Name: 탠덤 고압 냉동 및 투과 전자 현미경을위한 식물 조직의 빠른 동결 교체 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: 배우세요 고압 냉동 및 빠른 동결 교체를 이용한 식물 세포 초미세 구조 보존 방법을 투과 전자 현미경 관찰에 적용합니다. 이 기술은 기존 화학 고정법보다 아티팩트 형성을 최소화하여 우수한 형태학적 보존을 제공합니다.

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UC 버클리 박사 켄트 맥도날드의 친절과 관용이 크게 감사합니다. 우리는 매우 유용한 제안에 대한 익명의 검토를 부탁드립니다. 버치 스미스 연구소는 테네시 대학에서 창업 자금을 지원합니다.

참고 : QFS 절차는 사용자에 의해 극단적 인 관심과주의를 필요로하고 우리는 해당주의 및 참고 사항 여기에 이​​러한 안전주의 사항을 강조 표시합니다. HPF 실행에 대한 1. 준비 <ol><li> 샘플 준비를 시작하기 전에 제조업체의 지침에 따라 고압 냉장고의 전원을 켭니다. NOTE :이 프로토콜에서 사용 HPF 유닛 Wohlwend 컴팩트 부 02 (도 1a)이며, HPF가 실행되기 전에 시작할 수는 시동 절차 1과 시간 반에 약 걸립니다. <ol><li> Wohlwend 소형 02 고압 냉동고에 전환. <ol><li> &quot;1&quot;을 &quot;0&quot;에서 메인 스위치를 돌려 장비에 전환합니다. </li><li> 시스템에 압축 공기를 해제합니다. </li><li> 기계에 액체 질소를 놓습니다. </li><li> 눌러 &quot;SYSTEM DRY UP&quot;버튼을 누릅니다. </li><li> 30 분 후, &quot;SYSTE을 눌러M DRY UP &quot;버튼을 다시. </li><li> 을 눌러 &quot;ON / OFF&quot;버튼을 악기에 전환합니다. </li><li> &quot;질소&quot;버튼을 누릅니다. </li><li> 버튼 &quot;IN DRIVE&quot;가 이미 켜져있는 경우에도 기계가 20 분 동안 식히십시오. </li><li> 최대 버튼에 불이 &quot;IN DRIVE&quot;. </li><li> 버튼 &quot;IN DRIVE&quot;를 누릅니다. </li><li> &quot;AUTO&quot;버튼을 누릅니다. </li><li> &quot;SYSTEM READY&quot;버튼을 켜집니다. </li><li> 압력 챔버에 온도와 압력 프로브를 삽입하고 핀을 잠그고. </li><li> &quot;JET의 AUTO&quot;버튼을 누릅니다. 원하는 압력 증가 및 온도 저하가 있음이 확인 단계; 기본적으로 시운전. 온도와 압력의 급격한 증가 샤프 방울 (그림 1B) 예상된다. </li><li> 두 개 더 JET주기를 수행하십시오. </li></ol></li></ol></li></ol> Receivi에 대한 2 준비NG 냉동 샘플 <ol><li> 홀더가 완전히 (그림 1C) 적용되도록 액체 질소와 cryovial 홀더를 포함하는 절연 상자를 채우기 (안전 경고 참조). 주 : 액체 질소를 처리 할 때 사용 PPE는 cryogloves 고글을 포함. </li><li> 액체 질소 (그림 1C)에있는 알루미늄 튜브 홀더에 FS 매체를 포함하는 튜브의 적절한 수를 놓습니다. 최대 네 개의 디스크에이 프로토콜을 통해 하나의 샘플을 포함하는 각은 하나의 cryovial에 배치 할 수 있습니다. 참고 : 유리 병이 다이아몬드로 만들어진 학자 및 매우 부드러운 연필 등 뾰족한으로 표시해야합니다. <ol><li> QFS 동안 정착을 위해 아세톤 구에 1 % OSO 4와 0.1 % 우라 닐 아세테이트를 사용합니다. 액체 질소에 냉동 cryovials 및 저장소에 1.5 ㎖를 분취 량을 분배, 대량의 솔루션을 준비합니다. 참고 : OSO 4 우라 닐 아세테이트를 처리하기위한 안전 경고를 따르십시오. 참고 : OSO 4 </suB&gt;와 우라 닐 아세테이트는 위험한 화학 물질 및 폐쇄 발가락 신발, 실험실 코트와 장갑을 포함하여 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하고있는 동안 흄 후드에서 처리되어야한다. NOTE : QFS 용 샘플을 보유하는 데 사용 cryovials은 튜브가 OSO (4)의 누출을 피하기 위해 QFS 동안 밀봉 상태로 유지되도록하여 단단한 O 링을 가져야한다. </li></ol></li><li> 붙여 넣기가 부드럽게 될 때까지 이쑤시개 나 기타 등의 악기 10 % 메탄올의 대략 동일한 볼륨과 빵 효모를 혼합하여 효모 붙여 넣기를 준비합니다. 효모 페이스트 세포 동결 방지제로서 작용하고 캐리어의 시험편 샘플의 주위의 공간을 채우기 위해 사용된다. 페이스트의 양이 샘플의 수에 의존한다; 10 개 이하의 샘플 페이​​스트 (1 ml)을 마이크로 원심 튜브에 혼합 될 수 위해. </li></ol> 샘플의 3 고압 냉동 <ol><li> 공장에서 관심의 잎 (또는 다른 조직)를 제거하고 부드럽게 denta의 조각에 배치리터 왁스 또는 다른 절삭면. 잎에서 샘플을 잘라 2.0 mm 또는 원하는 크기의 펀치를 사용합니다. 포셉 한 쌍의 부드럽게 샘플을 처리하고 가능한 한 신속하게 작동합니다. </li><li> 해부 현미경 협력 형 시험편 캐리어 0.2 mm 측면에서 잎 디스크를 배치하고 효모 페이스트를 완전히 커버. 디스크가 완전히 충전되어 있는지 확인하고, 붙여 넣기는 잘 붓 (그림 2)와 붙여 넣기를 부드럽게 처리하여 홀더의 가장자리 수준입니다. </li><li> 시편 홀더 캐리어를 놓습니다. B 형 표본 캐리어 평평한 표면 아래로 샘플을 커버. 주 : 시편 홀더가 건조하고 상온에서해야한다. </li><li> 시편 홀더에 샘플을 받아 컴퓨터에 삽입하고 1 ~ 2 초에 완료해야합니다 &quot;JET의 AUTO&quot;버튼을 눌러 냉동 사이클을 시작합니다. </li><li> 가능한 한 빨리 작업 기계에서 홀더를 제거하고 SAMP를 들고 팁을 배치르 HPF 기계의 상단에 절연 상자에 액체 질소로. 그들을 진정 액체 질소에 집게 이쌍의 끝을 담가. 참고 : 동결 후, 항공사는 단 액체 질소 냉각 집게로 처리해야합니다. 따뜻한 (실온) 집게는 종종 cryotechniques에서 실패의 원인입니다. </li><li> FS 매체를 포함하는 cryovial를 열고 상자의 측면에 뚜껑을 배치합니다. 액체 질소 냉각 포셉 쌍의 도움으로 부드럽게 디스크가 액체 질소 또는 증기 항상되도록, 시험편 홀더로부터 디스크를 제거. 액체 질소 증기에서 작업 한 사전 냉각 집게 FS 튜브를 잡고 FS 유리 병에 홀더를 배치하는 다른를 사용합니다. 뒷면에있는 FS 유리 병의 뚜껑을 나사. 하지 함정을 유리 병에 액체 질소를 수행합니다. 참고 : QFS에 대한 cryovials에는 액체 질소가 유리 병에 갇혀되지 않도록하기 위해 샘플을 전송. 액체 질소는 온난화와 어떤 trappe 동안 700 배 확대D 액체 질소는이 기간 동안 폭발의 원인이 될 수 있습니다. </li><li> 원하는 모든 샘플이 고정 될 때까지 반복 3.7에 3.1 단계를 반복합니다. 샘플의 동일한 유형을 포함하는 다수의 리프 디스크는 동일한 병에 배치 될 수있다. 시편 홀더 건조 및 동결 실행 사이 실내 온도에 가져해야합니다. 신속하게이 작업을 수행하려면, 타격 드라이어로 가열하고, 터치에 의해 그 온도를 모니터링 할 수 있습니다. </li></ol> 프리즈 교체를위한 준비 (4) <ol><li> 10 분 동안 완전하게 핵 비등 또는 정지 될 때까지 액체 질소에서 알루미늄 히터 블록 젖어. 이 일이 벌어지고있는 동안, FS 챔버 (그림 3)로 사용되는 용기의 바닥에 드라이 아이스 (1-2 ㎝)의 층을 배치합니다. 스티로폼 용기 또는 얼음 양동이 짓 눌린 드라이 아이스 펠렛 (pellet)와 함께 FS 사용할 수 있습니다. </li><li> 신속 히터 블록의 중간 행에 온도 프로브와 함께 샘플을 함유 cryovials 삽입. 반드시 그의 뚜껑FS 미디어 FS 중에 누출되지 않도록 병 나사로 단단히 조여된다. 온도를 기록 시작합니다. <ol><li> 이 튜브의 바닥에 닿을 수 있도록 cryovial의 상단을 통해 열전대를 배치하여 온도 프로브를 확인. 수지 튜브의 뚜껑을되도록 액체가 밖으로 누출 봉쇄. 각 QFS 실행의 시작 부분에 1.5 ㎖의 아세톤 튜브를 입력합니다. </li></ol></li><li> 절연 cryogloves 또는 큰 집게를 사용하여, 히터 블록으로부터 모든 액체 질소를 부어. cryovials을 부어 않도록주의하십시오. 주 : 액체 질소를 처리 할 때 사용 PPE는 cryogloves 고글을 포함. </li><li> QFS 챔버에서 드라이 아이스 층 상 튜브를 함유하는 블록을 놓는다. 블록은 튜브가 수평으로 누워되도록 배치하지만, 약간 위쪽으로 기울기되어 있는지 확인합니다. 올바른 cryovials를 사용하는 경우 누설이 없어야합니다. </li><li> FS 튜브가 적용되도록 그것을 할 필요가 없습니다 만, 드라이 아이스와 함께 QFS 챔버 팩블록의 상단을 포함한다. 챔버의 뚜껑을 놓습니다. </li></ol> 5 빠른 FS 참고 : OSO 4의 누설이 실수로 다른 예방 조치에도 불구하고 발생하는 이벤트에 흄 후드에서 QFS 실행을 수행합니다. <ol><li> 흄 후드 플랫폼 회전 진탕 QFS 챔버를 놓고 120 분 동안 125 rpm으로 회전합니다. 이 때 블록의 온도는 약 -80 ° C로 서서히 증가한다. 교반 더 나은 FS에 대한 구성 요소의 혼합을 보장합니다. 참고 : 흄 후드에서 통하고 흄 후드 도어의 위치의 배치는 QFS 절차를 통해 샘플의 일관된 온난화를 확인하기 위해 실행할 때마다 QFS에 대해 동일해야합니다. </li><li> 챔버에서 드라이 아이스를 제거하고 다른 시간 진탕 계속합니다. 참고 : 온도가 -15 ° C에서 -20 ° C로 증가 할 전망이다. </li><li> QFS 실에서 샘플 및 온도 프로브를 제거하고에 배치또 10 ~ 15 분 동안 실온에서 진탕, 때까지 실온에 도달한다. 온도 기록을 중지합니다. </li><li> FS 동안, HPF 기계의 전원을 끄십시오. <ol><li> HPF 기계 질소로 충전되는 동안, 액체 질소 탱크의 수돗물습니다. </li><li> &quot;질소&quot;버튼을 누릅니다. </li><li> 빨간색 &quot;PISTON DOWN&quot;빛이 소멸 될 때까지 기다립니다. </li><li> &quot;ON / OFF&quot;버튼을 누릅니다. </li><li> 눌러 &quot;SYSTEM DRY UP&quot;버튼을 누릅니다. </li><li> 기계에 압축 공기의 공급을 차단. </li><li> 12 시간의 최소 후 (습기의 건조를 보장하는) &quot;0&quot;에서 &quot;1&quot;부터 메인 스위치를 켜서 시스템을 해제. </li></ol></li></ol> 6 포스트 FS 처리 <ol><li> 조심스럽게 유독성 폐기물에 대한 적절한 용기에 플라스틱 전송 피펫과 장소 FS의 용지를 제거합니다. NOTE : OSO 4 및 우라 닐 아세테이트는 위험한 화학 물질폐쇄 발가락 신발, 실험실 코트와 장갑을 포함하여 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용 한 상태와 흄 후드에서 처리되어야한다. </li><li> 워시 샘플 100 % 아세톤 네 번. 처음 두 세척을 수집하고 유독성 폐기물 용기에 넣습니다. </li><li> 미세 핀셋을 사용하여, 홀더로부터 조직 샘플을 제거한다. 이 작업이 완료 될 때 아세톤으로 젖은 샘플을 유지하고 파괴 샘플을 피하기 위해 매우 조심스럽게 작동합니다. 참고 : 그것은 드문 일이 아니다 그것은 실제로 효모 붙여 넣기이 시점에서 멀리 샘플에서 가을이 유용​​ 할 수 있습니다. 잎 조직은 여전히​​ 녹색 동안 효모 페이스트는 일반적으로 매우 어두운 갈색이다. </li><li> 아세톤을 함유 cryovials에서 샘플을 수집합니다. 일반적인 프로토콜에 따라 TEM에 대한 샘플 준비 (침투 및 포함)를 진행합니다. </li></ol>

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여기에 제시된 프로토콜의 성공은 사용자에 크게 의존한다. 첫째, 고급 준비가 필요한 모든 재료가 쉽게 사용할 수 전체 HPF-QFS 실행을 완료 할 수있는 충분한 양에 있는지 확인해야합니다. 둘째, 따라서 사용자는 조직의 고유 상태의 변경을 최소화 시료 처리를 최소화하는 효율적인 방식으로 공정 간 이동 단계에서 신속하게 작동한다. 샘플은 동결하고 탈수되기 전에주의를 실수로 예를 들어, 샘플을 가열 할 수있는 모든 처리를하지 않도록주의해야합니다 그래서 장갑을 낀 손 대신 사전 냉각 집게로 처리, 그들은 차가운 유지하는 것이 필수적입니다되면. 속도와 프로토콜에 익숙한 효율 증가, 그래서 실제로 실행은 관심의 하나의 샘플을 수정하기 전에하는 것이 좋습니다. 셋째, 사용자는 FS 매체뿐만 아니라, 액체 질소와 드라이 아이스 작업의 위험에 사용되는 화학 물질의 위험에주의를 유지해야. 흄 후드는 FS 매체의 제조 및 QFS 절차 필요하다. 다른 모든 단계는, 장갑, 실험실 코트를 포함하여 필요한 개인 보호 장비, 폐쇄 - 발가락 신발과 ...

세포 미세 구조에 대한 지식은 몇 나노 미터 (1)의 범위에서 상세 해결할 수 전자 현미경, 주로 온다. 샘플 준비 시간과 노력이 많이 소요된다고 프로토콜을 필요로하며, 실천에서 약간의 전문 지식을 필요로 해상도 TEM에 강력에도 불구하고, 사용자 친화적으로 간주되지 않습니다. 샘플의 전통적인 고정 수지에 삽입 한 후 다음 중금속 묻 얇은 섹션을 생산하는 단면, 탈수가 포함되어 추가 처리 전에 알데히드 및​​ 산화 오스뮴의 사용을 결합했다. 그러나, 화학 고정 궁극적 여러 셀룰러 구획이 멤브레인에 영향을주는 단백질 응집 및 지질 (1)의 손실, 및 변화를 포함 아티팩트를 생성 할 수 있다고 알려져있다. 이러한 아티팩트는 주로 상온 3, 4, 5로 고정 및 탈수 느린 레이트에 기인한다. 7. HPF가 감소, 20도에서 물의 빙점을 낮추는 얼음 결정의 핵 생성 및 성장을 느리게 및 세포 성분이 본질적 6 고정화되도록 생물학적 샘플에서 물의 점도를 증가 시킨다는 것이다 밀리 초 단위로 매우 높은 압력 (210 MPA는 또는 2100 줄)에서 액체 질소의 그것과 샘플의 온도. 제대로 완료되면 HPF 세포 미세 구조에 큰 손상을 일으킬 수 있습니다 대형 얼음 결정의 형성을 방지 할 수 있습니다. HPF는 생체 (7)의 전형적인 용질 농도로 100-200 μm의 두께의 샘플을 고정하기 위해 사용될 수있다. HPF, 예를 들어 1, 7, 8을 기본 수많은 물리학에 대한 리뷰와 원칙이 있습니다. HPF 후, 샘플은 -90 낮은 온도에서 (-78.5 ° C를 배양일반적으로 몇 일 동안 산화 오스뮴과 같은 액체의 유기 용매를 함유하는 화학 고정 제의 존재 하에서 C) # 176. 이 저온에서, 샘플은 물, 유기 용매, 통상적으로 아세톤, 메탄올 또는 1, (9)에 의해 대체된다. 따라서,이 프로세스가 호출 동결 치환 (FS). 샘플을 서서히 가온하고이 시간 동안 보통 산화 오스뮴과 우라 닐 아세테이트 (9), 고정된다. 저온에서 가교 결합을 고정화 한 분자를 고정하는 장점을 갖는다. FS 따라서이 개선 된 미세 보존 결과 특히 실온에서 기존의 화학 고정에 의해 고정와 비교 우수한 품질, 항원을 더 잘 보존 샘플을 생산하고 언 바운드 세포 성분 10, 11의 손실을 감소시켰다. 대부분의 FS는 일반적으로 몇 일까지 장기간에 걸쳐 수행된다. 이것은 특히 TRU 인식물 시료 12, 13, 14에 대한 전자. 맥도날드와 웹이 개발 한 최신 프로토콜은 크게 몇 시간 15 몇 일에서 FS의 시간을 줄일 수 있습니다. 슈퍼 빠른 FS에서 (SQFS) 샘플 90 분 안에 처리되는 동안 자신의 빠른 동결 치환 (QFS) 절차에서는 FS는 3 시간에 걸쳐 실시된다. 이러한 방법에 의해 생산 된 샘플의 품질은 전통적인 FS 프로토콜에 의해 수득 된 것과 대등하다. 우리는 HPF 후 식물 시료의 하류 처리 QFS 프로토콜을 채택했다. QFS 및 SQFS 대신에 비용이 많이 드는 시판 FS 기계의 일반적인 실험 장비를 사용할 때이 시간뿐만 아니라 돈뿐만 아니라 저장 입증되었습니다. 식물 조직은 종종 TEM을 준비하는 것은 매우 도전이다. 평균적으로, 식물 세포는 세균이나 동물의 세포 하나보다 큰. 소수성 왁스 표피 두꺼운 셀 벽, 유기산, 가수 분해 및 페놀 C를 함유하는 큰 물이 채워진 액포의 존재ompounds 즉 전체 세포 부피 (16)의 90 %까지 점유 할 수 있고, 통기 공간의 존재는 심각한 시스템 (17)의 열 전도성을 감소시킨다. 또한, 식물의 경우, 샘플 두께는 거의 항상 20 μm의 화학적 고정의 사용 한계를 초과한다. 이러한 두께에서, 물의 낮은 열전도율은 시료의 중심에 동결 속도보다 더 -10,000 ° C / sec의 방지한다. 즉, 환율을 손상 육각형 얼음 형성 (낮은 밀도의 얼음 결정 및보다 큰 10-15 나노 미터)를 방지하기 위해 필요 8. 이와 함께 샘플 및 후속 FS 모두 적절한 동결 이러한 본 과제. 그럼에도 불구하고, cryofixation 식물 샘플을 고정하기위한 가장 좋은 방법입니다. 여기에서 식물 조직 샘플의 HPF-QFS위한 프로토콜이 제시된다. 이 모델 종 애기 장대에 초점을 맞추고, 또한 Nicotiana의 benthamiana와 함께 사용되어왔다. 전형적인 결과는 HPF-QFS는 SA를 생성 입증짧은 시간에 전통 HPF-FS에 필적하는 품질의 mples. 적절한 조정으로,이 프로토콜은 또한 다른 비교적 두꺼운 생물학적 시료에 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Wohlwend HPF Compact 02 고압 동결 기계</td><td>Technotrade International, Inc</td><td>HPF02</td><td>동결 및 압력 곡선을 표시하는 통합 오실로스코프 포함; 디스플레이에는 PC(포함되지 않음)가 필요합니다&nbsp; 동결 매개 변수</td></tr><tr><td>DN 3 x 0.5 mm 알루미늄 apecimen 캐리어 홀더</td><td>Technotrade International, Inc</td><td>290</td><td></td></tr><tr><td>시편 캐리어, P = 1,000, DN 3 x 0.5 알루미늄, 유형 A</td><td>Technotrade International, Inc</td><td>241-200</td><td></td></tr><tr><td>시편 캐리어, P = 1,000, DN 3 x 0.5 알루미늄, B</td><td>타입 Technotrade International, Inc</td><td>242-200</td><td></td></tr><tr><td>스토리지 듀어 20.5 L, MVE 밀레니엄 2000 XC20</td><td>차트</td><td></td><td></td></tr><tr><td>베이커 효모</td><td></td><td></td><td>과도한 가스 (CO2) 생산을 피하기 위해 오래된 것보다 좋습니다</td></tr><tr><td>이봉</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>열전대 데이터 로거 EL-USB-TC</td><td>OMEGA Engineering Inc.</td><td>옴-엘-USB-TC&nbsp;</td><td>교체용 배터리는 별도로 구매해야 합니다</td></tr>.<tr><td>온도 프로브</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>34505</td><td></td></tr><tr><td>히터 블록 12/13mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>로터리 셰이커</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-402-10</td><td></td></tr><tr><td>리프 펀치 - Harris Uni-core 2.00</td><td>Ted-Pella Inc.</td><td>15076</td><td></td></tr><tr><td>핑크 치과 왁스</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72660</td><td></td></tr><tr><td>극저온 바이알 2ml</td><td>전자 현미경 과학</td><td>61802-02</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>블로우 드라</td><td></td><td></td><td></td></tr>이 <tr><td>아이스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>집게</td><td>여러 쌍</td></tr></tbody></table>

탠덤 고압 냉동 및 투과 전자 현미경을위한 식물 조직의 빠른 동결 교체

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

1940의 투과 전자 현미경 (TEM)이 생물학적 물질의 초 고해상도 이미지로 생물을 제공하고 있기 때문이다. 그러나 때문에 또한 잡티 무료 샘플의 준비 경험을 요구 힘들고 시간이 많이 소요되는 프로토콜로, TEM은 사용자 친화적 인 기술로 간주되지 않습니다. TEM 용 샘플 준비 전통적인 셀룰러 구조를 보존하는 화학 고정 제를 사용했다. 고압 동결시켜 세포 미세 구조의 완전성에 불리하다 얼음 형성을 제한하는 매우 빠른 냉각 속도를 생성하기 위해 높은 압력 하에서 생물학적 시료의 cryofixation이다. 고압 냉동 동결 치환은 현재 TEM에 대한 수지 부분에서 최고 품질의 형태를 생산하는 선택의 방법이 있습니다. 이러한 방법은 일반적으로 얇은 부분의 TEM에 대한 기존의 처리와 관련된 유물을 최소화 할 수 있습니다. cryofixation 후 샘플에 얼어 붙은 물이 액체로 대체된다낮은 온도에서 유기 용매, 공정은 동결 치환했다. 동결 대체는 일반적으로 전용, 비용이 많이 드는 장비 며칠 동안 실시한다. 최근의 혁신 대신 보통 이틀, 처리 3 시간에 완료 될 수있다. 이것은 일반적으로 침투와 단면 전에 에폭시 수지에 삽입을 포함 샘플 준비의 더 몇 일 뒤에. 여기에서 우리는 식물 샘플 고정이 시간 내에서 수행 할 수 있도록 고압 동결 빠른 동결 대체를 결합하는 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 쉽게 다른 조직 또는 유기체 작업에 적용 할 수 있습니다. 식물 조직 때문에 물이 얼음이없는 동결을 방해 화난 공간과 물이 채워진 공포의 존재의 특별한 관심사이다. 또한, 화학 물질의 정착 과정은 조직 내 깊은 곳으로 화학 물질의 침투를 방해 셀 벽으로 인해 공장에서 특히 길다. 식물 조직 따라서 partic 아르ularly 도전,이 프로토콜은 신뢰성과 최고 품질의 샘플을 생산하고 있지만.

아래에 제시 결과 HPF에 대한 Wohlwend 소형 02 (그림 1A)를 사용하여 얻어졌다. 이 기기의 하나의 중요한 이점은 표본 담체 및 그 소유자의 사용의 용이함이다. 다른기구를 사용할 때, 맥도날드 두 사용자가 다른 동결을 수행하고 FS에 전송 9 cryovials 동안 샘플을 준비하는 샘플 준비 및 HPF 번을 수행 할 것을 권장한다. 그러나 Wohlwend 캐리어 홀더가 단일 사용자가 독립적으로 (도 2A, B, E, F 및 G)를 조작하기에 충분한 쉽다 견본. 그것은 하나의 몇 가지 시험을 수행해야하지만 언급 가치있는 샘플을 사용하기 전에 HPF 악기에 익숙해 실행해야합니다. 숙련 된 사용자는 시간에 (10 이상) 몇 가지 샘플을 고정 할 수 있어야한다. 그러나,이 프로토콜에 제시된 원리들은 시판 HPF 기계 중 하나로 사용될 수있다. 아마도HPF-QFS 절차의 가장 중요한 부분은 표...

고품질 투과 전자 현미경 이미지를 얻는 것은 특히 물이 채워진 큰 액포와 폭기 공간이 풍부한 식물 세포의 경우 어렵습니다. 직렬 고압 동결 및 급속 동결 대체는 TEM을 위한 식물 샘플의 준비 시간을 크게 단축하는 동시에 탁월한 초구조 보존력을 가진 샘플을 생성합니다.

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

다음 실험의 전반적인 목표는 투과 전자 현미경에 의한 후속 시각화를 위해 고압, 동결 및 급속 동결 치환으로 식물 세포의 세포 구조를 고정시키는 것입니다. 이는 고압 동결 중에 조직이 최소한으로 손상되도록 동결 방지제로 코딩하여 동결을 위해 조직 샘플을 신중하게 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 샘플을 고압에서 빠르게 동결하여 세포 구성 요소를 고정시키고 결정질 얼음의 형성을 제한하여 형태가 손상되지 않은 세포를 만듭니다.다음으로 세포수를 유기 용매로 대체하고 사산화오스뮴과 같은 정착제를 도입하여 세포 초구조를 연결하고 안정화하기 위해 빠른 자유 치환이 수행됩니다. 투과 전자 현미경을 기반으로 고압 동결 및 급속 동결 대체가 식물 세포 구조와 형태를 효과적으로 보존한다는 결과를 얻었습니다. 기존의 화학적 고정과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 H-P-F-Q-F-S가 밀리초 단위로 세포 내용물을 고정시켜 인공물 형성을 최소화한다는 것입니다.일반적으로 QFS 프로토콜은 초보자에게 까다롭기 때문에 사용자가 절차에 익숙해질 때까지 두 사람이 함께 작업하는 것이 좋습니다. 액체 질소를 취급할 때는 항상 크라이오 장갑 및 고글을 포함한 개인 보호 장비를 착용해야 합니다. 급속 동결 치환 또는 QFS 중 고정 사용은 아세톤에 1%오스뮴, 테트록사이드 및 0.1%소변기 아세테이트입니다.모든 안전 경고에 따라 많은 양의 용액을 준비한 후 1.5ml의 분취액을 극저온 바이알에 분배하고 액체 질소에 냉동 보관합니다. 동결 치환 또는 FS 매체를 포함하는 라벨이 부착된 극저온 바이알을 액체 질소의 두 홀더인 알루미늄에 적절하게 놓습니다. 이 프로토콜을 사용하면 각각 단일 샘플이 포함된 최대 4개의 디스크를 샘플 준비 약 1-1시간 30분 전에 단일 바이알에 넣을 수 있습니다.고압 냉동고의 전원을 켜고 실행할 준비를 해야 합니다. 이 프로토콜은 또한 시료 주위의 공간을 채우기 위한 세포 외 동결 보호제로서 효모 페이스트를 필요로 합니다. 표본 캐리어에 페이스트가 부드러워질 때까지 이쑤시개를 사용하여 대략 같은 부피의 10% 메탄올이 있는 빵 효모를 섞습니다.팬케이크 믹스의 일관성으로 필요한 페이스트의 양은 10개 이하의 샘플에 대한 샘플 수에 따라 다르며 페이스트는 마이크로 원심분리기 튜브에 혼합될 수 있습니다. 고압 냉동 또는 HPF를 위한 샘플을 준비하려면 식물에서 관심 있는 잎을 제거하고 치과 왁스 조각이

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Biology

생물학

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