의 염색체 이상 수준은 형광 현미경으로 정량화할 수 있습니다. 이 기술의 의미는 표적 마우스 모델에서 게놈 안정성을 촉진하는 유전자를 식별하는 데 도움이 될 수 있으므로 DNA 복구 경로에 대한 이해를 확장할 수 있습니다.

이 방법은 염색체 파괴 및 기타 큰 염색체 재배열에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 전좌와 같은 다른 형태의 게놈 불안정성을 측정하는 데에도 적용할 수 있습니다. B 세포를 분리하려면 먼저 층류 후드에 2ml의 세척 완충액이 들어 있는 35mm 조직 배양 접시에 새로 분리된 비장을 놓습니다. 그런 다음 5ml 주사기의 플런저 뒤쪽 끝을 사용하여 비장을 부드럽게 침식합니다.

다음으로, 플런저를 사용하여 70마이크로미터 나일론 메쉬 스트레이너를 통해 조직 슬러리를 50ml 튜브에 여과하여 스트레이너를 통해 더 큰 조직 조각을 부드럽게 누릅니다. 플레이트와 주사기를 8ml의 세척 버퍼로 헹구고 여과기를 통해 세척액을 여과합니다. 그런 다음 세포를 회전시킨 후 CK 용해 완충액 3ml로 펠릿을 위아래로 몇 번 피펫팅합니다.

5분 후 10ml의 세척 버퍼로 반응을 멈춥니다. 그런 다음 셀을 다시 회전시킨 후 튜브 바닥을 두드려 펠릿을 다시 현탁시키고 세포에 1ml의 세척 버퍼를 추가합니다. 다음으로, 얼음 위에서 50 마이크로 리터의 anti CD 43 max 마이크로 비드로 세포를 배양합니다.

30분 후, 10ml의 세척 버퍼로 세포를 부드럽게 세척합니다. 원심분리하는 동안 자석에 미니맥스 컬럼을 놓고 컬럼 아래에 라벨이 붙은 15ml 원추형 튜브를 놓습니다. 그런 다음 컬럼에 1ml의 세척 버퍼를 추가하여 튜브에 EIT를 수집합니다.

세포 펠릿을 1ml의 세척 버퍼에 재현탁한 다음 세포를 컬럼에 로드합니다.샘플이 통과한 후 1ml의 세척 버퍼로 컬럼을 헹구고 7ml의 세척 버퍼를 수집된 샘플에 직접 추가합니다. 수집된 세포를 계수한 후 원심분리를 위해 50ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 B 세포를 활성화하기 위해 보충된 B 세포 배지에서 밀리리터당 6개의 세포 중 10개로 펠릿을 한 번에 현탁시키고 섭씨 37도의 가습 세포 배양 인큐베이터에서 웰당 5ml의 세포로 6개의 웰 플레이트에 세포를 배양하여 B 세포를 고정합니다.

다음으로 각 우물에 50마이크로리터의 스미드. 섭씨 37도에서 1시간 배양 후 B 세포를 라벨이 부착된 15ml 튜브로 옮깁니다. 라벨을 테이프로 덮고 셀을 스핀다운합니다.

그런 다음 약 1ml의 상층액을 제외한 모든 것을 흡인하고 피펫팅으로 펠릿을 재현탁합니다. 섭씨 37도의 5밀리리터, 염화칼륨을 소용돌이에서 펄스하면서 한 방울 한 방울 추가합니다. 그런 다음 10ml의 염화칼륨을 추가로 첨가하고 반전으로 세포 용액을 혼합합니다.

다음으로, 섭씨 37도의 수조에서 15분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 반전하여 새로운 고정 혼합 5방울을 다시 한 번 추가합니다. 그런 다음 1ml의 상등액에 펠릿을 현탁시킨 후 세포를 스핀다운하고, 5ml의 새로운 고정액을 추가하고, 소용돌이에서 펄스를 일으키면서 한 방울씩 떨어뜨리고, 세포와 추가 10ml의 고정액을 실온에서 배양합니다.

30분 후, 세포를 펠렛으로 만들고 고정액 1ml를 제외한 모든 것을 제거합니다. 그런 다음 세포를 세척 한 후 15 밀리리터의 고정액으로 두 번 더 펠릿을 상층액의 최종 70 마이크로 리터에 다시 현탁시킵니다. 이제 레이블이 지정된 슬라이드를 섭씨 22.9도 및 52% 습도로 설정된 습도 챔버에 35도 각도로 배치합니다.

35마이크로리터의 부유 B 세포를 각 슬라이드에 떨어뜨려 샘플당 2개의 슬라이드를 준비합니다. 그런 다음 습도 챔버에서 슬라이드를 30분 동안 건조시킨 후 완전히 건조될 때까지 섭씨 37도의 슬라이드 상자에 슬라이드를 보관하십시오. 건조되면 다이아몬드 펜을 사용하여 각 슬라이드 뒷면에 하이브리드화를 위해 18 x 18mm 영역을 표시하여 물고기의 슬라이드를 변성시킵니다.

다음으로, 120 마이크로 리터의 70 % 탈 이온화 된 형태 아미드를 24mm x 60mm 커버 슬립에 적용한 다음 각 슬라이드를 커버 슬립에 터치합니다. 90 초 동안 80 섭씨 온도 열판에 활주를 변성시키고, 그 후에 빨리 그리고 그리고 주의깊게 덮개 미끄러짐 및 연속적으로 미끄러집니다. 슬라이드를 얼음처럼 차가운 70, 90 및 100% 에탄올에 각각 3분 동안 놓고 슬라이드가 건조된 후 슬라이드를 습한 챔버에 배치하고 슬라이드의 표시된 영역에 사전 필요 프로브 믹스를 적용합니다.

프로브 믹스를 18 x 18mm 커버 슬립으로 덮고 슬라이드를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 미리 경고 된 두 개의 XSSC로 슬라이드를 흔들어 씻으십시오. 5분 후 35마이크로리터의 moyal 장착 매체를 슬라이드에 적용합니다.

매체를 24mm x 60mm 커버 슬립으로 덮고 슬라이드를 섭씨 4도에서 보관하십시오. 마지막으로, 표준 에피 형광 현미경을 사용하여 중기 슬라이드를 분석합니다. 하나의 마우스 세포에서 유래한 중기 염색체는 40개의 염색체를 포함하는 불분명한 클러스터를 형성해야 합니다.

각 염색체는 한쪽 끝에 중심체가 있고 두 개의 텔로미어 신호에 가깝고 염색체의 다른 쪽 끝에는 두 개의 추가 텔로미어 신호가 있습니다. 염색체 단절은 각 중기 염색체를 구성하는 두 자매 염색체 중 하나의 단절입니다. 어떤 경우에는 염색체의 부러진 끝이 동일한 중기 확산에서 텔로미어 신호를 가진 단편으로 관찰될 수 있습니다.

전파 염색체는 두 개의 염색체를 포함하는 복잡한 재배열입니다. 염색체는 또한 이심 염색체를 형성하기 위해 결합될 수 있으며, 이는 양쪽 끝에 중심체가 있는 염색체의 종단 간 융합으로 나타납니다. 로버트슨식 전좌(Robertsonian translocation)는 두 염색체의 중심체 사이의 전좌(translocation)의 일종으로, 단일 중심체에 부착된 4개의 자매 염색체 팔로 나타납니다.

이 마지막 이미지에는 텔로미어 신호가 존재하지 않는 중기가 표시됩니다. 텔로미어 신호의 부재는 프로브 준비의 오류 또는 혼성화 중 커버 슬립 아래의 기포로 인해 발생할 수 있습니다. 이 절차에 따라 세포주기 분석 및 결장 정보와 같은 다른 방법을 수행하여 게놈 불안정성 증가가 세포 생존력에 영향을 미치는지 여부와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.