Name: 조직 추출물의 고해상도 핵 자기 공명 분광법에 의한 쥐 뇌의 대사 체 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 학습하세요 쥐 뇌 조직 추출물의 고해상도 NMR 분광법을 이용한 대사체 프로파일링 방법을. 액체 질소 급속 동결, 메탄올-클로로포름 추출, 동결 건조 및 최적화된 데이터 처리 프로토콜을 통해 신경 화학 및 대사체 연구에 활용할 수 있습니다.

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Centre National de la Recherche Scientifique(CNRS, UMR 6612 및 7339)의 지원에 감사드립니다.

<ol><li>Manger, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+21st+century+neuroscience+too+focused+on+the+rat%2Fmouse+model+of+brain+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Is 21st century neuroscience too focused on the rat/mouse model of brain function and dysfunction.</a> Front Neuroanat. 2, 5(2008).</li>
<li>Buxbaum, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+phenotyping+of+rodent+ASD+models+enrichment+analysis+of+mouse+and+human+neurobiological+phenotypes+associated+with+high-risk+autism+genes+identifies+morphological%2C+electrophysiological%2C+neurological%2C+and+behavioral+features%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Autism%22%5BJournal%5D)">Optimizing the phenotyping of rodent ASD models enrichment analysis of mouse and human neurobiological phenotypes associated with high-risk autism genes identifies morphological, electrophysiological, neurological, and behavioral features.</a> Mol Autism. 3, 1(2012).</li>
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<li>Mallolas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polymorphism+in+the+EAAT2+promoter+is+associated+with+higher+glutamate+concentrations+and+higher+frequency+of+progressing+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A polymorphism in the EAAT2 promoter is associated with higher glutamate concentrations and higher frequency of progressing stroke.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203, 711-717 (2006).</li>
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<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+optimization+of+%2831%29P+NMR+spectroscopic+analysis+of+phospholipids+in+crude+tissue+extracts.+1.+Chemical+shift+and+signal+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts. 1. Chemical shift and signal separation.</a> Anal Chem. 82, 5433-5440 (2010).</li>
<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLutz%2C+NW+%22Methodologies+for+Metabolomics%22">Methodologies for Metabolomics</a>. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. , Cambridge University Press. New York. (2013).</li>
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<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+multiparametric+optimization+for+phospholipidomics+by+31P+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">Principles of multiparametric optimization for phospholipidomics by 31P NMR spectroscopy.</a> Biophys Rev. 5, 295-304 (2013).</li>
<li>Pearson, G. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPearson%2C+GA+%22Shimming+an+NMR+magnet%22">Shimming an NMR magnet</a>. , University of Iowa. Iowa City. (1991).</li>
<li>Lane, A. N., Fan, T. W. M., Higashi, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+AN+%22Biophysical+tools+for+biologists%22">Biophysical tools for biologists</a>. Correia, J. J., Detrich, H. W. Vol. 1, In vitro techniques, Academic Press. Waltham. (2008).</li>
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NMR 분광법은 매우 정확하고 재현 가능한 방식으로 용액 화학 물질의 농도를 측정하기위한 효율적인 방법이다. 그러나, 고품질의 데이터를 얻기 위해 그 샘플 준비 및 분석에 관한 소정의 규칙에 적용하는 것이 필요하다. 관측 된 신호의 강도가 검출 임계치 (특히 약한 신호)에 접근하지 않는 NMR 분광법에 의한 대사 산물 농도의 결정에있어서, 생성이나 NMR 신호의 수신도는 정량 오류를 지배하고있다. 다른 모든 경우 생물학적 변동, 시료 전처리 기법 (추출 효율, 화합물의 물리적 및 화학적 안정성, 피펫 및 오류 등을 계량), 및 / 또는 정밀도와 결과의 정확도를 결정하는 신호 획득 및 처리 파라미터의 선택에. 물론, 조직 수확하는 동안 발생하는 모든 신진 대사의 변화는 농도가 얻을 대사에 반영됩니다에디션. 따라서, 가능한 한 빠르게 조직 수확을 완료하고, 이러한 깔때기 빠르게 대사 화합물의 생체 내 농도에서 정확한 경우 동결로서 특정 조직 동결 기법을 적용 (중요 매우 중요 특히 글루코스, 락 테...

쥐 모델은 뇌 연구 1에서 광범위하게 활용되고있다. 유전자형 표현형 상관 관계는 다른 2-6 한편 RNA 및 / 또는 단백질 수준에서 유전자 발현을 연구함으로써, 마우스 및 래트의 뇌에 조사하고, 형태 학적 기능, 전기 생리 학적 및 / 또는 행동 적 표현형되었다. 그러나, 완전히 유전자형 표현형에 연결 메커니즘을 이해하기 위해서는 하류 단백질 발현, 즉 분자의 사건을 조사하는 것이 필수적이다. 효소는 7 행동을 두는 생화학 기판의 신진 대사. 이 요구 사항은 생물학 8,9의 여러 가지 대사 연구의 르네상스로 지난 10-15년 이상했다. 고전 대사 연구는 종종 특정 경로의 상세에 집중되었지만, 새로운 메타 볼로 접근법 고려 조직의 대사 프로파일의 글로벌 모두 포괄 맞도록 조사된다.이 개념 중 하나 결과는 특정 대사 경로 및 / 또는 화합물의 클래스에 대한 편견을 최소화 분석 도구에 대한 명백한 필요합니다. 그러나, 전통적인 생화학 적 분석은 분석이 수행되기 전에 지정해야 특정 분석 물의 특정 화학 반응에 기초한다. 대조적으로, 핵 자기 공명 (NMR) 분광법 및 질량 분석법 (MS) (I)와 같은 광학적 기술은 생화학 물질, 특정 분자 (물리적) 특성을 기반으로는 각각의 스펙트럼에있어서, 하나 또는 다수의 별개의 신호를 일으킨다 한 실험 과정에서 검출; 및 (ⅱ) 실험마다 상이한 다수의 화합물을 검출한다. 따라서, 각각의 스펙트럼은 대사 산물의 전체 범위의 결합 된 정보가 포함되어 있습니다. 더 이전의 선택은 피 분석의 특성에 관한 8 측정 할 할 필요가 없기 때문에 이러한 이유로, 분 광학적 방법은 대사 체학을위한 적절한 툴, 아르 </sup&gt;. 그들은 매우 예기치 대사 변화의 검출을 용이하게하기 때문에 결과적으로, 이들 기술은 자연 탐색 연구에는 적합. NMR 분광기 및 MS는 많은 대사 분석을 위해 상호 교환 적으로 사용될 수 있지만, 각각의 방법은 특정의 장점과 최근 10를 평가 한 단점을 가지고있다. 간단히, NMR 분광법은 보통 조 추출물에서 수행 할 수 있으며, 분석하기 전에 샘플 화합물을 크로마토 그래피 분리를 필요로하지 않는다. 반면, MS는 질량 분석 이미징 특히 최근 개발을 제외하고, 기체 또는 액체 크로마토 그래피 (GC 또는 LC) 분리와 함께 작동합니다. 다른 당의 공진 라인 (1 H) 양성자 NMR 스펙트럼에서 상당히 중첩 때문에 이러한 당의 분석과 같은 몇몇 특별한 경우에서, LC 분리는 물론 NMR 분광법에 대한 필요성이 될 수있다. CHR없이 그럼에도 1 H NMR 분광법omatographic 분리는 가장 인기있는 거의 보편적으로 적용 메타 볼로 NMR 방법 남아있다. 일반적으로, 샘플 준비는 NMR 분광법에 대해 MS보다 더 많은 시간이 걸리고 복잡한이다. 매트릭스 효과로 인해 심각한 문제가 많은가 상당히 약화 신호로 이어질 수있는 위치 MS보다 NMR 분광법 덜 일반적이다. 대사 정량은 어느 방법으로 달성 될 수있다. 그러나, 여러 표준 화합물 인해 대사 사이의 매트릭스 효과 및 이온화 효율의 변동에 MS 필요하다. 대조적으로, 샘플 당 하나의 표준 때문에 적절한 측정 조건 하에서 NMR 분광 분석에 필요한, ​​후자의 방법은 본질적으로 관측 핵에 의해 엄격하게 선형 응답 NMR로 정량 덕분이다. NMR의 주요 단점은 상대적으로 낮은 민감도이다. MS, 특히 LC-MS에 몇 배에 의해 NMR보다 더 민감하다; 이러한 이유로, MS는 NMR에 대해 선호 될매우 낮은 농도에서 발생하는 화합물의 분석. 한편, NMR 실험의 비파괴 특성은 MS 위에 분명한 장점은; 이러한 방식으로, NMR은 1 H, 인-31 (31 P), 탄소 -13 (13 C) 같은 다른 NMR-활성 핵 위해, 예를 들어 동일한 샘플에 반복적으로 수행 할 수있는 불소 - 19 (19 F) 등., MS 측정 반대로 어떤 물질이 NMR에 의해 소비되지 않은 것처럼. NMR 및 MS 모두는 상이한 모드로 사용될 수 있으며, 각각의 하나는 특정의 화학적 특성을 갖는 화합물의 검출에 최적 인. 거의 모든 대사 인산화도 양자를 포함 할지라도, 예를 들어, 31 P NMR 종종 적당히 농축 인산화 분석 화합물의 1 H NMR보다 더 적합하다. 그러나, 그들의 1 H NMR 신호는 후자 반면, 다른 비 - 인산화 된 화합물 1 H NMR 신호에 의해 가려 질 수도분명히 31 P NMR 스펙트럼에서 배경 신호를 발생하지 않습니다. 13 C NMR의 특별한 경우는 거의 독점적으로 관심있는 동안 아날로그 상황에서, 19 F NMR 분석, 불소 화합물, 예를 들면, 플루오르 화 약물 (내인성 대사에서 배경 없음 신호)에 바람직 할 경우 13 C-의 운명 표시 외인성 대사 전구 물질로 인해 13 C 동위 원소 (약 1 %)의 매우 낮은 자연 풍부 따라야합니다. 많은 질량 분석기는 음이온 모드 또는 양이온 모드에서 작동합니다. 따라서, 앞서 이온이 부정적 또는 긍정적으로 청구됩니다 관찰 할 수 있는지 여부를 분석 아는 것이 중요합니다. 이 방법은 시료 준비에 필요한 (I)의 시간적으로 저비용으로 중요한 대사 산물 농도의 많은 수를 산출하기 때문에 우리는 1 H, 31 P NMR 분광법에 의한 뇌 조직의 대사 체의 분석 프로토콜에 여기에 집중차 (II) 노력은 대사 산물 정량이 필요합니다. 모든 실험은 표준 습식 화학 실험실의 장비 및 고해상도 NMR 분광법 설비를 사용하여 수행 될 수있다. 또한 요구 사항은 아래의 프로토콜 부분에 설명되어 있습니다.

<table><tbody><tr>동물을 위한 <td>Isoflurane</td><td>Virbac</td><td>Vetflurane</td><td>마취제</td></tr><tr><td>Isoflurane 기화기</td><td>Ohmeda</td><td>Isotec 3</td><td>최신 모델 사용 가능: Isotec 4</td></tr><tr><td>메스, 가위, 집게, 클램프</td><td>Harvard Apparatus Fisher Scientific</td><td>다양한 </td><td>다양한 동물용 수술 장비</td></tr><tr><td>동결 클램프 도구</td><td>자체 제작</td><td>n/a</td><td>냉각을 위해 액체 질소에 삽입 알루미늄 플레이트가 있는 통</td></tr><tr><td>Dewar</td><td>Nalgene</td><td>4150-4000</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td>공기 액체</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>질소 가스</td><td>공기 액체</td><td>질소 n/a</td><td></td></tr><tr><td>질소 증발기</td><td>Organomation Associates</td><td>N-EVAP 111</td><td>자체 제작 장치로 교체 가능</td></tr><tr><td>모르타르</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>Z247472</tr><tr><td>유봉</td><td>시그마-알드리치</td><td>Z247510</td><td></td></tr><tr><td>조직 균질화기</td><td>Kinematica</td><td>Polytron</td><td>피팅 균질화 샤프트</td></tr><tr><td>전자 저울</td><td>Sartorius</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>M3641</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마-알드리치</td><td>366910</td><td></td></tr><tr><td>유리 원심분리기 튜브</td><td>Kimble</td><td>45500-15, 45500-30</td><td>Kimax 15 ml, 30 ml 튜브</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Kimble</td><td>45150-2</td><td>Kimax 2 ml 튜브; 원심분리기 로터와 호환되는 경우 "Eppendorf" 튜브를 교체해야 합니다.</td></tr><tr><td>폴리스티렌 피펫</td><td>Costar Corning</td><td>Stripettes</td><td>5 및 10 ml 용량</td></tr><tr><td>Deuterochloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431915</td><td>99.96% deuterated</td></tr><tr><td>중수소 산화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>423459</td><td>99.96% 중수소</td></tr>화 <tr><td>중수소 염화</td><td>알파 Aesar</td><td>42406</td><td>20% 중수소</td></tr>산화물 <tr><td>나트륨 중수소산화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>164488</td><td>30% 중</td></tr>수소산화물 <tr><td>동결건조기</td><td>Christ</td><td>Alpha 1-2</td><td></td></tr><tr><td>저온 원심분리기</td><td>헤레우스</td><td>메가퓨지 16R</td><td></td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td>Eutech Cybernetics</td><td>Cyberscan</td><td></td></tr><tr><td>CDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0922</td><td></td></tr><tr><td>수산화 세슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516988</td><td></td></tr><tr><td>NMR 튜브</td><td>Wilmad</td><td>528-PP</td><td></td></tr><tr><td>NMR 스템 동축 인서트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z278513</td><td>By</td></tr><tr><td>Wilmad NMR 피펫</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z255688</td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>Eppendorf</td><td>Research</td><td>0.5 - 1,000 &mu; l</td></tr><tr><td>Pipet-Aid</td><td>Drummond</td><td>XP</td><td></td></tr><tr><td>NMR 분광계</td><td>Bruker</td><td>AVANCE 400</td><td>프로브 및 기타 액세서리 포함</td></tr><tr><td>NMR 소프트웨어</td><td>Bruker</td><td>TopSpin 1.3</td><td>최신 버전 사용 가능 : Topspin 3.2</td></tr><tr><td>수용성 표준 화합물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>인지질 표준 화합물</td><td>Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich</td><td>다양한 다양한 </td><td>다양한 플라스말로겐 출처, 그러나 < 70-80 % 순도</td></tr><tr><td>메틸렌 디포스 포네이</td>트 <td>시그마 - 알드리치</td><td>M9508</td><td></td></tr><tr><td>TSP-d4</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>269913</td><td></td></tr></tbody></table>

조직 추출물의 고해상도 핵 자기 공명 분광법에 의한 쥐 뇌의 대사 체 분석

Metabolomic Analysis of Rat Brain by High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Tissue Extracts

RNA와 단백질 수준에 대한 유전자 발현에 대한 연구는 질병의 기저에 있는 생물학적 과정을 탐구하는 데 오랫동안 사용되어 왔습니다. 보다 최근에는 유전체학과 단백질체학이 생물학적 시스템에 존재하는 대사 산물 풀에 대한 포괄적인 정량 분석으로 보완되었습니다. 대사체학(metabolomics)이라고 하는 이 전략은 신진대사에 관여하는 소분자 보체의 전반적인 특성을 제공하기 위해 노력합니다. 게놈(genome)과 단백질체(proteome)는 세포가 수행할 수 있는 작업을 정의하지만, 대사체(metabolome)는 실제 표현형의 일부입니다. 현재 대사체학에 사용되는 방법 중 분광 기법은 특정 생화학적 경로에 대한 사전 선택 없이 많은 수의 대사 산물을 동시에 분석할 수 있어 광범위하고 편향되지 않은 접근 방식을 가능하게 하기 때문에 특히 중요합니다. 여기에서는 고분해능 NMR 분광법에 의한 대사체 분석을 위한 최적화된 실험 프로토콜을 제시하며, 이는 조직 대사 산물의 효율적인 정량화를 위해 선택되는 방법입니다. 이 방법의 중요한 장점은 (i) 샘플 및/또는 별도의 대사 산물을 정제할 필요 없이 미처리 추출물을 사용한다는 것입니다. (ii) NMR의 본질적으로 정량적인 특성으로, 하나의 참조 화합물만 있는 NMR 스펙트럼으로 표시되는 모든 대사 산물의 정량화를 허용합니다. (iii) NMR의 비파괴 특성으로 인해 여러 측정을 위해 동일한 샘플을 반복적으로 사용할 수 있습니다. 다루어질 수 있는 대사산물 농도의 동적 범위는 NMR 신호의 선형 응답으로 인해 상당하지만, 극히 낮은 농도에서 발생하는 대사산물은 검출하기 어려울 수 있습니다. 가장 적은 화합물의 경우, 고감도 질량 분광법(mass spectrometry method)이 유리할 수 있지만, 이 기술은 NMR 분광법보다 더 복잡한 시료 준비 및 정량화 절차가 필요합니다. 우리는 여기에서 쥐의 뇌 분석에 맞게 조정된 NMR 프로토콜을 제시합니다. 그러나 동일한 프로토콜이 약간의 변형으로 다른 조직에 적용될 수 있습니다.

추출 솔루션의 현재 : 두뇌와 다른 조직 추출물의 대사 NMR 스펙트럼에서 최상의 해상도를 얻으려면, 그것은 긴 제거하거나 (상자성 이온 가장 중요한) 마스크 금속 이온을하는 것이 일반적이었다. 이것은, 또는 Chelex-100 (20)로 이온 교환 수지를 통해 추출물을 전달하여 추출물 19 EDTA 또는 CDTA 같은 킬레이트 제를 첨가함으로써 하나를 달성되었다. 도 1에 제시된 결과는 뇌 추출물을 조심스럽게 상기 프로토콜에 따라 제조하는 경우에는이 단계는 1 H NMR 분광 분석에 대한 필요가 없다는 보여준다. 여기서, 매우 좁은 스펙트럼 선 분석 스펙트럼 모든 영역에 대해 얻어졌다. 심지어 글루타민 / 글루타메이트와 미오의 -inositol / 글리신 매우 혼잡 한 지역, 예를 들면,에, &lt;0.01 ppm으로 거리에서 피크가 거의 400 메가 헤르츠 (그림 1, 아래...

포유류 뇌의 신경 화학은 많은 신경 및 전신 질환에서 변화합니다. 대뇌 대사 산물의 특징적인 프로파일은 뇌 조직의 미가공 추출물을 기반으로 효율적으로 얻을 수 있습니다. 이를 위해 고해상도 NMR 분광법을 사용하여 대사 산물 농도(대사체학)에 대한 상세한 정량 분석이 가능합니다.

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics ...

이 절차의 전반적인 목표는 쥐의 뇌 추출물에서 고해상도 대사 산물 프로파일을 얻는 것입니다. 이것은 먼저 쥐의 뇌를 채취하여 액체 질소에서 급속 냉동함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 메탄올 클로로포름 물에서 조직을 균질화하여 뇌 대사 산물을 추출한 다음 변성된 단백질과 유기 용매를 제거하는 것입니다.다음으로, 수성 샘플은 동결건조되고 모든 샘플은 잘 정의된 용매에서 resol입니다. 최적의 NMR 분광 분석을 위해 마지막 단계는 대사체 NMR 실험을 신중하게 설정하고 최적화하는 것입니다. 궁극적으로 NMR Spectra는 잘 정의된 실험 조건에서 필요하며 최적화된 데이터 처리 프로토콜을 사용하여 평가됩니다.이 방법은 뇌 대사에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 종양, 간, 신장 및 기타 장기와 같은 다른 연조직에도 적용할 수 있습니다. 먼저 미리 준비한 냉동 뇌 조직 샘플을 섭씨 영하 80도의 냉동고에서 꺼냅니다. 그런 다음 조직 샘플을 부분적으로 액체 질소로 채워진 모르타르로 즉시 옮깁니다.액체 질소 차가운 절굿공이를 사용하여 얼어붙은 뇌 조직을 조직 균질화에 사용되는 시험관에 쉽게 들어갈 수 있는 더 작은 조각으로 부수십시오. 이 혼합물을 따라 얼어붙은 뇌 조직의 작은 조각은 250-350mg의 조직의 무게를 철저히 측정하고 총 4ml의 얼음처럼 차가운 메탄올로 채워진 시험관으로 옮깁니다. 냉동 조직 조각을 시험관에 추가할 때마다 조직 균질화기로 즉시 균질화하십시오.냉동 쥐 뇌 샘플의 마지막 조각을 시험관에 추가하고 균질화한 후 균질액을 20ml 이상의 유리 바이알로 옮깁니다. 나사 캡을 닫고 균질액을 얼음 위에 15분 동안 놓습니다. 다음으로, 4ml의 얼음처럼 차가운 클로로포름을 균질화에 넣고 완전히 와류에 넣습니다.완료되면 균질산염을 얼음 위에 15분 동안 놓습니다. 와류를 완전히 일으킨 후 균질산염에 4ml의 물을 첨가하고 하룻밤 동안 균질산염을 섭씨 영하 20도에서 두십시오. 완전한 상 별거를 위해, 더 크거나 동등한 관 20 밀리리터 클로로포름 저항하는 분리기 관에 뇌 조직 균질산염 해결책을 옮기고 40 분 동안 13, 000 G 및 4 섭씨 온도에 표본을 분리기로 하십시오.원심분리 후 파스터 피펫을 사용하여 상부상을 적절한 15ml 메탄올 내성 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 새 페이스트 피펫을 사용하여 낮은 상을 적절하고 크거나 같은 튜브 15 밀리리터 클로로포름 내성 튜브로 옮기고 얼음 위에 물 메탄올 상이 있는 튜브를 유지하면서 얼음 위에 놓습니다. 건조 질소 스트림을 추출물 용액으로 유도하여 메탄올을 증발시킵니다.질소가 버블링되면 증발 과정을 종료합니다. 더 이상 추출 용액의 부피 감소를 일으키지 않습니다. 메탄올 클로로포름 상이 있는 튜브를 얼음 위에 놓은 후 건조 질소 흐름을 추출물 용액의 표면으로 향하게 하여 메탄올을 증발시킵니다.모든 용매가 증발하면 튜브를 닫고 NMR 분석이 준비될 때까지 샘플을 섭씨 영하 80도로 유지합니다. 동결건조를 위해 수성상을 준비하려면 수성 샘플을 완전히 헹궈진 50ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 튜브의 내부 표면이 동결된 액체로 점진적으로 덮이도록 원심분리기 튜브를 액체 질소로 회전시켜 추출물 용액을 동결합니다.모든 액체가 얼면 증기가 빠져나갈 수 있도록 구멍이 뚫린 나사 캡으로 튜브를 덮고 튜브를 넓은 목의 진공 필터 병에 넣습니다. 병을 동결 건조기에 부착한 후 동결 건조를 시작하고 동결 건조 과정을 종료합니다. 샘플이 완전히 건조되면 NMR 분석에 사용될 때까지 밀폐된 튜브에서 샘플을 섭씨 영하 80도로 유지하십시오.인지질의 인 NMR 분석을 위해 건조된 지질을 5 내지 4 대 1의 중수소화 클로로포름 메탄올 혼합물 700마이크로리터와 200밀리몰 수성 CDTA 용액에 용해시킵니다. 클로로포름 내성 팁이 있는 직접 치환 마이크로 피펫을 사용하여 샘플을 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 이 시점에서 NMR 프로브의 온도 조절을 원하는 목표 값(일반적으로 섭씨 25도 원심분리기)으로 설정합니다.인지질은 4 섭씨 온도 및 11, 표본에 있는 단단한 잔류물을 아래로 회전시키기 위하여 30 분 동안 000 G 추출물 해결책을 추출한다. 완료되면 600마이크로리터의 슈퍼 나틴을 외경이 5mm인 고품질 NMR 튜브로 옮깁니다. 화학적 이동 참조 및 정량 분석을 위해 pH 7.0에서 20mmolar 메틸렌 이인산염 수용액으로 채워진 적절한 동축 인서트 스템을 준비합니다.인지질 추출물 용액으로 채워진 NMR 튜브에 이 삽입물을 놓습니다. 다음으로 NMR 튜브에 적절한 스피너를 끼우고 NMR 자석으로 옮깁니다. 샘플이 설정 온도로 조정될 때까지 기다린 후 15-20Hz에서 샘플을 회전시킵니다.온 축 및 오프 축 심 코일 전류를 조정하여 샘플 전체에 걸쳐 균일 한 자기장을 조심스럽게 최소화하고 NMR 스펙트럼 획득 매개 변수를 최적의 값으로 설정하며, 이는 자기장 강도의 함수로 달라질 수 있습니다. 스펙트럼 수집이 완료되면 최적화된 매개변수를 사용하여 자유 유도 감쇠를 처리하여 전체 범위의 인지질 공진에 대해 최상의 결과를 얻습니다. 두 개 이상의 서로 다른 필터링 절차를 사용하여 처리를 반복합니다.마지막으로, 매우 약하고 넓은 신호를 크게 겹치지 않고 필터링하여 신호 대 잡음비를 높입니다. 이 실험에서는 매우 밀집된 영역에서도 분석된 모든 스펙트럼 영역에 대해 매우 좁은 스펙트럼 라인을 얻었습니다. 0.01P PP M 미만의 거리에서 피크는 400MHz에서 거의 완전히 분리할 수 있습니다.결과적으로, 작지만 현재 할당되지 않은 수많은 피크에 대한 정성적 및 정량적 분석은 200.Millimolar 대신 1000 millimolar를 선택하여 향후 라인이 좁아지는 것을 예상할 수 있습니다. CDTA가 원했지만 297 대신 277 Kelvin을 선택하여 인지질 신호 라인의 중첩이 좁아졌습니다. 켈빈(Kelvin)이 필요했지만 인지질 신호의 중첩을 초래하기도 했습니다.CDTA 농도가 200 밀리몰에서 50 밀리몰로 감소하면 선 너비가 약간 증가하고 화학적 이동의 변화는 거의 없습니다. 그러나 50 millimolar CDTA 추출물의 조직 농도는 200 millimolar CDTA 추출물의 절반 수준입니다. 상대적으로 좁은 선을 설명하면서, 상당한 농도 범위를 포괄하는 정량화 가능한 인지질이 많이 검출되었습니다.스펙트럼 분해능은 특정 피크의 부분 분할을 일상적으로 감지하기에 충분합니다. 결과적으로, 향후 추가 인지질 하위 그룹에 대한 정성적 및 정량적 분석이 예상될 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 최적의 대사 산물 분석을 보장하기 위해 각 단계를 매우 조심스럽게 수행해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

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신경과학

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