Name: PNA-FISH에 의해 마우스 B 림프구에서 염색체 이상을 신속하게 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 배우세요 마우스 B 림프구에서 PNA-FISH를 이용한 염색체 이상 분석 방법입니다. 형광 현미경으로 유전체 불안정성을 정량화하고 DNA 복구 경로를 연구할 수 있습니다.

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이 작품은 NIH 보조금 R00 CA160574 (SFB)으로하고 (SMM에) 럿 거스 생명 공학 교육 프로그램의 교제에 의해 지원됩니다.

이 절차는 럿 거스에서 기관 동물 관리 및 사용위원회, 뉴저지 주립 대학에 의해 승인되었습니다. 마우스는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 따라 처리 하였다. 과학자들은 설립 승인 지침은 자신의 국가 및 기관 동물 조직을 문의해야합니다. 시작하기 전에 표 1에 나와있는 솔루션을 준비합니다. 1 B 세포의 분리 및 활성화 경추 탈구이어서 CO 2를 사용하여 마우스를 안락사. 몸의 왼쪽면이 위로 오도록 마우스를 위치시키고 모피에 습기가 될 때까지 70 % 에탄올로 마우스를 스프레이. 2 ML 세척 버퍼를 가지는 35mm 조직 배양 접시에 비장과 장소를 해부하다. 층류 후드에서 조심스럽게 5 ㎖ 주사기의 평평한 단부를 이용하여 조직 배양 접시에 비장을 분쇄. <ol><li> 50에 70 μm의 나일론 메쉬 삽입ML 튜브 및 나일론 메쉬로 2 ml의 세척 완충액에서 비장 샘플을 전송. 조심스럽게 주사기의 평평한 끝 부분을 사용하여 메쉬에서 비장을 방해. </li><li> 세척 버퍼의 8 mL를 주사기의 뒷면 35mm 판을 씻어 70 μm의 나일론 메쉬를 필터링 할 수 있습니다. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. </li><li> 기음은 상층 액을 제거하고 ACK 용해 버퍼의 3 ㎖에 펠렛을 재현 탁합니다. 대단히 짧은 시간을 방해하고 5 분 동안 배양 아래로 간단히를 피펫. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 세척 버퍼와 원심 분리기 10 ML을 추가합니다. </li><li> 대기음 상층 액을 제거하고 세척 완충액 1 ㎖에 피펫 팅 한 후 튜브의 바닥을 터치하여 펠렛을 재현 탁하고. 항-CD43 MACS 마이크로 비즈의 50 μl를 추가하고 30 분 동안 얼음에 품어. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에, 세척 버퍼의 10 ML을 추가 부드럽게 섞어 원심 분리기. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에, 세척 버퍼의 10 ML을 추가 부드럽게 섞어 원심 분리기. </li><li> 설정MACS 자석에 열을 배치하여 미니-MACS 열입니다. 열 아래 표시된 15 ML 원뿔 튜브를 배치합니다. 열 세척 버퍼의 1 ML을 추가하고 15 ML 튜브를 통해 실행할 수 있습니다. </li><li> 세척 완충액 1 ㎖에 재현 탁하고 상등액을 기음. 세척 버퍼를 통해 실행 후 열에서 샘플을로드합니다. </li><li> 샘플이 칼럼을 통해 실행 된 후, 열을 씻어 1 ML 세척 버퍼를 추가합니다. 직접 15 ML 튜브에 수집 된 샘플에 세척 버퍼의 7 ML을 추가합니다. </li><li> 혈구를 사용하여 세포를 카운트. 50 ㎖의 튜브에 / 웰 5,000,000 세포에 필요한 세포의 필요한 양을 전송. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. LPS 1과 부록 B 세포 배지 : 500 IL4 일 : 1000. </li><li> 상등액을 흡인하고 백만 세포 / ml의 최종 농도에 필요한 보충 된 B 세포 배지의 양을 적절한 추가. </li><li> humidifi 1,000,000 세포 / ㎖과 장소에서 세포 5 ㎖를 6 - 웰 플레이트에서 플레이트 세포37 ° C에서 에드 세포 배양 인큐베이터, 5 % CO 2. </li></ol> 2 B 세포 고정 <ol><li> 잘 (100 NG / ㎖의 최종 농도) B 세포의 5 mL를 함유하고 37 ℃에서 1 시간 배양 C에 colcemid의 50 μl를 추가합니다. 37 ° C의 물을 욕조에 Prewarm 75 밀리미터의 KCl 솔루션입니다. 레이블이 15 ML 튜브로 B 세포를 전송합니다. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 테이프와 원심 분리기와 레이블을 커버. </li><li> 튜브에 1 ㎖에 떠나는 뜨는을 기음과 피펫으로 펠렛을 재현 탁. 누르거나 소용돌이에 펄스 동안 드롭에 의해 데워진의 KCl 드롭의 5 ML을 추가합니다. </li><li> KCl을 10 ㎖를 추가하고 반전 섞는다. 15 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 품어. 반전 신선한 정착과 혼합 5 방울을 추가합니다. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 로 pipetting 아래로 튜브에 resuspend 펠렛 1 ML을 떠나 뜨는을 대기음. </li><li> 누르거나 보르에 펄스 동안 드롭으로 신선한 정착액 드롭의 5 ML을 추가텍스. 정착액의 추가 10 mL를 넣고 실온에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 피펫 팅 튜브에 resuspend 1 ML을 떠나 뜨는을 대기음. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 신선한 정착 원심 분리기의 14 ML을 추가합니다. </li><li> 단계를 반복 2.7 두 번 더. </li><li> 신선한 정착액의 14 ML을 추가합니다. 파라 필름으로 뚜껑을 밀봉 및 -20 ° C에서 하룻밤 저장합니다. </li></ol> 중기 염색체 스프레드의 3 준비 <ol><li> 22.9 ° C 및 52 % 습도로 조절 된 환경 챔버를 설정합니다. </li><li> 원심 분리기는 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에서 B 세포를 고정. 대기음은 피펫 팅 튜브와에 resuspend 70 μl를 떠나 정착액. </li><li> 35 ° 각도로 습도 챔버에 표시된 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드에 재현 탁 B 세포의 35 μl를 삭제하고 샘플 당이 슬라이드를 놓습니다. 30 분 후 슬라이드를 저장하기위한 슬라이드 습도 챔버에서 건조하도록 허용37 ° C에서 슬라이드 상자에. </li></ol> 4 텔로미어 (telomere) PNA의 FISH <ol><li> 프로브의 제조 <ol><li> 37 ° C에 대한 사전 따뜻한 탈 포름 아미드. 7 ㎕의 탈 미리 예열 포름 아미드와 텔로미어 (telomere)의 PNA 프로브의 2 μl를 혼합하고 1 시간 동안 진탕 37 ° C에서 배양한다. </li><li> 37 ° C에 대한 사전 따뜻한 FISH 마스터 믹스. 4.1.1 단계에서 혼합물에 7 ㎕를 미리 예열 FISH 마스터 믹스를 추가하고 1-3 시간 동안 37 ° C에서 배양한다. </li><li> 80 ° C에서 8 분 동안 프로브 혼합물을 변성. 37 ° C에서 1 시간 동안 프로브를 사전 어닐링. </li></ol></li><li> 염색체 슬라이드의 전처리 <ol><li> 수조에서 37 ° C로 0.01 M 염산 50 ㎖를 포함하는 유리 슬라이드 염색 항아리를 미리 따뜻하게. </li><li> 실온에서 5 분 동안 2X SSC를 포함하는 다른 유리 슬라이드 오염성 항아리에 도시 슬라이드. </li><li> 예열 유리 슬라이드 염색 항아리에 펩신 주식의 2 μl를 추가하고 반전 섞는다. 이 유리 SL에 슬라이드로 이동IDE-염색 항아리와 37 ° C에서 90 초를 배양. </li><li> 슬라이드 떨고, 실온에서 5 분마다 1X PBS를 포함하는 다른 유리 슬라이드 염색 항아리에 배 씻으십시오. 그런 다음 떨고, 실온에서 1X PBS / MgCl2를 5 분 동안 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 실온에서 10 분 동안 갓 제조 한 1 % 포름 알데히드 / PBS 1X / MgCl2를 함유 유리 슬라이드 오염성 항아리에 슬라이드를 이동. </li><li> 떨고, 실온에서 1X PBS를 포함하는 다른 유리 슬라이드 염색 항아리에 5 분 동안 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 70 %, 90 %, 및 100 % 에탄올을 함유하는 별도의 유리 슬라이드 염색 단지를 구비하여 탈수 에탄올 시리즈를 준비한다. </li><li> 다음, 70 % 에탄올, 90 % 에탄올을 100 % 에탄올로 시작하여 3 분 동안 각 항아리에 슬라이드를 이동. 완료되면 -20 ° C에서 에탄올 항아리를 놓습니다. </li><li> 종이 타월로 여분의 에탄올을 눌러과 35 ° 각도로 슬라이드를 지탱하여 건조 공기 슬라이드를 허용합니다. 일단 건조, mA다이아몬드 펜을 사용하여 슬라이드의 뒷면에 혼성화 18 X 18mm 영역 애먹. </li></ol></li><li> 물고기를 슬라이드의 변성 <ol><li> 24 X 60mm coverslip에 120 ㎕의 70 % 탈 포름 아미드 / 2X SSC를 적용합니다. 커버 슬립에 슬라이드를 터치합니다. 90 초 동안 핫 플레이트에서 80 ° C에서 슬라이드를 변성. </li><li> 신속하고 신중하게 커버 슬립을 밀어 넣고 3 분 동안 90 % 에탄올 다음 3 분, 100 % 에탄올 각 얼음 차가운 70 % 에탄올에 슬라이드를 배치합니다. 건조 공기 슬라이드를 허용합니다. </li><li> 꽉 뚜껑 젖은 휴지와 플라스틱 상자를 안감으로 습기 챔버를 준비합니다. 용지에 습기가 될 수 있지만 물과 포화 안된다. </li><li> 습기 챔버에서 슬라이드에 표시된 부분에 단계 4.1.3에서 사전 열처리 프로브 믹스를 적용 18 X 18mm 커버 슬립 커버와 1 시간 동안 37 ° C에서 배양한다. </li></ol></li><li> 후 배양 세척 <ol><li> 사전 따뜻한 50 % 포름 아미드 / 2X SSC, 1X SSC, 그리고 4 배 SSC / 0.1 % 트윈 20 45 °에서; C 물 목욕. </li><li> 조심스럽게 된 커버를 제거하고 어둠과 흔들림에 미리 예열 50 % 포름 아미드 / 2 배 SSC 3xfor 5 분에 각각의 슬라이드를 씻으십시오. 떨고 3xfor 5 분 미리 예열 1X SSC에 각각 슬라이드를 씻으십시오. 마지막으로, 예열 배 SSC에서 슬라이드를 씻어 / 0.1 % 트윈 20 3xfor 5 분 각을. </li><li> 빛 보호 유리 슬라이드 염색 항아리에 DAPI에서 3 분 동안 슬라이드를 얼룩. </li><li> 흔들리는 배 SSC에서 5 분 동안 슬라이드를 씻으십시오. 24 X 60mm의 커버 슬립 커버, Mowiol 장착 매체의 35 μl를 적용하고 4 ° C에서 슬라이드를 저장합니다. </li></ol></li></ol> 염색체의 5 현미경 분석 <ol><li> 표준 에피 형광 현미경을 사용하여 중기 슬라이드를 분석한다. 최상의 결과를 얻기 위해 이러한 MetaSystems Metafer 플랫폼으로 자동 스테이지 이미징 플랫폼을 사용한다. DAPI 형광이 염색체를 시각화하기 위해 각각의 중기 스프레드를 들어, 하나의 이미지를 수집하고, 텔로미어 (P)으로부터 형광 신호에 대한 하나의 이미지가운. (예를 들어, Cy3- 다른 루어를 사용할 수 있으며 잘 동일하게 작동합니다.) </li><li> 이미지 분석 프로그램과 영상을 오버레이 분석. </li></ol>

<ol><li>Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+mammalian+DNA+repair+and+the+DNA+damage+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints.</a> Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).</li>
<li>Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+checkpoints+in+stem+cells%2C+ageing+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.</a> Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).</li>
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<li>Bunting, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+inhibits+homologous+recombination+in+Brca1-deficient+cells+by+blocking+resection+of+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks.</a> Cell. 141 (2), 243-254 (2010).</li>
<li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).</li>
<li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+IgH-TCRalpha%2Fdelta+translocations+in+T+lymphocytes+mediated+by+RAG%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG.</a> Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).</li>
<li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+catalyzes+robust+IgH+locus+deletions+and+translocations+in+the+combined+absence+of+ligase+4+and+Ku70%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70.</a> Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).</li>
<li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphocyte+culture+and+chromosome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Human lymphocyte culture and chromosome analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaphase+spreads+and+spectral+karyotyping+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Schreck, R. R., Disteche, C. M. Chapter 4. Chromosome banding techniques. Unit 2, Curr Protoc Hum Genet. (2001).</li>
<li>Gilley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-PKcs+is+critical+for+telomere+capping%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">DNA-PKcs is critical for telomere capping.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).</li>
<li>Bolzan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+aberrations+involving+telomeres+and+interstitial+telomeric+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences.</a> Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).</li>
<li>Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interstitial+telomeric+repeat+sequences+and+chromosomal+aberrations%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations.</a> Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).</li>
<li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Chapter 18. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPoon%2C+SS+%22Quantitative+fluorescence+in+situ+hybridization+%28Q-FISH%29%22">Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH)</a>. Unit 18 14, Curr Protoc Cell Biol. (2001).</li>
<li>Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+and+p53+synergize+to+suppress+genomic+instability+and+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).</li>
<li>Halaby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+interaction+of+Rnf8+and+p53+in+the+protection+against+genomic+instability+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003259(2013).</li>
</ol>

저자는 충돌하는 이해 관계가 없습니다.

활성화 된 B 림프구, 특히 유사 분열 염색체 스프레드의 제조에 적합한 반면, 다른 세포 유형 또한 사용될 수있다. T 림프구가 이들이 비장 또는 림프절로부터 정제 될 수있는, B 세포의 많은 장점을 공유 할 수 있으며, 적절한 8 분열 촉진 물질을 함유하는 배지에서의 성장에 의해 자극 될 때 높은 유사 분열 지수가 있습니다. 배아 줄기 세포 (ES 세포)도 중기 염색체 분석 구에 적합하다. 이 사용할 수없는 경우 colcemid와 장기간 치료 (예를 들면, 10 NG / ㎖의 최종 농도 colcemid 16 시간)을 고정하기 전에 중기에 트랩 이상의 셀을 사용하는 것이 좋지만, 섬유 모세포가 사용될 수있다. 우리는 중기의 준비의 일관성이 크게 이러한 Thermotron CDS-5로 제어 된 습도 챔버에 세포 유전학 건조 챔버를 고정 염색체 낙하에 의해 용이하게 스프레드되는 것을 발견하지만 ㅁ 좋은 결...

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.&#160;Table 1 (the list of solutions to prepare) was omitted from the Protocol section. The contents of Table 1 are as follows:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td>Reagents</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">B Cell Wash Buffer</td>
			<td>500 ml 1x Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td rowspan="3">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="3">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">B Cell Medium</td>
			<td>418.5 ml RPMI-1640</td>
			<td rowspan="8">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="8">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml nonessential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8 ml 14.2 M 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 1M HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative</td>
			<td>3:1 v/v methanol/glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td>Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.075 M KCl</td>
			<td>1.395 g KCl</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">FISH Master Mix</td>
			<td>40 ml 50% Dextran sulfate</td>
			<td rowspan="3">Vortex the solution and leave in a shaking platform overnight</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ml sterile distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">70% Formamide/2x SSC</td>
			<td>10 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7 with 1M HCl</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 ml deionized formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.01 M HCl</td>
			<td>1 ml 1M HCl</td>
			<td rowspan="2">Adjust to pH 2.0</td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1x PBS/MgCl2</td>
			<td>50 ml 1M MgCl2</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>950 ml 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">50% Formamide/2x SSC</td>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7.25 
			Formamide used in this step does not have to be deionized.</td>
			<td rowspan="3">Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">4x SSC/0.1% Tween20</td>
			<td>50 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td rowspan="3">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;l Tween20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DAPI staining solution (80 ng/ml)</td>
			<td>40 &#956;l 0.2mg/ml DAPI stock</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">4 &#176;C in light protected staining jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml 2x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Mowiol Mounting Medium</td>
			<td>6 g glycerol</td>
			<td rowspan="5">Incubate at 50 &#176;C with stirring for 2hrs</td>
			<td rowspan="5">Aliquot and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g Mowiol 4-88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 ml 0.2 M TrisCl pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>230 &#956;l 1% Thimerosal (w/v in water)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. List of solutions.&#160;

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.

Erratum: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

암은 정상 세포의 성장을 조절하는 유전자에 영향을 미치는 돌연변이의 축적에 의해 발생합니다. 돌연변이 DNA의 손상에 의해 야기 게놈의 구조 및 서열에 대한 변경의 결과이다. DNA 손상 등의 전리 방사선 등 외인성 제제를 포함한 프로세스의 다양한 등을 통해 발생할 수있는 등의 활성 산소 종 (1)과 접촉하여 발생하는 뉴클레오티드 염기 또는 손상의 자발적인 탈 아미 노화 정상적인 세포 대사의 부산물로서. 포유 동물 세포가 DNA 손상 또는 역방향 브레이크 사이트의 시퀀스를 복원 할 수있는 보수 활동의 범위를 갖고 있지만, 그럼에도 불구하고 돌연변이 세포의 수명에 걸쳐 축적. DNA 손상은 또한 노화 - 관련 질환과 연관된 2 개의 프로세스를 노화 및 줄기 세포의 효능의 손실에 기여할 수있다. 이 응답을 어드레스에 따라서 중앙 중요성 DNA 손상의 복구된다 이해공중 보건 ificant 문제. 증거가 증가 포유류의 DNA 복구 경로가 더욱 필수적 돌연변이 분자 수준에서의 억제에 관여하는 과정을 이해하는 데있어 암세포 3,4 게놈의 발전에 기여할 수 있음을 시사한다. 염색체 이상을 직접 시각화는 특정 세포 유형에서 게놈의 불안정성의 정도를 판정하는 강력한 양적 수단이다. 중기에서 세포로부터 연유 염색체 분리 및 광 또는 형광 현미경을 사용하여 검사 될 수있다. 이러한 유전 학적 접근은 수십 년 동안 실제로 왔고 전좌 또는 DNA 복구 활동의 손실과 관련된 염색체 이상 특정 유형의 모양을 보여주기 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜은 몇 가지 잠재적 인 확장에 빌려 준다 : 염색체가 현장 하이브리드의 스펙트럼 핵형 (SKY) 또는 여러 가지 빛깔의 형광에 대한 프로브를 표시 할 수(mFISH)는 전좌 5,6를 식별합니다. 이러한 기술은 또한이 프로토콜 가능합니다 것 이상으로 추가 정보를 제공 염색체 전좌의 빈도와 결정 복잡한 염색체 전좌의 구조를 가능하게한다. 대안 적으로, 특정 프로브 시퀀스가 생성되고 선택된 사이트 7 게놈 DNA에서 파손의 주파수를 테스트하는데 사용될 수있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 중기 염색체의 준비가 B 림프구에서 확산에 대해 설명합니다. 텔로미어 반복하는 형광 표지 된 펩티드 핵산 (PNA) 프로브를 효율적으로 중기 염색체에 텔로미어를 표시하는 데 사용되는이 프로토콜은 몇 가지 장점이 펼쳐집니다. B 세포는 높은 품질의 퍼짐 일관 제조 할 수 있도록 높은 유사 분열 지수 성장하도록 유도 될 수있다. 유전자 변형 마우스의 B 세포도 훨씬 덜 기여의 분석을 혼동 할 수 있습니다 차 유전 변이를 포함 할 가능성이있다게놈 무결성의 특정 유전자. PNA-FISH 방법은 하루에 완료하고, 염색체 휴식의보다 정확한 득점을 허용 할 수 있습니다. 특히 이런 프로토콜에 기재된 특정 장비와 함께,이 방법을 사용함으로써, 매우 일관된 고품질의 퍼짐을 생성하고 신속 레이트 및 게놈 불안정성의 유형을 분석 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>50% 덱스트란 설페이트</td><td>Intergen</td><td>S4030</td><td></td></tr><tr><td>탈이온화 포름아미드</td><td>Ambion</td><td>9342</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin (5 g)</td><td>Sigma</td><td>P 6887&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>LPS (100 mg)</td><td>Sigma</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 (5 &mu; g)</td> <td>시그마</td><td>I1020</td><td></td></tr><tr><td>PNA 텔로미어 프로브</td><td>PNA Bio Inc</td><td>F1002</td> <td>(CCCTAACCCTAACCCTAA)</td></tr> <tr><td>Colcemid</td><td>Roche</td><td>295892</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>시그마</td><td>81381-50g</td><td></td></tr><tr><td>CD43 (ly-48_) 마이크로 비즈</td><td>Miltenyl Biotec.</td><td>130-049-801</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>시그마</td><td>32670-5MG</td><td></td></tr><tr><td>이클립스 E800</td><td>니콘</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioImager.Z2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDS-5 세포유전학 건조실</td><td>Thermotron</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pna-fish에 의해 마우스 b 림프구에서 염색체 이상을 신속하게 분석

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

결함 DNA 수리 종양 이어질 돌연변이의 근본 원인 인 게놈 불안정성을 증가하도록 이끈다. 상이한 세포 유형에서 주파수 및 염색체 이상 유형의 분석은 DNA 복구 경로의 결함은 해명 할 수있다. 이해 포유 동물 DNA 수리 생물학이 크게 특정 유전자 녹아웃 생쥐의 생산에 도움이되고있다. 이 프로토콜의 목적은 마우스 B 림프구에서 게놈의 불안정성을 정량화하는 것이다. PNA-FISH 프로브 (펩티드 핵산 - 시츄 혼성화 형광)을 사용 텔로미어의 레이블링은 중기 염색체 스프레드 게놈 불안정성의 신속한 분석을 용이하게한다. 그들은 정상 배수성과 높은 유사 분열 인덱스를 가지고 있기 때문에 B 세포는 섬유 아세포에 비해 특정 장점을 가지고있다. B 세포의 단기 문화 따라서 적은 보조 유전자 변이를 가질 가능성이 차 세포​​ 인구에 게놈 불안정성의 정확한 측정을 가능하게일반적으로 형질 전환 된 섬유 아세포 또는 환자의 세포 라인에있는 것보다의.

하나의 셀로부터 유도 중기 염색체 (도 1a)를 (마우스의 세포를 사용하는 경우)를 함유하는 염색체 40 이산 클러스터를 형성한다. 각각의 염색체는 밝은 파란색 영역으로 표시 한 끝에서 중심 소체가 있습니다. 보통 염색체에서 텔로미어이 신호는 각 동원체 의해 염색 분체와 두 신호의 끝에서 볼 수있다. 간기 핵뿐만 아니라 슬라이드에 존재합니다. 다음은 빨간색 텔로미어 (telomere)의 신호에 파란색 분야,하지만 응축 된 염색체 (예 : 그림 1B에 대한 참조)로 표시됩니다. 간기 핵 게놈 불안정성을 정량화 할 목적으로 무시할 수있다. 염색체 이상 서로 다른 유형의 수는 관찰 될 수있다. 염색 분체가 나눠 각 중기 염색체를 구성하는 두 자매 염색 분체의 일에 휴식입니다. 연구자는 일단 오에서 하나의 텔로미어 (telomere) 신호의 한 염색 분체의 불연속 또는 손실을 보면 그들은 득점 할 수있다FA 염색체 <str...

DNA 수리 경로는 게놈 무결성의 유지 보수 및 예방 돌연변이 및 암 필수적이다. 이 프로토콜의 목적은 중기는 텔로미어 DNA 반복위한 원위치 혼성화 (FISH)에 형광체를 사용하여 마우스 B 세포로부터 확산에 염색체 이상을 직접 관찰하여 게놈 불안정성을 정량화하는 것이다.

PNA-FISH에 의해 마우스 B 림프구에서 염색체 이상을 신속하게 분석

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

다음 실험의 전반적인 목표는 마우스 B 림프구의 게놈 불안정성을 정량화하는 것입니다. 이는 일차 세포 배양을 위해 먼저 B 세포를 분리함으로써 달성됩니다. 다음으로, 세포는 고정되어 중기 확산의 준비를 용이하게 합니다.마지막으로, 텔로미어 PNA 물고기는 형광 표지된 텔로미어의 시각화를 위해 수행됩니다. 궁극적으로 다양한 유형의 염색체 이상 수준은 형광 현미경으로 정량화할 수 있습니다. 이 기술의 의미는 표적 마우스 모델에서 게놈 안정성을 촉진하는 유전자를 식별하는 데 도움이 될 수 있으므로 DNA 복구 경로에 대한 이해를 확장할 수 있습니다.이 방법은 염색체 파괴 및 기타 큰 염색체 재배열에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 전좌와 같은 다른 형태의 게놈 불안정성을 측정하는 데에도 적용할 수 있습니다. B 세포를 분리하려면 먼저 층류 후드에 2ml의 세척 완충액이 들어 있는 35mm 조직 배양 접시에 새로 분리된 비장을 놓습니다. 그런 다음 5ml 주사기의 플런저 뒤쪽 끝을 사용하여 비장을 부드럽게 침식합니다.다음으로, 플런저를 사용하여 70마이크로미터 나일론 메쉬 스트레이너를 통해 조직 슬러리를 50ml 튜브에 여과하여 스트레이너를 통해 더 큰 조직 조각을 부드럽게 누릅니다. 플레이트와 주사기를 8ml의 세척 버퍼로 헹구고 여과기를 통해 세척액을 여과합니다. 그런 다음 세포를 회전시킨 후 CK 용해 완충액 3ml로 펠릿을 위아래로 몇 번 피펫팅합니다.5분 후 10ml의 세척 버퍼로 반응을 멈춥니다. 그런 다음 셀을 다시 회전시킨 후 튜브 바닥을 두드려 펠릿을 다시 현탁시키고 세포에 1ml의 세척 버퍼를 추가합니다. 다음으로, 얼음 위에서 50 마이크로 리터의 anti CD 43 max 마이크로 비드로 세포를 배양합니다.30분 후, 10ml의 세척 버퍼로 세포를 부드럽게 세척합니다. 원심분리하는 동안 자석에 미니맥스 컬럼을 놓고 컬럼 아래에 라벨이 붙은 15ml 원추형 튜브를 놓습니다. 그런 다음 컬럼에 1ml의 세척 버퍼를 추가하여 튜브에 EIT를 수집합니다.세포 펠릿을 1ml의 세척 버퍼에 재현탁한 다음 세포를 컬럼에 로드합니다.샘플이 통과한 후 1ml의 세척 버퍼로 컬럼을 헹구고 7ml의 세척 버퍼를 수집된 샘플에 직접 추가합니다. 수집된 세포를 계수한 후 원심분리를 위해 50ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 B 세포를 활성화하기 위해 보충된 B 세포 배지에서 밀리리터당 6개의 세포 중 10개로 펠릿을 한 번에 현탁시키고 섭씨 37도의 가습 세포 배양 인큐베이터에서 웰당 5ml의 세포로 6개의 웰 플레이트에 세포를 배양하여 B 세포를 고정합니다.다음으로 각 우물에 50마이크로리터의 스미드. 섭씨 37도에서 1시간 배양 후 B 세포를 라벨이 부착된 15ml 튜브로 옮깁니다. 라벨을 테이프로 덮고 셀을 스핀다운합니다.그런 다음 약 1ml의 상층액을 제외한 모든 것을 흡인하고 피펫팅으로 펠릿을 재현탁합니다. 섭씨 37도의 5밀리리터, 염화칼륨을 소용돌이에서 펄스하면서 한 방울 한 방울 추가합니다. 그런 다음 10ml의 염화칼륨을 추가로 첨가하고 반전으로 세포 용액을 혼합합니다.다음으로, 섭씨 37도의 수조에서 15분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 반전하여 새로운 고정 혼합 5방울을 다시 한 번 추가합니다. 그런 다음 1ml의 상등액에 펠릿을 현탁시킨 후 세포를 스핀다운하고, 5ml의 새로운 고정액을 추가하고, 소용돌이에서 펄스를 일으키면서 한 방울씩 떨어뜨리고, 세포와 추가 10ml의 고정액을 실온에서 배양합니다.30분 후, 세포를 펠렛으로 만들고 고정액 1ml를 제외한 모든 것을 제거합니다. 그런 다음 세포를 세척 한 후 15 밀리리터의 고정액으로 두 번 더 펠릿을 상층액의 최종 70 마이크로 리터에 다시 현탁시킵니다. 이제 레이블이 지정된 슬라이드를 섭씨 22.9도 및 52% 습도로 설정된 습도 챔버에 35도 각도로 배치합니다.35마이크로리터의 부유 B 세포를 각 슬라이드에 떨어뜨려 샘플당 2개의 슬라이드를 준비합니다. 그런 다음 습도 챔버에서 슬라이드를 30분 동안 건조시킨 후 완전히 건조될 때까지 섭씨 37도의 슬라이드 상자에 슬라이드를 보관하십시오. 건조되면 다이아몬드 펜을 사용하여 각 슬라이드 뒷면에 하이브리드화를 위해 18 x 18mm 영역을 표시하여 물고기의 슬라이드를 변성시킵니다.다음으로, 120 마이크로 리터의 70 % 탈 이온화 된 형태 아미드를 24mm x 60mm 커버 슬립에 적용한 다음 각 슬라이드를 커버 슬립에 터치합니다. 90 초 동안 80 섭씨 온도 열판에 활주를 변성시키고, 그 후에 빨리 그리고 그리고 주의깊게 덮개 미끄러짐 및 연속적으로 미끄러집니다. 슬라이드를 얼음처럼 차가운 70, 90 및 100% 에탄올에 각각 3분 동안 놓고 슬라이드가 건조된 후 슬라이드를 습한 챔버에 배치하고 슬라이드의 표시된 영역에 사전 필요 프로브 믹스를 적용합니다.프로브 믹스를 18 x 18mm 커버 슬립으로 덮고 슬라이드를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 미리 경고 된 두 개의 XSSC로 슬라이드를 흔들어 씻으십시오. 5분 후 35마이크로리터의 moyal 장착 매체를 슬라이드에 적용합니다.매체를 24mm x 60mm 커버 슬립으로 덮고 슬라이드를 섭씨 4도에서 보관하십시오. 마지막으로, 표준 에피 형광 현미경을 사용하여 중기 슬라이드를 분석합니다. 하나의 마우스 세포에서 유래한 중기 염색체는 40개의 염색체를 포함하는 불분명한 클러스터를 형성해야 합니다.각 염색체는 한쪽 끝에 중심체가 있고 두 개의 텔로미어 신호에 가깝고 염색체의 다른 쪽 끝에는 두 개의 추가 텔로미어 신호가 있습니다. 염색체 단절은 각 중기 염색체를 구성하는 두 자매 염색체 중 하나의 단절입니다. 어떤 경우에는 염색체의 부러진 끝이 동일한 중기 확산에서 텔로미어 신호를 가진 단편으로 관찰될 수 있습니다.전파 염색체는 두 개의 염색체를 포함하는 복잡한 재배열입니다. 염색체는 또한 이심 염색체를 형성하기 위해 결합될 수 있으며, 이는 양쪽 끝에 중심체가 있는 염색체의 종단 간 융합으로 나타납니다. 로버트슨식 전좌(Robertsonian translocation)는 두 염색체의 중심체 사이의 전좌(translocation)의 일종으로, 단일 중심체에 부착된 4개의 자매 염색체 팔로 나타납니다.이 마지막 이미지에는 텔로미어 신호가 존재하지 않는 중기가 표시됩니다. 텔로미어 신호의 부재는 프로브 준비의 오류 또는 혼성화 중 커버 슬립 아래의 기포로 인해 발생할 수 있습니다. 이 절차에 따라 세포주기 분석 및 결장 정보와 같은 다른 방법을 수행하여 게놈 불안정성 증가가 세포 생존력에 영향을 미치는지 여부와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 문서는 단일 셀 생선 blastomere 핵 확산에 대한 기술 및 현장 하이브 리다이 제이션과 임상 설정에서 미리 주입 유전자 진단 (PGD)에 적용되는 신호 골을에 적합한 프로브의 선택을 설명합니다.

사전 이식 유전자 진단 생선

Chromosomics : 수치과 구조 변경의 탐지는 모두 24 인간의 염색체로 동시에 소설 OctoChrome 생선 분석을 사용

염색체는 림프구 나 피부 섬유 아 세포 등 살아있는 세포에서 분리하고, 인간이나 쥐 등의 유기체에서 할 수있다. 이러한 염색체의 준비는 더 일상 G 밴딩과 같은 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광, 비교 게놈 교잡 (CGH) 및 스펙트럼 핵형 분석 (SKY) 등의 분자 세포 유전 학적 과정에 활용 될 수있다.

배양 세포에서 염색체 준비

현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광은 세포 내에서 네이티브 환경에서의 핵산을 검출 할 수 있습니다. 우리는 여기에 마우스 배아 줄기 세포에서 X 염색체의 불 활성화를 연구하는 데 사용할 수있는 FISH에 의해 RNA와 DNA의 결합, 동시 검출을위한 프로토콜을 설명합니다.

결합 된 DNA-RNA 형광<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 화 (물고기) 차별화 된 여성 마우스 배아 줄기 세포에서 X 염색체의 불 활성화를 연구하는

이 프로토콜은 대기 입자상 물질로 치료 한 후 마우스 RAW264.7 대 식세포 관내에서 정량 및 염색체 이상 특성화를위한 기술을 설명한다.

를 사용하여 주변 입자상 물질에 의한 염색체 수차 분석<em&gt; 체외</em&gt; 시스템

본 프로토콜은 전신 조사에 노출된 후 마우스의 골  수 세포에서 염색체 간 안정 이상을 식별하는 데 있어 다중 형광 현장 혼성화(mFISH) 및 스펙트럼 핵형 분석(SKY)의 유용성을 설명합니다.

여러 형광에 의한 간 염색체 안정 수차의 검출<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 (mFISH) 및 방사선 조사 마우스의 스펙트럼 핵형 분석 (SKY)

이 관 스쿼시 기술의 목표는 빠르게 세포 무결성을 유지 하면서 마우스 spermatocytes를 개발의 cytological 기능을 평가 하기 위해입니다. 이 메서드와 spermatogenesis의 모든 단계의 학문에 대 한 수 있습니다 마우스 감수 분열의 연구에 대 한 다른 생화학 및 분자 생물학적 접근 함께 쉽게 구현할 수 있다.

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핵 표면 퍼짐은 만피증 도중 염색체 사건을 공부하기 위한 필수적인 공구입니다. 여기서 우리는 제브라피쉬 정자세포로부터 의한 1단계 진행 중에 메오성 염색체를 준비하고 시각화하는 방법을 시연한다.

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여기에 제시된 마우스 페이어의 패치에서 발아 센터 B 세포를 사용하여 면역 글로불린 무거운 사슬 유전자 궤적 내의 체세포 초열을 정량화하는 분석이다.

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마우스 난 모세포의 스핀들 어셈블리 체크 포인트 무결성 평가

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시냅스와 재조합 평가를 위한 마우스 난모세포에서 퍼진 감수분열 염색체 준비(Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Oocytes for Assessment of Synapse and Recombination)

배우세요 마우스 B 림프구에서 PNA-FISH를 이용한 염색체 이상 분석 방법입니다. 형광 현미경으로 유전체 불안정성을 정량화하고 DNA 복구 경로를 연구할 수 있습니다.

PNA-FISH에 의해 마우스 B 림프구에서 염색체 이상을 신속하게 분석

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