Name: Organotypic 슬라이스는 문화 희소 돌기 아교 세포 역학 및 수초화을 공부하기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 배우세요 조직 슬라이스 배양을 이용하여 NG2 세포와 과수두아교세포의 증식 및 분화 역학을 연구하는 방법입니다. 이 기술은 조직 구조를 유지하면서 세포 환경을 조작할 수 있어 신경발달 및 수초화 연구에 유용합니다.

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이 연구는 미국 국립다발경화증학회(National Multiple Sclerosis Society, RG4179 to A.N.), 미국 국립보건원(National Institutes of Health, NIH R01NS073425, R01NS074870 to A.N.) 및 미국 국립과학재단(National Science Foundation, A.N.)의 보조금으로 지원되었습니다. PLPDsRed 형질전환 마우스를 제공해 주신 Dr. Frank Kirchhoff(독일 홈부르크 자를란트 대학교)에게 감사드립니다. 유전자 변형 쥐 군체를 유지하는 데 도움을 주신 Youfen Sun에게 감사드립니다.

주 : 모든 동물의 절차는 지침을 따르고 코네티컷 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 참고 : YFP 기자 20 (JAX 번호 006148) 선이 각각 사용되었다 : NG2cre 18 구성 적 (JAX # 008533)와 NG2creER 16 유도 이러한 실험 (JAX 번호 008538)의 경우 형질 전환 마우스는 19 (JAX은 # 003920) 또는 gtRosa26 / EG Z에 교차 화상 NG2 세포 및 그 자손. 희소 돌기 아교 세포로 성숙 화상, PLPDsRed 트랜스 제닉 마우스 (21)를 사용 하였다. 일관성 생존을 위해, 조각까지 전뇌와 소뇌 모두에서 출생 일 10 생쥐에서 분리 할 수​​ 있습니다. 1 조각 준비 <ol><li> 문화 후드에서 여섯 잘 접시에 조직 배양 삽입을 배치하고 (시약 섹션에서 레시피) 1 ml의 슬라이스 문화 매체를 추가 할 수 있습니다. 5 %와 37 ° C에서 해부하기 전에 CO 2 적어도 2 시간을 세포 배양 인큐베이터에서 접시를 넣습니다. </li><li> 70 % 에탄올에서 모든 도구와 조직 초퍼 멸균. </li><li> 이전 해부의 시작 적어도 15 분 동안 얼음에 95 % O 2, 5 % CO 2와 버블 해부 버퍼 (시약 섹션에서 레시피). </li><li> 승인 된 동물 프로토콜에 따라 5 ~ 10 분 동안 얼음에 배치하여 마우스 새끼를 마취. 쥐 꼬리와 발가락 핀치에 응답하지 않는 것을 확인하여 마취의 적절한 깊이를 확인하라. </li><li> 동물 프로토콜을 다음 예리한 가위를 사용하여 동물을 참살. 빨리 첫번째 살균 도구를 사용하여 횡 절개 다음에 시상 컷을하여 전뇌와 소뇌를 통해 두개골을 제거합니다. 조심스럽게 옆으로 조직을 압연하여 뇌와 소뇌의 복부 표면에서 두개골 신경을 잘라. </li><li> 얼음처럼 차가운 산소 해부 버퍼를 포함하는 멸균 35mm 접시에 조직을 배치합니다. </li><li> 면도날을 사용하여, 소뇌 및 전뇌 단절. 그런 다음 중간 시상 컷 죽을반구를 분리 우 전뇌와 소뇌. </li><li> 수동 조직 헬기와 전뇌와 소뇌의 300 μm의 두께의 관상 및 시상 부분을 잘라. 참고 : 수동 조직 헬기 아가로 오스 삽입 할 필요없이 문화 부화 해부에서 신속하게 처리 할 수​​ 있습니다. 앞서 설명한 바와 같이 9 vibratome도 사용될 수있다. </li><li> 얼음에 갓 버블 차가운 해부 버퍼로 분리 된 조각을 전송합니다. </li><li> 작은 해부를 사용하거나 개별 섹션을 분리하고 배양 삽입과 여섯 잘 요리를 미리 배양로 전송 주걱 무게. </li><li> 일회용 전송 피펫 또는 P 200 피펫 팁을 사용하여 문화 삽입물의 표면에서 초과 해부 버퍼를 제거합니다. 세 전뇌 또는 세 소뇌 조각에 두 하나의 문화 삽입에 배치 할 수 있습니다. 참고 : 전뇌 문화와 일치하는 결과를 얻기 위해서 (때문에)는 전방에게 뇌량의 3 분의 1에 걸쳐 조각을 위해 이상적입니다동일한 슬라이스에 모두 회색과 흰색 문제 영역을 공부하기 위해 (그림 1A). 각 동물은 일반적으로 6 전뇌 슬라이스와 6 소뇌 조각을 얻을 수 있습니다. </li><li> 인큐베이터에있는 여섯 잘 접시를 놓고 다음 일 일일 슬라이스 준비 후 슬라이스 매체의 ML 슬라이스 고정 될 때까지 다른 모든 일에 슬라이스 매체를 교체합니다. </li><li> 실험에 따라, 문화 5-7 일 후에 조각을 사용합니다. 처음 몇 일 후에 투명하게 조각을 사용하여 요철이 불투명 한 영역을 가지고 그 사람들을 버린다. 참고 : 슬라이스 내에서 불투명 한 영역은 눈으로 볼 수 있으며, 위상차에서 어두운 세포의 덩어리로 나타납니다. 기술이 습득 한 후에, 죽은 불투명 조각 조각 미만 1-5%에서는 거의 발생하지 않는다. </li></ol> NG2의 세포 분열 및 희소 돌기 아교 세포 분화 2 타임 랩스 영상 참고 : 경제의 제로 성장 생쥐 16 : 우리가 NG2cre를 사용 NG2 세포의 증식과 분화의 시간 경과 이미징을 수행하려면NG2 세포 및 그 자손 (도 1C-E)에서 EGFP를 발현한다. 이 줄 리포터 발현 즉시 적어도 4주의 기간 동안 후 단면 슬라이스 라이브 GFP + 세포의 이미지를 획득 할 수있을만큼 충분히 튼튼하다. 깨끗한 이미지는 문화의 첫 번째 3-5일을 통해 발생하는 슬라이스의 초기 숱이 기간 이후에 얻을 수있다. <ol><li> 실험을하는 동안, 37 ° C에서 세포 배양 인큐베이터에서 조각을 유지하고 시간의 짧은 기간 만 제거 (슬라이스 미만 15 분), 육 웰 플레이트 동안 영상에 뚜껑을 유지. </li><li> 디지털 카메라를 구비 한 반전 된 형광 현미경을 사용하여, 10 배 대물 렌즈를 사용하여 첫 번째 시점에서 이미지를 캡처. 참고 : 처음 지점이 실험에 의해 달라지며 조각이 제조되었다 일 또는 후 어느 시점이 될 수 있습니다. </li><li> 슬라이스의 두 회색과 흰색 물질 분야에서 시점 일에 여러 지역의 이미지를 캡처합니다. 주 일슬라이스 내의 특정하여 도시 및 후속 이미징 세션에 사용할 수있는 이미지에 개략적 위치를 매핑하여 전자 묘화 영역. 유용한 랜드 마크 백질 책자의 조각 및 / 또는 방향의 모서리를 포함 할 수 있습니다. 콘텐츠 각 시점에서 각 조각에 위치 4-8. </li><li> 4-6 시간 간격으로 연속 된 이미지를 캡처 NG2의 세포 분열 및 희소 돌기 아교 세포의 분화, 이상적 통해 5~7일 검사하는. </li><li> 모든 지역의 최종 이미지를 캡처하여 즉시 조각을 수정. 다음 조각 위에 다른 하나를 가하여, 문화 삽입의 바닥 (0.1M L-라이신 0.01 M 나트륨 메타 요오드와 4 % PFA) 고정액의 한 ML을 추가합니다. 그것은 막에서 분리 할 수​​ 있습니다로 슬라이스에 직접 정착 물총 않도록주의하십시오. 30 분 동안 조직을 수정하고 4 절에 설명 된대로 발달 단계 특정 마커를 사용하여 면역 조직 화학 진행합니다. </li><li> 0.2 M 인산 나트륨 완충액 3 × 10m 씻을 조각인치 1-3일 0.2 M 인산 나트륨 완충액에서 4 ° C에서 필요한 저장하기 전에 조각은 면역 염색한다면 이상적으로 24 시간 내에 염색을 수행합니다. 희소 돌기 아교 세포 (그림 2D-F)로 분화 한 세포의 비율을 결정하기 위해 4 장에 아래와 같이 면역 조직 화학 염색을 진행합니다. </li></ol> 슬라이스 문화에 유도 성 기자 형질 전환 마우스를 사용 NG2 세포 자손의 3 운명 매핑 주 : 문화 특정 시점에서 NG2 세포의 운명을 추적하기 위해, 유도 NG2creER : YFP 트랜스 제닉 마우스를 사용할 수있다. <ol><li> 배지에 에탄올 100 나노 4OHT 추가하여 Cre 호텔 재조합 및 리포터 발현을 유도한다. NOTE : 리포터 양성 세포는 모든 NG2 세포 단계에서 세포 것이다 ~ 20-25% YFP + NG2 + / NG2 + 세포의 유도 효율이 시점에서 1~2일 내에 표시한다 (도 2A-C) </li><li> 수정하고 슬라이스를 씻어상이한 시점에서의 각종 조작 후 (섹션 2.5 및 2.6에 기재되어 있음). </li></ol> 4 슬라이스 면역 조직 화학 <ol><li> 메스를 사용하여 삽입에서 부착 된 조각 세포막을 잘라. </li><li> 멤브레인 픽업시 슬라이스의 조성물을 방해하지 않도록주의하면서, 핀셋의 세트를 이용하여 24 웰 플레이트에 함유하는 인산염 완충 식염수 (PBS) 중 각각의 웰에 조각을 전송. </li><li> 1 시간 동안 PBS에서 5 % 정상 염소 혈청 (NGS)와 0.1 % 트리톤 - X100을 포함 차단 솔루션과 24 웰 플레이트에 조각을 전송합니다. </li><li> 4 ° C에서 PBS에서 5 % NGS에 / 차 항체 O에서 N을 슬라이스를 품어. NG2 세포 단계에서 세포를 식별하기위한, 그리고 NG2 PDGFRα 대한 항체를 사용. 희소 돌기 아교 세포 분화를 확인하기위한, 선종 성 용종증 콜라이 항원에 대한 항체를 사용하여 (APC; 클론을 CC1). </li><li> PBS 3 X15의 분에서 두 번째 일 세척 슬라이스에서 다음 차 antibo에 품다RT에서 1 시간 동안 PBS 중 5 %에​​서 NGS 죽는다. PBS 3 X15 최소의 조각을 세척하고 슬라이드에 탑재합니다. 멤브레인 대물과 조직 사이되지 않도록 슬라이드 대향 조각 위로 막 마운트. </li></ol>

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<li>Stevens, B., Porta, S., Haak, L. L., Gallo, V., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine%3A+a+neuron-glial+transmitter+promoting+myelination+in+the+CNS+in+response+to+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Adenosine: a neuron-glial transmitter promoting myelination in the CNS in response to action potentials.</a> Neuron. 36 (5), 855-868 (2002).</li>
<li>Wake, H., Lee, P. R., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+local+protein+synthesis+and+initial+events+in+myelination+by+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of local protein synthesis and initial events in myelination by action potentials.</a> Science. 333 (6049), New York, N.Y 1647-1651 (2011).</li>
<li>Rosenberg, S. S., Kelland, E. E., Tokar, E., De la Torre, A. R., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+geometric+and+spatial+constraints+of+the+microenvironment+induce+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The geometric and spatial constraints of the microenvironment induce oligodendrocyte differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14662-14667 (2008).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다

중추 신경계의 수초화 효율적으로 신경 세포의 통신 및 축삭의 생존 22 필수적이다. 25 - 대부분의 뇌 영역 16,23의 거주 인구를 유지하면서 NG2 세포는 지속적으로 성인에 myelinating 희소 돌기 아교 세포를 생성합니다. 이러한 세포의 분화를 조절 일부 유전 및 분자 메커니즘을 설명했지만 많이 발견되고 남아있다. Organotypic 슬라이스 배양 인해 해부학 영역, 세포 외 환경의 쉬운 조작 견고 수초화, 모든 주요 세포 유형의 존재를 유지하는 자신의 고유 한 특성으로 이러한 메커니즘을 조사하기 편리한 도구이다. 이러한 특성은 NG2 세포, 희소 돌기 아교 세포와 축삭 11,26 사이의 단기 및 장기 작용의 조사를 용이하게한다. 또한, 세포 이식은 수행하기가 비교적 용이하고 의존적 D 영역을 조사하는데 사용될 수있다셀 동작을 17 ifferences. 또한, 약리학 적 치료는 정상 17,27,28</sup...

4 - 중추 신경계 Organoytpic 슬라이스 배양 semiintact 시스템 (1)의 뉴런 및 신경교 세포 생물학을 연구하는데 매우 유용한 것으로 입증되었다. 9 - 이러한 문화를 채택하고 세포 외 환경의 조작을 반복 장기 라이브 세포 이미징에 대한 쉬운 접근과 전기 생리 레코딩 (5)이 기본으로 해리 된 세포 배양의 많은 혜택을 유지하기가 비교적 간단하다. 또한, 슬라이스 배양 3 차원 조직 cytoarchitecture 지역 신경 연결을 유지하고, 가장 중요한 세포 유형은 시스템에 존재한다. 이러한 특성은 세포와 환경의 상호 작용으로 단일 세포의 행동과 생리를 조사하기 위해 이들 문화에 고유 한 편리한 시스템을 확인합니다. NG2 세포 증식 및 m을 계속 생성 포유류의 중추 신경계에서 신경교 세​​포 집단이다배아 및 출생 후의 개발 10 동안 희소 돌기 아교 세포를 yelinating. 이들은 광범위 해리 일차 세포 배양에서 연구되었으며, NG2 형광 단백질의 세포 특이 식 트랜스 제닉 마우스 라인의 최근의 발전은 급성 슬라이스 제제의 생체 내 거동 매핑 및 전기 생리 레코딩에서 촉진했다. 비록 이러한 연구와 거의 NG2 세포 증식 및 희소 돌기 아교 세포의 분화의 시간적 역학에 대해 공지되어있다. 해리 된 세포 배양 물을 광범위하게 약리 유전 조작에 대하여 설비를 위해 사용되지만, 그것은 세포의 미세 환경의 컨텍스트를 유지하는 것이 바람직하다 특히 다른 뇌 영역에서 이들 세포의 기능 차이를 질의에 적합하지 않다. 슬라이스 배양 세포 약리 조작에 대한 의무이며, 희소 돌기 아교 세포의 수초화 (11, 12)을 조사하기 위해 사용 된 간단한 대안을 제공(LPC)을 lysolecithin 또는 항체 약물 치료 15를 통해 탈수 초화 13, 14, 및 재유 수화 유도를 유도 한 후 신경근 응답. 방법은 조사 및 라이브 영상 및 고정 조직 (또는 postfixation) 전뇌와 소뇌에서 모두 촬영 Organotypic 슬라이스 문화의 NG2 세포의 증식 및 희소 돌기 아교 세포의 분화의 분석 설명을 수행 할 수 있습니다. 이 16 분할 한 후 NG2 세포 세포의 운명을 연구하고 성장 인자 유도 NG2 세포 증식 17 인 지역, 연령 의존적 차이를 발견하는데 사용될 수있는 강력한 방법이다. 이 상대적으로 간단한 기술은 또한 고유 및 / 또는 환경이 아교 세포의 생리학 및 신경 세포의 활동이나 수초의 손상에 대한 반응을 조절하는 메커니즘을 세포를 조사하기 위해 광범위하게 액세스 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Slice Culture Medium</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11090</td><td>50%</td></tr><tr><td>Hank' s 균형 잡힌 염 용액</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>25%</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마-알드리치</td><td>H-4034</td><td>25mM</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>인비트로젠</td><td>25030</td><td>1mM</td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마-알드리치</td><td>I6634</td><td>1mg/L</td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>시그마-알드리치</td><td>A-0278</td><td>0.4mM</td></tr><tr><td>호스 세럼</td><td>하이클론</td><td>SH30074.03</td><td>25%</td></tr><tr><td colspan="4">NaOH로 pH 7.22로 적정하고 병 상단 필터로 걸러낸 다음 섭씨</td></tr><tr> 4도에서 보관<td colspan="4">Dissection Buffer</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>124mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>3.004mM</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>1.25mM</td></tr><tr><td>MgSO4 (무수)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>4.004mM</td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>2mM</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>26mM</td></tr><tr><td>D-(+)-포도</td>당 <td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>10mM</td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0278</td><td>2.0mM</td></tr><tr><td>아데노신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>0.075mM</td></tr><tr><td colspan="4">병 상단 필터로 필터링하고 섭씨 4도에서 보관, 95%O2 5%CO2로 산소화 사용</td></tr><tr> 전<td colspan="4">기타 시약 및 용품</td></tr><tr><td>4-hydroxy tamoxifen (4OHT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904</td><td>100nM</td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td><td>EM Sciences</td><td>19200</td><td>4%</td></tr><tr><td>L-라이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>L-6027</td><td>0.1M</td></tr><tr><td>메타피리요트</td>나트륨 <td>시그마-알드리치</td><td>S-1878</td><td>0.01M</td></tr><tr><td>토끼 항 NG2 항체</td><td>Chemicon (Millipore)</td><td>AB5320</td><td>1:500</td></tr><tr><td>마우스 항 CC1 항체</td><td>Calbiochem (Millipore)</td><td>OP80</td><td>1:200</td></tr><tr><td>마우스 anti Ki67 항체</td><td>Vision Biosystems</td><td>NCL-Ki67-MM1</td><td>1:300</td></tr><tr><td>마우스 anti NeuN 항체</td><td>Chemicon (Millipore)</td><td>MAB377</td><td>1:500</td></tr><tr><td>종 특이적 2차 항체</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (NGS)</td><td></td><td></td><td>5%</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>0.10%</td></tr><tr><td>Mounting medium DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>밀리셀 배양 멤브레인 인서트 0.45&mu; m 기공 크기</td><td>Fisher Scientific</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>병 상단 필터</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-25E</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% O2 5% CO2 가스 혼합</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 6웰 플레이트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부(해마) 또는 계량 주걱,</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>수동 또는 자동 조직 다지기 면도날</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>,</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>일회용 이송 피펫,</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35mm 및 60mm 멸균 페트리 접시</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 실체 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>반전상 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>층류 후드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 인큐베이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>거꾸로 된 형광 Microcope</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

organotypic 슬라이스는 문화 희소 돌기 아교 세포 역학 및 수초화을 공부하기

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 발현 세포 (polydendrocytes, 희소 돌기 아교 세포 전구 세포)는 중추 신경계에서 주요한 넷째 신경교 세​​포 집단이다. 배아 및 출생 후의 개발하는 동안 그들은 적극적으로 증식 myelinating 희소 돌기 아교 세포를 생성합니다. 이 세포는 일반적으로 기본 해리 문화, 신경 세포 공 배양 연구, 고정 조직되었다. 새로 사용 가능한 트랜스 제닉 마우스 선이 배양 시스템은 전뇌와 소뇌 모두 회색과 백질 영역에 희소 돌기 아교 세포 계통 세포의 증식과 분화를 조사하는데 사용될 수있는 슬라이스. 슬라이스 문화는 출생 초기 마우스에서 준비가되어 1 개월까지에 대한 문화에 보관됩니다. 이 조각은 세포의 행동과 상호 작용을 조사하기 위해 배양 기간 동안 여러 번 이미지를 만들 수 있습니다. 이 방법은 NG2의 세포 분열의 시각화와의 상세한 분석을 가능하게하고있는 동안 희소 돌기 아교 세포의 분화로 이어지는 단계 지역별 의존 할 수 있습니다천만에 NG2 세포 및 희소 돌기 아교 세포 기능 이질성. 이는 생체 내에서 밀접 발견 유사한 셀룰러 환경에서 시간 경과에 영향을 미치는 이러한 세포 및 극한 외부 신호를 조사하는데 사용될 수있는 강력한 기술이다.

대표 데이터의 예는 다음과 같습니다 P8 NG2cre의 전뇌와 소뇌에서 모두 슬라이스 문화를 사용하여 획득 한 것을 : 경제의 제로 성장, NG2creER : YFP를 형질 전환 마우스 라인을 PLPDsRed. NG2 세포 전뇌와 소뇌 조각 (그림 1B-D, 비디오 1) 이러한 세포의 표현형 일 동안 이미지를 만들 수는 고정 후 결정 NG2와 CC1 항체 (그림 1E)과 면역 염색 할 수 있습니다. 이미징 사는 또한 세포 증식은 또한 Ki67 (도 1F)와 같은 세포 증식 마커에 대한 면역 조직 화학 염색을 사용하여 평가 될 수있다. 이러한 데이터는 개개의 세포 기초 NG2의 세포 분열 후에 희소 돌기 아교 세포의 분화의 시간의 상세한 역학 분석을 허용한다. YFP 마우스 (도 2) : NG2 세포의 운명 매핑 NG2creER에 4OHT와 슬라이스에 CRE 재조합 유도 한 후에 수행 될 수있다. YFP 리포...

전뇌와 소뇌의 슬라이스 배양 시스템을 사용하여 NG2 세포와 희소돌기아교세포를 연구하는 기술에 대해 설명합니다. 이 방법을 사용하면 조직 세포 구조를 유지하면서 세포 외 환경을 쉽게 조작할 수 있는 희소돌기아교세포 계통 내에서 세포의 증식 및 분화 역학을 조사할 수 있습니다.

Organotypic 슬라이스는 문화 희소 돌기 아교 세포 역학 및 수초화을 공부하기

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

이 절차의 전반적인 목표는 생체 내에서 발견되는 것과 매우 유사한 환경에서 희소돌기아교세포 계통 세포의 증식 및 분화를 조사하는 것입니다. 이것은 먼저 출생 후 초기 형질전환 마우스에서 4개의 뇌와 소뇌의 절편 배양을 준비함으로써 달성됩니다. 그런 다음 절편의 단일 세포를 몇 시간에서 며칠에 걸쳐 이미지화하여 증식 및 분화의 세포 역학을 시각화합니다.이미징 후 세포의 사후 면역조직화학을 사용하여 다양한 세포 특성을 결정합니다. 궁극적으로, 결과는 정상적인 조건과 약리학적 또는 유전자 조작 후의 세포 증식 및 분화의 역학을 보여줄 수 있습니다. 해리된 석탄, 뉴런 배양 및 리가 세포 계통 세포와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 슬라이스 배양을 통해 조직 세포 구조를 유지하면서 무세포 환경을 조작할 수 있다는 것입니다.모든 동물 절차는 지침을 따르고 있으며 해부 최소 2시간 전에 코네티컷 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 각각 6개의 웰 플레이트에 조직 배양 삽입물을 준비합니다. 글쎄, 슬라이스 배양 배지 1 밀리리터를 첨가 한 다음 해부 최소 15 분 전에 5 % 이산화탄소와 함께 섭씨 37 도의 세포 배양 인큐베이터로 플레이트를 옮깁니다.해부 완충액을 얼음 위에 놓고 산소 95%, 이산화탄소 가스 5%로 거품을 일으키기 시작합니다. 또한 모든 도구와 조직 다지기가 70% 에탄올로 멸균되었는지 확인하십시오. 조직을 얼음처럼 차가운 산소 해부 완충액이 들어 있는 멸균 35mm 접시에 옮깁니다.다음으로, 면도날을 사용하여 소뇌와 전뇌를 절단하고 반구를 분리하는 전뇌와 소뇌를 절단합니다. 이제 수동 초퍼를 사용하여 4개의 뇌와 소뇌의 300미크론 두께의 관상 및 시상 단면을 만듭니다. 각 동물은 일반적으로 6개의 4개의 뇌 조각과 6개의 소뇌 조각을 산출합니다.이상적으로는 동일한 슬라이스에서 회백질 영역과 백질 영역을 모두 연구하기 위해 말뭉치의 앞쪽 1/3에 걸쳐 있는 슬라이스를 사용합니다. 분리된 슬라이스를 작은 해부 또는 칭량 주걱을 사용하여 완충액의 얼음 위에 갓 거품이 일고 있는 차가운 해부 버퍼로 옮깁니다. 개별 섹션을 분리하여 사전 배양으로 옮깁니다.배양 삽입물을 포함하는 6개의 우물 접시. 하나의 배양액에 2-3개의 슬라이스를 배치할 수 있습니다. 배양 표면에서 과도한 해부 버퍼에서 피펫을 삽입합니다.플레이트가 고정될 때까지 플레이트를 인큐베이터에 삽입하고 옮깁니다. 슬라이스 배지는 슬라이스 준비 후 하루씩 교체해야 하며, 그 다음에는 프로토콜에 명시된 대로 슬라이스 고정까지 격일로 교체해야 합니다. 실험에 따라 5일에서 7일 후에 슬라이스를 사용하십시오.문화에서. 처음 며칠이 지나면 투명해지는 슬라이스만 사용하고 육안으로 볼 수 있는 고르지 않은 불투명 영역이 있는 슬라이스는 버리십시오. 얼굴 대비에서 이러한 불투명한 영역은 어두운 세포의 덩어리로 나타납니다.올바르게 수행되면 데드 불투명 영역이 1-5%의 슬라이스에서 발생합니다. NG 2 세포 증식 및 분화에 대한 타임 랩스 이미징을 수행하려면 NG 2 세포에서 EGFP를 발현하는 마우스의 3-5일 된 슬라이스를 사용합니다. 슬라이드가 섭씨 37도 이하로 15분 이상 내려가지 않도록 하십시오.이미징 세션마다 플레이트를 닫은 상태로 도립 형광 현미경의 10 x 대물렌즈를 사용하여 한 번에 이미지를 캡처합니다. 문화의 포인트. 각 슬라이스의 4-8개 위치를 슬라이스의 회색 물질과 백질 영역에서 모두 이미지화합니다.또한 재배치 목적을 위해 슬라이스의 가장자리, 특정 세포 또는 백질 관의 방향과 같은 유용한 랜드마크를 이미지화합니다. 이전 시점 이미지는 NG 2 세포 분열 및 희소돌기아교세포 분화를 위한 재배치 중 참조 이미지로 사용할 수 있습니다. 이상적으로는 5-7일 동안 4-6시간마다 이미지를 캡처합니다.유도성 마커인 NG 2 cre, ER YFP를 사용하는 경우, 100 나노 몰을 가진 배양액을 이용하여 리포터 발현을 유도한다. 에탄올 리포터 활동에 용해 된 4 개의 하이드 록시 타목시펜은 1-2 일 이내에 나타나야합니다. 고정을 위해 배양 바닥에 1ml의 고정액을 첨가하십시오.슬라이스 위에 다른 밀리리터를 삽입하고 추가합니다. 고정액을 조각에 직접 분사하지 마십시오. 그렇지 않으면 분리될 수 있습니다. 섭씨 4도에서 30분 동안 조직을 고정한 다음 메스를 사용합니다.조각이 부착된 멤브레인을 잘라냅니다. 핀셋을 사용하여 PBS가 로드된 24웰 플레이트의 개별 웰로 슬라이스를 조심스럽게 옮깁니다. 다음으로, PBS에서 5%일반 염소 혈청과 0.1% 트리톤 X 100을 함유한 차단 용액이 로드된 두 번째 24웰 플레이트로 슬라이스를 옮깁니다.실온에서 한 시간 동안 차단 용액에서 배양하도록 합니다. 차단되면 5% NGS의 PBS에 1차 항체가 로드된 플레이트로 슬라이스를 이동합니다. 다음날 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 부화시키십시오.PBS에서 조각을 씻으십시오. 그런 다음 5% NGS를 가진 PBS에서 2차 항체와 함께 슬라이스를 배양합니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다.이전과 같이 PBS를 세 번 더 세척하고 멤브레인이 슬라이드를 향하도록 슬라이스를 장착하여 대물렌즈와 조직 사이에 있지 않도록 합니다. 희소돌기아교세포 분화의 시간적 역학을 분석하기 위해, 여러 날에 걸쳐 P 8 NG 2 크리그 형질전환 마우스의 전뇌 슬라이스 배양물에서 NG 2 세포 분열의 이미지를 얻었고, 122시간 동안 타임 랩스 시퀀스를 촬영했습니다. 분열된 세포의 표현형은 NG2 및 CC 1 항체로 측정하였다.세포 증식은 또한 세포 증식 마커에 대한 면역조직화학적 염색을 사용하여 평가되었습니다. NG 2 세포의 KI 67 미끼 맵핑은 NG 2 CRE YFP 마우스의 슬라이스에서 CRE 재조합을 유도 한 후 수행되었습니다. 4개의 하이드록시 타목시펜을 첨가한 후 2일.NG를 발현하는 YFP 리포터는 배양물에서 2개의 양성 세포가 발견되었습니다. 4일 후, 이들 세포의 일부가 CC 1 양성 희소돌기아교세포 세포로 분화했습니다. 성숙한 희소돌기아교세포는 P-L-P-D-S의 소뇌 절편 배양에서 이미지화되었습니다.붉은 쥐 myelinated Perkin 뉴런이 이러한 배양에 존재했습니다. 반복 이미징은 이러한 슬라이스에서 희소돌기아교구 면역조직화학을 발현하는 수초화 DS red의 첨가를 보여주었고, 이는 미엘린 염기성 단백질의 상당한 발현을 보여주었습니다. 마지막으로, 더 높은 시간 해상도 이미징은 원위 과정에서 약간의 작은 움직임을 가진 안정적인 희소돌기아교세포 세포체를 보여주었습니다.이 동영상을 시청한 후에는 4개의 뇌와 소뇌에서 절편 배양을 준비하고, 며칠에서 몇 시간에 걸쳐 단일 세포를 반복적으로 이미지화하고, 사후 면역조직화학을 사용하여 이미지 세포의 운명을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이미징 외에도 이러한 슬라이스는 준비된 슬라이스에서 유도성 크림 재조합과 같은 운명 매핑 기술을 사용하면서 세포 환경을 조작할 수 있습니다.

organotypic-slice-cultures-to-study-oligodendrocyte-dynamics

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이것은 피라미드 뉴런에서 전기 레코딩을 만드는 목적 organotypic 문화 neocortical 슬라이스 준비를 준비하고 유지하는 프로토콜입니다.

네크로 텍스의 Organotypic 슬라이스 준비에서 전체 셀 녹음

이 비디오는 세포독성 CD8+ T 세포를 통해 매개되는 뇌세포 사멸을 유도하는 생체 외 기술을 보여줍니다. 뇌 절편을 얻으면 활성화된 희소돌기아교세포 지향 CD8+ T 세포가 절편으로 전달되어 미엘린 수초와 희소돌기아교세포를 표적으로 합니다. 배양 후, 미엘린과 신경 세포 사멸에 대한 손상은 관심 영역에서 조직학적으로 평가할 수 있습니다.

희소돌기아교세포 특이적 CD8+ T 세포를 통해 신경 세포 사멸을 유도하는 생체 외 기술

출처: Kennedy, L. H., et. al. 아데노 관련 바이러스 및 컨포칼 현미경을 사용한 유기형 뇌 절편에서 희소돌기아교세포 소기관의 시각화 및 라이브 이미징. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 유기형 마우스 뇌 절편에서 희소돌기아교세포 미토콘드리아의 이미징을 보여줍니다. 슬라이스는 지속적인 유체 순환과 온도 조절이 가능한 수조 챔버 내부에 배치됩니다. 컨포칼 현미경의 다양한 매개변수를 설정한 후 적색 형광을 가진 미토콘드리아의 타임 랩스 이미지를 캡처한 다음 녹색 형광을 가진 희소돌기아교세포의 Z 스택 이미지를 캡처합니다.

Organotypic Brain Slice Cultures에서 희소돌기아교세포 내 미토콘드리아 운동의 공초점 이미징

염증성 탈수초성 질환의 피질 병변에서 탈수초화 및 신경 세포 사멸의 메커니즘을 다루기 위해 다양한 동물 모델이 사용됩니다. 여기에서는 뇌 절편에 희소돌기아교세포 특이적 CD8+ T 세포를 사용하여 희소돌기아교세포 및 신경세포 사멸을 초래하는 생체 외 접근법을 설명합니다. 모델의 잠재적인 응용 프로그램 및 제한 사항에 대해 설명합니다.

생체 내 급성 뇌 조각의 희소 돌기 아교 세포 지시 T 세포 공격의 모델

여기에서 우리는 Organotypic 슬라이스 문화 기술을 사용하여 해마 출생 후 신경 세포를 연구하는 기술에 대해 설명합니다. 이 방법은 성인 신경의 체외에서 조작이 가능하며 배양 된 해마되는 약물의 직접 적용이 가능합니다.

출생 후 신경 발생의 연구 Organotypic 슬라이스 문화

Organotypic hippocampal 슬라이스 문화 (OHSC) 아주 잘 vivo에서 상황을 시뮬레이션 하는 체 외에서 모델을 나타냅니다. 여기 설명 vibratome 기반 소설 물질의 신경 가능성 또는 종양 세포의 생물학 행동 평가에 사용 하기 위해 고품질 슬라이스를 얻기 위해 프로토콜을 깔 끔 히 개선 합니다.

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 연구 Neuroprotection 및 종양 세포의 침입을 모델로

Myelinating oligodendrocytes는 급속 한 활동 전위 전파 및 신경 생존을 촉진합니다. 여기에 설명 된은 organotypic에 형광 단백질의 oligodendrocyte 특정 식에 대 한 프로토콜 후속 시간 경과 화상 진 찰과 뇌 조각입니다. 또한, 흠 없는 수 초를 시각화에 대 한 간단한 절차 제공 됩니다.

시각화 및 Adeno 관련 바이러스 및 Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 Organotypic 뇌 조각에서 Oligodendrocyte 세포의 라이브 영상

여기 우리 organotypic 슬라이스 문화 마우스 소 뇌 및 myelination와 중앙 신 경계에 remyelination의 메커니즘을 조사 적합 immunohistochemistry에 의해 얼룩 myelin 칼 집에서 준비 하는 방법을 제시.

준비 및 Immunostaining Myelinating Organotypic 소 뇌 조각 문화

ex vivo 슬라이스 분석은 oculomotor 신경 성장을 실시간으로 심상화할 수 있게 합니다. 슬라이스는 E10.5 IslMN:GFP 배아를 아가로오스에 포함시키고, 진동을 슬라이스하고, 스테이지 탑 인큐베이터에서 성장시킴으로써 생성됩니다. 축색 유도 경로의 역할은 배양 배지에 억제제추가에 의해 평가됩니다.

배아 GFP 발현 마우스에서 전 Vivo Oculomotor 슬라이스 배양 Oculomotor 신경 파생의 시간 경과 화상 진찰을 위한

본 명세서에서, 우리는 올리고엔드로시트의 정제 및 공동 배양 실험에 사용될 수 있는 올리고엔드로시테 컨디셔닝 배지의 생산을 위한 효율적인 방법을 전시한다.

공동 문화 실험을 위한 올리고엔드로시테 및 올리고엔드로시테-컨디셔닝 배지 생성

배우세요 조직 슬라이스 배양을 이용하여 NG2 세포와 과수두아교세포의 증식 및 분화 역학을 연구하는 방법입니다. 이 기술은 조직 구조를 유지하면서 세포 환경을 조작할 수 있어 신경발달 및 수초화 연구에 유용합니다.

Organotypic 슬라이스는 문화 희소 돌기 아교 세포 역학 및 수초화을 공부하기

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