질량 분석에 의해 - 겔 개선 환원 적 β-제거 포괄적 인 O가 연결된과에 대한 설포 글라 이코믹스

이 절차의 전반적인 목표는 Olink 글라이칸을 수확하는 것입니다. 이는 먼저 SDS 페이지로 당단백질을 분리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 관심 당단백질을 함유한 겔 조각을 세척하는 것입니다.

다음으로, olink glycans는 환원적 베타 제거에 의해 방출됩니다. 마지막 단계는 상 분할이 있는 메틸화당 글라이칸입니다. 궁극적으로 perm 메틸화 글라이칸은 구조를 감지하고 존재량을 정량화하기 위해 탠덤 질량 분석법으로 분석됩니다.

고성능 액체 크로마토그래피와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 당사의 방법이 빠른 상 분할에서 메틸화된 글라이칸당 중성과 전하를 띤 글라이칸을 분리한다는 것입니다. 이 방법은 분해된 당단백질에서 방출된 또는 연결된 글라이칸의 포괄적인 특성화를 허용함으로써 글리코 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시작하기 전에 겔 전기영동을 사용하여 당단백질을 분해합니다.

전기영동 후 유리판에 겔을 놓고 깨끗한 메스를 사용하여 관심 영역을 절제하여 OG 글라이칸의 수율을 높입니다. 관심 있는 젤 밴드를 다른 유리판으로 옮기고 조각을 약 2mm 입방체로 자릅니다. 작은 젤 조각을 스테인리스 스틸 마이크로 주걱이 있는 13 x 100mm 나사 상단 유리관으로 옮깁니다.

다음으로, 1mL의 25밀리몰 중탄산암모늄 또는 앰비를 샘플 튜브에 추가합니다. 테프론 라인 나사 상단 캡으로 튜브를 덮은 후 튜브를 튕겨 내용물을 부드럽게 섞은 후 10분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 유리관에서 앰비트를 조심스럽게 제거합니다.

목초지 또는 유리 피펫을 사용하여 유리관에 1ml의 아세토 니트릴을 추가하여 젤 조각을 완전히 덮습니다. 튜브의 뚜껑을 씌운 후 튜브를 튕겨 내용물을 부드럽게 섞은 후 10분 동안 그대로 두십시오. 완료되면 유리관에서 아세토 니트릴을 제거합니다.

밝은 파란색이 제거될 때까지 이전 단계를 반복한 후 에틸 아세테이트 2ml를 추가하고 튜브를 다시 닫습니다. 튜브를 섭씨 4도에서 밤새 교반하면서 끝에서 끝까지 교반합니다. 에틸 아세테이트 세척이 제거되면 2ml의 탈이온수로 3회 세척합니다.

젤 조각이 건조되면 500 밀리몰 수산화나트륨 용액 100 마이크로 리터를 추가합니다. 그리고 얼음 위에서 3-5분 동안 서서 젤이 글리칸 회수를 향상시키는 기본 조건으로 평형을 이루도록 합시다. 그 후, 100 밀리몰 수산화나트륨에 2 몰 나트륨 보로 수소화물 500 마이크로 리터를 첨가하여 100 밀리 몰 수산화 나트륨에 1 몰 나트륨 보로 수소화물의 최종 농도를 얻습니다.

튜브를 부드럽게 혼합한 후 샘플을 섭씨 45도에서 18시간 동안 배양합니다. 배양 첫 1시간 동안은 15분마다 튜브를 부드럽게 섞어줍니다. 베타 제거 반응이 완료되고 튜브를 얼음 위에 놓은 후 10% 아세트산을 천천히 적가합니다.

염기를 중화하려면 아세트산 첨가 사이에 샘플 튜브를 부드럽게 와류로 회전시키고 튜브를 원심 분리하여 기포를 제거하고 필요한 경우 유출을 방지합니다. 작은 유리 기둥을 만들려면 세라믹 커터를 사용하여 목초지 또는 유리 피펫의 끝을 긁어 부러 뜨려 피펫 팁의 테이퍼 길이가 약 1cm가되도록합니다. 유리솜 플러그를 놀린 후 팁 쪽으로 밀어 수지 베드를 지지합니다.

피펫 컬럼을 옷핀으로 고정하고 유리 시험관 위에 놓습니다. 다음으로, 유리솜이 들어있는 빈 피펫을 1 밀리리터의 메탄올과 3 밀리리터의 5 % 아세트산으로 씻으십시오. 소용돌이 치기 후에 Dow X 수소 양이온 교환 수지 5%Acetic 산에 있는 슬러리.

목초지 피펫 컬럼에 1 밀리리터 베드 부피를 생성하기에 충분할 정도로 옮기고, 수지 입자의 출현을 위해 흐름을 확인하는 5 가지 부피의 5 % 아세트산을 사용하여 컬럼을 헹굽니다. 새로운 16 x 125mm 나사 상단 유리관 위에 컬럼을 배치한 후 샘플을 컬럼에 로드합니다. 흐름이 수집되면 최소 3부피의 5% 아세트산을 가진 글라이칸을 동일한 튜브에 용리화합니다.

동결 건조 후 건조된 샘플 튜브에 메탄올에 300마이크로리터의 10% 아세트산을 추가합니다. 와류 후, 섭씨 37도의 질소 흐름 아래에서 증발하여 생성된 트리메틸 베이트를 제거합니다. 재현탁 및 건조 단계를 최소 4회 반복한 후 샘플을 5% 아세트산으로 재구성합니다.

샘플이 평형 C 18 컬럼에 로드되면 13 x 100mm 유리 스크류 캡 튜브로 흐름을 수집합니다. OOG 글라이칸을 3ml의 5% 아세트산으로 동일한 튜브에 용리합니다. 그런 다음 샘플을 동결 건조하여 perm 메틸화를 위한 기본 시약을 준비합니다.

깨끗한 13 x 100mm 유리 나사 상형 튜브에 400마이크로리터의 50% 수산화나트륨을 추가합니다. 그런 다음 동일한 튜브에 800마이크로리터의 무수 메탄올을 추가합니다. 4 밀리리터의 무수 디메틸 설프 산화물과 와류를 첨가하여 흰색 침전물을 생성하십시오.

침전물을 펠릿화하기 위해 600배 G에서 1분 동안 샘플을 원심분리합니다. 상등액을 버리고 펠릿 와류에 무수 디메틸 설프 옥사이드 4 밀리리터를 첨가 한 후 시약은 기본 슬러리가 반투명해질 때까지 4 회 더 반복합니다. 펠릿 염기를 3 밀리리터의 무수 디메틸 설프 산화물에 용해시키고 깨끗한 목초지 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.

다음으로, 200 마이크로 리터의 무수 디메틸 설프 산화물을 건조 된 샘플과 와류에 첨가합니다. 현탁액을 복원하려면 300마이크로리터의 현탁액 염기 슬러리를 샘플에 첨가하고 즉시 100마이크로리터의 ITOM 메탄을 첨가합니다. 테프론을 덧댄 캡으로 튜브를 밀봉하고 소용돌이로 5분 동안 세게 섞습니다.

펌 메틸화 반응을 멈추려면 튜브를 얼음 위에 놓고 5%아세트산 2ml를 첨가하십시오. 볼텍싱 후 용액을 위아래로 5회 피펫팅하여 증발에 의한 ITOM 메탄의 잔류 부피를 줄입니다. 이 시점에서 볼텍싱 및 원심분리 후 샘플에 2ml의 디클로로 메탄을 추가합니다.

상단 수성층을 새로운 13 x 100mm 유리관으로 옮깁니다. 디 클로로 메탄 층의 수성 세척을 반복 한 후, 두 번째 수성상과 제 1 수성 층을 결합한다. 디클로로 메탄 상의 물 세척을 2-3회 반복한 후 디클로로 메탄 상을 깨끗한 목초지 피펫이 있는 깨끗한 유리관으로 옮깁니다.

그런 다음 섭씨 42도의 질소 스트림 아래에서 유기상을 건조시킵니다. C 18 컬럼을 e 평형화하고 그 위에 수성층을 로드한 후. C 18 컬럼을 물로 세척 한 다음 perm 메틸화 황산 O 글리칸을 2 밀리리터의 50 % Aceto 니트릴이 함유 된 새로운 유리관으로 용리화하여 210 °C에서 분당 0.4-0.6 마이크로 리터의 주사기 유속으로 나노 전기 스프레이 소스를 사용하여 적절한 질량 분석기에 직접 주입하여 구문 메틸화 OG 글리칸

이온 트랩 기기의 MSM S 및 다차원 MS에서 충돌 유도 해리에 의한 단편화를 위한 모세관 온도는 ingel reductive beta elimination을 사용하여 소 점액에서 방출된 perm methylated olink glycan 샘플의 30-40% 충돌 에너지 대표 질량 스펙트럼을 적용합니다. 스펙트럼은 폴리 아크릴아미드 겔에서 파생된 폴리 분산 오염 물질에 의해 지배됩니다. 하단 패널은 베타 제거 전에 겔 조각의 에틸 아세테이트 세척이 이 문제를 제거한다는 것을 보여줍니다.

Oinked glycans는 작거나 크게 얇게 썬 젤 조각을 사용하여 Ingel 환원성 베타 제거에 의해 소의 상악 이하 점액에서 방출되었습니다. 작은 겔 조각에서 잉잉된 글라이칸의 회수율은 큰 겔 조각보다 거의 10배 더 컸습니다. 중성 펌 메틸화 글라이칸은 유기 디클로로 메탄 단계에서 회수됩니다.

오닉 펌 메틸화 글라이칸은 정량적으로 물 상태로 분할됩니다. 상 분할 방법의 효율성과 단순성은 시료 처리량과 후속 분석 접근 방식을 크게 용이하게 합니다. nons sulfated perm methylated O glycans는 유기상에서 회수되었고, 모든 perm methylated sul glycans는 수성상에서 회수되었으며, 이는 거의 Isobar sulfated 및 nons sulfated glycans의 식별 및 특성화를 용이하게 합니다.

이러한 글라이칸은 0.1 질량 단위만 다르며 개발 후 상 분할로 두 종을 물리적으로 분리하지 않고는 분리하기 어렵습니다. 이 기술을 통해 조직 샘플, 배양된 세포, 모델 시스템 및 환자 샘플에서 글라이칸 다양성을 철저히 탐색할 수 있었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 gly 단백질에서 방출된 모든 연결된 글라이칸을 성공적으로 손바닥 모양으로 하고 분할하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

SDS 페이지에서 해결됨.