2014년 9월 5일
영상 기술의 통합 제품군은 카리브해 산호 Montastraea의 annularis와 M.에서 용종의 형태와 조직 구조를 결정하기 위해 적용되었습니다 faveolata. 형광, 직렬 블록 얼굴, 및이 광자 공 초점 레이저 주사 현미경 lobate 구조 용종 벽 및 예상 chromatophore 및 주산 셀러 밀도 및 분포를 확인했다.
다음 실험의 전반적인 목표는 1-2mm 두께의 산호 폴립을 3D로 이미지화하여 미세한 구조와 산호 색소 및 그 위치를 이해하는 것입니다. 이것은 먼저 샘플을 왁스에 삽입한 다음 마이크로톰을 사용하여 샘플을 1미크론 섹션으로 절단함으로써 달성됩니다. 다음으로, 맞춤형으로 설계된 직렬 블록 면 기술을 사용하여 산호 폴립을 이미지화하고 3D 이미지를 재구성합니다.
여러 2D 이미지를 사용하여 구조적 무결성을 손상시키지 않고 산호 조직의 미세한 구조적 세부 사항을 해결할 수 있는 기술의 능력을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 절차를 시연합니다. 오늘은 제 연구 그룹의 공동 연구자인 Dr. Maunde Siva guru입니다.
사전 여과 왁스 용융을 준비하기 위해 3.6g의 스티어를 핫 플레이트의 유리 비커에 플레이크에 녹입니다. 다음으로 수단 400mg을 넣는다. 4 왁스 배경 형광을 최소화하기 위해 잘 혼합하고 빨간색 반투명 용액이 얻어질 때까지 기다립니다.
그런 다음 파라핀 81g을 넣고 잘 섞습니다. 그런 다음 15g의 흰색 과립 VI 바를 넣고 동일한 비커에서 완전히 녹입니다. 녹으면 다시 혼합하여 완전히 혼합된 왁스 용액을 얻습니다.
이제 혼합물을 유리병에 넣고 뚜껑으로 느슨하게 닫습니다. 유리병을 섭씨 60도의 컨벡션 오븐에 넣어 재료를 액체 상태로 유지하고 모든 침투가 일어나도록 합니다. 이 용액은 200밀리리터로 만들 수 있으며 두 개의 100밀리리터 병으로 나눌 수 있습니다.
하나는 침투를 위한 것이고 다른 하나는 AU에서 카리브해 암초 건물 산호 샘플을 최종적으로 매립하기 위한 것이며 현장의 파라 포름알데히드에 고정되었습니다. SBFI를 위해 산호 조직을 삽입하려면 먼저 밭에 수집된 산호 폴립을 씻고 파라 포름알데히드에 섭씨 4도에서 보관합니다. 그런 다음 이미징할 준비가 되었을 때 매번 5분 동안 PB S3로 세척합니다.
24시간 동안 또는 용종에 탄산칼슘이 완전히 없어질 때까지 ex Cal 2 용액에서 용종을 석회화합니다. 여러 개의 석회질 제거된 산호 폴립을 25, 50, 75 및 100% 에탄올 시리즈의 단일 블록으로 배양한 다음 하나의 x 자일렌을 배양합니다. 샘플을 탈수하기 위해 각 세션마다 30분씩 대체하십시오.
다음으로 처리된 용종을 100% 자일렌에 넣습니다. 섭씨 65도의 오븐에서 30분 동안 대체하십시오. 그 후, 새 용액으로 교체하고 30분 더 배양합니다.
폴립의 윗부분이 아래를 향하고 표면이 가능한 한 평평하도록 방향을 잡습니다. 2 대 1, 1 대 1, 1 대 2의 솔루션을 만드십시오. 크실렌 대체물 및 사전 여과 왁스.
50밀리리터의 Falcon 튜브에서 이 세 가지 농도의 사전 여과 왁스로 산호 폴립을 배양한 다음 100% 사전 여과 왁스에서 매번 30분에서 1시간 동안 세 번 배양합니다. 이제 샘플을 포매 왁스로 옮깁니다. 30분 후에 포진 왁스를 제거한 다음 새 포딩 왁스로 교체하고 섭씨 65도에서 최소 4시간 동안 배양을 계속합니다.
그런 다음 블록을 촬영합니다. 이는 왁스에 일단 삽입되면 삽입된 빨간색 왁스가 불투명하기 때문에 샘플의 위치가 보이지 않게 되기 때문에 필요합니다. 다음으로 예열된 새 스테인리스강 임베딩 몰드 주위에 고융점 왁스의 작은 방울을 놓고 냉각시킵니다.
두 번째 부분 표본에서 갓 녹은 소량의 침구 왁스를 붓고 산호 폴립을 흰색 왁스 점 위에 아래로 향하게 빠르게 놓습니다. 그런 다음 스테인리스 스틸 트레이에 플라스틱 샘플 홀더를 놓고 왁스가 플라스틱 금형 표면으로 올라오도록 임베딩 왁스를 더 붓습니다. 이제 섭씨 65도의 오븐에서 전체 설정을 꺼내 왁스가 완전히 굳을 때까지 벤치나 시원한 표면에서 식히십시오.
그런 다음 건조된 블록을 섭씨 4도의 냉장고에 넣고 장기간 보관하기 위해 빛으로부터 보호하여 블록을 절단합니다. 먼저 다듬고 1미크론 부분을 자릅니다. 마이크로톰을 사용하여 샘플이 포함된 부드러운 블록 면의 이미지를 캡처합니다.
매번. 절편이 제거되면 흰색 왁스가 사라지기 시작할 때 샘플이 나타납니다. 그런 다음 fitzy 형광 필터를 사용하여 흑백 카메라로 이미지를 캡처하여 각 샘플에서 3-4개의 석회질 보정된 코어인 크로마토포어 또는 산호 폴립 이미지의 자가형광을 포착합니다.
2개의 광자 형광 이미징을 수행하려면 780나노미터의 여기 이미지에서 2개의 광자 레이저를 사용하여 10 x 대물렌즈를 사용하여 두 개의 서로 다른 배율로 3-4개의 폴립을 사용하여 4%파라 포름알데히드에 세척된 산호 폴립 코어를 거꾸로 놓습니다. 다음으로, 타일 스캔 모드를 사용하여 10 또는 20 미크론 간격으로 XY의 초점면당 약 25-100개의 이미지를 수집합니다. 그런 다음 10 또는 20 미크론 간격으로 Z 축을 통해 50-100 개의 이미지를 수집하면 산호 폴립당 총 약 5, 000-10, 000 이미지가 됩니다.
그 이미지 다음에는 3-4개의 폴립 영역이 코어와 산호 종을 나타냅니다. 그런 다음 모든 이미지를 원시 데이터 형식으로 시스템의 하드 디스크에 저장합니다. 이 절차에서는 정사각형 자르기 도구를 사용하여 단일 폴립에 초점을 맞춰 2D 데이터를 자르고 단일 TIF 파일로 컴파일하여 파일 크기를 줄입니다.
획득 소프트웨어에서. SBFI 데이터의 조립된 파일 또는 EMERIS surpass 프로그램 모듈 under volume 알고리즘 프로젝트에서 두 광자 광학 섹션의 타일링된 여러 Z 스택을 열고 SBFI 데이터를 3D로 렌더링합니다. 그림자 투영을 사용하여 복셀이 솔리드 표면 패턴을 만들기 위한 임계값이 되는 ISOSURFACE 모드를 만듭니다.
XY, xz 및 YZ 직교 모드에서 클리핑 플레인 알고리즘을 사용하여 3D 투영을 시각화하여 산호의 3D 구조와 모양을 드러냅니다. 그런 다음 키 프레임 애니메이션 모듈을 사용하여 프로젝션을 애니메이션합니다. 동일한 erris 프로그램에서 5% 압축으로 비디오 파일을 생성하고 볼륨 3D 및 등곡면 방식을 사용하여 VI 형식의 동영상 클립을 생성합니다.
다음은 M Anis와 M fa Lata의 산호 폴립의 두 가지 광자 형광 3D 이미지입니다. 이 두 이미지는 450에서 700 나노미터에서 수집된 광 신호로 두 광자 레이저의 780 나노미터 여기를 사용하여 구성 요소의 스펙트럼 분리 없이 캡처되었으며, 이 두 이미지는 동일한 여기로 수집되었지만 두 개의 광 증배관 검출기를 동시에 사용하여 두 구성 요소에서 데이터를 수집했습니다. 하나는 500-550 나노 미터이고 다른 하나는 650-720 나노 미터입니다. 이것은 뎁스 코팅된 이미지입니다.
2D에서 빨간색은 가장 얕고 파란색은 가장 깊은 구성 요소입니다. 예. 이 절차를 시도하는 동안 적색 왁스 함유 샘플을 올바르게 준비하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 연속 블록 얼굴 이미징과 형광 현미경 투피트의 조합을 통해 다양한 렌즈 스케일에서 산호 색소 침착 및 세포 구조를 분석할 수 있습니다.
이 비디오를 시청한 후에는 산호초와 그 스펙트럼 특성을 3차원으로 처리하고 이미지화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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이 연구는 코랄 산호의 형태와 조직 구조를 분석하기 위해 통합된 영상 기술 세트를 사용합니다. 활용된 방법에는 형광 현미경, 연속 블록 페이스 이미징, 그리고 2광자 공초점 레이저 스캐닝 현미경이 포함됩니다.
Advanced multimodal optical microscopy enables high-resolution 3D visualization of complex biological tissues, supporting target validation and mechanistic de-risking in preclinical research. By resolving subcellular architecture and molecular distribution in intact tissue samples, these methods enhance predictive confidence in disease-relevant systems. This capability aids in early discovery workflows where structural and molecular phenotyping informs lead identification and assay development.
These imaging methods integrate into the discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, enabling iterative assessment of tissue response to perturbations. The workflow supports hypothesis-driven biology by linking structural phenotypes to molecular readouts.