Name: 소설 생체 유전자 전달 기술과 시험관 셀 기반 분석 실험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-08T23:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: 학습하세요 생체 내 파골세포 분화를 위한 유전자 전달 기술과 시험관 내 세포 배양 프로토콜을. 마우스 골수 대식세포와 인간 말초혈액 단핵세포를 활용한 이 방법은 뼈 생물학 연구에 활용됩니다.

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연구는 NIH 연구 보조금 R01 AR062173과 IEA에 대한 SHC 250862의 일부 지원을 받았습니다. ES는 NIH T32 CTSC 박사 전 펠로우십을 받았습니다.

sRANKL MC DNA의 1. 유체 역학 배달 <ol><li> 마우스의 꼬리 정맥을 통해 유체 역학 배달 <ol><li> 꼬리 정맥 주입하기 전에 마우스의 무게를. 마우스의 체중의 10 % ~의 총 부피에 sRANKL 또는 링거액에 녹색 형광 단백질 (GFP) MC (미리 따뜻한 37 ° C에서)를 희석. </li><li> 혈관을 팽창하고 눈에 보이는 측면 혈관 (정맥 주사)를 확인하기 위해 주사 전에 10 분 동안 새장에 마우스를 따뜻하게. 탈수와 고열을 피하기 위해 신중하게 마우스를 모니터링합니다. </li><li> 즉시 정맥 주사가 넓혀진 눈에 보이는대로, 제한 수단에 마우스를 전송하고 이동을 억제하는 통에 충분히 플러그를 삽입합니다. 같은 호흡으로 정상 활동에 마우스를 모니터링합니다. 필요한 경우 제한 기의 플러그를 조정합니다. </li><li> 와이프 주류로 꼬리의 끝으로부터 주입 영역 3 / 4을 소독. 마우스 꼬리 정맥 주입을 위해 27 ~ ​​30 G 바늘을 사용합니다. 한 손으로 단단히 꼬리를 잡고있는 바늘을 삽입꼬리 정맥에. 주사기에 압력을 적용하고 5-7 초 내에 주입을 완료합니다. </li><li> 꼬리 정맥에서 바늘을 제거하고 출혈을 멈추게하는 주사 부위에 면봉으로 압력을 적용합니다. 호흡 속도가 정상 속도로 감소되면 다음 동식물 사육장에 다시 마우스를 전송, 15 ~ 30 분 동안 마우스를 모니터링합니다. </li></ol></li><li> 마우스 혈청 TRACP5b 포스트 유전자 전송의 전신 마우스 sRANKL 표현과 정량화의 확인 <ol><li> 혈관을 팽창하고 정맥 주사를 볼 수 있도록하기 위해 5 ~ 10 분간의 장에 마우스를 따뜻하게. 탈수와 고열을 피하기 위해 신중하게 마우스를 모니터링합니다. </li><li> 꼬리의 끝에서 앞으로 사이트 한 곳에서 마우스의 꼬리에 잎을 가진 작은 절개를합니다. </li><li> 혈청 분리 튜브에 혈액의 약 100 μl를 수집합니다. </li><li> 실온에서 30 분 동안 혈청 분리 튜브를 배양한다. </li><li> 원심 분리기 5 분 10,000 XG에 샘플 및 혈청을 수집합니다. STOR추가 분석을 위해 -80 ° C에서 E 세럼. </li><li> 상용 가능한 키트를 사용하여 혈청 샘플에 sRANKL ELISA와 마우스 혈청 TRACP5b 분석을 수행합니다. </li></ol></li></ol> 마우스 BMMs 2. 체외 파골 세포 생성 <ol><li> 분리 및 BMMs의 배양 <ol><li> 경골과 대퇴골 뼈의 분리 : CO 2 기증자 마우스를 안락사, 70 % 에탄올로 다리를 소독. 그대로 대퇴골과 경골 뼈를 제거하기 위해, 종골 뼈에 치골에서 해부. </li><li> 뼈를 손상시키지 않고 조심스럽게 피부와 근육을 제거합니다. 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)를 포함하는 배양 접시에서 처리 대퇴골과 경골 뼈를 놓습니다. </li><li> 골수 제거 : 대퇴골과 경골 뼈의 한쪽 끝을 잘라 및 α-MEM은 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 포함하는로드 25 G 바늘을 1 ㎖ 주사기를 사용하여 50 ㎖ 튜브에 골수를 플러시 (파골 세포 배양액 / OCM). </li><lI&gt; 프로세스 골수 : 혼합 및 70 μm의 나일론 셀 스트레이너를 통해 전달하여 새로운 50 ㎖ 튜브에 골수 현탁액을 전송합니다. 원심 분리기 300 XG와의 세포를 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 10 % FBS (파골 세포 배양액 / OCM (+))를 포함하는 α-MEM에 다시 일시 중지합니다. </li></ol></li><li> 대 식세포의 문화 <ol><li> 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계산합니다. </li><li> 96 - 웰 플레이트에 넣고 37 ℃에서 부화 유리 커버 슬립 (5 ㎜) 또는 상아질 조각에 6 잘 판 3 × 10 5 세포를 잘 당 플레이트 1 X 10 6 세포 </li><li> 기음 비 부착 세포를 포함하는 48 시간 동안 25 NG / ML 마우스 M-CSF를 포함하는 신선한 OCM (+)와 37 ° C에서 세포를 품어 모든 미디어. </li><li> 25 NG / ML 마우스 M-CSF 및 파골 세포를 시작하는 30 NG / ML 마우스 sRANKL를 포함 기음 모든 미디어와 신선한 OCM으로 37 ° C에서 세포를 배양 (+) 미디어. 필요에 따라 매 3 일마다 미디어를 보충. </li><li> 세포 성장약 6~8일 뼈를 resorbing 할 수있는 거대한 멀티 핵 세포를 형성하는 데 필요한 권한입니다. 즉시 다핵 세포가 나타날 때, 상용 가능한 키트를 사용하여 염색 TRAP (주석 산염 저항하는 산성 인산 가수 분해 효소)를 수행하고, 완전히 성숙 할 때, 기능 분석을 수행합니다. phalloidin도 스테인 및 이미지 (19) 이전에 설명한 바와 같이 주사 전자 현미경 (SEM)에 의해 슬라이스 상아질 부착 세포를 이용하여 커버 슬립에 F-액틴 링 시각화. </li></ol></li></ol> 인간 PBMC를 3. 체외 파골 세포 생성 <ol><li> 인간 PBMC를의 분리 <ol><li> 50 ㎖ 튜브에 미리 예열 Histopaque-1077의 10 ML을 추가합니다. </li><li> 빈 백혈구 필터는 50 ML 튜브 (PBS와 혈액의 1:1 비율)로 멸균 PBS와 혈액 은행에서 얻을. 혈액이 histopaque와 혼합하지 않도록하고, 아주 천천히 histopaque 용액에 희석 된 혈액을 레이어. </li><li> 18 ° C에서 20 분 1000 XG에 원심 분리기 샘플 따라원심 분리를하여 보내고, 정중 백혈구 함유 백색 버피 코트 층을 분리하고 50 ㎖의 새로운 튜브로 옮긴다. </li><li> 세포를 수집하는 5 분 650 XG에 다시 PBS와 원심 분리기로 세포를 희석. </li><li> 미디어 및 셀 카운터를 사용하여 세포를 계산 (-) OCM에 뜨는에 resuspend 세포를 제거합니다. </li></ol></li><li> PBMC를 도금 및 배양 <ol><li> OCM에있는 세포를 재현 탁 (+) 미디어 판 (8) × 10 / ㎖ 당 잘 6 잘 플레이트 또는 1 X 10 6 세포 / ㎖ 당 잘 96 - 웰 플레이트에있는 6 개의 세포. 로 면역 형광 이미징뿐만 아니라 골 흡수 분석에 적합한 뼈 조각에 대한 필요에 따라 유리 커버 슬립 (5 ㎜)에 플레이트 세포는 이전에 (20)을 설명했다. </li><li> 변경 배양액 인간 M-CSF 2-3 일마다 또는 필요에 따라 세포를 보충. 그런 osteoclastogenes을 시작 OCM (+) 미디어 25 NG / ML 인간의 M-CSF와 함께 인간의 sRANKL 30 겨 / ㎖를 추가하여 5 일에 분화 단계로 진행이다. </li><li> 거대한 멀티 핵 세포를 형성하는 데 약 14-21일에 세포를 성장. 마자 다핵 세포가 나타나는 바와 같이, 이들 세포는 TRAP 표지 할 수 있고, 완전히 성숙 할 때, 기능적 분석법이 수행 될 수있다. F-액틴 링은 phalloidin도 얼룩을 사용하여 커버 슬립에 시각화 할 수 있습니다. 세포 형태는 SEM에 의해 조각을 상아질에 부착 된 세포에서 검사 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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근골격계 조건은 병적 상태와 장애의 원인을 선도하고 150 개 이상의 질병 및 증후군 구성되어 있습니다; 현재 약 90 만 명의 미국인에 영향을 미치는. 관절 염증 및 골 파괴는 관절염과 골다공증 등의 근골격 조건의 주된 기능이다. 골다공증은 주로 뼈의 골절로 이어지는 뼈의 무결성을 약화 조건이다. 관절염은 부어, 부드럽고 뻣뻣한 제한 정상적인 운동이되어 장애로 이어질 수있는 관절의 염증을 특징으로 질병을 쇠약, 만성입니다. 근골격계 질환의 발병이 크게 서로 다르지만, 골 파괴가 무엇보다 중요한 일반적인 기능입니다. 근골격계 조건에서 뼈 파괴는 주로 골 흡수와 골 형성 (21, 22) 사이의 불균형에 의해 발생합니다. 한 치료 방법은 뼈를 파괴하는 이들 세포의 능력을 차단하도록 시도하는 것이다 <s업&gt; 23. 여기에 설명 된 기술과 절차는 생체 내 및 시험 관내에서 모두 파골 세포의 연구를 할 수 있습니다. <p class="jove_content...

근골격계 질환은 국가 및 지역 보건 시스템 1에 대한 미국과 현재의 심각한 결과에있는 사람들의 수백만에 영향을 미칩니다. 이 질환은 뼈의 손실과 광범위한 치료 및 회복의 오랜 기간을 필요로 관절 기능을 특징으로한다. 일반적으로, 파골 세포의 수 및 / 또는 활성의 상대적 증가는 세포가 골다공증, 뼈 재 흡수하도록 특수화 및 관절염이 관찰된다. 생리적 조건에서 파골 세포의 수와 활성을 골아 세포에 의해 생산되는 핵 인자 κ B-리간드 (RANKL)의 수용체 활성에 의해 조절된다. 게린 (OPG), RANKL에 대한 미끼 수용체는 조골 세포 (3)에 의해 생성되는 조직 sRANKL의 과발현 또는 OPG의 삭제를 포함하는 생체 내 동물 모델 골다공증 연구에 매우 유용합니다.; 그러나,이 방법은 형질 전환 마우스 4,5의 생성을 필요로합니다. 여기서, 새로운 대안근골격계 관련 질환의 연구 sRANKL를 과발현하는 방법이 설명된다. 특히, minicircle (MC) DNA 기술 및 유체 전달 방법은 생체 내에서 sRANKL의 유전자 전달을 달성하고 체계적으로 6 마우스 sRANKL를 과발현하는 데 사용되었습니다. 이 방법은 또한 낮은 칼슘 다이어트 (8)에 의해 난소 7식이 개입을 다음 파골 세포의 호르몬 변조 골다공증의 다른 생체 모델을 보완. 이 모델들은 수술 절차가 필요하고 상당한 비용 9에서 몇 달까지 걸릴 수 있습니다 그러나 근골격계 관련 질환의 다양한 측면을 연구하는 것은 매우 유용하다. 난소 절제 (OVX) 설치류 모델은 난소를 제거함으로써 인간의 폐경 후 골다공증 (10)을 흉내 낸 에스트로겐 결핍에 이르게 실험 동물 모델입니다. 인간의 폐경 후 골다공증, 에스트로겐 defici 조건ency은 골절의 위험이 증가로 연결 골다공증은 미국에서만 약 8 백만명의 여자에 영향을 미칩니다. OVX 모델은 폐경 후 골다공증에 유용하지만 그것은 일반적으로 골다공증을 연구하는 제한된 이점을 제공합니다. 에스트로겐 따라서 그것의 부재에서 증가 된 파골 세포 활성은 10-12을 관찰하고, 파골 세포 및 조골 세포 유도 세포 사멸을 억제함으로써, 골 손실을 억제한다. 골 흡수 호의 RANKL-OPG 비율 불균형도 13를 관찰된다. 성장 인자 β (TGF β의), 증가 된 인터루킨 12 (IL-12) 및 TNF, IL-1 및 IL-6 (14, 15)를 변형의 수준을 감소함으로써 그러나, 생체 내에서 에스트로겐 결핍도 수반한다. 이러한 사이토 카인은 RANKL 경로의 뼈 리모델링 조절 성 기능을 독립적 알고있다, 그것은 전적으로 RANKL-RANK 축에있는 파골 세포의 활성화를 속성 수 없다. 이 문서에 설명 된 모델은 비브에서 공부하는 연구자 수오 전 염증성 사이토 카인없이 파골 세포와 뼈 손실에 RANKL-RANK 축이 OVX 쥐 모델에 비해. 또한, 체외 파골 세포 기술은 근골격계 질환의 잠재적 인 치료 트리트먼트의 파골 세포의 활성을 연구하는 중요한 도구입니다. 이전 연구는 또한 마우스 대 식세포 집락 자극 인자 (M-CSF)와 마우스 sRANKL와 마우스 골수 유래 대 식세포 (BMMs)를 배양하는 파골 세포의 분화 3,16,17로 이어질 수있는 것으로 나타났습니다. 여기서, 마우스 골수로부터뿐만 아니라 체외 (18)에서 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMC를)까지 다핵 파골 세포 - 유사 세포를 생성하는 프로토콜이 설명된다. 성숙한 말기 차별화 된 완벽한 기능 파골 세포를 정의하는 데 필요한 세포 기반 분석도 간략하게 설명되어 있습니다. 체외 기술은 생체 방식의 소설을 보완하고 함께 P 역할owerful 조사 도구는 파골 세포의 분화 및 활성화를 공부한다. 이러한 시스템을 사용하여, 과학자들은 생체 내 및 시험관 내에서 파골 세포 생성 및 증식 및 활성화에 필요한 자극 및 신호를 정의 할뿐만 아니라 약리학 적 및 생물학적 억제제의 효능을 시험 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>알파-MEM</td><td>생명 기술&nbsp;</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>Human M-CSF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-492</td><td></td></tr><tr><td>마우스 M-CSF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-643</td><td></td></tr><tr><td>Human RANK-Ligand - 용해성</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-631</td><td></td></tr><tr><td>마우스 RANK-Ligand - 용해성</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-076</td><td></td></tr><tr>마우스 <td>Braintree</td> TV-150<td>용 Tailveiner Restrainer</td><td> </td><td></td>STD</tr><tr><td>마우스 트랜스/랭크 L/TNFSF11 Quantikine ELISA 키트&nbsp;</td><td>R& D systems</td><td>MTR00</td><td></td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit</td><td>Sigma</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>MouseTRAP assay&nbsp;</td><td>면역진단시스템</td><td>SB-TR103</td><td></td></tr></tbody></table>

소설 생체 유전자 전달 기술과 시험관 셀 기반 분석 실험

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

파골세포의 분화와 활성화는 근골격계 질환의 발병에 중요한 역할을 하는데, 이 세포는 주로 뼈 흡수에 관여하기 때문입니다. 파골세포는 특정 사이토카인이 존재하는 단핵구/대식세포 전구세포로부터 체외에서 생성될 수 있으며, 이는 생존과 분화를 촉진합니다. 여기에서는 in vivo 및 in vitro 기술이 모두 시연되어 과학자들이 파골세포 분화, 신호 전달 및 활성화에 대한 다양한 사이토카인 기여를 연구할 수 있습니다. minicircle DNA delivery gene transfer system은 골다공증 관련 모델을 확립하기 위한 대안적인 방법을 제공하며, 다양한 약리학적 억제제의 in vivo 효능을 연구하는 데 특히 유용합니다. 마찬가지로, 특정 사이토카인이 존재하는 상태에서 인간 전구 세포에서 파골세포를 생성하기 위한 체외 배양 프로토콜을 통해 과학자들은 중개 응용을 위해 인간 세포의 파골세포 형성을 연구할 수 있습니다. 이러한 기술을 결합하면 파골세포 특이적 표적 치료제에 대한 약물 발견 노력을 가속화할 수 있는 잠재력이 있으며, 이는 전 세계 수백만 명의 골다공증 및 관절염 환자에게 도움이 될 수 있습니다.

여기서, 파골 세포에 대한 사이토 카인의 효과를 연구하기위한 방법으로 체외로 파골 전구 세포 분화에 대한 생체 내 및 세포 배양 프로토콜에서 파골 세포의 분화를위한 신규 한 유전자 전달 기술이 설명된다. 그림 1에서, 마우스에있는 GFP 마우스 sRANKL MC의 성공적인 유전자 전달의 대표적인 결과가 표시됩니다. 그림 2에서, 마우스의 골수 또는 시야 현미경에 의한 파골 세포에 전구 세포의 인간 PBMC 세포 분화 시간 코스의 문화를 대표하는 이미지가 표시됩니다. 그림 3, 마우스 골수 유래 파골 세포의 특성을 세 가지 독립적 인 방법의 대표 이미지가 표시됩니다 . 마우스 sRANKL의 존재는 TRAP의 표현 (그림 3A와 B)와 F-액틴 링 (그림 3 C와 D)의 형성을 활성화합니다. 스캔 ELEC트론 현미경 (SEM)을 마우...

전구세포의 파골세포로의 분화는 사이토카인과 성장인자에 의해 조절됩니다. 여기에서는 사이토카인이 파골세포형성에 미치는 영향을 연구하는 방법으로서 in vivo에서 파골세포를 파골세포로 분화하기 위한 새로운 유전자 전달 기술과 전구세포를 in vitro에서 파골세포로 분화하기 위한 세포 배양 프로토콜에 대해 설명합니다.

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

전반적인 목표는 in vivo에서 파골세포의 분화를 위한 새로운 유전자 전달 기술을 보고하는 것입니다. 또한 인간 pbmc의 마우스의 골수 대식세포를 파골세포로 구별하기 위한 세포 배양 프로토콜에 대해서도 설명합니다. 이 비디오는 세 부분으로 나뉩니다.하나, 랭크 이끼 미니 서클, DNA, 마우스에서 2 개의 체외 파골 세포 생성, 골수 대식 세포, 인간 pbmc에서 3 개의 체외 파골 세포 생성의 유체 역학적 전달. 1 부, 계급 이끼 미니 서클, DNA의 유체 역학적 전달. 다음 애니메이션은 마우스 꼬리 정맥 주입을 통한 유체역학적 전달에 대한 간략한 개요를 보여줍니다.먼저 주입하기 10분 전에 마우스를 히트 맵 아래에 놓습니다. 이것은 혈관을 확장하고 측면 정맥을 더 잘 보이게 합니다. 그런 다음 주사 부위를 찾아 주사를 진행하고 5-7초 이내에 주사를 완료해야 합니다.이 비디오의 다음 부분에서는 쥐 꼬리 정맥을 통한 유체역학적 전달과 관련된 절차에 대한 자세한 설명을 보여줍니다. 주입할 재료를 모읍니다. 주입하기 전에 10분 동안 케이지에서 마우스를 워밍업합니다.탈수와 저체온증을 피하기 위해 마우스를 주의 깊게 모니터링하십시오. 마우스를 따뜻하게 하면 혈관이 확장되고 측면 정맥이 더 잘 보입니다. 정맥이 보이면 마우스를 구속기로 옮기고 플런저를 삽입하여 쥐의 움직임을 억제합니다.알코올 물티슈로 주사 부위를 소독합니다. 27-30 게이지 바늘을 사용하여 희석 된 랭크 리간드 또는 GFP 미니 서클을 Prewarm ringer 용액에 마우스 꼬리 주입합니다. 한 손으로 꼬리를 단단히 잡고 바늘을 꼬리 정맥에 삽입합니다.주사기에 압력을 가하고 5-7초 이내에 주입을 완료합니다. 그 후 정맥 꼬리에서 바늘을 제거하고 주사 부위에 면봉으로 압력을 가하여 출혈을 멈춥니다. 희석된 혈액으로 인한 호흡 속도 증가를 관찰하고 성공적인 주사를 해야 합니다.15-30분 동안 구강을 모니터링한 다음 다시 바륨으로 옮깁니다. 일단 생쥐가 정상적인 호흡 속도를 갖게 되면, 유체역학적 유전자 전달은 DNA가 실질 세포로 들어가는 것을 막는 내피 세포막의 물리적 장벽을 극복하기 위해 대량의 액체를 혈관에 빠르게 주입함으로써 생성되는 유체역학적 압력을 활용합니다. 실질 세포는 모세혈관 내피에 근접하여 DNA에 즉시 접근할 수 있기 때문에 형질 주입됩니다.일단 내피 장벽이 파괴되면. 2부, 마우스 골수 대식세포에서 체외 파골세포 생성, 첫 번째 단계는 마우스 분리 경골과 대퇴골을 희생하는 것입니다. PBS가 적재된 주사기를 사용하여 골수를 씻어낸 다음 세포를 세고 간단히 플레이트를 만듭니다.기증자 마우스를 안락사시키고 대퇴골과 경골 뼈를 제거한 후 골수를 50ml 튜브로 씻어냅니다. PBS 믹스가 장전된 25게이지 바늘이 있는 1밀리리터 주사기를 사용한 다음 나일론 세포 여과기를 통과시켜 골수 현탁액을 새로운 50ml 튜브로 옮깁니다. 골수 현탁액을 나일론 세포 스트레이너에 통과시켜 세포를 원심분리하고 파골세포 배양 배지에서 현탁액을 재생한 후 5mm 상아질 슬라이스를 사용하여 96웰 플레이트를 준비합니다.마찬가지로 5mm 유리 커버 슬립을 사용하여 96웰 플레이트를 준비할 수 있습니다. 왼쪽의 상아질 절편과 오른쪽의 유리 덮개 슬립은 혈류, 세포 분석기 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 세고 300, 000 세포를 유리 덮개로 미끄러 뜨리거나 움푹 들어간 조각을 96 웰 플레이트에 놓고 섭씨 37도의 인큐베이터에서 배양합니다. 모든 비부착성 세포를 포함하는 모든 배지를 제거하고 48시간 동안 MCSF가 보충된 새로운 등급 배지를 추가합니다.48시간 후 모든 배지를 제거한 다음 마우스 MCSF 및 마우스 랭크 라인을 포함하는 파골세포 배지를 추가하여 파골형성을 시작하고 필요에 따라 3일마다 배지를 제거 및 보충합니다. 다핵 트랩 양성 세포의 형성에 의해 정의되는 성숙한 골 클래스. F 상아질 파트 3의 활성 형성 및 흡수.시험관 내에서도 인간 pbmc에서 클래스 생성. 50ml 튜브에 10ml의 예열 히스토 팩을 추가하고 PBS로 플러시하는 혈액 은행에서 얻은 백혈구 필터를 50ml 튜브에 넣습니다. 그런 다음 histo pack 용액 위에 혈액을 매우 천천히 층을 이루어 혈액이 histo pack 용액과 혼합되지 않도록 합니다.혈액이 섭씨 18도에서 20분 동안 2, 250RPM으로 히스토팩 용액 원심분리기 샘플 위에 어떻게 층을 이루는지 확인하십시오. 세 레이어의 중앙에 있는 Buffy 코트 레이어에 주목하십시오. 원심분리 후 백혈구가 포함된 흰색 담황색 코트층을 분리하고 새로운 50ml 튜브로 옮깁니다.그런 다음 단계 완료 후 PBS로 세포를 희석하고 1800RPM에서 5분 동안 다시 원심분리하여 세포를 수집합니다. 원심분리 후 슈퍼 이름을 제거합니다. 파골세포 배양 배지 혼합물에서 세포를 다시 현탁시키고 세포와 배지를 함께 교반합니다.혈구, 세포 분석기 또는 세포 계수기로 세포 계수 이 비디오에서 이전에 시연된 것처럼 움푹 들어간 조각 또는 유리 덮개 슬립이 있는 96웰 플레이트를 준비합니다. 그런 다음 도금 후 24시간 후에 유리 커버가 미끄러지거나 움푹 들어간 조각에 웰당 100만 개의 세포를 플레이트합니다. 인간 MCSF를 배양 배지에 추가합니다.배양 배지를 변경하고 필요에 따라 2-3일마다 세포에 인간 MCSF를 보충합니다. 그런 다음 human MCSF 및 osteoclast media로 보충된 human rank ligand를 추가하여 osteoclastogenesis, multinucleate trap positive cells의 형성으로 정의되는 성숙한 파골세포, F actin 고리 형성 및 상아질 결과에 대한 흡수를 시작하여 분화 단계를 진행합니다. 여기에서는 용해성 랭크 리간드 미니 서클, DNA의 유체역학적 전달과 전구 세포의 체외 배양 및 분화를 사용하여 in vivo osteoclastogenesis 마우스 모델에 대해 설명합니다.파골세포로. 그림 1은 마우스에서 GFP 및 랭크 리간드 미니 서클의 성공적인 유전자 전달을 보여주고, 그림 2는 마우스 골수 또는 PBMC 세포 분화 시간 경과 배양의 대표적인 이미지를 보여주며, 명시야 현미경 검사에 의한 파골세포로의 전구세포의 배양 시간 과정 그림 3은 마우스 골수 유래 파골세포를 특성화하기 위한 세 가지 독립적인 방법의 대표적인 이미지를 보여줍니다. 우리는 용해성 랭크 리간드의 존재가 트랩 그림 3 A와 B의 발현 및 방출, F 액틴 고리의 형성을 활성화한다는 것을 보여줍니다.그림 3 C 및 D.우리는 또한 주사 전자 현미경을 통해 용해성 랭크 이끼가 상아질에 흡수 구덩이의 형성을 유도한다는 것을 보여줍니다 그림 3 E 및 F.그림 4는 PBMC 유래 파골세포에서 동일한 특성화 방법을 보여줍니다. 다시, 가용성 랭크 리간드의 존재는 트랩 그림 4 A와 B의 발현 및 방출을 활성화합니다.F, 액틴 고리 그림 4 C 및 D의 형성 및 용해성 랭크 리간드는 상아질 그림 4 E 및 F에 흡수 구덩이의 형성을 유도합니다. 이러한 시스템을 사용하여 in vivo 및 in vitro에서 osteo class를 생성하고 증식 및 활성화에 필요한 자극과 신호를 정의하고 약리학 및 생물학적 억제제의 효능을 테스트할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

성인 마우스의 대퇴골과 tibiae의 뼈 손실의 길이 시험은 순차적 낮은 선량 X - 선 검사를 사용하여 척수 상해 다음을 수행했다. 대퇴골의 골 손실은 40 일 이후 부상까지 발견되지 동안 경골 뼈 손실은 연구를 통해 발견되었다.

소설을 사용하여 척수 상해 후에 마우스 뒷다리 뼈 손실의 세로 평가, 생체내에 방법론

동물 모델은 자주 뼈에 암 전이를 공부하는 활용하고 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 뼈 전이 연구에 대한 종양 접종의 일반적인 두 가지 방법을 설명하고 간략하게이 모델을 모니터링하고 정량화하기 위해 이용 분석의 일부를 설명합니다.

뼈 전이의 모델

골절 치료에 뼈 전구 기능의 정량적 측정은 고해상도 시리얼 이미징 기술을 필요로한다. 여기에, 프로토콜은 이미지를 순차적으로 골절을 수리하는 과정에서 내생 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이동, 증식과 분화를 정량화의 intravital 현미경과 osteo-혈통 추적을 사용하여 제공됩니다.

순차<em&gt; 생체 내</em&gt; 골절 치료시 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이미징

황색 포도상 구균의 발광 생물 공학적 변형을 이용하여, 정형 외과 임플란트 감염 마우스 모델에서 광과 μCT 화상을 결합하여, 비 침습적으로 및 종 방향에서의 세균 감염의 역학뿐만 아니라 대응하는 염증 반응 및 해부학 적 변화를 모니터 할 수있는 기능을 구비 뼈.

결합<em&gt; 생체</em&gt; 광학 및 μCT 이미징 마우스의 정형 외과 임플란트 감염에 감염, 염증 및 뼈 해부학을 모니터링

이 프로토콜은 생체 내에서 대퇴골수에서 세포의 움직임을 추적하는 데 사용할 수 있는 새로운 쥐 대퇴골 창 챔버 모델을 설명합니다. 생체 내 다광자 형광 현미경은 시간이 지남에 따라 대퇴골수의 세 가지 구성 요소(혈관 구조, 콜라겐 매트릭스 및 호중구)를 이미지화하는 데 사용됩니다.

대한 대퇴골 창 회의소 모델<em&gt; 생체</em쥐의 골수에서&gt; 셀 추적

우리는 비골 신경의 자극과 쥐 뒷다리의 앞쪽 가랑이 구획의 수축에 따라 발의 배측 굴곡을 측정하기 위한 생체 내 프로토콜을 설명합니다. 이러한 측정은 근육 복구 및 재생에 대한 골격근 병리학 및 조직 공학 접근 방식을 평가하는 데 필수적인 번역 도구입니다.

의 응용 프로그램<em&gt; 생체</em&gt; 조직 평가를위한 쥐 앞정 전방의 기능 테스트는 골격근 수리 엔지니어링

작은 실험용 물고기는 인간의 뼈 질환의 기저에 있는 메커니즘에 대한 뼈 연구와 뼈 조절 약물의 스크리닝을 위한 인기 있는 모델이 되었습니다. 이 보고서에서는 골다공증성 병변이 있는 medaka 유충의 뼈 세포에 대한 alendronate의 효과를 평가하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

약물 치료와<em&gt; 생체</em&gt;은 메다카 물고기 골다공증 모델에서 조골 파골 세포 상호 작용의 영상

이 프로토콜의 목표 경도 평가 vivo에 는 반자동된 microcomputed 단층 기반 정량적 구조 분석을 사용 하 여 될 수 있는 누드 쥐 척추 압축 골다공증 관련 골절 모델을 생성 하는 것입니다.

반자동 경도 Microcomputed Tomography 기반 정량적 구조 분석 누드 쥐 척추 골절 골다공증 관련 모델의

제안된 프로토콜은 다중 모드 분석을 사용하여 뼈 재생의 맥락에서 뼈 형성을 평가하기 위한 글로벌 접근 방식을 수반합니다. 새로운 뼈 형성에 대한 정성적 및 정량적 정보를 제공하여 기초 및 전임상 조사의 엄격성과 타당성을 향상시키는 것을 목표로 합니다.

Ex vivo 모델에서 조직 광물화의 포괄적인 특성 분석

쥐 골수 손상 모델은 막내 골화를 통한 출생 후 골형성을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 단순화된 수술 프로토콜은 새로운 뼈 형성 및 손상 후 세포 반응의 다운스트림 평가를 위한 골수 절제 절차를 설명합니다.

쥐 골수 손상 모델에서 골수내 골화를 통한 출생 후 골형성을 연구하기 위한 개선된 방법론

여기에서는 골내 주사를 통해 ABE로 코팅된 키토산을 골수에 직접 전달하는 유전자 치료 방법을 제시합니다.

키토산 나노입자 캡슐화된 아데닌 염기 편집기 플라스미드의 골내 주입을 사용한 유전자 전달 및 발현 향상

학습하세요 생체 내 파골세포 분화를 위한 유전자 전달 기술과 시험관 내 세포 배양 프로토콜을. 마우스 골수 대식세포와 인간 말초혈액 단핵세포를 활용한 이 방법은 뼈 생물학 연구에 활용됩니다.

소설 생체 유전자 전달 기술과 시험관 셀 기반 분석 실험

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