마이크로 광 및 전기 방사의 조합은 각막 재생을위한 틈새를 장착 멤브레인을 생산하는

다음 실험의 전반적인 목표는 적층 제조 기술과 전기 방사를 결합하여 조직 공학 스캐폴드 내에 3D 공간 복잡성을 도입하는 것입니다. 이는 마이크로 광조형(micro stereolithography)이라고 하는 층별 광 경화 기술을 사용하여 폴리에틸렌 글리콜, D acrl 또는 PEG DA로 만든 분해되지 않는 템플릿을 생성함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로.

템플릿은 금속 기판에 부착되고 전기 방사는 기본 형태를 모방하는 생분해성 멤브레인을 생산하는 데 사용됩니다. 다음으로, 전기 방적 멤브레인의 포장 절차와 열화를 연구합니다. 저장된 멤브레인의 조기 열화는 온도와 수분을 제어하여 방지합니다.

마지막 단계는 각막 재생 장치로서의 잠재적 용도를 연구하기 위해 3D 상처 입은 각막 모델에 생분해성 멤브레인을 배치하는 것으로 구성됩니다. 결과는 적층 제조 기술과 전기 방사를 사용하여 자연 줄기 세포 틈새를 어느 정도 모방하는 마이크로 포켓을 포함하는 복잡한 멤브레인을 만드는 것의 다양성을 보여줍니다. 이 기술의 주요 장점은 다양성입니다.

생분해되지 않는 주형은 광범위한 제조 기술을 사용하여 새로 만들 수 있기 때문에 이 방법은 제조 및 조직 재생 분야 모두에서 관심이 있을 것이며 줄기세포 거동 및 줄기세포 틈새와 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 것입니다. 미세 가공 골격을 만드는 이 방법은 각막 재생에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 피부 및 구강 점막과 같은 줄기 세포 틈새가 있는 다른 상피 조직에 적용하거나 광범위한 조직의 엔지니어링을 위한 다른 3D 기능 및 골격을 제공할 수 있습니다.

오르테가 당수와 토마스 패터슨 대표가 이 절차를 시연할 예정이다. 첫 번째 레이어인 L one을 만들어 이 절차를 시작합니다. 그것은 1.2cm 검은 원에 적합한 그리기 프로그램을 사용하여 구조의 기초가 될 것입니다.

다음으로 L two를 만듭니다. 두 번째 레이어는 1.2cm의 검은 색 원을 그리지 만 6-8 개의 흰색 0.5 x 0.35mm 말굽 모양의 구조를 포함합니다. 검은색 원 구조 내에 작은 흰색 말굽 모양을 배포합니다.

L 1과 L 2를 JPEG 형식으로 저장하여 마이크로 광조형을 설정합니다. 먼저 시스템의 광학 장치를 조정하고 조심스럽게 청소합니다. 300마이크로리터의 폴리에틸렌 글리콜 디 아크릴 또는 PEG D 혼합물을 12웰 조직 배양 플레이트의 웰에 넣습니다.

우물은 테프론 또는 다른 달라붙지 않는 재료로 미리 코팅되어 있거나 구조를 쉽게 제거할 수 있어야 합니다. 경화 후 블루 레이저를 켜고 L one을 ALP 3 기본 소프트웨어에 업로드하십시오. 이 소프트웨어는 PC와 디지털 마이크로 미러 장치 간의 링크를 제공하는 USP 인터페이스입니다.

첫 번째 층에 60초 동안 방사선을 조사합니다. 우물에 250 마이크로 리터의 페그 다를 더 추가하십시오. L 2를 업로드하고 L 2를 60초 동안 조사합니다.

경화되지 않은 폴리머를 제거하고 이소프로판올로 링을 밤새 세척하십시오 전기 방사 전날, 전기 도금된 12cm x 20cm 알루미늄 시트에 PEG DA 링을 분배하여 정전기 전기 방사 수집기를 만듭니다. 전도성 탄소 테이프를 사용하여 링을 부착합니다. 폴리 락타이드 co glyco 또는 PLGA 용액을 준비하고 다음 날 사용하기 전에 밤새 저어줍니다.

끝이 뭉툭한 내경 0.8cm의 바늘이 있는 5밀리리터 주사기 4개를 주사기 펌프에 놓습니다. 단일 주사기 대신 4개의 주사기가 사용됩니다. 보다 빠른 전기 방사를 보장하기 위해 각 주사기에 2.5ml의 PLGA 용액을 로드합니다.

이 절차의 성공을 위해서는 laro pinine 변수를 가능한 한 일정하게 유지하는 것이 중요합니다. 바늘과 수집기 사이에 15cm의 거리를 두십시오. 1시간 30분 동안 전기 회전 전기 스핀에 대해 분당 30마이크로리터의 유량과 12에서 15킬로볼트 범위의 전압을 설정합니다.

전기 방사가 완료되면 PEG da 링을 지지하는 수집기에서 PLGA 전기 스폰지 시트를 조심스럽게 벗겨냅니다. PEG DA 링은 전기 방사를 위한 템플릿으로 재사용할 수 있습니다. 원형 구멍 펀치를 사용하여 전기 스폰 스캐폴드를 직경 22mm 원으로 자릅니다.

장기 보관을 위해 PLGA 멤브레인을 준비하기 위해 고리 구조를 중앙에 배치합니다. 플라스틱 페트리 접시와 같은 작은 용기에 각각을 장착하고 의료용 가방에 넣습니다. 의료용 가방 안에 건조제 3개를 넣습니다.

가방에 시중에서 판매되는 6개 지점 습도 표시기 카드를 추가하십시오. 이렇게 하면 보관 기간 동안 축적된 수분을 감지할 수 있습니다. 진공 열 밀봉 기계를 사용하여 백을 진공 청소기로 청소하고 밀봉하십시오.

그 후, PLGA 멤브레인은 저장 전에 감마 또는 방사선인 외부 회사로 보내집니다. 이 실험에서는 토끼 변연계 가지를 토끼를 식용으로 사육하는 농장에서 얻은 토끼 눈에서 분리했습니다. 먼저 3% 소독액을 사용하여 토끼 눈을 소독합니다.

다음으로, 각막을 둘러싼 과도한 조직을 제거하여 눈을 청소합니다. 윤부 영역은 투명한 각막과 흰색 공막 사이의 얇은 원형 영역으로 식별될 수 있습니다. 윤부 부위를 각막의 나머지 부분과 분리합니다.

변부 부위를 약 1.5cm 길이의 분절로 자르고 윤부 분절을 1.5% 살균액으로 1분 동안 소독합니다. 소독 후에는 메스 날을 사용하여 윤부 부분을 작은 조각으로 자릅니다. 작은 조직 조각을 DMEM 플러스 글루트 최대 매체에 섭씨 37도, 이산화탄소 5% 또는 사용 1시간 전에 보관하십시오.

이 절차를 시작하려면 세포 스크레이퍼를 사용하여 15마이크로리터의 피브릴린 접착제로 고리막을 코팅합니다. 해부 현미경 아래에서 작업하는 동안 피브릴린을 고르게 분포시킵니다. 25게이지 바늘을 사용하여 변연계 외식식물을 PLGA 마이크로 포켓에 직접 놓습니다.

조직 익스플랜이 있는 고리를 이전에 준비된 탈락된 각막에 놓습니다. explan이 위를 향하고 공기 액체 계면 조건에서 PLGA 링은 빠르게 젖고 각막 모델의 모양을 채택합니다. 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 4주 동안 장기 배양 모델을 유지하고 이틀에 한 번씩 5%의 이산화탄소를 교체합니다.

마이크로 광조형은 다양한 크기의 PEG DA 링을 제작하고 마이크로 기능을 동시에 통합할 수 있습니다. 링은 재현 가능하게 만들고 재사용할 수 있으며 전기 방사 수집기로 사용할 수 있는 금속판에 쉽게 부착할 수 있습니다. 이 예에서 링에는 말굽 마이크로 기능이 포함되어 있습니다.

그런 다음 전기 방사는 PLGA 복제품을 생산하고, PLGA 멤브레인의 진공 패킹은 의도적으로 습한 조건에서도 섭씨 37도에서도 장기 보관을 크게 향상시킵니다. 사용된 백의 유형은 멤브레인 안정성에도 영향을 미치며, 주사 전자 현미경 및 세 가지 디칸트를 검사한 결과 손상되지 않은 섬유의 섬유 무결성이나 습도에 변화가 없음을 보여주었습니다. 변연계 보형물에서 세포 분양 또는 새로 만든 생분해성 PLGA 링과 영하 20도에서 6개월 보관 후

3D 상처 입은 각막 모델에 PLGA 멤브레인을 배치할 때 4주 후에 세포 전달이 이루어졌습니다. H 및 e 이미지는 틈새에 배치된 외식에서 나오는 세포에 의해 형성된 새로운 다층 상피를 보여줍니다. 음성 대조군은 추가된 세포가 없는 상태에서 새로운 상피가 형성되지 않음을 확인했습니다.

신선한 토끼에서 관찰된 기존의 각막 상피와 비교하여, 양성 대조군으로 사용된 각막. 면역 세포 화학(immuno cyto chemistry)은 임플란트에서 자라는 세포가 각막 분화 마커인 사이토케라틴 3(cytokeratin three)에 양성이었기 때문에 각막 상피 세포임을 입증했습니다. 생분해되지 않는 템플릿을 포함하는 전기 방사 수집기는 재사용이 가능하기 때문에 프로토콜이 최적화되면 2시간 이내에 스캐폴드 생산을 완료할 수 있습니다.

이 기술을 통해 조직 공학 분야의 연구자들은 세포 거동을 연구할 수 있는 미세 기능을 포함하는 복잡한 조직 공학 멤브레인을 제조하는 새로운 방법을 모색할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 적층 제조 기술 또는 모델링과 같은 유사한 접근 방식을 사용하여 분해되지 않는 미세 제작 템플릿을 만드는 방법과 스캐폴드에 복잡성을 추가하기 위해 전기 방사를 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.