Name: 복합 광학 현미경 방법 카리브 암초 건물 산호의 폴립 조직 형태와 구조를 밝히기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 학습하세요 복합 광학 현미경을 이용하여 카리브 암초 건물 산호의 폴립 조직 형태와 구조를 3D로 분석하는 방법을. Montastraea annularis와 M. faveolata의 미세 구조와 색소 분포를 밝혀 산호 보전 연구에 기여합니다.

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일리노이 대학교 어바나-샴페인(UIUC) 유전체생물학연구소(Institute for Genomic Biology)의 조직학자인 Donna Epps에게 시료 준비 및 절편에 대한 유능한 기술 지원을 제공해 주신 것에 감사드립니다. 이 작업은 Office of Naval Research(N00014-00-1-0609)에서 B.W. Fouke에게 연구 보조금으로 지원되었습니다. 또한 C.A.H. Miller는 UIUC 지질학과 Wanless Fellowship, UIUC 지질학과 Leighton 기금 및 UIUC 지질학과 Roscoe Jackson 현장 조사 기금으로부터 보조금을 받았습니다. 이 원고에 제시된 해석은 저자의 해석이며 반드시 보조금 수여 기관의 해석을 나타내는 것은 아닙니다. 또한 퀴라소에 있는 카리브해 생물다양성 연구 및 관리(Carmabi) 실험실의 산호 조직 생검 샘플 수집에 대한 지원과 협력에 감사드립니다. 유능한 언어 교정을 해준 IGB 미디어 커뮤니케이션 전문가인 Claudia Lutz에게 감사드립니다.

참고 : 시약은 산호 샘플의 직렬 블록 얼​​굴 이미징을위한 준비를합니다 1 Preinfiltration 왁스 <ol><li> 유리 비커에 스테아린 조각 3.6 g을 녹여. 핫 플레이트 (60 ~ 70 ° C에서) 잘 섞는다. </li><li> 수단 IV의 400 mg의 추가 (왁스 배경 형광을 최소화하기 위해). 잘 섞어 빨간색 반투명​​ 솔루션이 달성 될 때까지 기다립니다. </li><li> 96 ㎖의 뜨거운 용융 파라핀 (100 %)을 넣고 잘 섞는다. </li></ol> 1.2) 포함] 왁스 <ol><li> 유리 비커에 스테아린 조각 7.2 g을 녹여 뜨거운 접시에 잘 혼합 (60 ~ 70 ° C). </li><li> 수단 IV의 0.8 g을 추가합니다. 잘 섞어 빨간색 반투명​​ 솔루션이 달성 될 때까지 기다립니다. </li><li> 파라핀 과립 (162g)를 추가 파라핀이 완전히 녹을 때까지 섞는다. </li><li> 흰색 과립 Vybar의 30g를 추가하고 같은 비커에 완전히 녹아; 녹인 후, 혼합한다. </li><li> 느슨하게 뚜껑 유리 병을 닫습니다. 60 ° C 대류 오븐에 유리 병을 배치EN은 액상 성분을 유지한다. 이 오븐의 모든 침입을 수행하십시오. </li><li> 100 ㎖의 각의 두 유리 병에 200 ㎖의 빨간색 왁의 전체 볼륨을 분할합니다. 한 침투에 대한 나누어지는 최종 매립에 대한 기타를 사용합니다. </li></ol> 1.3) 직렬 블록 얼​​굴 이미징에 대한 임베딩 산호 조직 <ol><li> 인산염 완충 생리 식염수에 (3 배 5 분) (파라 포름 알데히드 4-5 ° C에서 3-6개월) 산호 분야 (SI 비디오 1)에서 수집 및 저장 폴립을 씻고 준비가 이미지를 만들 때 석회. 24 시간 동안이나 용종의 CaCO3의 완전히없는만큼 때까지 ExCal 솔루션의 폴립을 석회. 샘플을 탈수 1X 크실렌 대체 한 후, 25, 50, 75, 및 100 % 에탄올 시리즈에서 단일 블록으로 여러 탈회 산호 폴립 부화. </li><li> 100 % 자일 렌의 대체를 포함하는 예열 65 ° C의 오븐에서 처리 된 용종을 놓습니다. 창이에 의해 두 번 30 분 동안 품어신선한 용액에 겨. 폴립의 상부면 아래 및 상부 표면은 가능한 평탄한되는 방식으로 용종의 방향. </li><li> 1, 1 : 1 및 1 : 2의 용액을 2 크실렌 대체물 및 50 ㎖의 팔콘 튜브에서 preinfiltration 왁스 (단계 1.1). </li><li> 30 ~ 60 분마다 100 %의 preinfiltration 왁스의 3 배 인큐베이션 preinfiltration 왁스의 세 가지 농도를 증가, 산호 폴립을 품어. </li><li> 주의 : 샘플의 두께에 따라, 단계 1.3.1-1.3.5 장기간에 따라 증가 될 수있다. </li><li> 왁스를 포함하는 샘플을 이동 100 % preinfiltration 왁스의 3 배 배양 후에 (단계 1.2.6 참조). </li><li> 30 분 후 삽입 왁스를 제거합니다. 신선한 삽입 왁스로 교체하고 65 ° C에서 4 시간의 최소 배양을 계속합니다. </li></ol> 1.4) 레드 왁스에 포함하기 <ol><li> 블록 (흰색 왁스 배치와 상단에있는 스테인리스 스틸 트레이를 촬영하는의 샘를 들어)이 배치된다. 일단 왁스에 매립하기 때문에 필요한 샘플의 위치는 매립 붉은 왁스가 불투명으로 보이지 않게된다. </li><li> 새로운 예열 된 스테인레스 스틸 삽입 금형 주위에 고 융점 왁스의 작은 방울을 넣고 식 힙니다. 단계 1.2.6에서 언급 한 바와 같이 제 2 용기에서 갓 녹은 내장 왁스의 작은 볼륨을 붓는다. </li><li> 흰색 왁스 점 이상 빠르게 아래로 향하게 산호 폴립의 위치를​​ 다음 스테인리스 쟁반에 플라스틱 샘플 홀더를 배치하고 왁스는 플라스틱 금형의 표면까지 오도록 더 삽입 왁스를 붓는다. </li><li> 65 ° C의 오븐에서 전체 설치를 타고 왁스가 완전히 경화 될 때까지 벤치 또는 차가운 표면에 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 이것은 하루 이틀에 6 시간 최대 걸릴 수 있습니다. 장기 저장을 위해 빛으로부터 보호 4 ° C에서 냉장고에 건조 된 블록을, 놓습니다. </li></ol> 1.5) 직렬 블록 얼​​굴 설정에서 단면 <ol><li> TR블록 메신저 및 마이크로톰을 사용하여 1 μm의 섹션을 잘라. 그들은 분말처럼 될 것 같은 부분을 수집하지 마십시오. 우리는 단지 블록의 얼굴을 이미지화하는 것을 잊지 마십시오. 흰색 왁스가 사라지기 시작할 때 샘플이 나타납니다. </li><li> 샘플보기 부분이 제거 될 때마다 블록이 포함 매끄러운면의 이미지를 캡처. 산호 폴립은 SI 비디오 2에서 사라질 때까지 계속합니다. </li><li> 녹화 / 색소 / 산호 폴립의 자동 형광을 데리러 FITC 형광 필터를 사용하여 흑백 카메라로 이미지를 캡처합니다. 이미지 각 종에서 3-4 탈회 코어. </li></ol> 2 이미징 산호에서 두 개의 광자 형광 현미경 <ol><li> 즉시 물에서 수확 각 컬렉션 (바다 해안)의 사이트에서 4 % 파라 포름 알데히드에 직경 인치에 대해 약 10 ~ 12 폴립을 포함, 산호 폴립 코어를 수정합니다. </li><li> 영상까지 4 ° C에서 샘플을 보관하십시오. 세탁 코어는 일에 배치됩니다거꾸로 커버 유리 바닥 접시에 전자 같은 용액 (0.17 mm 두께). </li><li> 10 배 (0.3 NA) 목표를 사용하여 780 nm의 여기, 이미지 두 개의 서로 다른 배율 (디지털 줌)에서 3-4 폴립에서 두 광자 레이저를 사용. 산호 폴립 형상과 높이도 촬상 대물의 작동 거리에 의해 제한되는 샘플 (보통 1~2밀리미터) 및 촬상 깊이 사이에서 변한다. </li><li> 주위 5,000-10,000 이미지를 총, 10, 20 μm의 간격으로 z 축 통해 XY의 초점면 당 이미지와 50 ~ 100 이미지를 약 25 ~ 100 (5 × 5, 10 × 10 타일)를 수집하기 위해 타일 스캔 모드를 사용 / 산호 폴립. </li><li> 네 용종 지역 이미지 셋은 코어와 산호 종을 나타냅니다. 참고 : 이미지 획득 시간은 2-5 시간 / 용종 지역마다 다릅니다. </li><li> LSM 5는 3D 이미지 분석 및 렌더링 소프트웨어에서 3D 렌더링으로 시스템의 하드 디스크에 원시 데이터 형식으로 모든 이미지를 저장합니다. </li></ol> 3 차원 볼륨 렌더링과 VisualizatioSBFI의 n 및 두 개의 광자 형광 스펙트럼 데이터 <ol><li> 프로그램 사각형 자르기 도구를 사용하여 하나의 용종에 포커스함으로써 파일 크기를 줄이고 컴파일 단일 TIFF 파일로 수집 소프트웨어 (8 비트 형식으로 파일을 저장하여도 파일 크기를 감소)하는 2D 데이터 자르기. </li><li> Imaris 볼륨 알고리즘에 따라 모듈을 능가 프로그램에 SBFI 데이터의 조립 파일 (1.5.1 단계에서 수집) 또는 (2.1.4 단계에서 수집 된) 두 광자 광학 부분의 타일 여러 Z-스택을 엽니 다. </li><li> 그림자 투영을 사용하여 3D 렌더링 SBFI 데이터를 전망이다. 복셀은 고체 표면 패턴 (SI 비디오 3)을 만들 역치 아르있는 isosurface 모드를 만듭니다. </li><li> 산호의 3 차원 구조와 형태를 나타 내기 위해 XZ, XY에서 클리핑면 알고리즘을 사용하여 3D 돌기, 그리고 YZ 직교 모드를 시각화. </li><li> Imaris 동일한 프로그램 키 프레임 애니메이션 모듈을 사용하여 돌기에 애니메이션 (SI 바이DEOS 3-7). </li><li> 5 % 압축에서 비디오 파일을 생성하고 볼륨을 사용하여 AVI 형식의 동영상 클립을 생성 (SI 동영상 4 및 6), 3D 및있는 isosurface 양식 (SI 동영상 5, 7). </li></ol>

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</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

산호초 연구는 해양 환경에서 작동을 동시에 물리적, 화학적 분석, 생물학적 현상을 포함하는, 고도의 학제 적 연구 노력이다. 복잡한 산호초 생태계의 연구는 따라서 최선의 상황에 맞는 프레임 워크 (그림 10) &#39;10의 멱수&#39;내에 완료됩니다. 이 그래픽 편집 산호 생태계 차원 공간의 넓은 범위 (10 -9 10 5m)를 다루고 있음을 보여줍니다. 또한,이 운동은 geobiological 필드를 결합하여 실험실 분석하는 데 필요한 다리 아르 1mm-1cm의 중간 길이 규모로 분석 것을 보여줍니다. 텐 프레임 워크의이 힘은 모델링, 물리적, 화학적 합성, 큐라 소 산호초 생태계를 제어 생물학적 매개 변수, 실험에 대한 상황 분석입니다. 본 연구는 완벽하게 통합 된 스위트 (을)를 적용하는 것이 첫 번째입니다FM F, SBFI과 CLSM 기법 증가 수심 외관상 건강한 산호의 반응을 추적한다. 이미지 ...

지구 온난화 및 첨부 환경의 변화는 직접적으로 열대 해양 산호 1-4의 건강 및 유통에 영향을 미치는됩니다. 여러 영향 산호 표백 및 전염병 5-6의 출현을 포함하여 관찰되고있다. 그러나 이러한 환경 적 위협에 대한 미래 산호 응답의보다 정확한 예측은 조직 학적 &quot;베이스 라인&quot; &quot;건강 해 보이는&quot;산호에 대한 조직의 형태 및 세포 구성과 분포를 정의하는 설립하는 것이 필요합니다. 차례로, 산호가 다음 정량적으로 비교 될 수있다 &quot;영향&quot;. &quot;정상 응답이&quot;또한 환경에 걸쳐 구배 계측 할 수 있도록 또한,이 기준선은, 다양한 환​​경 조건 하에서 외관상 건강한 산호 대해 확립되어야한다. 이 기준선을 설정 향한 초기 단계로서, 고해상도 3D 연구는 어떻게 외관상 건강한 산호 폴립 조직 수행되었다형태와 세포 조성물은 햇빛 조사량에서 수심의 증가 (WD) 및 첨부 감소에 응답합니다. 결과는 다음 산호 적응 기작보다 포괄적 이해를 설정할뿐만 아니라, 산호 공생 진화 통찰력과 광 수확의 향상을 얻기 위해 이용 될 수있다. 스토니 산호 (Scleractinia)는 공동으로 산호 7-10 holobiont이라 다른 미생물의 복잡한 조립, 호스트를 재생 식민지 해양 무척추 동물이다. 본 연구에서 수행 연구는 동시에 조직 색소의 증가 수심 분명히 건강한 호스트 산호의 공생 주산 셀러와 변경 사항을 추적하기 위해 최첨단 영상 기술의 제품군을 사용하고자한다. 이 산호 난방의 지표로 분명히 건강한 산호와 행위에 대해 수심 그라데이션을 통해 필요한 비교 조직 셀 &quot;기준&quot;을 설정합니다LTH 10. 산호 안료라는 색소가 흡수, 반영, 산란, 굴절, 회절, 또는 다른 사건 태양 복사 11을 방해하는 역할을합니다. 주산 셀러 - chromatophore endosymbiotic 관계는 산호 동물 (12)에 대해 전략적으로 유리한 빛 수확 최적화 및 골격 성장 전략의 공진화뿐만 아니라 영양 소성 (시프트 공급 전략 autotrophy가 heterotrophy까지 앞뒤로)를 사용할 수있다. 쿠라 카오 남부 카리브해 섬 국가 (네덜란드 령 앤 틸리 스의 이전 부분) 아루바 라 Blanquilla 열도 (그림 1A)를 동향 동서 내에서 약 65km 북쪽 베네수엘라있다. 쿠라 카오 70km 긴 남쪽 해안은 현대 지속적이고 중신 - 플라이오세 - 플라이 스토 홀로 세 고대의 언저리 산호초 기관 13, 14이 포함되어 있습니다. 큐라는 약 3 ° C 형을 변화에 연간 SST 평균nually, 27.5 ± 0.5 ºC의 연간 평균 온도, 9 월 초에 29 ° C의 최대 월 말에서 26 ° C의 최소에 이르기까지 (NOAA SST 데이터 것은 2000년부터 2010년까지 설정합니다). 이전에 잘 공부 되었기 때문에 큐라 (그림 1A)의 북서쪽 끝에 근처에 누워 야 Kalki에서 산호초 (12 ° 22&#39;31.63 &quot;N, 69 ° 09&#39;29.62&quot;W)는, 샘플링에 선정되었다 이 위치에서 해양 생태계 신선한 nonpolluted 해수 7,15-19에서 목욕을합니다. . 두 밀접하게 관련 scleractinian 산호 종, M.의 annularis 및 M faveolata,이 연구에서 실험과 분석을 위해 선택되었다 각 종 때문에 (1) 선반 휴식과에 대한 암초 기관에 전시 분명히 다른과 겹치지 않는 수심 분포 관련 탄산염 퇴적 퇴적 환경 (M.의 annularis 범위 = 0-10미터 WD, M.의 faveolata범위 = 10~20m WD 20,도 1B, 2A 및 2B); (2) 카리브해 (21)에 걸쳐 공통의 산호초 프레임 워크 빌더입니다; (3) 잘 연구 된 생태 학적, 생리 학적, 진화 관계 (22)이있다. 본 연구를위한 필드를 샘플링은 해외 쿠라에 플라 야 Kalki의 표준 스쿠버 다이빙 기술을 사용하여 실시 하였다. 얕은 - 투 - 심해 해저 지형의 횡단면은 선반 휴식을 통해, 선반 가로 질러 그 설립하고, 깊은 물 이물 암초 환경으로 하였다. (1) 세 개인 M.의 ~ 1m 직경 산호 머리 : 분명히 건강한 산호 헤드는 다음을 포함하여이 수심 횡단면을 따라 샘플링 확인되었다 5m 수심 (WD)에 있었다 모두 annularis; M.의 (2) 개별 세 ~ 1m 직경 산호 머리 faveolata는 모두 12m WD에 있었다. 광합성 활성 복사 (PAR)는 33-36% P로 측정 하였다5m WD에서 AR과 10m WD에서 18-22%의 PAR. SST는 5m와 12m 모두의 수심에서 26 ° C를 때 샘플링 년 1 월에 실시했다. 이 여섯 산호 헤드의 각 (즉,. 육 반구형 산호 머리에 각각 약 45 ° N 위도) 동일한 공간 위치에 세중 샘플링했다. 각각의 샘플은 청소 아치 펀치 수집 2.5 cm 직경 산호 조직의 골격 코어 생검으로 구성되었다. 세 산호 조직의 골격 조직 검사가 산호 머리에서 각각 장갑을 낀 손으로 표준 SCUBA에서 샘플링되었다 (M. 9은 5m WD에서 식민지를 annularis 및 M.에서 9 12m WD에서 faveolata). 즉시 깊이에서 수령시, 각 조직 검사 코어 시료를 멸균 50 ㎖의 폴리 프로필렌 원심 분리 관에 넣고, 나사 정상은 밀봉하고, 표면에 돌아왔다. 해수 각 원심 관으로부터 경사 분리하고, 각 코어 생검 후, 침지 저장, 4 % 파라 포름 알데히드로 이송 하였다. 23-30와 동물 샘플의 여러 유형을 포함하여 생물학적 시료의 넓은 범위에서 수행되었다. 형광 또는 시야 기법 중 하나와 광학 / 광학 현미경을 이용 이러한 연구의 대부분. 그러나, 연구는 지난 31 년 사형 전자 시리얼 블록 얼굴 영상을 사용하여 초고 배율에서 수행되고있다. 본 연구에서, 변성 SBFI 프로토콜이 개발되었으며 처음 산호인가. M. 때문에 annularis와 M. faveolata 산호 폴립은 두께 1-2mm 아르, 루틴 광학 현미경 기술 중 어느 것도 산호 폴립 조직의 전체 두께를 관통 할 수 없을 것입니다. 따라서, 우리는 특히 산호 샘플을 위해 설계 SBFI 샘플 준비 프로토콜을 가지고있다. 또, 정의 실체 홀더를 설계했다x와 y 방향 모두에서 동력 이동된다. 이 장치는 오히려 현미경 앞의 정규 마이크로톰을 사용하는 섹션을 수집하는 것보다 샘플 블록 얼​​굴의 화상을 얻어. 우리는 또한 산호 조직의 전체 두께에 걸쳐 이미지에 동일한 산호 폴립을 다른 비선형 광학 두 광자 현미경 기술을 소개했다. 이것은 탈회 측면과 시료 전처리 (탈수) 및 프로세싱 프로토콜에 의해 유도 될 수있다 조직 형태학 및 볼륨 (수축)의 변화의 가능성에 의해 부과 SBFI 한계를 극복한다. 또한, 산호에서 배출 프로파일은 스펙트럼 색소와 광합성 주산 셀러 사이에 절정 배출과 변화를 확인하기로 결심 하였다. 이러한 결과는 사용 된 방법의 컨텍스트 및 수집 시간에 관한 개별 장점, 분석 시간, 및 STR을 손상시키지 않고 미세 구조적 세부 사항을 해결하는 능력으로 평가 하였다산호 조직의 uctural 무결성.

<table><tbody><tr><td>산호 조직 골격</td><td></td><td></td><td>자연 서식지에서 2.5cm 생검</td></tr><tr><td>Arch Punch Coring Device</td><td>C.S. Osborne and Company</td><td>No. 149</td><td>산호 생검 수집용</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>RT 15700</td><td>16% 사전 희석</td></tr><tr><td>Histoclear/Safeclear II</td><td>전자 현미경 과학</td><td>RT 64111-04</td><td>크실렌, 탈수 및 탈파라핀화에 대한 무독성 대안</td></tr><tr><td>크실렌 및 에탄올</td><td>피셔 과학</td><td></td><td>탈수</td></tr><tr><td>파라핀 왁스</td><td>리처드 앨런 사이언티픽</td><td>타입 H REF 8338</td><td>침투 용액</td></tr><tr><td>Vybar</td><td>캔들 메이커</td><td></td><td>레드 왁스</td></tr><tr><td>스테아린</td>의 구성 요소 캔들 <td>메이커</td><td></td><td>레드 왁스</td></tr><tr><td>수단 IV</td>의 구성 요소<td>Fisher Chemical</td><td>S667-25</td><td>레드 왁스-불투명 배경</td></tr><tr><td>밀 배아 Agglutinin (WGA)</td><td>Life Technologies</td><td>W32466</td><td>라벨링용&nbsp; 산호 점액</td></tr><tr><td>Prolong, Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36095</td><td>페이드 방지 마운팅 미디어</td></tr><tr><td>플루오로 접시</td><td>세계 정밀 기기</td><td>FD-35-100</td><td>2 광자 이미징</td></tr><tr><td>XY 모터, 드라이버 및 컨트롤러</td><td>용 Lin Engineering</td><td>211-13-01R0, R325, R256-RO</td><td>XY 평행 이동</td></tr><tr><td>핫 플레이트</td><td>코닝</td><td>DC-220</td><td>모든 왁스</td></tr> <tr><td>녹이기컨벡션 오븐</td><td>Yamato</td><td>DX-600</td><td>침투 및 임베딩</td></tr><tr><td>티슈 프로세서</td><td>Leica</td><td>ASP 300</td><td>탈수, 침투</td></tr><tr><td>마이크로톰</td><td>Leica</td><td>RM2055</td><td>일회용 칼</td></tr><tr><td>스테레오 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stereolumar V 12</td><td>1.5x(30mm WD) ApoTome</td></tr><tr><td>Carl Zeiss</td> Axiovert M 200<td>이 있는 대물 형광 현미경</td><td>, ApoTome I 시스템</td><td>폴립의 얇은 부분 이미징 : Zooxanthellae</td></tr><tr><td>Axiocam 카메라</td><td>Carl Zeiss</td><td>MRm</td><td>흑백 카메라 1388x1040 픽셀</td></tr><tr><td>Axiovision 소프트웨어</td><td>Carl Zeiss</td><td>버전 4.8</td><td>이미지 수집 프로그램</td></tr><tr><td>2 광자 레이저</td><td>분광 물리학</td><td>Maitai eHP, 펄스 레이저 (70fs)</td> <td>DeepSee 모듈</td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 현미경</td><td>Carl Zeiss 포함</td><td>스펙트럼 검출기가 있는 LSM 710</td><td>34채널 PMT 감지</td></tr><tr><td>Zen 소프트웨어</td><td>Carl Zeiss</td><td>2010 이상</td><td>2광자 및 스펙트럼 이미지 획득</td></tr><tr><td>Imaris Suite Software</td><td>Bitplane, Inc.,</td> <td>버전 7.0 이상</td><td>3D 볼륨, 등면 렌더링, 시각화</td></tr></tbody></table>

복합 광학 현미경 방법 카리브 암초 건물 산호의 폴립 조직 형태와 구조를 밝히기

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

이미징 기술의 통합 스위트 카리브해 암초 건물 산호 Montastraea의 annularis 및 M. 이루어지는 3 차원 (3D) 형태학 및 용종 조직의 세포 구조를 결정하기 위해 적용되어왔다 faveolata. 이러한 접근은 형광 현미경 (FM), 시리얼 블록 얼​​굴 영상 (SBFI), 및 2 광자 공 초점 레이저 주사 현미경 (TPLSM)를 포함한다. SBFI 물리적 절편 후 깊은 조직 이미징을 제공한다; 그것은 이상 2mm의 조직 깊이에 조직 표면의 질감과 3D 시각화에 대해 자세히 설명합니다. 조직 세포 구조의 보완 FM 및 TPLSM 수율은 매우 높은 해상도의 이미지. 결과가있다 : (1) 외부 개별 산호 폴립의 벽에 이전에보고되지 않은 lobate 조직 형태학을 확인 (2) 색소, 조류와 같은 dinoflagellate의 주산 셀러의 endosymbionts의 3 차원 분포와 조직 밀도의 제 1면지도를 만들었습니다. 스펙트럼 흡수 완두콩500 nm 내지 675 nm 인 KS는 각각 제안 M. annularis와 M. faveolata 엽록소와 색소의 유사한 유형을 포함. 그러나, M. annularis와 M. 조직 밀도와 이러한 주요 세포 구성 요소의 3 차원 분포의 유의 한 차이를 나타내지 faveolata. 이미징 방법에 초점을 맞춘이 연구는 SBFI이 탈회 산호 조직의 큰 mm 크기의 샘플의 분석에 매우 유용 있음을 나타냅니다. 무료 FM 및 TPLSM는 nondecalcified 산호 조직 샘플에서 세포의 분포와 밀도의 미묘한 서브 밀리미터 규모의 변화를 알 수있다. TPLSM 기법 수득한다 : (1) 최소 침습 샘플 준비, (2) 우수한 광 단면 처리 능력, (3) 최소의 광 흡수 및 산란, 여전히 깊은 티슈 이미징을 허용하면서.

(본 연구를 위해 특별히 제조 된 그림 3) 사용자 정의 설계 SBFI 장치는 M.의 외부 표면의 질감과 형태의 첫번째 상세한 3D 디지털 고도지도 (DEM을)를 생산 annularis와 M. faveolature 산호 폴립 (그림 4 및 SI 동영상 1-2). 이것은 각각의 동심 폴립 (도 4B, 4D 및 4E)의 중심으로부터 외측 방사 산호 조직되지 않았던 이전 누적 로브 이미지를 수득 하였다. 이 엽 (叶)은 반경 방향 바깥 쪽과 최하단의 고도 엽 (叶)이 결국 합성 및 폴립 사이 coenosarc 조직 합병과 조직 덮인 기본 및 보조 골격 격벽의 최상부 능선을 따라 적층되어있다. 산호 조직 샘플은 고온 침투와 삽입의 여러 단계를 통과하는 데에도 불구하고 3D 용종의 모양과 관련된 엽 (叶)은 잘 보존되었다. additio블랙 컬러는 각 샘플의 콘트라스트를 최대화하고 신...

영상 기술의 통합 제품군은 카리브해 산호 Montastraea의 annularis와 M.에서 용종의 형태와 조직 구조를 결정하기 위해 적용되었습니다 faveolata. 형광, 직렬 블록 얼​​굴, 및이 광자 공 초점 레이저 주사 현미경 lobate 구조 용종 벽 및 예상 chromatophore 및 주산 셀러 밀도 및 분포를 확인했다.

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

다음 실험의 전반적인 목표는 1-2mm 두께의 산호 폴립을 3D로 이미지화하여 미세한 구조와 산호 색소 및 그 위치를 이해하는 것입니다. 이것은 먼저 샘플을 왁스에 삽입한 다음 마이크로톰을 사용하여 샘플을 1미크론 섹션으로 절단함으로써 달성됩니다. 다음으로, 맞춤형으로 설계된 직렬 블록 면 기술을 사용하여 산호 폴립을 이미지화하고 3D 이미지를 재구성합니다.여러 2D 이미지를 사용하여 구조적 무결성을 손상시키지 않고 산호 조직의 미세한 구조적 세부 사항을 해결할 수 있는 기술의 능력을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 절차를 시연합니다. 오늘은 제 연구 그룹의 공동 연구자인 Dr. Maunde Siva guru입니다.사전 여과 왁스 용융을 준비하기 위해 3.6g의 스티어를 핫 플레이트의 유리 비커에 플레이크에 녹입니다. 다음으로 수단 400mg을 넣는다. 4 왁스 배경 형광을 최소화하기 위해 잘 혼합하고 빨간색 반투명 용액이 얻어질 때까지 기다립니다.그런 다음 파라핀 81g을 넣고 잘 섞습니다. 그런 다음 15g의 흰색 과립 VI 바를 넣고 동일한 비커에서 완전히 녹입니다. 녹으면 다시 혼합하여 완전히 혼합된 왁스 용액을 얻습니다.이제 혼합물을 유리병에 넣고 뚜껑으로 느슨하게 닫습니다. 유리병을 섭씨 60도의 컨벡션 오븐에 넣어 재료를 액체 상태로 유지하고 모든 침투가 일어나도록 합니다. 이 용액은 200밀리리터로 만들 수 있으며 두 개의 100밀리리터 병으로 나눌 수 있습니다.하나는 침투를 위한 것이고 다른 하나는 AU에서 카리브해 암초 건물 산호 샘플을 최종적으로 매립하기 위한 것이며 현장의 파라 포름알데히드에 고정되었습니다. SBFI를 위해 산호 조직을 삽입하려면 먼저 밭에 수집된 산호 폴립을 씻고 파라 포름알데히드에 섭씨 4도에서 보관합니다. 그런 다음 이미징할 준비가 되었을 때 매번 5분 동안 PB S3로 세척합니다.24시간 동안 또는 용종에 탄산칼슘이 완전히 없어질 때까지 ex Cal 2 용액에서 용종을 석회화합니다. 여러 개의 석회질 제거된 산호 폴립을 25, 50, 75 및 100% 에탄올 시리즈의 단일 블록으로 배양한 다음 하나의 x 자일렌을 배양합니다. 샘플을 탈수하기 위해 각 세션마다 30분씩 대체하십시오.다음으로 처리된 용종을 100% 자일렌에 넣습니다. 섭씨 65도의 오븐에서 30분 동안 대체하십시오. 그 후, 새 용액으로 교체하고 30분 더 배양합니다.폴립의 윗부분이 아래를 향하고 표면이 가능한 한 평평하도록 방향을 잡습니다. 2 대 1, 1 대 1, 1 대 2의 솔루션을 만드십시오. 크실렌 대체물 및 사전 여과 왁스.50밀리리터의 Falcon 튜브에서 이 세 가지 농도의 사전 여과 왁스로 산호 폴립을 배양한 다음 100% 사전 여과 왁스에서 매번 30분에서 1시간 동안 세 번 배양합니다. 이제 샘플을 포매 왁스로 옮깁니다. 30분 후에 포진 왁스를 제거한 다음 새 포딩 왁스로 교체하고 섭씨 65도에서 최소 4시간 동안 배양을 계속합니다.그런 다음 블록을 촬영합니다. 이는 왁스에 일단 삽입되면 삽입된 빨간색 왁스가 불투명하기 때문에 샘플의 위치가 보이지 않게 되기 때문에 필요합니다. 다음으로 예열된 새 스테인리스강 임베딩 몰드 주위에 고융점 왁스의 작은 방울을 놓고 냉각시킵니다.두 번째 부분 표본에서 갓 녹은 소량의 침구 왁스를 붓고 산호 폴립을 흰색 왁스 점 위에 아래로 향하게 빠르게 놓습니다. 그런 다음 스테인리스 스틸 트레이에 플라스틱 샘플 홀더를 놓고 왁스가 플라스틱 금형 표면으로 올라오도록 임베딩 왁스를 더 붓습니다. 이제 섭씨 65도의 오븐에서 전체 설정을 꺼내 왁스가 완전히 굳을 때까지 벤치나 시원한 표면에서 식히십시오.그런 다음 건조된 블록을 섭씨 4도의 냉장고에 넣고 장기간 보관하기 위해 빛으로부터 보호하여 블록을 절단합니다. 먼저 다듬고 1미크론 부분을 자릅니다. 마이크로톰을 사용하여 샘플이 포함된 부드러운 블록 면의 이미지를 캡처합니다.매번. 절편이 제거되면 흰색 왁스가 사라지기 시작할 때 샘플이 나타납니다. 그런 다음 fitzy 형광 필터를 사용하여 흑백 카메라로 이미지를 캡처하여 각 샘플에서 3-4개의 석회질 보정된 코어인 크로마토포어 또는 산호 폴립 이미지의 자가형광을 포착합니다.2개의 광자 형광 이미징을 수행하려면 780나노미터의 여기 이미지에서 2개의 광자 레이저를 사용하여 10 x 대물렌즈를 사용하여 두 개의 서로 다른 배율로 3-4개의 폴립을 사용하여 4%파라 포름알데히드에 세척된 산호 폴립 코어를 거꾸로 놓습니다. 다음으로, 타일 스캔 모드를 사용하여 10 또는 20 미크론 간격으로 XY의 초점면당 약 25-100개의 이미지를 수집합니다. 그런 다음 10 또는 20 미크론 간격으로 Z 축을 통해 50-100 개의 이미지를 수집하면 산호 폴립당 총 약 5, 000-10, 000 이미지가 됩니다.그 이미지 다음에는 3-4개의 폴립 영역이 코어와 산호 종을 나타냅니다. 그런 다음 모든 이미지를 원시 데이터 형식으로 시스템의 하드 디스크에 저장합니다. 이 절차에서는 정사각형 자르기 도구를 사용하여 단일 폴립에 초점을 맞춰 2D 데이터를 자르고 단일 TIF 파일로 컴파일하여 파일 크기를 줄입니다.획득 소프트웨어에서. SBFI 데이터의 조립된 파일 또는 EMERIS surpass 프로그램 모듈 under volume 알고리즘 프로젝트에서 두 광자 광학 섹션의 타일링된 여러 Z 스택을 열고 SBFI 데이터를 3D로 렌더링합니다. 그림자 투영을 사용하여 복셀이 솔리드 표면 패턴을 만들기 위한 임계값이 되는 ISOSURFACE 모드를 만듭니다.XY, xz 및 YZ 직교 모드에서 클리핑 플레인 알고리즘을 사용하여 3D 투영을 시각화하여 산호의 3D 구조와 모양을 드러냅니다. 그런 다음 키 프레임 애니메이션 모듈을 사용하여 프로젝션을 애니메이션합니다. 동일한 erris 프로그램에서 5% 압축으로 비디오 파일을 생성하고 볼륨 3D 및 등곡면 방식을 사용하여 VI 형식의 동영상 클립을 생성합니다.다음은 M Anis와 M fa Lata의 산호 폴립의 두 가지 광자 형광 3D 이미지입니다. 이 두 이미지는 450에서 700 나노미터에서 수집된 광 신호로 두 광자 레이저의 780 나노미터 여기를 사용하여 구성 요소의 스펙트럼 분리 없이 캡처되었으며, 이 두 이미지는 동일한 여기로 수집되었지만 두 개의 광 증배관 검출기를 동시에 사용하여 두 구성 요소에서 데이터를 수집했습니다. 하나는 500-550 나노 미터이고 다른 하나는 650-720 나노 미터입니다. 이것은 뎁스 코팅된 이미지입니다.2D에서 빨간색은 가장 얕고 파란색은 가장 깊은 구성 요소입니다. 예. 이 절차를 시도하는 동안 적색 왁스 함유 샘플을 올바르게 준비하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 연속 블록 얼굴 이미징과 형광 현미경 투피트의 조합을 통해 다양한 렌즈 스케일에서 산호 색소 침착 및 세포 구조를 분석할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 산호초와 그 스펙트럼 특성을 3차원으로 처리하고 이미지화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

multimodal-optical-microscopy-methods-reveal-polyp-tissue-morphology

Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

헤모글로빈 농도, 멜라닌 농도 및 산소 포화도를 포함한 조직 생리학적 매개변수와 표재성 조직 이미지 데이터를 함께 등록할 수 있는 다중 모드 마이크로 내시경의 조립 및 사용에 대해 설명합니다. 이 기술은 조직 구조 및 관류를 평가하는 데 유용할 수 있으며 연구자의 개별 요구에 맞게 최적화할 수 있습니다.

멀티 모달 이미징 및 비 침습적에 대한 분광학 섬유 다발 Microendoscopy 플랫폼,<em&gt; 생체</em&gt; 조직 분석

우리는 튜브웜인 Hydroides elegans의 석회화를 관찰하고 최초의 석회화된 물질을 찾고 특성화하는 데 유용한 다양한 현미경 방법의 사용을 보여줍니다. 생체 현미경과 전자 현미경을 함께 사용하여 생체 광물화 연구에 중요한 기능 및 재료 정보를 제공합니다.

해양 tubeworm 인 라이브 광학 및 전자 현미경 기술을 사용하여 석회화 이벤트의 특성

산호는 인간과 해양 생물 모두에게 중요한 생물 다양성 생태계를 만듭니다. 그러나, 우리는 아직도 많은 산호 세포의 완전한 잠재력과 기능을 이해하지 못합니다. 여기에서, 우리는 돌로 된 산호 세포 인구의 격리, 표지 및 분리를 위해 개발된 프로토콜을 제시합니다.

Scleractinian 세포 인구의 격리를 위한 형광 활성화 세포 분류

여기에 제시 라이브 마우스 안구 표면 이미징을위한 다광 현미경 플랫폼입니다. 형광 형질 전환 마우스는 안구 표면 내의 세포 핵, 세포 막, 신경 섬유 및 모세 혈관의 시각화를 가능하게합니다. 콜라주 구조에서 파생된 비선형 제2 고조파 생성 신호는 기질 아키텍처에 대한 라벨없는 이미징을 제공합니다.

마우스 각막과 결막의 라이브 이미징을 위한 맞춤형 다광현미경 플랫폼

폴립 구제 금융은 급성 스트레스에 의해 유발되는 과정으로, 산호 폴립이 콜로니에 연결된 조직을 소화하고 개인으로 살기 위해 분리됩니다. 본 프로토콜은 고식염수 또는 칼슘이 없는 해수 처리를 사용하여 구제금융에 의해 산호 미세전파를 유도하는 방법을 기술한다.

산호 식민지에서 폴립 구제 금융을 유도하여 실험실 실험 사용을위한 개별화 된 미세 전파를 얻습니다.

Coral Arks라고 하는 계류된 중수 측지 구조물은 연안을 포함하여 이전에 작동하지 않는 지역에서 산호초 커뮤니티를 구축, 모니터링 및 교란하는 데 사용할 수 있는 모듈식의 확장 가능하고 수직으로 조정 가능한 연구 플랫폼을 제공합니다.

Coral Reef Arks: 산호초 커뮤니티를 조립하기 위한 현장 메소코스m 및 툴킷

여기에서는 가스 크로마토그래피-질량 분석 분석을 위해 산호 홀로비온트에서 극성 및 반극성 대사 산물의 추출 및 준비와 분리된 산호 숙주 조직 및 Symbiodiniaceae 세포 분획을 제시합니다.

가스 크로마토그래피 - 경산호 시료의 질량분석법 기반 표적 대사체학

여기에 제시된 프로토콜은 수중 사진 측량 데이터를 수집하고 처리하기 위한 프로토콜로, 생태 데이터 추출, 분석 및 적용을 위해 준비된 지리 참조 및 시계열 정렬 출력을 생성하는 크게 단순화되고 완전히 자동화된 이미지 처리 파이프라인을 포함합니다.

Reefshape: 저서 서식지 모니터링을 위한 시계열 수중 사진 측량 데이터의 효율적인 수집 및 자동 처리를 위한 시스템

이 프로토콜은 산호초 군집의 구조적 복잡성, 군집 구성 및 인구 통계에 대한 메트릭을 추출하는 데 사용되는 4단계 대면적 이미징 조사 방법론을 다룹니다. 수집된 이미지의 품질과 소스 이미지에 대한 통합 액세스는 프로토콜의 각 단계 내에서 우선 순위가 지정됩니다.

Measuring the Structure, Composition, and Change of Underwater Environments with Large-Area Imaging(대면적 이미징을 통한 수중 환경의 구조, 구성 및 변화 측정)

label-free 광학 이미징 방식을 결합한 멀티모달 플랫폼을 활용하여 세포 역학 및 신진대사를 시각화하고 정량화하기 위한 프로토콜을 개발했습니다. 다광자 형광, 2차 고조파 생성 및 유도 라만 산란 현미경을 통한 이미징을 통해 세포 및 분자 환경에 대한 전체적인 개요를 생성할 수 있습니다.

세포 대사 연구를 위한 멀티모달 광학 이미징 플랫폼

우리는 다양한 계층적 수준에서 뼈 재생을 평가하는 프로토콜을 제안합니다. 이 다중 모달 접근법은 다양한 길이 척도에서 구조 분석을 가능하게 하여 시료 준비의 문제를 효과적으로 해결합니다. 또한 생체 재료가 뼈 재생을 촉진하는 효과를 평가하는 신뢰할 수 있는 워크플로우를 제공합니다.

골 재생 및 스캐폴드 성능 평가를 위한 다중 모드 접근법

학습하세요 복합 광학 현미경을 이용하여 카리브 암초 건물 산호의 폴립 조직 형태와 구조를 3D로 분석하는 방법을. Montastraea annularis와 M. faveolata의 미세 구조와 색소 분포를 밝혀 산호 보전 연구에 기여합니다.

복합 광학 현미경 방법 카리브 암초 건물 산호의 폴립 조직 형태와 구조를 밝히기

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