Name: C.에서 영속 특정 신경 세포 리모델링의 생체 내 이미징에서 엘레 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 배우세요 Caenorhabditis elegans의 다우어 단계에서 감각 신경원 리모델링을 생체 이미징하는 방법을. GFP 표시와 라이브 이미징을 통해 신경가소성 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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dauer IL2 리모델링 표현형을 처음 특성화한 Maureen Barr 박사에게 감사드립니다. 원고를 비판적으로 읽어준 C. Britt Carlson 박사에게 감사드립니다. Barr 연구실의 자금 지원은 NIH(5R01DK59418)와 USDA(2010-65106-20587) 및 New Jersey Commission on Spinal Cord Research(CSCR12FEL004)의 박사후 연구원에서 지원받았습니다. 이 작업에 대한 현재 자금은 University of Illinois Urbana-Champaign College of ACES FIRE 보조금에서 제공합니다.

1 원유 영속 페로몬 생산 <ol><li> OP50 E. 성장 하나의 식민지 O에서 / N 37 ° C에서 대장균은 200 rpm에서 LB 배지 100 ㎖에 떨고있다. 참고 :이 O / N 문화가 사전에 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> N2 C. 성장 엘레 15 - 20 OP50 E.의 50 μL 시드 NGM 한천 (표 1의 레시피 참조) 6cm 배양 접시 대장균 박테리아까지 거의 19 고갈된다. </li><li> 1 L 삼각에 S 미디어의 5 배 250 ㎖에 (표 1의 레시피를 참조하십시오) 확인은 19 플라스크. 참고 :이 솔루션은 사전에 할 수있다. </li><li> OP50 E.의 문화를 성장 E.에서 OP50의 1 ㎖로 접종하여 LB 국물 O의 4 L / N에서 대장균 대장균 및 16 시간 동안 37 ° C에서 떨고. </li><li> (S 기저 용액 (표 1의 제조법 참조) 및 단계 1.3에서 제조 된 S 미디어 4 일 L 삼각 플라스크 각각에 4 ~ 5 판에서 전송 선충 1 ㎖와 함께 접시 (단계 1.2)에서 4를 선충을 씻으 5 판각 실린더 용) 19. </li><li> 10 분 동안 650 XG에서 단계 1.4에서 OP50을 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다. S 기저 용액 10 ㎖ 중의 각 세균 펠렛을 재현 탁. 선충의 각 플라스크에 재 부유 세균의 같은 양을 전송합니다. </li><li> 이 솔루션은 음식의 고갈을 나타내는 취소 시작할 때까지 5 일 - (- 25 ° C에서 20) 100 - 4 150 rpm으로 실온에서 진탕에 플라스크를 배치합니다. </li><li> 음식이 고갈되면, OP50 E.의 또 다른 O / N 문화를 성장 LB 국물의 4 배 1 L에 대장균. 10 분 동안 650 XG에서 박테리아를 원심 분리기 및 선충류와 S 미디어 플라스크에 각각 한 플라스크에서 펠렛을 추가합니다. 음식이 다시 소진 될 때까지 추가 3~4일를 들어, 단계 1.7에서와 같이 진탕에 S 미디어 플라스크를 돌려줍니다. </li><li> 각 플라스크 용액의 ~ 1 ㎖의 분취 량을 가지고 각 1 ㎖의 분취에서 1 μl를 서브가 샘플링 및 선충의 수를 계산하여 선충의 농도를 추정한다. 참고 :75,000 선충 / ㎖ - 선충 인구는 50,000 있어야합니다. 이 농도에서 선충 대부분 dauers이다. </li><li> 오염 된 플라스크를 폐기하십시오. 참고 : 오염 자주 단계 1.9 동안 본 곰팡이 균사로 나타난다. </li><li> 4 ° C에서 10 분 동안 4,000 XG에 원심 분리기 선충. 선충 펠렛을 버리고 상층 액을 유지합니다. 대안 적으로, 낮은 - 역가 페로몬을 만들기 위해 동물을 사용하여 이들에 대한 설명을 참조. </li><li> # 1 와트 만 여과지를 통해 뜨는을 필터링합니다. 주 : 진공 플라스크에이 과정을 촉진 할 것이다. </li><li> 또한 0.45 μm의 멸균 진공 여과 장치를 통해 뜨는을 필터링 할 수 있습니다. 참고 : 여과 액은 4 ° C에서 O / N을 유지 또는 1.14로 진행 할 수 있습니다. </li><li> 교반 막대와 2 L 비이커에 여과 액을 추가합니다. 가열 볶음 접시에 흄 후드에 배치합니다. 교반하면서 끓기 약 200 ㎖의 증발. 500 ㎖의 비이커에 용액을 전송. 약 50 ㎖를 제작 때까지 끓는 계속피트 NOTE : 용액 위에 비등하는 것이 가능한 한 용품은이 단계에서 수행되어야한다. 50 ml의 최종의 색은 어두운 갈색이다. 조리 과정 중에 언제든지 열이 해제 될 수 있고, 여과 액을 RT 또는 4 ℃에서 O / N을 기억. </li><li> g 차가운하자 X 1000에서 5 분 동안 원심 분리. 100 ㎖의 비이커에 뜨는을 붓고 펠렛을 폐기합니다. </li><li> 갈색 빵 껍질에 뜨는을 졸이다. 열에서 제거하고 주걱 지각을 휴식. 지각을 커버하기에 충분한 200 증거 에탄올을 추가합니다. 파라 필름으로 비이커를 커버하고 RT에서 O / N 앉아 보자. 깨끗한 비커에 에탄올을 붓고 옆에 넣어. 지각을 커버하는 신선한 에탄올을 추가합니다. O / N의 추출을 3 회 반복합니다. 추출물을 풀입니다. </li><li> 에탄올 추출물을 건조 진공 펌프를 사용합니다. 진공 펌프를 사용할 수없는 경우 흄 후드에서 교반하면서, 50 ° C로 깨끗한 비커에 따뜻한로 에탄올 추출물을 추가합니다. 참고 : 에탄올 리터의 끈끈한 잔류 물을 증발되면광명 브라운 컬러는 유지되어야합니다. 가열이 사용되는 경우,주의가 너무 오랫동안 가열하여 용액을 구울주의해야한다. </li><li> 멸균 증류수 10ml에 잔류 물을 용해. 필터는 1 ㎖의 분액에서 -20 ° C에서 0.22 μm의 주사기 필터 및 저장이 솔루션을 소독. 참고 : 물 1 ㎖의 원액 선충 문화의 100 ML에 대한 잔류 물을 용해하는 데 사용됩니다. 액체 배양 플라스크 중 하나는 오염으로 인해 폐기되는 경우, 예를 들어, 다음, 잔사를 용해하는 데 사용되는 물의 양을 조절한다. </li></ol> 페로몬 복용량 응답의 2 결정 <ol><li> 펩톤없이 노블 한천로 NGM 미디어의 6 배 5 mL를하여 영속 페로몬을 준비하고, 50 / ㎖ 스트렙토 마이신, 황산 μg과 영속 페로몬의 범위와 보충. 4, 19 (표 1에서 제조법 참조) 13x100 mm의 구성 요소를 믹스 유리 문화 튜브, 분젠 버너를 통해 종기, 다음 3cm 페트리 접시에 붓는다. </li><li> 오전의 무게를icrocentrifuge 관. E.의 O / N 문화의 한 ML을 추가 microcentrifuge 관에서 ~ 17,000 XG에 튜브와 원심 분리기에 대장균 OP50. 상층 액을 모두 제거합니다. 다시 튜브를 달아 세균 펠릿의 중량을 결정한다. 4 %의 최종 농도를 위해 M9 완충액 (표 1의 레시피를 참조) 펠렛을 재현 탁 (/ w v). 나누어지는 각 페로몬 판 (4)의 중심 상에 세균 현탁액 10 μL. 저장 판 O / RT에서 N. </li><li> 페로몬 판 (4) 상에 성인으로 탈피 한 후 10 ~ 15 임신하는 N2 야생 형 자웅 동체에게 일일를 선택합니다. 4 시간 - 3 25 ° C에서 번호판을 저장합니다. </li><li> 성인 자웅 동체의 모든를 선택합니다. 각 접시에 누워 계란의 수를 기록한다. 파라 필름과 판을 밀봉하고 삼일 (17)에 대해 25 ° C로 돌아갑니다. </li><li> dauers의 비율을 계산한다 (그림 2). 참고 : 두 가지 방법의 경우는주의하는 것이 중요하다 dauers (그리고에 낮은 전십t 비 dauers)의 벽을 오르고, 페트리 접시의 뚜껑 위에 것이다. 이 선충에 대한 요리의 모든 표면을 검사하는 것이 중요하다. </li><li> 용량 - 반응 곡선의 데이터를 장착하고도 3에 도시 된 바와 같이 (dauers을 형성하기 위해 동물의 90 %를 유도하기에 충분한 페로몬) 페로몬의 EC (90)의 농도를 추정 참고. 우리는 보통 EC (90)을 추정하기 위해 로지스틱 회귀 모델을 사용 하지만 서로 다른 통계 소프트웨어 패키지는 유사한 추정치를 생산하는 다른 방법이있을 수 있습니다. </li></ol> 영속 IL2 뉴런의 3 라이브 영상 <ol><li> 단계 2.6에서 결정된 EC 90 값을 사용하여 프로토콜이 같이 영속 페로몬 판을 준비합니다. </li><li> 통합 IL2 리포터 유전자를 운반하는 균주 (myIs13 [P의 KLP-6 :: GFP] myIs14 [P의 KLP-6 :: GFP] myIs16 [P와 프로토콜이있는 방법을 사용하여 dauers을 유도 <em&gt; KLP-6 :: tdTomato] 또는 qIs56 [P 지연-2 :: GFP]) 12, 20, 21 참고 :. Q Is56를 사용하는 경우, GFP의 발현에 몇 시간까지 IL2Qs에 표시되지 않습니다 영속 탈피하고 초기 리모델링 이벤트 중 일부는 표시되지 않습니다. P 래그-2 : GFP 유전자에서 형광 신호가 P의 KLP-6 형광 리포터보다 영속 동안 IL2s 궁극적 밝게하면서 또한,이 P 래그-2 : GFP 유전자는 머리 근육에 약하게 발현되는 미세 IL2 분기에 마스크를 적용 할 수 있습니다. </li><li> 달걀 누워 다음, 성인 자웅 동체를 제거 파라 필름과 번호판을 봉인하고 25 ° C 17에서 34 시간 동안 배양한다. 참고 : 영속 탈피에 시간의 길이는 개인 사이에서 약간 다릅니다. 영속 탈피의 시작 5 시간 (39 - - 수상 돌기 arborization의 가장 빠른 기간은 4를 시작합니다 (44)시간 포스트 달걀 누워 25 ° C) 12시. </li><li> 촬영 전날, EC 90 농도의 영속 페로몬과 M9 버퍼에 10 %의 용액 (w / v)의 아가로 오스를 구성합니다. 나누어지는 아가로 오스의 약 100 μl의 현미경 슬라이드 상에 신속하게, 조심스럽게, 평면 아가로 오스 표면을 만들기 위해 상단에 다른 슬라이드를 배치합니다. 아가로 오스가 고형화 후, 습도 챔버 (젖은 종이 타월로 피펫 팁 상자)에 사란 랩 및 저장소에 슬라이드를 래핑합니다. </li><li> 34 시간의 잠복기 후, 인두 펌핑을 중지 선충에 대한 페로몬 판을 검사합니다. 개별 슬라이드 한 슬라이드 일면에만 그것에 아가 갖도록. 10 % 아가로 오스 패드와 0.1 미크론 폴리스티렌 비즈 22의 한 μ 리터에 하나 이상의 선충을 선택합니다. 참고 : 잘 동기화 인구, 접시에 선충의 대부분은 L2D에서 영속에 털갈이로 입력됩니다. 그러나, 나는 사이에서 변동이있을 수 있습니다ndividuals. 그것은 동물이 영속 탈피 내왔다 시간 (예를 들어 대표적인 결과 참조)의 양을 추정하기 위해 추가 기능 (인공 항문 폐쇄, 인두 리모델링)을주의하는 것이 중요합니다. </li><li> 선충의 방향을 (좌 / 우, 지느러미 / 복부)를 결정합니다. 가능한 최저 형광 강도와 100X 배율 매 15 분으로 IL2Q 덴 드라이트의 Z-스택 이미지를 캡처하거나 특정 실험에 필요한. (인두가 펌핑 시작) 선충은 L2D 표피에서 분리 될 때까지 캡처 이미지를 계속 동물이 영속을 복구하는 경우 고정이 불가능하거나. 적극적 묘화하지 않을 때, 습도 챔버에 슬라이드를 배치했다. 참고 : 우리는 전동 무대와 미분 간섭 대비 (DIC) 광학과 epifluorescent 현미경을 사용합니다. </li></ol>

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</ol>

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영속 별 신경 가소성 및 기타 영속 관련 형태 학적 변화를 검사 통제되고 하나 유전자 변이 (즉, DAF-C 돌연변이)를 통해 또는 페로몬 야생 형 동물의 노출에 의해 dauers의 안정적인 형성이 필요합니다. dauers를 유도하는 유전자 변이의 사용이 편리하지만, 그 결과를 혼란시킬 수있다. 따라서 DAF-C 돌연변이로 수집 된 데이터는 이후 영속 페로몬에 노출 영속 단계를 입력하도록 유도 야생형 동물과 확인해야합니다. 원유 영속 페로몬의 생산은 상대적으로 간단하고,이 프로토콜의 변화는 18을 게시됩니다. 오염 수를 제외하고, 여기에 제시된 방법은 매우 안정적입니다. 추출물을 생성하기 위해 S 미디어 배양액 19 선충 큰 밀도를 배양의 표준 방법을 사용한다. initia의 금액 유연성 다량 존재리터 선충 접종은 액체 배양에 추가됩니다. 선충의 큰 숫자로 시작하면 절차를 신속하게 처리됩니다. 그러나, 초...

발달 및 행동 가소성을 포함 표현형 소성은 불리한 환경 조건에 적응하기위한 중요하고 진화 한 원동력으로 간주됩니다. C. 엘레 자주 개발 및 신경 생물학의 연구에 사용되는 모델 생물이다. 이상적인 조건에서, C. 엘레 성인 생식 단계에 들어가기 전에 사 애벌레 단계를 통해 개발하고 있습니다. 그러나, 낮은 음식 가용성과 높은 인구 밀도, C의 조건에서 엘레 발달 스위치를 받아야하고 수명이 긴 스트레스에 강한 영속 2 단계로 입력 할 수 있습니다. Dauers 가능성이 스트레스 저항을 중재 비 dauers에서 여러 형태 학적 및 행동의 차이를 표시합니다. 영속 항목을 규제하는 환경 단서 및 유전 적 경로가 광범위하고, 5, 4, 3 6, 7을 설명했다. 그러나, 각각의 표현형의 변화를 제어하는 분자 메커니즘을 거라고 발생하는uring의 영속 형성이 덜 잘 이해된다. 영속 특정 표현형 검사는 영속 동물의 생산을 필요로한다. 이 세 가지 방법으로 수행 할 수 있습니다 : 1) C의 결핍 문화 따기 엘레 간스, 2) 영속 형성 제정 (DAF-C) 돌연변이, 정제 페로몬을 통해 영속 형성 3) 유도의 사용. 그것은 C.있는 표준 NGM 플레이트에서 dauers을 선택하는 비교적 간단하다 그 박테리아의 식품 공급을 소진했다 elegans의 인구. 우리의 손으로, 표준 NGM 플레이트는 원래 삼일 성장이 허용 이후 3 접종 OP50 대장균의 50 μL, 시드 - 4 성인 자웅 동체는 일주 내에서 식량 공급을 배출하고 수천을 생산합니다 25 ° C로 유지 추가 3 일 이내 dauers (공복 수많은 비 dauers 이외에). 그러나,이 방법은 D로 탈피 중에 발생하는 검사 공정에 불만족AUER. 그것은 영속에 입력하는 일반적인 굶주린 접시에 수천의 동물을 결정하기가 어렵습니다. 또한, 고갈 플레이트의 사용은 동기화를위한 가능성을 제공하지 않는다. DAF-C 돌연변이 체의 사용은 동기화 및 dauers의 안정적인 생성을 허용한다. 그러나, 특정 DAF-C 돌연변이가 단독으로 또는 추가 돌연변이와 함께 다른 영속 특정 표현형에 영향을 미치지 않는다는 보장은 없습니다. 영속 페로몬의 존재는 첫째 Cassada 러셀에 의해 암시하고 나중에 황금과 수수께끼에 의해 입증되었다. 영속 페로몬은 이후 화학적, 열 9, 8,이 특징으로하고있다. 정제 된 페로몬은 다른 형태로 9, 원유 영속 페로몬 추출물 11. 사용이 가능 모두 행동 및 발달 과정을 조절 ascarosides의 복잡한 혼합으로 구성 야생형 백그라운드에서 동기화 dauers의 안정적인 제어 유도. </p&gt; 신경계 및 관련 아교 세포는 영속 유충 형성 12, 13, 14시 개장을받을. 이러한 변화 중 일부는 영속 13 일 14시 신경교 세포의 리모델링으로 되돌릴 수 있습니다. 그러나 다른 리모델링 이벤트가 유리한에 반환시 되돌릴 수 있습니다 환경 조건에 따른 것입니다. 수상 돌기 arborization, multidendritic 신경 세포와 축삭이 12 개조에 하나의 돌기에서 스위치 : 예를 들어, 네 IL2Q 뉴런의 집합을 포함 영속 형성하는 동안 신속하고 가역적 신경 리모델링을 거쳐. 방법은 여기에 모델 생물 스트레스에 의한 신경 가소성의 신뢰할 수있는 생체 내 이미징 할 수 있습니다. 원유 생산 및 영속 페로몬의 테스트를 위해 제시된 방법은 앞서 여러 소스 4, 8, 15, 16, 17, 18에서 설명한 컴파일된다.

<table><tbody><tr><td>N2 C. elegans 브리스톨 균주</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III</td><td>Schroeder lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PT2762 요청에 따라 myIs14[Pklp-6::gfp] V</td><td>Schroeder lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JK2868 qIs56[Plag-2:: gfp] V</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes</td><td>Tritech Research</td><td>60 mm T3308, 35 mm T3501</td><td></td></tr><tr><td>NGM 한천</td><td>975</td> ml H2O에서 다양한 <td></td><td>3 g NaCl, 17 g 한천, 2.5 g 펩톤, 55°C로 고압멸균; C 다음 에탄올 중 5mg/ml 콜레스테롤 1ml, 1M KPO4 완충액(pH 6.0) 25ml, 1M CaCl2 1ml, 1M MgSO4</td></tr><tr><td>S 매체</td><td>1ml, 다양한</td><td></td><td>S 매체는 S 기저 용액(1.46g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5g KH2PO4 중 5mg/ml 콜레스테롤 0.25ml 및 H2O to 250ml. 오토클레이브.) S 기저 용액에 pH 6.0 구연산 칼륨 2.5 ml (구연산 일수화물 2g, 구연산 삼 칼륨 일수화물 29.4 g, , H < >2 O to 100 ml, 오토 클레이브), 미량 금속 용액 2.5 ml (1.86 g 이나트륨 EDTA, 0.69 g FeSO4&nbsp; &황소; 7 H2O, 0.2 g MnCl2&bull; 4 H2O, 0.29 g ZnSO4&nbsp; &황소; 7 H2O, 0.025 g CuSO4&nbsp; &황소; 5 H2O, H2O to 1 L. 오토클레이브 및 암간에 보관), 0.75 ml 1 M CaCl2 및 0.75 ml 1 M MgSO4.</td></tr><tr><td>용량 반응 분석을 위한 Dauer 페로몬 플레이트</td><td>다양한</td><td></td><td>믹스 0.085g 고귀한 한천, 0.513M NaCl 0.5ml 및 5 &micro; L 6x 15ml 배양 튜브 각각에 에탄올에 용해된 5mg/ml 콜레스테롤. 각 튜브에 충분한 조잡한 페로몬을 첨가하여 다양한 농도를 생성합니다. H2O를 추가하면 부피가 4.725ml가 됩니다.&nbsp; 한천이 용해될 때까지 분젠 버너에서 끓인 다음 55°C로 냉각합니다. 125°C를 추가합니다. l 1 M KPO4 완충기 (PH 6.0), 50 &마이크로; l 0.1 M CaCl2, 50 &마이크로; l 0.1 M MgSO4 및 50 & 마이크로; 각 튜브에 5 mg/ml 스트렙토마이신 설페이트의 l.&nbsp; 각 튜브의 내용물을 직경 35mm의 페트리 접시에 붓습니다. 한천을 실온에서 하룻밤 동안 굳히십시오(더 긴 경우 과도한 건조를 방지하기 위해 밀폐된 용기에 보관하십시오).</td></tr><tr><td>마이크로스피어 비드 0.1 미크론</td><td>Polysciences Inc.</td><td>00876-15</td><td></td></tr><tr><td>M9 버퍼</td><td>다양한</td><td></td><td>믹스 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O에서 1리터까지. 오토클레이빙으로 살균</td></tr></tbody></table>

c.에서 영속 특정 신경 세포 리모델링의 생체 내 이미징에서 엘레

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

동물의 스트레스에 의한 표현형의 가소성을 조절 메커니즘은 생체 내에서 공부를 자주 복잡하고 어렵습니다. 스트레스에 의한 소성의 전형적인 예는 C의 영속 무대 엘레 간스. Dauers 박테리아 음식과 영속 페로몬의 높은 농도의 낮은 농도의 조건에서 형성된 대안 발달 애벌레 단계이다. Dauers 광범위한 발달 및 행동 가소성을 표시합니다. 예를 들어, 네 개의 내부 - 순측 사분면의 세트 (IL2Q) 뉴런 영속 형성 동안 광범위한 가역 리모델링을 겪는다. 대형 선충 액체 배양에서 원유 영속 페로몬의 생산을위한 잘 알려진 경로 환경을 미치는 영속 항목, 이전에 설정된 방법을 활용하는 것이 입증된다. 이 방법으로, 50000의 농도 - 배양액 75000 선충 / ㎖가 고도로 강력한 원유 영속 페로몬을 생산하기에 충분하다. 조 페로몬의 효능 dete입니다용량 반응 생물 검정법에 의해 rmined. 마지막으로, 영속 형성하는 동안 IL2Qs의 생체 시간 경과 영상에 사용되는 방법이 설명되어 있습니다.

더위와 추위 안정적인있는 노란색 액체의 원유 영속 페로몬 결과 (그림 1)의 생산. 원유 페로몬 일정량 활동의 명백한 손실 무기한 -20 ° C에 저장됩니다. 페로몬의 제조에 이어, 단일 용량 - 반응 생물 검정법의 효능은 대략적으로 충분하다. 3 회, 각 실험으로부터 평균을 취 - 그러나, 대부분의 실험에는 생물 검정 2를 반복 할 필요가있다. 이 페로몬 생물 검정에서 대표 결과는 그림 3에 나와있다. EC 50, EC (90)가 계산 될 수있다 이러한 데이터에서. 도데 실 황산나트륨 (2)에 대한 내성 이외에, dauers는 폐색 장루, 횡 alae, 굴절 반사 바디 전방 피하 및 수축 인두 (도 2 및도 4a FO 등 여러 형태의 기능에 의해 인식 될 수있다R L2 유충). Dauers는 등 여러 가지 독특한 행동 특성이 ...

특정 환경 스트레스 요인에 노출된 후, 선충 Caenorhabditis elegans는 광범위한 표현형 가소성을 거쳐 스트레스에 강한 'dauer' 유년기 단계로 들어갑니다. 우리는 dauer 동안 neuroplasticity의 제어된 유도 및 이미징을 위한 방법을 제시합니다.

C.에서 영속 특정 신경 세포 리모델링의 생체 내 이미징에서 엘레

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

이 절차의 전반적인 목표는 바다의 우아함에서 감각 뉴런의 다우어 특이적 리모델링을 이미지화하는 것입니다. 이것은 먼저 액체 배양에서 조잡한 페로몬을 추출하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 조잡한 페로몬의 효능을 측정하는 것입니다.다음으로, 페로몬은 IL 2 개의 뉴런에서 GFP를 발현하는 동물의 dour 형성을 유도하는 데 사용됩니다. 마지막 단계는 DMT 단계에서 현미경 슬라이드에 동물을 장착하고 라이브 이미징을 수행하여 수상돌기 수목화를 보여주는 것입니다. 이 방법은 뉴런이 환경 조건에 반응하여 어떻게 리모델링되는지와 같은 신경 가소성 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 방법은 IL 2 리모델링에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 인두 리모델링과 같은 다른 daer 특정 이벤트에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 단일 군체에서 OP 50 e coli를 배양하면서 200RPM에서 100ml의 lb 육수를 흔듭니다. 그런 다음 박테리아가 거의 고갈 될 때까지 50 마이크로 리터의 대장균과 함께 NGM 한천을 사용하여 15-26 센티미터 페트리 접시에서 N 두 C의 우아함을 키웁니다.다음으로, 1ml의 대장균을 접종하고 섭씨 37도에서 16시간 동안 흔들어 LB 육수 4리터에 대장균 배양을 배양합니다. 그 후, 1 밀리리터의 S 바질 용액으로 플레이트에서 선충을 씻으십시오. 4-5 개의 선충 플레이트를 1 리터의 삼각 플라스크에 옮기고, S 매체를 10 분 동안 650gs에서 대장균을 원심 분리하고, 상등액 염증을 제거하고, 각 박테리아 펠릿을 10 밀리리터의 S 바질 용액에 현탁시킵니다.그 후, 동일한 양의 재현탁 박테리아를 선충의 각 플라스크에 옮깁니다. 용액이 제거되기 시작할 때까지 4일 동안 100-150RPM의 실온에서 오비탈 셰이커에 플라스크를 올려 놓으십시오. 음식이 고갈되면 하룻밤 동안 1리터 파운드 육수를 4가지 배양으로 배양합니다.그런 다음 650G에서 10분 동안 박테리아를 원심분리합니다. 선충이 있는 S 배지 플라스크에 박테리아 펠릿을 추가하고, 음식이 다시 고갈될 때까지 추가로 3-4일 동안 모든 S 배지 플라스크를 안와 챔버에 되돌려 놓습니다. 그런 다음 1ml의 용액 분취량을 페트리 접시에 옮기고 해부 현미경으로 선충의 수를 계산합니다.다음으로, 선충을 섭씨 4도에서 10분 동안 4, 000Gs로 원심분리하고 선충 펠릿을 버리고

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 그대로의 anesthetization 및 이미징을위한 신뢰할 수있는 방법을...

서브 세포 해상도 손상 Drosophila의 애벌레의 생체내 이미징에서

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

간단한 마이크로 유체 장치는 마취 무료를 수행하기 위해...

에 대한 간단한 마이크로 유체 장치<em&gt; 생체 내</em의&gt; 이미징<em&gt; C. elegans</em&gt;<em&gt; Drosophila</em&gt;와 Zebrafish

출처: Doser, R., et al. 생체 내 신경 칼슘 처리의 세포 내 이미징. J. Vis. 경험. (2023년)이 비디오는 형질전환 Caenorhabditis elegans 균주의 복부 신경 코드 뉴런에서 세포내 칼슘 플럭스의 생체 내 이미징을 보여줍니다. 두 가지 별개의 칼슘 지표가 사용됩니다: 한 균주의 세포질 지표와 다른 균주의 미토콘드리아 지표. 뉴런은 자발적인 뉴런 활동 중 칼슘 플럭스를 반영하여 뉴런 세포질 및 미토콘드리아 내 형광 강도의 실시간 변화를 모니터링하기 위해 형광 현미경으로 관찰됩니다.

Caenorhabditis elegans의 뉴런에서 세포내 칼슘 역학 이미징

작은 투명 몸, 잘 문서화 neuroanatomy 및 의무 유전자 기술과 시약의...

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

동물을 움직이지 않게 하지 않고 장시간 척도에 걸쳐 행동과 신경 활동을 영상화하는 것이 행동을 이해하기 위한 전제 조건입니다. 아가로스 미세유체 챔버 이미징(AMI)은 예쁜꼬마선충의 모든 생애 단계에 대한 신경 활동과 행동을 이미지화하는 데 사용할 수 있습니다.

의 장기 칼슘 이미징을위한 아가로 오스 Microchambers<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

여기에서 우리는 생활 C 에서 고해상도 현미경, 전산 도구 및 단일 세포 라벨링을 사용 하 여 조합 접근법을 제시 합니다. 신경 발달 중에 단일 세포 역학을 이해 하는.

등방성 라이트 시트 현미경 검사 및 자동 세포 계보 분석을 통해 아닌 간 분해능을 통한 배아 발생 발생

수지상 등뼈는 신경계의 중요한 세포 특징입니다. 여기에서는 C. elegans에서 수지상 가시의 구조와 기능을 평가하기위한 라이브 이미징 방법이 설명됩니다. 이러한 접근법은 수지상 척추 모양 또는 기능을 정의하는 유전자에 대한 돌연변이 스크린의 개발을 지원합니다.

Caenorhabditis elegans의 수지상 가시 이미징

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생체 내 Caenorhabditis elegans 뉴런의 미세 투덜역학 및 오리엔테이션 평가

이 프로토콜은 최대 36 시간 동안 지속적인 식품 공급이있는 상태에서 C. elegans를 성장시키는 데 사용되는 간단한 미세 유체 칩 설계 및 미세 가공 방법론을 설명합니다. 성장 및 이미징 장치는 또한 며칠 동안 개발 중에 세포 및 하위 세포 프로세스의 간헐적 인 장기 고해상도 이미징을 가능하게합니다.

Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

현재 방법은 쉽게 사용할 수 있는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 사용하여 예쁜꼬마선충에서 생체 내 고해상도 하위 구획 칼슘 이미징을 위한 비비율계량 접근 방식을 설명합니다.

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

배우세요 Caenorhabditis elegans의 다우어 단계에서 감각 신경원 리모델링을 생체 이미징하는 방법을. GFP 표시와 라이브 이미징을 통해 신경가소성 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

C.에서 영속 특정 신경 세포 리모델링의 생체 내 이미징에서 엘레

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