Name: 작은 RNA 종의 북부 오 탐지의 향상된 초파리 Melanogaster (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 학습하세요 Drosophila melanogaster에서 소량 RNA를 검출하는 향상된 Northern Blot 기법입니다. RNA 추출, 아크릴아미드 겔 전기영동, 교차결합, 프로브 표지를 통해 유전자 발현을 분석하는 이 방법은 분자생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 작품은 연구소 국립 드 라 상테 동부 표준시 드 라 공들인 Médicale에 의해 지원되었다, 센터 국립 드 라 공들인 과학원, 4 대학 드 스트라스부르, HOPITAL 드 스트라스부르, 협회 부어 라 공들인 쉬르 르 암, 연구소 국립 뒤 암, 직원은 국립 드 라 공들인 및 지역 알자스. 피에트로 Laneve는 라 공들인 Médicale는 Fondation에 의해 부어지지를 받고 있습니다. 현재는있는 Istituto 이탈리아 Tecnologia (IIT) 교제의받는 사람입니다. 출판 비용을 Neurex 네트워크에 의해 지원됩니다 (TriNeuron - 프로그램 Interreg IV 상단 라인)

1 샘플 컬렉션 <ol><li> 피펫에 의해 반 부착 슈나이더의 두 세포 (평균 1-5 × 10 6 세포), 분리 및 원심 분리 (1 분 100 XG)에 의해 그들을 수확. 체외 부착 세포 배양의 경우는, 표준 조건에서 그들을를 Trypsinize 직접 셀 스크레이퍼의 도움으로, RNA 추출 시약의 양에 편리한 플레이트에서 그들을 수집. </li><li> 배아 수집, 플라이 케이지에서 초파리 균주를 성장하게 배아는 계란 누워 판에 누적됩니다. 증류수에 붓 DH (2 O)에 의해 배아를 닦아, 자체 필터링 파편을 버리고 씻어 유리 병 (48)에 배아를 복구 할 수 있습니다. </li><li> 다른 방법으로 수동으로 조직 / 장기를 해부하다. 힘으로 박리 바늘 또는 집게를 사용하여, 실체 현미경 (배율 20 배)에서는 인산염 완충 식염수 (PBS)에 초파리 복부에서 고환 (피르 분석을위한 우선적 인 시스템)을 격리설리반 등 49 ualized. </li><li> 유 봉은 RNA 추출 시약 0.5 볼륨의 중독에 샘플을 균질화. </li></ol> 2 RNA 추출 / 분석 <ol><li> 다음은 제조업체의 지침에 상용 시약을 통해 RNA 분리를 수행합니다.주의! RNA 추출 에이전트는 일반적으로 독성 및 부식성이다. 또는 다음과 같이, RNA 분리 (50)에 대한 테 K-기반의 프로토콜을 적용 <ol><li> 정지 믹스 400 μL로 샘플을 희석하고 실온에서 15 분 동안 배양한다. </li><li> 클로로포름 : 이소 아밀 알코올과 클로로포름 추출 및 에탄올 (EtOH를) 침전 / 세탁에 의한 표준 페놀에 의해 hydrosoluble 구성 요소를 복구 할 수 있습니다. 공기 샘플을 건조 diethylpyrocarbonate (DEPC)로 재현 탁 더블 (일) H 2 O 증류 - 처리 </li></ol></li><li> UV 분광 측정하여 RNA 농도를 평가합니다. 또한, RNA의 순도는 2.0에 가까운 높은 BAS 보장260에 ED / 280 읽기. </li><li> 다음과 같이 아가 로스 젤을 변성에 RNA 준비 확인 <ol><li> 깨끗한 비커에서 연속 교반, DEPC-DDH 2 O의 82 ㎖에 아가로 오스의 1.2 g을 녹인다. 완전히 용해 될 때까지 끓인다. </li><li> 겔 용액을 냉각시킵니다; 온도가 60 °가 10 배 4 morpholinepropanesulfonic 산 10 ㎖를 추가 C에 도달 할 때 (MOPS)는 1X 최종 농도 (FC)에 버퍼, 8 ml의 3 포름 알데히드 % 37 %의 FC.주의! 포름 알데히드는 발암 물질이다. </li><li> 수평 전기 영동 셀에 겔을 붓고. 젤은 적어도 1 시간 동안 후드 강화하도록 허용합니다. 응고 후, MOPS 1X에 젤 잠수함. </li><li> 분취 RNA 시료 2 μg 및 1 μg의 래더 (정확한 평가가 요구 될 때 RNA 마커를 사용). RNA에 아가로 오스 로딩 염료 (ALD)의 3 볼륨을 추가하고 사다리. 열 70 ° C 5 분 동안 얼음에 즉시 차가운에서. CA의 ution! ALD의 내용 (에티 디움 브로마이드 및 포름 아미드, 자료 참조)는 각각, 돌연변이 및 부식성이다. </li><li> 샘플을로드하고 가끔 버퍼 재활용 약 1 시간 동안 50 V에서 젤을 실행합니다. UV 시각화 또는 젤 이미징에 의해 RNA의 분류 패턴을 확인합니다. 28S와 18S rRNAs과 된 tRNA에 해당하는 개별 밴드를 인식 (그림 1 참조). </li></ol></li><li> -80 ° C에서 북부 분석 또는 저장 RNA 진행합니다. </li></ol> 3 변성 아크릴 아마이드 젤 준비 <ol><li> 이 분류 단계에 대한 작은 수직 전기 영동 장치 (플레이트의 크기 8cm X 9cm, 빗 두께 0.75 mm)를 사용합니다. </li><li> 주조 프레임에서 함께 깨끗한 안경을 조립합니다. </li><li> (1 19) MOPS 1X 용액, 7 M 우레아 10 % 아크릴 아미드 / 비스 - 아크릴 아미드 10 ㎖를 준비합니다. 바로 주입하기 전에, 10 %의과 황산 암모늄 100 ㎕ TEMED 및 10 μL를 추가하고 신속 용액을 혼합한다.주의! 아크릴 아마이드는 신경 독성 및 발암 물질이다. </li><li> 유리판 사이에 젤을 부어 거품을 피하기 위해 신중하게 잘 빗를 삽입합니다. 젤은 사용하기 전에 적어도 45 분 동안 실온에서 중합 보자. 또한, 겔 O / N, 물에 젖은 여과지에 싸여 사란 랩에 밀봉 저장합니다. </li></ol> 4 샘플 준비 <ol><li> 나누어지는 0.5-20 각 샘플에 대한 총 RNA ㎍의. 볼륨 3-4 μl를 초과하면, 진공은 샘플을 건조. </li><li> 크기 결정 용 마커로서 (제조 섹션 4.3 및 4.4 참조), 샘플에 평행 방사성 표지 저역 사다리의 분취 량 (20-30 CPS)를 실행. 단계 4.5에 기재된 바와 같이, 샘플들에 병렬로 취급. </li><li> 사다리 : 10 bp의 단계 사다리의 0.1 μg을 사용하여 인산 앞으로 반응을 설정합니다. 30 분 동안 37 ° C에서 품어 20 mM의 FC에 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 추가하여 반응을 중지합니다. </li><li> EtOH로 침전 / 세척, 건조 공기에 의해 정화DDH 2 O (약 100 μL).에 재현 탁주의! 32 P 방사성 소스입니다. </li><li> 각 샘플에 아크릴 아미드 파란색 염료 (ABD)의 동일한 볼륨을 추가합니다. 5 분 동안 80 ° C에서 가열에 의해 변성 및로드.주의까지 얼음에 멋지다! 포름 아미드 (ABD의 내용이) 부식성이다. </li></ol> (5) 전기 영동 분획 <ol><li> 캐스팅 지원을 유리판을 제거하고 적절하게 전기 영동 셀을 조립한다. 충분한 실행 버퍼 (RB)와 모두 내부 및 외부 챔버를 입력합니다. </li><li> 부드럽게 빗를 제거하고 10 분 동안 200 V에서 젤을 미리 실행합니다. 로드 샘플 전에 주사기를 통해 일부 RB를 분출하여 우물에서 요소 예금을 씻어. </li><li> 플랫 팁을 사용하여 각 우물의 바닥에서 4.5 단계에서 신중 충 샘플. 거꾸로 실행을 방지하기 위해 양극과 음극 연결을 확인합니다. 샘플이 5 분 동안 100 V에서 젤을 입력 한 후, 난V. 200에 전압을 ncrease </li><li> 약 7cm의 분별 길이를 들어, 45 분 - 장기적으로는 충분하다. 젤을 오버플로 브로 모 페놀 블루 (ABD에서 추적 안료를)하지 마십시오. </li><li> 선택적인 단계로 에티 디움 브로마이드 (EtBr이) 염색에 의해 분류 된 긴 RNA를 겔에 - 시각화 : <ol><li> 겔의 정상에서 멀리 2cm를 잘라 짧게 DDH 2 O.에서 슬라이스를 씻어 </li><li> RB, EtBr이 0.5 μg / ml의 FC 부드러운 동거와 15 분 동안 실온에서 겔 슬라이스를 품어. </li><li> RB에서 1​​5 분 동안 젤 Destain, UV 조사 또는 겔 촬상 장거리 rRNAs 시각화. RNA 로딩과 품질 (그림 1, 패널 7).주의를 확인! 에티 디움 브로마이드가 돌연변이이다. </li></ol></li><li> 한편 작은 RNA 종을 포함하는 겔의 하부 블로 팅을 진행. </li></ol> 6 젤 블로 팅 <ol><li> 6 블롯 영역에 맞추기 위해 압지 조각과 uncharge의 상당 부분을 잘라D 나일론 막을. 용지, 막과 RB의 두 블로 팅 패드를 적 십니다. 완전히 반복 RB에서 그들을 압박하여 패드를 흡수해야합니다. </li><li> 장치에서 젤을 제거하고 주걱의 평균에 의해 안경을 엽니 다. 우물을 제거하기 위해 깨끗한 커터를 사용합니다. 젤에 젖은 와트 종이를 놓고 조심스럽게 들어 올립니다. </li><li> 겔의 자유면에 나일론 막을 놓습니다. 샘플 상태에 따라 필터의 방향을 모서리를 표시. &quot;샌드위치&quot;(3 종이 조각 각면)을 완료합니다. 가능한 모든 공기 방울을 제거하고, 표면에 오점 플라스틱 막대 롤. </li><li> 모래 바닥 카세트에이 모래 바닥 패드와 다음 사이의 오점을 놓습니다. , 모래 바닥 모듈에 카세트를 조립 RB와 챔버를 작성하고 (겔과 긍정적 인 말단 사이에 유지해야 나일론 막) 올바른 방향을 확인합니다. </li><li> 20 분 동안 20 V에서 전송합니다. 참고 : 10 분 블로 팅 모듈과 연구를 연 후, 균일 한 조건을 보장하기 위해전송을 완료하기 전에 180도 샌드위치 otate. </li></ol> 7 막 가교 <ol><li> 신선한 가교 솔루션 (XLS)의 6 ML을 준비합니다. 포화 10cm는 (나일론 막보다 더 큰) 10cm XLS.주의와 압지의 조각을 X!에 HCl (XLS의 구성 요소)이 높은 부식성이다. </li><li> 오점을 해체 젖은 3MM 필터 종이에 막 배치합니다. 참고 : RNA는 포화 종이와 직접 접촉하지 않아야합니다. 두 개의 유리판 사이의 필터 종이를 놓고 사란 랩에 포장. </li><li> DDH 2 O 세척 한 다음 2 시간 동안 60 ° C에서 막을 열. -20 ° C에서 저장 또는 하이브리드를 진행합니다. </li></ol> 8 멤브레인의 프레 하이브 리다이 제이션 <ol><li> RNA로드 (옵션 단계 5.5)을 선택되어 있으면 직접 하이브리드를 진행합니다. 아니면, 나일론 필터의 꼭대기로부터 거리 1cm 잘라 프로브 간 hybridizatio 않도록분별 긴 RNA를 ns의. </li><li> 37 ° C에서 하이브리드 솔루션 (HS) 10 ㎖를 예열. 5 분 동안 95 ° C에서 연어 정자의 1 mg의 변성 얼음에 시원하고 HS 추가 할 수 있습니다. </li><li> 혼성화 오븐에서 회전에 따라, 적어도 1 시간 동안 37 ℃에서 HS에서 필터를 배양한다. 필터의 RNA 측이 HS에 직면 해 있는지 확인합니다. </li></ol> 9 프로브 합성 <ol><li> 4.3에 설명 된대로 특정 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 10 pmol의에 인산 앞으로 반응을 설정합니다. </li><li> (EtOH로 침전도 이상) 트리스-EDTA-염화나트륨 (TEN)의 5 볼륨이 반응 버퍼 및 G-25 세파 덱스 컬럼에 젤 배제 크로마토 그래피에 의한 합병되지 않는 뉴클레오티드의 표지 프라이머를 정화 추가합니다. 프로브 활성을 액체 섬광 계수기에 의해 평가 될 수있다. </li></ol> (10) 멤브레인 하이브리드 <ol><li> 신선한 10 ㎖의 분취 (전술 한 바와 같이 제조 및 보완)로 배출 HS를 교체합니다. 에 프로브를 가열얼음에 시원하고 새로운 HS에 추가 10 분 동안 95 ° C에서. 37 ° C ON에서 필터를 품어. </li></ol> (11) 멤브레인 세척 <ol><li> 하이브리드 솔루션을 복구 및 방사능 차폐 상자에 -20 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 세척 버퍼 (WB)의 필터를 세척하여 실온에서 10 분 동안 철저하게 씻는다. </li><li> 필터 코너에서 잔류 방사능을 점검하기위한 가이거 뮬러 감지기를 사용합니다. 배경 배출량은 약 5 CPS 때, 박람회를 막에 진행합니다. </li></ol> (12) 신호 감지 <ol><li> 오토 라디오 그래피 필름 또는 분자 영상 화면 ON에 필터를 노출. 사진 처리 또는 디지털 변환하여 신호를 알 수있다. </li><li> 전용 정량화 소프트웨어 (ImageJ에 또는 Optiquant)에 의해 밴드의 강도를 분석 할 수 있습니다. </li></ol> (13) 멤브레인 스트립 <ol><li> 스트리핑 끓는 용액의 500 ㎖에 잠수함, 막 1 차 신호를 제거하려면다음 1 분 동안 실온에서 배양한다. 소설 (전) 하이브리드를 진행 또는 -20 ° C에서 필터를 저장합니다. </li></ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

RNA가 신경을 조절 통해 얽혀 닳고 닳은 우리의 감사가 지속적으로 증가하고 있지만, 신경 줄기 세포 생물학, 신경 세포의 분화 / 기능 통합, 신경 병변 및 암의 개발에 영향을 미치는 RNA 기반 circuitries의 기계적인 의미는 미개척 남아있다. 초파리는 짧은 RNA를 비 암호화 및 전사 인자가 큰 분자 플레이어로 간주되는 비경 셀룰러 경로를 해명하는 수단으로서 melanogaster 왕국 통해 이러한 네트워크의 유지 보수 시스템은 유전자의 전위를 만든다. 이보기에서, 후보 작은 RNA 발현 수준의 프로파일 링은 정확한 기능 분석에 대한 초보의이다 : 예를 들어 북 블로 팅 분석의 개선 된 버전으로 통해 ​​수행 DMEL-miR279가 생체 내에서 GCM / 글라이드 운명의 결정을 변조 우리의 최근 시위에서 온다 발현 분석 용 툴. <p1977 (51)에서의 초기 개발 이후 클래스 = &quot;jove_content는&quot;&gt;, NB...

RNA 생화학는 지난 몇 년 동안 일에 극적으로 진행되는 발생했습니다. 유전자 발현의 조절에서 RNA 전위의 우리의 이해는 신규 한 RNA 기반 규제 메커니즘 3,4의 발견에 의해 이미 공지 된 전사 후 이벤트 깊은 특성화에 의해, 강력한 비 암호화 리보 - 레귤레이터 (2)의 식별 정보를 이용하여 버스트되었습니다 5. 모두 함께 이러한 연구가 허용 한 RNA 생물학 극적으로 현재 과학 풍경에 주요 연구 대상이되고, 현장을 확인합니다. 특히, 최근 몇 년 동안 우리는 분자 신경 생물학 (6), 현대 생명 과학에서 가장 역동적 인 연구 영역 중 하나에서 &quot;RNA 세계&quot;의 보급에 미치는 영향의 감각을 얻고있다. 지난 세기 지난 10 년 동안 과학 전반적인 시나리오는 RNA 간섭 7,8 발견 의해 소형 RNA를 규제 9,10의 혁명되었습니다마이크로 RNA (11)에 특정과 관련하여, 내생 적 유전자 발현의다면 발현과 조합 규제 등 거의 모든 세포 기능의 조절에 관여 작은 비 암호화 RNA를 표현. miRNA가 높은 번호가 초파리뿐만 아니라 12 ~ 15 인간의 세포에서 발견했을 때 거의 십년 AMBROS 및 Ruvkun의 연구소에 의해 예쁜 꼬마 선충에서 miRNA의 초기 발견 후, 새롭게 관심 분야에가되었습니다. 그 이후로, 다양한 형질 전환 방법 덕분에, 초파리는 miRNA의 생합성 및 활동에 대해 깊이 탐구 귀중한 생물 컨텍스트로서 서 있었다. 초파리의 miRNA가 경로를, 신진 대사 노화 신호에서 이르기-곤충 특정 또는 진화 적으로 보존 된 프로세스에 고유 한 기능을 계시했다 행동하고, 물론, 신경. 이 방향을 따라, 우리는 최근 흥미로운 공동의 소설 링크 16을 발표했다마스터 유전자 GCM / RNA 활공 경로 사이에서 발생 rrelation. 플라이 전사 인자 GCM / 글라이드 17-19 능성에 아교 대 신경 운명의 선택이 신경 전구체 20 비행 지시 세포 운명 결정의 독특한 예를 구성한다. 스물 년이 주제에 대한 오랜 연구는 GCM /를 통해 수렴 유전자 발현 조절의 다양하고 중복 입력의 발생 신경 개발 과정에서 신경 세포와 신경 교세포의 대응 사이의 섬세한 비율을 균형에 필요한 임계 값 레벨을 설정하는 21 ~ 28 활공을 강조 분명히하고있다. 우리는 DMEL-miR279 타겟팅을 통해 그 규정은 GCM의 전사 후 미세 조정 / 16 식 활공에 기여하는 또 다른 제어 수준을 나타냅니다 발견했다. 전 세계적으로 이러한 연구 선이 필요 한 특정 방법론 개선 : 년 함께 몇 가지 기술은 원래 트라를 분석하기 위해 개발itional RNA들처럼, 작은 비 코딩의 RNA를 정량화 변환 된의 RNase 보호 분석법, cDNA를 배열 29-31, 실시간 PCR 방법 32-35 및 36,37 시퀀싱 등. 다른 측면에서, 기술적 접근 방법의 재 교정이 분야에서 지속적으로 진행되는 육성하고있다. 북부 얼룩 분석 (NB, 또는 RNA 겔 블롯 분석은) 대표 인스턴스를 구성 : 그것은 크기가 결정뿐만 아니라 모두 발현 수준의 정량을 보장 이후 크게, RNA 축적을 프로파일 사용된다. 그러나, 본 방법의 본질적인 나쁨 감도는 짧은 RNA를 원한다면, 낮은 풍부한 유전자 발현 미세 튜너에인가 될 때 제한된다. 해로운 결과는 특정 생체 시료 어려운 그 응용 프로그램을 만드는 총 RNA, 많은 양의 요구 사항입니다. 이러한 이유로, 작은 RNA를 검출을위한 특정 NB 변종의 경우 38 ~ 40를 개발되어 있습니다 : 우리는 개선 된 NB 발동을 이용했다edure 41 (ENB, 향상된 북부 오), DMEL-miR279와 GCM / 활공의 전술 상호 작용을 해명하면서. 이 방법은, 카르 보디이 미드 유도체의 활동을 기반으로 화학적 가교 결합 단계에 의존 [1 - 에​​틸 3 - (3 - 디메틸 아미노 프로필) 카 보디이 미드, EDC] 고체 지지체에 핵산을 고정한다. 카르 보디이 미드 활성화 카복실 또는 포스페이트 그룹 및 아민 기 (42) 사이에 아미드 결합의 형성을 촉진하는 것으로 알려진 다기능 가교제이다. 이 속성은 나일론 막의 표면에서 그룹을 아미노하기 위해 모노 인산화 된 5&#39;-하이드 록실 그룹을 통해 공유 커플 작은 RNA들에 악용 될 수 있습니다. 얻어진 부착 구성은 다시 검출 현저한 향상 43 결과 프로브의 타겟의 혼성화의 효율을 고정화 핵산의 접근성을 높이고. 이 기술은 특정 relevanc 가정초파리 분자 연구에서 전자가있는 작은 비 암호화 RNA를 소설과 독특한 클래스의 발생이 44 떠오르고있다. 이 중, 45, 46가 순서 특정 유전자 침묵 (gene silencing)에 참여 piwi 상호 작용하는 RNA를 (piRNAs 47)의 특정 하위 유형을 구성 rasiRNAs. 이 방법의 동작 상세하게 설명 하나 rasiRNA, rasi4 중, 최초로, 마이크로 RNA-DMEL miR279 및 DMEL-miR286의 분석을 기준으로하고, 이하에서 가시화된다. 우리는 RNA (이하 1 μg)의 최소 금액에서 제대로 표현 대상도 공개 허용이 방법을, 극단으로 밀었다.

<table><tbody><tr><td>최종 구성/이름</td><td>회사</td><td>카탈로그 (재고)</td><td>코멘트<</td></tr><tr>td colspan="4">일반 요구 사항</td></tr><tr><td>원심분리기, 5418</td><td>Eppendorf</td><td>5418 000.017</td><td></td></tr><tr><td>오염 제거제, RNase Away</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83931</td><td>유리/플라스틱 제품에 적용하고</td></tr><tr><td>RNase 억제제, DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>유해 //// 1609-47-8</td></tr><tr><td colspan="4">샘플 준비</td></tr><tr><td>실체 현미경, M60</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS 버퍼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>137 mM NaCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>2.7 mM KCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>P9541</td><td>7447-40-7&nbsp;</td></tr><tr><td>10 mM Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td>7558-79-4&nbsp;</td></tr><tr><td>1.8 mM KH2PO4</td><td>시그마-알드리치</td><td>P9791</td><td>7778-77-0&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">RNA 추출/분석</td></tr><tr><td>UV-Vis 분광 광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>겔 이미저, ChemiDoc XRS+</td><td>Biorad</td><td>170-8265</td><td></td></tr><tr><td>수평 전기영동, 미니 서브 셀 GT</td><td>BioRad</td><td>170-4487EDU</td><td></td></tr><tr><td>RNA 추출 시약, TRIzol 시약</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>PCA (25:24:1), 추출</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617</td><td>136112-00-0</td></tr><tr><td>Chlorophorm, 추출</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>67-66-3&nbsp를 위한 1:1; &nbsp;</td></tr><tr><td>EtOH, 2.5 vol. 강수량, 세척용 70%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59844</td><td>64-17-5&nbsp;</td></tr><tr><td>유전자 눈금자 1Kb DNA 사다리</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td></td></tr><tr><td>스톱 믹스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>300 mM NaOAc, pH 5.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>127-09-3</td></tr><tr><td>1x RSB 용액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2% 도데실황산나트륨 (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>강수량을 피하기 위해 SDS를 절대 냉각시키지 마십시오 //// 151-21-3</td></tr><tr><td>2 mg/ml Proteinase K</td><td>Roche Applied Science</td><td>0-3115828001</td><td>EC 3.4.21.64 9</td></tr><tr><td>10X 망상적혈구 표준 완충액(RSB)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM Tris-Cl, pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td>1185-53-1&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>100 mM NaCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>30 mM MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>7786-30-3</td></tr><tr><td>변성 아가로스 젤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.2% 아가로스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>젤을 최소 1시간 동안 응고시키십시오 //// 9012-36-2</td></tr><tr><td>10X MOPS 버퍼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 M MOPS 나트륨 염, pH 7</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9381</td><td>MOPS 나트륨 염을 혼동하지 마십시오. 걸레 //// 71119-22-7</td></tr><tr><td>아가로스 로딩 염료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x MOPS 버퍼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3% 포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>F8775</td><td>위험 //// 50-00-0</td></tr><tr><td>50% 포름아미드</td><td>시그마-알드리치</td><td>47670</td><td>위험 //// 75-12-7</td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드(EtBr) 30 &mu; g/ml</td><td>시그마-알드리치</td><td>E1510</td><td>위험 //// 1239-45-8</td></tr><tr><td>브로모페놀 블루&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>B0126</td><td>115-39-9&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4"> SMALL RNA FRACTIONATION</td></tr><tr><td>플랫 젤 로딩 팁</td><td>Life Technologies</td><td>LC1002</td><td></td></tr><tr><td>Savant SpeedVac 집중</td>기 <td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>DNA120</td><td></td></tr><tr><td>수직 전기영동, Mini-PROTEAN Tetra Cell&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>변성 아크릴아미드 겔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% 아크릴아미드/비스-아크릴아미드 (19:1)</td><td>시그마-알드리치</td><td>A3449</td><td>위험. 사용하기 전에 젤을 45분 동안 중합시키십시오</td></tr><tr><td>. 1x TBE 버퍼 (또는 1x MOPS 버퍼)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7 M 요소</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6504</td><td>57-13-6</td></tr><tr><td>0.1% 과황산 암모늄</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215589</td><td>7727-54-0&nbsp;</td></tr><tr><td>0.1% TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td>110-18-9</td></tr><tr><td>유전자 통치자 초저범위 DNA 사다리(10bp-단계)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1211</td><td>라벨 0.1 &mu; g, "프로브 라벨링"반응</td></tr><tr><td>아크릴 아미드 블루 염료&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% 포름아미드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47670</td><td>위험 //// 75-12-7</td></tr><tr><td>Bromophenol 블루</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>115-39-9&nbsp;</td></tr><tr><td>러닝 버퍼(RB)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x MOPS 버퍼&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>대안적인 RB: 1x TBE 버퍼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x TBE 버퍼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5X TBE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>445 mM 트리스 기반</td><td>시그마-알드리치</td><td>T1503</td><td>77-86-1&nbsp;</td></tr><tr><td>445 mM 붕산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td>10043-35-3</td></tr><tr><td>20 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>60-00-4&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>겔 염색 용액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>: 브롬화 에티듐 0.5 &mu; g/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>유해 //// 1239-45-8</td></tr><tr><td>1x RB</td><td></td><td></td><td>EtBr로 15분 동안 얼룩, EtBr</td></tr><tr><td colspan="4">BLOTTING</td></tr><tr><td>3MM Whatman 종이</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z270849</td><td></td></tr><tr><td>중성 나일론 멤브레인, Hybond NX</td><td>GE 헬스케어 생명 과학</td><td>RPN203T</td><td>감광성</td></tr><tr><td colspan="4">가교</td></tr><tr><td>가교 용액 (XLS)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1 % 1- 메틸이 미다 졸 (v / v)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>336092</td><td>항상 XLS의 새로운 부분 표본을 준비하십시오 // 616-47-7</td></tr><tr><td>12.5 mM HCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>H1758</td><td>위험 //// 7647-01-0</td></tr><tr><td>3.1 % EDC (w / v)</td> <td>시그마-알드리치</td><td>3450</td><td>25952-53-8&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">(PRE)-HYBRIDIZATION</td></tr><tr><td>액체 신틸레이션 카운터&nbsp;</td><td>Beckmann</td><td>LS 6500</td><td></td></tr><tr><td>전단 연어 정자, 0.1 mg/ml&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM9680</td><td></td></tr><tr><td>rasi4 안티 센스 프로브</td><td></td><td></td><td>5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -</td>3'5s-rRNA</tr> <tr><td>안티 센스 프로브</td><td></td><td></td><td>5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3'Dmel-miR279</td></tr> <tr><td>안티 센스 프로브</td><td></td><td></td><td>5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3'Dmel-miR286</td></tr> <tr><td>안티 센스 프로브</td><td></td><td></td><td>5'- AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'</td></tr><tr><td>정제 키트, Illustra MicroSpin G-25 열</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>(Pre)-Hybridization Solution (HS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5% SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>151-21-3&nbsp;</td></tr><tr><td>5x Denhardt의 솔루션</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20X SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.6 M NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>0.2 M 인산나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>342483</td><td>7601-54-9&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>20 mM EDTA (pH 8.0)</td><td>시그마-알드리치</td><td>EDS</td><td>&nbsp; 60-00-4&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>50x Denhardt의 솔루션</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% Ficoll 400 (w/v)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2637</td><td>26873-85-8</td></tr><tr><td>1% 폴리비닐피롤리돈</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td>9003-39-8</td></tr><tr><td>1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>9048-46-8&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>1X TEN 버퍼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-Cl (pH 8.0)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&nbsp;</td></tr><tr><td>100 mM NaCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>1 mM EDTA (pH 8.0)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>EDS</td><td>60-00-4&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>프로브 라벨링</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.4 &mu; M 올리고뉴클레오티드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 &mu; l Ci/&mu; l [&gamma;-32P] ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG002A</td><td>유해 //// 51963-61-2</td></tr><tr><td>1x T4 폴리뉴클레오티드 키나아</td>제 <td>완충액 Biolabs</td><td>B0201</td><td></td></tr><tr><td>T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 0.5 단위/&mu; l</td><td>Biolabs</td><td>M0201</td><td>EC 2.7.1.78</td></tr><tr><td colspan="4"> 세척</td></tr><tr><td>Geiger Mueller 탐지기</td><td>Canberra Industries</td><td>MCB2/CPS &ndash; </td><td></td>EM77021</tr><tr><td>세척 버퍼(WB), 2x SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>엄격한 세척 버퍼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2x SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x SSPE, 0.5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2x SSPE, 0.5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">신호 감지</td></tr><tr><td>PharosFX Plus 시스템</td><td>Biorad</td><td>170-9460</td><td></td></tr><tr><td>이미지 J</td><td>자유롭게 사용 가능한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수량 1</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X 선 필름, BioMax XAR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5888</td><td></td></tr><tr><td>X 선 필름 용 감광성 현상</td><td>액 Sigma-Aldrich</td><td>P7042</td><td></td></tr><tr><td>X 선 필름 용 해결사</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7167</td><td></td></tr><tr><td colspan = "4"> 스트리핑</td></tr><tr><td>스트리핑 용액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 8.8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&nbsp;</td></tr><tr><td>5 mM EDTA</td><td>시그마-알드리치</td><td>EDS</td><td>60-00-4&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>0.1 % SDS</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>71736</td><td>거품을 피하기 위해 끓인 후 SDS를 첨가하십시오 // 151-21-3</td></tr></tbody></table>

작은 rna 종의 북부 오 탐지의 향상된 초파리 melanogaster

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

지난 수십 RNA 수준에서 유전자 발현을 제어 메커니즘 주위 과학적 관심 폭발을 보아왔다. 분자 생물학의이 지점은 크게 전사 후 조절에 중요​​한 선수로의 RNA를 비 암호화의 발견에 의해 연료를 공급하고있다. 이러한 혁신적인 관점은 높은 처리량 레벨 (게놈 전체의 식별) 또는 단일 후보 분석 (특정 종의 정상 상태 축적)으로 모두 함께 짧은 RNA를 발현 프로파일 링에 대한 강력한 기술의 개발에 의해 촉발되었다. 여러 첨단 전략 투여 또는 도피 분자를 시각화 현재 사용할 수 있지만, 북부 오 점 분석은 RNA 발현의 즉각적이고 정확한 평가를위한 분자 생물학 자격이 접근 남아있다. 이는 많은 경우에 더 정교하고 고가의 기술의 응용을 향해 첫 단계는 쉽게 통찰력을 얻기 위해 우선적 인 방법 남아 나타내고RNA 생물학에. 여기에서 우리는 수동으로 애벌레 / 성인 조직을 해부 또는 체외 배양 된 세포에서, 전체 배아를 melanogaster 초파리에서 약하게 발현 마이크로 RNA (또는 다른 작은 규제 RNA 종)을 검출 (북 오 강화) 효율적인 프로토콜 개요. RNA의 매우 제한된 양이 필요하고 계측법 절연 세포가 될 수있는 흐름 물질의 사용은 또한 예상된다.

도 1에서 설명 텍스트 및 개략적 전반적인 절차에 따라, 우리는 상이한 기원의 복잡한 RNA 샘플로부터 RNA를 작은 식을 평가 하였다. (: 아가 로스 젤 분류 변성 선택적 단계) 두 번에로드 그림 1에서 제시 한 실험에서, RNA는 무결성 검사 테 K 추출하여 초파리 슈나이더의이 세포로부터 분리되었다. 겔의 절반은 중립 멤브레인에 블 롯팅시키고, 화학적 가교 결합에 의해 EDC; 후반전 후 UV 크로스가 결합, 양전하 나일론 필터 상에 (1.2 × 105 μJ / cm 2)을 옮겼다. DMEL-miR279 가족에 속하는이 마이크로 RNA의 내생 적 표현은 (DMEL-miR279 자체 DMEL-miR286 15)는 두 조건 모두에서 확인되었다. 개선 된 절차 (ENB)는 표준 일 (SNB) 높은 감도 존중을 보장합니다. <p class=...

이 책의 목적은 시각화 및 초파리에서 추출한 RNA에 향상된 북부 얼룩 프로토콜의 동작 단계를 논의 배아, 세포 및 조직을 melanogaster하는 것입니다. 이 프로토콜은 작은 RNA 종의 효율적인 검출에 특히 유용하다.

작은 RNA 종의 북부 오 탐지의 향상된 초파리 Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

이 절차의 전반적인 목표는 Deano gaster 배아 또는 조직 또는 세포에서 작은 RNA 발현을 검출할 수 있도록 하는 것입니다. 이는 먼저 선택한 생물학적 공급원에서 RNA를 추출하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 아크릴아미드 겔을 따라 전기영동으로 RNA를 분별하여 저분자량 이동 패턴을 해결하는 것입니다.다음으로, RNA 종은 중성 고체 지지체로 전달되고 화학적으로 가교됩니다. 마지막 단계는 후보 분자를 특정 안티센스 프로브로 어닐링하여 라벨링하는 것입니다. 궁극적으로 자동 방사선 촬영은 분석 중인 분자의 발현을 반영하는 신호를 밝히는 데 사용됩니다.이 답이 없는 북쪽 블록 방법은 완전히 발현된 RNA 분자의 정상 상태 수준과 같은 RNA 생물학 분야의 핵심 질문에 답할 수 없습니다. 먼저 초파리 슈나이더의 두 세포를 1-5배, 10-6밀리리터의 밀도로 성장시킵니다. 그런 다음 피펫팅을 통해 반부착 세포를 분리하고 1분당 100GS로 세포를 원심분리합니다.또는 난자를 낳는 접시에 배아를 축적하십시오. 붓과 증류수로 배아를 닦아내고 이중 체로 걸러낸 다음 튜브에서 배아를 헹구고 회수하고 100마이크로리터의 RNA 추출액, 시약 및 유봉을 추가합니다. 샘플을 균질화합니다.제조업체의 지침에 따라 RNA 분리를 수행합니다. 다음으로, UV 분광 광도계로 RNA 농도를 평가하고 RNA 순도가 A two 60을 기준으로 2.0에 가까운지 확인합니다. 두 번 이상 80 읽기.그런 다음 변성 아로스 젤을 준비하고 젤 용액을 식히십시오. 온도가 섭씨 60도에 도달하면 10 x 걸레 버퍼 10 밀리리터와 37 % 포름 알데히드 8 밀리리터를 첨가하십시오. 겔을 수평 전기영동 셀에 붓습니다.응고 후 1 시간 동안 후드 아래에서 젤을 응고시키고 젤을 500 밀리리터의 1 x 걸레 버퍼에 담그십시오. 다음으로 Eloqua, 2마이크로그램의 RNA 샘플과 1마이크로그램의 사다리. RNA와 사다리에 염료를 로딩하는 3가지 부피의 aros를 추가합니다.샘플을 섭씨 80도에서 5분 동안 가열하고 즉시 얼음으로 식힙니다. 샘플을 로드하고 50볼트에서 1시간 동안 겔을 작동시키며 가끔 완충액을 재활용합니다. 하나의 X 걸레 버퍼에 10%아크릴아미드 비스 아크릴아미드 용액 10밀리리터, 황산염당 10%암모늄 100마이크로리터의 몰 요소 7개, 테트라에틸 에틸렌 디아민 10마이크로리터를 준비하고 용액을 즉시 빠르게 혼합합니다.깨끗한 유리판 사

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연구

JoVE Journal

Biology

생물학

RNA 간섭은 유전자의 기능을 분석하는 매우 효과적인...

dsRNA 주입하여 RNAi 간섭에 Drosophila 태아

우리의 단백질 표현 및 현지화의 postembryonic 규제를 식별할 수 sensitized 방법을...

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em

여기 우리는 전체 마운트 형광을...

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

교 잡 프로토콜 설명된 RNA 제자리에 전체 초파리 배아 또는 해 부 조직에서 RNA의 검출을 허용 한다. 96-잘 결정 접시와 tyramide 신호 증폭에 사용 하 여, 성적 감지할 수 있습니다 높은 해상도, 감도, 및 처리량, 그리고 상대적으로 저렴 한 비용.

높은 해상도 교 잡 형광 제자리에 초파리 태아와 Tyramide 신호 증폭을 사용 하 여 조직에서

여기에서, 우리는 분자 비콘, 회전 디스크 공초점 현미경 및 오픈 소스 분석을 사용하여 살아있는 Drosophila melanogaster 계란 챔버에서 내인성 mRNA 인신 매매의 시각화, 탐지, 분석 및 추적을위한 프로토콜을 제시합니다. 소프트웨어.

라이브 드로소필라 멜라노가스터 에그 챔버에서 내인성 mRNA 를 시각화하고 추적

이 방법은 전체 RNA 추출물로부터 miRNAs를 검출하기 위해 북부 혼성화 기술의 사용을 보여줍니다.

식물 MicroRNAs의 검출 및 정량화를 위한 RNA 블롯 분석

초파리 는 근육 형성을 조절하는 주요 분자를 연구하기 위한 잘 정립된 모델입니다. 그러나 현재의 방법은 mRNA 전사 역학 및 세포융합 내 공간 분포를 결정하기에 충분하지 않습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 RNA 형광 in situ hybridization 방법을 최적화하여 단일 분자 규모에서 mRNA를 검출하고 정량화할 수 있습니다.

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila (초파리의 단일 분자 스케일에서 근육 전사 역학 연구)

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization(EASI-FISH)은 확장 현미경 검사와 FISH(Fluorescence in situ hybridization)를 결합하여 두꺼운 조직에서 여러 유전자의 발현을 검출하는 강력한 기술입니다. 이 프로토콜은 이 방법의 최근 발전과 온전한 초파리 중추 신경계를 라벨링하기 위한 적응을 간략하게 설명합니다.

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization을 사용한 온전한 초파리 뇌의 유전자 발현의 다중 검출

이 프로토콜은 Drosophila melanogaster의 X 또는 Y 염색체 리보솜 DNA 자리에서 유래한 리보솜 RNA 전사체를 구별하기 위해 단일 뉴클레오티드 다형성에 민감한 제자리 형광 혼성화(SNP-FISH) 방법을 설명합니다.

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH: Drosophila melanogaster에서 유전자좌 특이적 리보솜 RNA 전사 검출

이 글에서는 시약을 경제적으로 사용하고 소수의 상상 디스크를 쉽게 다룰 수 있는 효율적인 상상 디스크 해부 및 항체 염색 프로토콜을 설명합니다.

Drosophila melanogaster의 눈-더듬이 및 날개 상상 디스크의 소규모 해부 및 항체 염색

학습하세요 Drosophila melanogaster에서 소량 RNA를 검출하는 향상된 Northern Blot 기법입니다. RNA 추출, 아크릴아미드 겔 전기영동, 교차결합, 프로브 표지를 통해 유전자 발현을 분석하는 이 방법은 분자생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

작은 RNA 종의 북부 오 탐지의 향상된 초파리 Melanogaster

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