Organotypic 슬라이스는 문화 희소 돌기 아교 세포 역학 및 수초화을 공부하기

이 절차의 전반적인 목표는 생체 내에서 발견되는 것과 매우 유사한 환경에서 희소돌기아교세포 계통 세포의 증식 및 분화를 조사하는 것입니다. 이것은 먼저 출생 후 초기 형질전환 마우스에서 4개의 뇌와 소뇌의 절편 배양을 준비함으로써 달성됩니다. 그런 다음 절편의 단일 세포를 몇 시간에서 며칠에 걸쳐 이미지화하여 증식 및 분화의 세포 역학을 시각화합니다.

이미징 후 세포의 사후 면역조직화학을 사용하여 다양한 세포 특성을 결정합니다. 궁극적으로, 결과는 정상적인 조건과 약리학적 또는 유전자 조작 후의 세포 증식 및 분화의 역학을 보여줄 수 있습니다. 해리된 석탄, 뉴런 배양 및 리가 세포 계통 세포와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 슬라이스 배양을 통해 조직 세포 구조를 유지하면서 무세포 환경을 조작할 수 있다는 것입니다.

모든 동물 절차는 지침을 따르고 있으며 해부 최소 2시간 전에 코네티컷 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 각각 6개의 웰 플레이트에 조직 배양 삽입물을 준비합니다. 글쎄, 슬라이스 배양 배지 1 밀리리터를 첨가 한 다음 해부 최소 15 분 전에 5 % 이산화탄소와 함께 섭씨 37 도의 세포 배양 인큐베이터로 플레이트를 옮깁니다.

해부 완충액을 얼음 위에 놓고 산소 95%, 이산화탄소 가스 5%로 거품을 일으키기 시작합니다. 또한 모든 도구와 조직 다지기가 70% 에탄올로 멸균되었는지 확인하십시오. 조직을 얼음처럼 차가운 산소 해부 완충액이 들어 있는 멸균 35mm 접시에 옮깁니다.

다음으로, 면도날을 사용하여 소뇌와 전뇌를 절단하고 반구를 분리하는 전뇌와 소뇌를 절단합니다. 이제 수동 초퍼를 사용하여 4개의 뇌와 소뇌의 300미크론 두께의 관상 및 시상 단면을 만듭니다. 각 동물은 일반적으로 6개의 4개의 뇌 조각과 6개의 소뇌 조각을 산출합니다.

이상적으로는 동일한 슬라이스에서 회백질 영역과 백질 영역을 모두 연구하기 위해 말뭉치의 앞쪽 1/3에 걸쳐 있는 슬라이스를 사용합니다. 분리된 슬라이스를 작은 해부 또는 칭량 주걱을 사용하여 완충액의 얼음 위에 갓 거품이 일고 있는 차가운 해부 버퍼로 옮깁니다. 개별 섹션을 분리하여 사전 배양으로 옮깁니다.

배양 삽입물을 포함하는 6개의 우물 접시. 하나의 배양액에 2-3개의 슬라이스를 배치할 수 있습니다. 배양 표면에서 과도한 해부 버퍼에서 피펫을 삽입합니다.

플레이트가 고정될 때까지 플레이트를 인큐베이터에 삽입하고 옮깁니다. 슬라이스 배지는 슬라이스 준비 후 하루씩 교체해야 하며, 그 다음에는 프로토콜에 명시된 대로 슬라이스 고정까지 격일로 교체해야 합니다. 실험에 따라 5일에서 7일 후에 슬라이스를 사용하십시오.

문화에서. 처음 며칠이 지나면 투명해지는 슬라이스만 사용하고 육안으로 볼 수 있는 고르지 않은 불투명 영역이 있는 슬라이스는 버리십시오. 얼굴 대비에서 이러한 불투명한 영역은 어두운 세포의 덩어리로 나타납니다.

올바르게 수행되면 데드 불투명 영역이 1-5%의 슬라이스에서 발생합니다. NG 2 세포 증식 및 분화에 대한 타임 랩스 이미징을 수행하려면 NG 2 세포에서 EGFP를 발현하는 마우스의 3-5일 된 슬라이스를 사용합니다. 슬라이드가 섭씨 37도 이하로 15분 이상 내려가지 않도록 하십시오.

이미징 세션마다 플레이트를 닫은 상태로 도립 형광 현미경의 10 x 대물렌즈를 사용하여 한 번에 이미지를 캡처합니다. 문화의 포인트. 각 슬라이스의 4-8개 위치를 슬라이스의 회색 물질과 백질 영역에서 모두 이미지화합니다.

또한 재배치 목적을 위해 슬라이스의 가장자리, 특정 세포 또는 백질 관의 방향과 같은 유용한 랜드마크를 이미지화합니다. 이전 시점 이미지는 NG 2 세포 분열 및 희소돌기아교세포 분화를 위한 재배치 중 참조 이미지로 사용할 수 있습니다. 이상적으로는 5-7일 동안 4-6시간마다 이미지를 캡처합니다.

유도성 마커인 NG 2 cre, ER YFP를 사용하는 경우, 100 나노 몰을 가진 배양액을 이용하여 리포터 발현을 유도한다. 에탄올 리포터 활동에 용해 된 4 개의 하이드 록시 타목시펜은 1-2 일 이내에 나타나야합니다. 고정을 위해 배양 바닥에 1ml의 고정액을 첨가하십시오.

슬라이스 위에 다른 밀리리터를 삽입하고 추가합니다. 고정액을 조각에 직접 분사하지 마십시오. 그렇지 않으면 분리될 수 있습니다. 섭씨 4도에서 30분 동안 조직을 고정한 다음 메스를 사용합니다.

조각이 부착된 멤브레인을 잘라냅니다. 핀셋을 사용하여 PBS가 로드된 24웰 플레이트의 개별 웰로 슬라이스를 조심스럽게 옮깁니다. 다음으로, PBS에서 5%일반 염소 혈청과 0.1% 트리톤 X 100을 함유한 차단 용액이 로드된 두 번째 24웰 플레이트로 슬라이스를 옮깁니다.

실온에서 한 시간 동안 차단 용액에서 배양하도록 합니다. 차단되면 5% NGS의 PBS에 1차 항체가 로드된 플레이트로 슬라이스를 이동합니다. 다음날 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 부화시키십시오.

PBS에서 조각을 씻으십시오. 그런 다음 5% NGS를 가진 PBS에서 2차 항체와 함께 슬라이스를 배양합니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

이전과 같이 PBS를 세 번 더 세척하고 멤브레인이 슬라이드를 향하도록 슬라이스를 장착하여 대물렌즈와 조직 사이에 있지 않도록 합니다. 희소돌기아교세포 분화의 시간적 역학을 분석하기 위해, 여러 날에 걸쳐 P 8 NG 2 크리그 형질전환 마우스의 전뇌 슬라이스 배양물에서 NG 2 세포 분열의 이미지를 얻었고, 122시간 동안 타임 랩스 시퀀스를 촬영했습니다. 분열된 세포의 표현형은 NG2 및 CC 1 항체로 측정하였다.

세포 증식은 또한 세포 증식 마커에 대한 면역조직화학적 염색을 사용하여 평가되었습니다. NG 2 세포의 KI 67 미끼 맵핑은 NG 2 CRE YFP 마우스의 슬라이스에서 CRE 재조합을 유도 한 후 수행되었습니다. 4개의 하이드록시 타목시펜을 첨가한 후 2일.

NG를 발현하는 YFP 리포터는 배양물에서 2개의 양성 세포가 발견되었습니다. 4일 후, 이들 세포의 일부가 CC 1 양성 희소돌기아교세포 세포로 분화했습니다. 성숙한 희소돌기아교세포는 P-L-P-D-S의 소뇌 절편 배양에서 이미지화되었습니다.

붉은 쥐 myelinated Perkin 뉴런이 이러한 배양에 존재했습니다. 반복 이미징은 이러한 슬라이스에서 희소돌기아교구 면역조직화학을 발현하는 수초화 DS red의 첨가를 보여주었고, 이는 미엘린 염기성 단백질의 상당한 발현을 보여주었습니다. 마지막으로, 더 높은 시간 해상도 이미징은 원위 과정에서 약간의 작은 움직임을 가진 안정적인 희소돌기아교세포 세포체를 보여주었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 4개의 뇌와 소뇌에서 절편 배양을 준비하고, 며칠에서 몇 시간에 걸쳐 단일 세포를 반복적으로 이미지화하고, 사후 면역조직화학을 사용하여 이미지 세포의 운명을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이미징 외에도 이러한 슬라이스는 준비된 슬라이스에서 유도성 크림 재조합과 같은 운명 매핑 기술을 사용하면서 세포 환경을 조작할 수 있습니다.