Name: 효율적인위한 킬러 인공 항원 제시 세포 (KaAPC) 체외 인간의 항원 특이 T 세포의 고갈 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-11T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 학습하세요 킬러 인공 항원 제시 세포(KaAPC)를 생성하여 체외에서 항원 특이 T 세포를 선택적으로 고갈시키는 방법을. 이 기술은 자가면역 질환 치료를 위한 세포 면역요법에 활용됩니다.

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이 작품은 독일 연구 재단 (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (CS) 및 KFO 146 (MF)에 의해 지원 된 국방 보조금 PC의 DOD 부서 040,972 (MO)와 국립 보건 연구소는 RO1 CA108835은 부여 , RO1 Ai44129 (JPS)

HLA-A2-IG 기반 KaAPC의 1 세대 <ol><li> 멸균 붕산 버퍼를 준비합니다. 물에 붕산의 0.1 M 솔루션을 확인하고 7.0으로 pH를 조정합니다. 무균 필터 (0.22 μm의) 버퍼와 4 ° C에서 보관. </li><li> 멸균 비드 세척 버퍼를 준비합니다. 마그네슘과 칼슘없이 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)를 사용합니다. 3 % 최종 농도에 대한 인간 AB 혈청을 추가합니다. 2 mM의 최종 농도에 대한 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 추가합니다. 0.01 % 최종 농도에 아 지드 화 나트륨 (NaN의 3)를 추가합니다. 무균 필터 (0.22 μm의) 버퍼와 4 ° C에서 보관. </li><li> 멸균에 재고 에폭시 구슬 (약 100 × 10 6 구슬)의 250 μl를 전송, 최고 유리 병을 조입니다. </li><li> 붕산 버퍼의 250 μl를 추가합니다. </li><li> 자석에 유리 병을 넣어 구슬이 2 분 동안 부착 할 수; 흡인은 버퍼 자석에서 유리 병을 제거합니다. </li><li> 1 ㎖의 붕산 버퍼로 한번 구슬을 씻으십시오. </li><li> 0.018 μg의 550 μL로 재현 탁 비즈/ ㎖ HLA-A2-IG 및 3.64 μg / ml의 항 - 인간 CD95 단클론 항체 (클론 CH11) 부드럽게 흔들어 섞는다. (자세한 내용은 설명 절을 참조하십시오.) </li><li> 24 시간 동안 4 ° C에서, 말을 통해 회 전자 끝에 유리 병을 품어. </li><li> 2 분 동안 300 XG에 구슬을 스핀 다운. </li><li> 2 분 동안 자석에 유리 병을 놓고 "KaAPC 로딩 솔루션을"대기음; 자석에서 유리 병을 제거 비드 세척 버퍼의 1 mL를 넣고 흔들어 조심스럽게 재현 탁. </li><li> 단계를 반복 1.10 배. </li><li> 1 ml의 비드 세척 버퍼에서 24 시간 동안 4 ° C에서 회 전자에 유리 병을 품어. 이 시점에서, 결합 부위의 모든 잔여 단백질 비드 세척 버퍼에 포함 인간 AB 혈청에 의해 차단 될 것이다. </li><li> 2 분 동안 300 XG에 구슬을 스핀 다운. </li><li> 장소 유리는 2 분, 흡인 비드 세척 버퍼위한 자석에 유리 병; 자석에서 유리 병을 제거하고 PBS 1 ㎖의 솔루션을 교체합니다. </li></ol> 2 품질 관리, 펩타이드로드, W애싱, 저장 및 KaAPC의 안정성 <ol><li> FACS 튜브에 1.5 × 10 5 KaAPC를 전송하고 FACS 버퍼를 씻어 1 ㎖로 씻는다. </li><li> 버퍼 및 검출 및 항 - 마우스 IgM 항체 FITC (클론 R6-60.2의 1 μL (HLA-A2-IG의 Fc 부분의 검출) 항 - 마우스의 IgG1 PE의 1 μl를 추가 워시 100 ㎕의 FACS에서 재현 탁 비즈 항 사람 CD95 단클론 항체). </li><li> 버퍼 및 유동 세포 계측법에 의해 염색을 읽을 씻어 250 ㎕의 FACS 1 FACS 버퍼를 씻어 ml의 재현 탁 씻어, 4 ° C에서 15 분 동안 품어. </li></ol><img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" width="500"> 프로토콜 섹션에서 언급 한 바와 같이 만든 KaAPC 배치의 그림 1 QC 얼룩은. 염색은 안티 - 인간 CD95 반면, 2 HLA-A2-IG는 안티 - 마우스의 IgG1 PE 단클론 항체를 사용하여 검출 된 프로토콜 절에 설명 된대로 수행 하였다 (안티는 Fas)는 (자체 프로토콜을 참조 항 - 마우스 IgM 항체-FITC 항체로 검출되었다ction의 2.2) (파란 선). 채워진 검은 색 그래프는 각각 항 - 마우스-IgG1의 PE 단클론 항체 또는 항 - 마우스 IgM 항체 FITC 항체로 염색 빈 구슬을 나타냅니다. 오른쪽 상단 모서리에있는 숫자는 평균 형광 강도 (MFI)를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="4"><li> 새로운 멸균 유리 병에 펩타이드로드 전송 20 × 10 6 KaAPC를 들어, 2 분 동안 자석에 배치, 5㎍을 펩타이드와 500 ㎕의 신선한 PBS로 흡인 PBS 및 재현 탁 비즈 (명심 만 HLA-A2 제한 펩타이드는 것 이량에 바인딩!). </li><li> 스토어는 HLA-A2-IG 이량 체 상에 충분한 펩타이드 로딩을​​ 할 수 있도록 최소한 3 일 동안 사용할 때까지 4 ° C에서 KaAPC로드. </li><li> 사용하기 직전에, 1.14에 표시된대로 KaAPC로드 펩타이드를 씻어; 이 단계에서 적어도 6 배를 반복합니다. 참고 :이 무료 펩타이드 t이 있는지 확인하는 중요한 단계이다O 위양성 죽이는 결과를 피하기 위해 완전히 제거; 잔류 자유 펩티드 항원 특이적인 T 세포 배양 9에서 아폽토시스를 유도하는 것으로 나타났다. 가용성 펩타이드의 효과를 배제하기 위해,로드 펩타이드의 상층 액을 제어 샘플을 실행하고 KaAPC을 (3.8 참조) 세척 하였다. </li><li> 혈구를 사용하여 구슬을 세어 펩타이드 농도의 날짜, 이름과 레이블을 붙입니다. 참고 :로드 KaAPC 적어도 한 달 동안 4 ° C에서 작동 남아있다. 일개월 후, 동일한 펩타이드와 재로드는 KaAPC는 일년까지 활용 될 수 있습니다. </li></ol> 3 KaAPC 체외 죽이는 분석 <ol><li> 공동 문화 매체를 준비합니다. 3 % 기증자자가 플라즈마 (실험실 6 제) 3 % ​​T 세포 성장 인자 보충 완료 RPMI 매체를 준비합니다. 기증자자가 혈장을 사용할 수없는 경우, 열 불 활성화 된 인간 AB 혈청을 사용합니다. </li><li> AnnexinV 바인딩 버퍼 준비를 준비합니다. 8.12 g 염화나트륨 (NaCl) 및 0.12 g의 석회질을 녹여990 ML의 DDH 2에 윰 클로라이드 (염화칼슘) 10 ㎖의 1M HEPES 버퍼를 O.Add. </li><li> 인간 항원 특이적인 T 세포를 생성한다. (자세한 프로토콜의 인공 항원 제시 세포 (AAPC)를 이용 이전 게시 7 참조). 그 펩타이드 특이 사량 염색에 의해 결정 적어도&gt; 75 % 있는지 확인하십시오. </li><li> 가습 인큐베이터에서 48 시간 동안 KaAPC 1 비율로 37 ℃에서 각 샘플에 대해 2 × 105 항원 특이적인 T 세포 / 웰 (96 웰 둥근 바닥 플레이트의) 하나의 공동 - 배양액 200 μL의 부화 C, 5 % CO 2. </li><li> 수확 샘플 및 FACS 튜브로 전송; , 1 ㎖의 AnnexinV 결합 버퍼로 씻어 5 분 동안 300 XG에 스핀 다운, AnnexinV 결합 완충액 100 ㎕에 뜨는에 resuspend 폐기 </li><li> 1 μL AnnexinV FITC와 실온에서 10 ~ 15 분 동안 5 μL 7-AAD와 얼룩 샘플, 1 ml의 AnnexinV 결합 버퍼로 씻어; 5 분 동안 300 XG에 스핀 다운 뜨는 폐기250 ㎕의 AnnexinV 바인딩 버퍼의 개발에 resuspend </li><li> 흐름에 즉시 샘플을 사이토 읽어보십시오. </li><li> KaAPC에 의해 항원 특이적인 살해를 결정하기 위해 다음과 같은 샘플을 준비 : T 세포 만; + T 세포 용해 안티 CD95; T 세포는 KaAPC 언로드 +; + T 세포에 비 - 동족 펩티드 KaAPC로드; T 세포 + 동족 펩티드 KaAPC로드; 동족 펩티드의 T 세포 상등액 + KaAPC를 적재했다. </li></ol><img alt="그림이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" width="500"> ., CMVpp65 특정 T 세포 (~ 80 %)와 1 비율 수확 이후 AnnexinV 염색 : 그림 2 KaAPC 죽이는 분석 펩타이드는 1에서 48 시간 동안 배양 KaAPC 또는 제어 구슬 (HLA-A2-IG는 구슬) 하였다로드 및 요오드화 프로피 듐 (PI)는. 유동 세포 계측법 (참조 프로토콜 섹션 3.3-3.7)에 의해 "동족"세포 사멸을 결정이어야합니다 "비 동족"CMVpp65와 함께로드 구슬을 의미합니다마트-1 펩티드로드 광고. 숫자는 각 플롯의 왼쪽 사분면 가능한 T 세포의 비율을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="9"><li> , 십자형 실험을 수행하는 두 개의 다른 특이성의 항원 특이적인 T 세포를 생성한다. </li><li> 또한 이종의 T 세포 집단에서 T 세포의 항원 특이적인 제거의 동시 분석 KaAPC의 항원 특이 플리 능력을 평가한다. (자세한 프로토콜의 쉬츠 외를 참조하십시오. 10). </li></ol>

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</ol>

CS와 MF는 공개 아무것도 없어. NexImmune와 존스 홉킨스 대학, 박사 부부 사이의 라이선스 계약에 따라. Schneck 및 Oelke는이 문서에서 설명 AAPC 제품의 판매에 대학에서받은 로열티 주에받을 수 있습니다. 또한 대학의 정책에 따라 특정 제한 사항이 적용됩니다 NexImmune 주식을 소유. 박사 Schneck 회사 &quot;의 이사회 및 과학 자문위원회의 일원이다.이 배열의 조항은이자 정책의 충돌에 따라 존스 홉킨스 대학에 의해 관리되고있다.

프로토콜에서 가장 중요한 단계는 신호 1 (펩타이드 MHC)와 신호 2 (안티는 Fas 항체)의 적절한 비율을 보장하는 것입니다. 우리는 신호 1 및 2에 대한 완벽한 비율을 정의하는 데 집중 적정 실험을 수행 한; 인한 HLA-A2 IG 이합체 또는 안티는 Fas 항체 농도 차이에 최소한의 변형 KaAPC의 기능을 방해 할 수있는 것이 분명하게되었다. 따라서, 두 신호의 농도는 항상 확인해야합니다 두 단백질의 품질은 자주가 상용 소스에서 주문 된 경우에도 테스트해야합니다. 다른 검출법은 다른 농도이 있으므로 또한, 농도는 항상 동일한 분석에 의해 결정되어야한다. HLA-A2-IG의 기능은 불완전한 폴딩 및 / 또는 비효율적 인 펩타이드 로딩에 손상 될 수 있습니다. 또한 다이머 분자는 단백질의 기능적 활성에 영향을 미칠 수있는 다른 각도에 모을 수있다. 따라서 ACTU이량 체의 알 금액이 다를 수 있습니다 기능 및 특정 KaAPC의 생성에 필요한. 또한, 우리는 KaAPC에 신호 방지는 Fas 항체를 유도하는 죽음에 대한 이상적인 범위는 매우 엄격한 것으로 나타났습니다. 우리의 손의 양에서 큰 3.64 ㎍ / ㎖의 아래 금액은 복용량에 따라 감소 살인 활동 결과 동안 ML의 Fas 긍정적 인 T 세포의 비 특정 살인으로 이어질 / 3.64 μg. 이러한 조건이 아주 꽉 보이지만, 이러한 세부 사항에주의는 기능과 특정 KaAPC이 발생 할 수 있습니다. 현재 KaAPC 표현형은 순진하거나 휴식 항원 특이 T 세포를 대상으로 활성화 된 항원 특이 T 세포, 초기 실험의 고갈에 대한 기능이지만이 인구와 Fas 발현을 감소 항원 특이적인 면역 세포 사멸의 유의 한 유도를 입증하지 않습니다. 따라서, 하나 만들어 놓을 수 있도록 T 세포 휴식의 FA에 상향 조절을 유도 KaAPC에 동시 자극 신호를 가산 상상할 수도KaAPC의 대상으로. 이 가능하지만 세 가지 신호를주의 깊게 기능 KaAPC 표현형을 보장하기 위해 적정해야합니다. 생체 적합성 또는 생분해 성 매트릭스에 비드 플랫폼을 조정하면 생체 적용에 KaAPC을 향상시킬 것입니다. 최근 쉔 등은. KaAPC가 -TRP2 11 B 안티는 Fas (복제 Jo2) 및 안티 그의 / H2-K에 결합 5 μm의 라텍스 구슬을 이용하여 생체 사용의 성공을보고했다. 우리는 인공 항원 제시 세포 (AAPC)의 일반적인 개념이 성공적으로 나노 크기의 입자 (12)에 크기 μm의에서 전송 될 수 있으며, 해당 기능이 입자 형상 (13)에 의해 영향을 받는다는 보여줄 수 있었다. 따라서, 크기 및 / 또는 미래 KaAPC의 모양을 변화시켜 하나의 장기 특정자가 면역 질환의 성공적인 치료를위한 열쇠가 될 수있는 생체 내 기능과 생체 분포에 영향을 미칠 수있을 디자인입니다. 경화증이, 내가 더 증가의 적용 범위를 확장 할 것입니다 분자뿐만 아니라 새로운자가 면역 관련 항원의 지속적인 식별을 이량 체 추가 HLA 클래스의 개발이 확인 된 KaAPC. 또 하나는 동시에 여러 항원을 대상으로 서로 다른 항원에 지시 KaAPC를 사용하여 생각할 수있다. 요약하면, KaAPC는 유연한 플랫폼을위한 기술을 나타내는tigen 특정 T 세포 고갈. 그들의 "레고 같은"자연은 확대하고 시험관 및 생체 적용에 자신의 후속을 향상시킬 수있는 다양한 행렬에 같은 PD1 또는 TRAIL 등의 추가 공동 자극하거나 억제 신호와 같은 새로운 신호를 포함 할 수 있습니다. 우리는 본원 KaAPC, 상이한 특이성을 가진 T 세포 혼합물로부터 항원 특이적인 T 세포의 제거를위한 제 비드 기반 접근법을 생성하는 단계별 프로토콜을 제시한다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" width="500"> 그림 3은 KaAPC는 항원 특이적인 방식으로 CTL을 제거하는 일에의 Fas + 이펙터 메모리 CTL 활성화 PKH26 표지와 혼합하여 동일한 기증자 CMVpp65 특정 CTL PKH67가 표지 :. CMVpp65 KaAPC 1 비율과 공 배양 48 시간 동안. 제어 문화 언로드 KaAPC 또는 1 μg / ml로 처리 하였다의 용해 방지는 Fas-단클론 항체 (클론 CH11). 가능한 세포의 손실을 최소화 처리되지 않은 혼합 CTL 문화 (T 믹스)에서 산출 된 것입니다. T 믹스의 각 CTL 인구에 대한 원본 FACS 데이터가 표시됩니다. 이전 두 T 세포 집단 (10) 상에 별도의 게이팅이 공표 한 세포 사멸을 분석 하였다. 왼쪽 상단 사분면에 묘사 된 숫자는 전체 세포의 %를 나타냅니다. 보여주는 그림은 3 개의 독립적 인 실험에서 대표 한 실험에서 파생됩니다. 이 연구는 원래 혈액에 출판되었다​​. . 쉬츠, C. 외 킬러 인위적인 항원 제시 세포 : 신규 한 전략이 특정 T 세포를 제거하는 피.. 2008, 111, 3546-52. 저작권 혈액의 미국 사회. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

지난 20 년간 많은 진전이자가 면역 질환의 발병 기전을 이해에서했다. 그러나, 가장 일반적인 치료는 여전히 스테로이드뿐만 아니라 퓨린 유사체와 같은 면역 억제제, 알킬화제 및 칼시 뉴린 억제제 하나에 의존한다. 이러한 약물의 사용은 크게 환자의 예후를 개선했다 아직 처리 기본적인 면역 오작동의 치료법을 제공하지 않는다. 또한, 환자는 감염 및 암의 발생에 취약해진다. 따라서, T 세포 매개자가 면역 질환 및 동종 이식 거부 반응의 치료를위한 궁극적 인 목표는 구체적으로, 동시에, 그대로과 면역 질환 싸울 유능한 나머지 면역 체계를 유지하면서 T 세포를 일으키는 유일한 질환을 대상으로하는 것이다. 살린 항원 제시 세포 (APC)는 말초 T 세포 반응을 억제하는 치료제로 제 빠르면 설명한여러 그룹에 의해 1970 년대. 다음 많은 셀 기반 접근법이 개발 되었기 때문에 (쉬츠 외. 2에서 검토). 면역 세포가자가 면역, 동종 이식 거부 반응 및 만성 감염의 치료를위한 치료 가능성을 나타내는 유망한 결과를 켰을 때의 FasL 발현 킬러-APC 사용하는 전략. 그러나, 궁극적으로 임상 적용 가능성을 제한 FasL의 킬러-APC를 활용 전략에 상당한 제한이있다; APC의 (ⅰ) 세대 분리는 시간, 노동 집약적 비용 (II) 혈구 감소증에서 인해 면역 억제로 고통받는 환자는 제한 금액과 세포의 품질을 제공 (III) 등이 높은에서 FasL의 결과로 세포 사멸 유도 신호에 코팅 또는 APC의 전달 가변 표현형 및 (ⅳ) 킬러-APC 결과적으로 그들의 치료 가능성을 감소 T 세포의 효과기 기능을 세포 독성에 민감하다. 따라서, 정의 재현성 킬러-APC의 pheno을 보장하기 어렵다생체 내에서 T 세포 반응의 항원 특이 변조에 이용 될 수있는 타입. 킬러-APC 3-5 인공 항원 제시 세포 (AAPC)를 표현 FasL의 우리의 이전의 연구를 바탕으로 6,7 우리는 자동 반응성 T 세포의 항원 특이적인 억제 또는 제거에 대한 비드 기반 접근 방식 (KaAPC)을 개발 체외. KaAPC는 HLA-A2-IG 이량 체 (신호 1) 공유 4.5 μm의 상자성 라텍스 구슬의 표면에 고정화 방지는 Fas 항체 (세포 사멸 유도 신호)로 구성되어 있습니다. 그들은 항원 특이적인 방법으로 다수의 특이성 T 세포 배양에서의 Fas / FasL의 중재 방식으로 항원 특이적인 T 세포를 고갈 및 활성화 유도 세포사 (AICD) 경로의 독립적. 타겟팅 T 세포에서 농도 의존적 사멸 이미 30 분 후에 8 빠르게 유도된다. KaAPC 용이하게 제어 된 방식으로 생성 될 수는 선반 phenot 오프 정의 확보YPE 셀 기반 공핍 전략의 단점의 대부분을 극복. 따라서, KaAPC는 T 세포 특정 치료 전략의 분야를 발전, T 세포 매개자가 면역 질환 및 이식 거부 반응의 치료에 큰 잠재력을 표시합니다.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Human AB serum</td><td>Atlanta biologicals</td><td>S40110</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>M-450 에폭시비즈</td><td>Invitrogen/Dynal</td><td>14011</td><td></td></tr><tr><td>MPC-1 자석</td><td>Invitrogen/Dynal</td><td>12001D</td><td></td></tr><tr><td>스크류 탑 유리 바이알</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-338AA</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD95 (clone CH11)</td><td>Milliore</td><td>05-201</td><td></td></tr><tr><td>HLA-A2-Ig dimer</td><td>BD/Pharmingen 551263</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryo-tube 2 ml</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse IgG1 PE</td><td>BD/ Pharmingen</td><td>559320</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 IgM FITC</td><td>BD / Pharmingen</td><td>553408</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Merck</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Sigma / Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>cellgro / Mediatech</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>gibco / life technologies</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>96-well Round 바닥판</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>AnnexinV FITC</td><td>PromoKine</td><td>PK-CA577-1001-1000</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD/Pharmingen</td><td>51-68981E</td><td></td></tr><tr><td>FACS 튜브</td><td>Falcon</td><td>352008</td><td></td></tr></tbody></table>

효율적인위한 킬러 인공 항원 제시 세포 (kaapc) 체외 인간의 항원 특이 t 세포의 고갈

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

T 세포 매개 된자가 면역 질환의 치료 전류는 감염 또는 악성 종양을 제어하는​​ 능력의 감소로 장기적으로, 부작용을 동반 글로벌 면역의 전략에 주로 의존한다. 따라서, 새로운 접근법은 질병 표적 세포 매개 그대로 남아 면역 체계를 남겨이 개발 될 필요가있다. 지난 10 년간 세포 면역 요법 전략 다양한 T 세포 매개 성 면역 반응이 개발되었다 변조. 이러한 방법의 대부분은 허용 오차를 유발하는 항원 제시 세포 (APC)에 의존하고있다. 그러나, 기술적으로 어렵고 복잡 할뿐만 아니라, 그러한 셀 기반 접근법은 치료 용량을 제한 세포 독성 T 세포 반응에 매우 민감하다. 여기서 우리는 재를 남기고 병적 T 세포의 고갈을 허용 비 셀룰러 킬러 인공 항원 제시 세포의 세대 (KaAPC)에 대한 프로토콜을 제시maining 면역 체계의 손길이 닿지 않은 및 기능. KaAPC는 항원 특정 방식으로 바람직하지 않은 T 세포 반응을 조절함으로써 면역 질환 및 이식 거부의 치료에 잠재적 인 세포 면역 요법을 갖는 대안이다.

이 프로토콜의 특징은 셀 기반 방식에 비해 도포에 의해 변경되지 않는 동시에 HLA-A2-IG (신호 1)와 안티는 Fas 항체 (세포 사멸 신호)를, 표시 KaAPC 표현형의 정의 생성을 포함 또는 전달 효능 및 쉽게 제작 (그림 1) 중 변조 할 수 있습니다. 또한, KaAPC은 T 세포의 세포 독성 이펙터 기능에 민감하지 않으며 그들의 기능 시험관 조작에 전후자가 항원 제시 세포의 품질에 의존하지 않는다. KaAPC 비는 동족 KaAPC이 T 세포 (도 2)이 소모하지 않을 로딩 동안, 동족의 펩티드와 함께로드 될 때 시험 관내에서 항원 특이적인 T 세포를 파괴 할 수있다. 따라서 KaAPC은 항원 특이적인 방식으로 T 세포의 사멸을 유도한다. 다음으로, 우리는 서로 다른 T 세포 SPE의 혼합물로부터 항원 특이적인 T 세포를 선택적으로 고갈 KaAPC 위해 사용최소한의 세포 독성 이웃 T 세포로 누출되는 것을 보여 cificities (그림 3). 따라서 KaAPC은자가 면역 질환 및 이식 거부의 치료를위한 잠재적 임상 적용 가능성을 가진 인간 활성화 항원 특이적인 T 세포의 시험 관내 항원 특이 고갈위한 정교한 도구를 나타낸다.

지침을 제시 세포 킬러 인공 항원의 생성을 위해 제시되고, KaAPC 인간 항원 특이적인 T 세포의 생체 외 고갈과 항원에 T 세포 - 매개자가 면역 질환의 치료를위한 세포 면역 요법에 대한 대안을위한 효율적인 도구 나머지 면역 체계를 손상시키지 않고 특정 패션.

효율적인위한 킬러 인공 항원 제시 세포 (KaAPC) 체외 인간의 항원 특이 T 세포의 고갈

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

이 실험의 전반적인 목표는 자가 반응성 또는 원치 않는 T 세포 집단의 고갈을 위해 비세포 HLA IG 기반 킬러 인공 항원 제시 세포 또는 K-A-A-P-C를 생성하는 것입니다. 이는 HLA IG 분자와 Antifa 단클론 항체를 세포 크기의 철 덱스트란 입자에 먼저 공유 연결함으로써 달성되며, 두 번째 단계에서 K-A-A-P-C는 적절한 기능을 보장하기 위해 유세포 분석을 특징으로 합니다. 다음으로, K-A-A-P-C에는 원치 않는 항원 특이적 T 세포 집단을 표적으로 하는 다양한 관심 펩타이드가 로드됩니다.궁극적으로, 유세포 분석을 수행하여 동족 물질이 적재된 T 세포의 항원 특이적 항지방 매개 사멸을 측정할 수 있습니다. 카-아-파-씨. 우리는 세포 기반 킬러 항원 제시 세포를 개발하는 과정에서 문제가 발생하면서 동시에 비트 기반 플랫폼을 개발하면서 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 면역 세포 조절 기술 먼저 K-A-A-P-C를 생성하려면 스톡에서 250마이크로리터의 에폭시 비드와 새로 준비된 붕산염 완충액 250마이크로리터를 멸균 스크류 탑 유리 바이알에 추가합니다.바이알을 자석에 올려 2분 후에 비드가 부착되도록 하고 버퍼를 흡인하고 자석에서 바이알을 제거합니다. 또 다른 밀리리터의 보어 8 버퍼로 비드를 한 번 세척한 다음 550마이크로리터의 HLA A 2 IG 및 안티-휴먼 CD 95 MAB에 재현탁합니다. 바이알을 부드럽게 흔들어 비드와 항체를 혼합한 다음 24시간 동안 섭씨 4도의 회전체에서 비드를 배양합니다.다음 날, 300G과 실온에서 2분 동안 비드를 회전시키고 바이알을 자석에 다시 놓습니다. 2분 후 로딩 버퍼를 흡인합니다. 자석에서 바이알을 제거하고 조심스럽게 흔들면서 1ml의 세척 버퍼로 비드를 씻습니다.세 번째 세척 후 1ml의 새 비드 세척 버퍼에 바이알을 넣어 잔류 단백질 결합 부위를 차단합니다. 다음 날, 구슬을 다시 돌리고 바이알을 자석에 다시 놓습니다. 2분 후 세척 버퍼를 흡입합니다.자석에서 바이알을 제거하고 KAPC에 PBS 1ml를 추가합니다. 구슬의 품질을 확인하려면 K-A-A-P-C의 1.5 번 10을 팩스 튜브에 넣고 1 밀리리터의 팩스 세척 버퍼 Resus로 세척하십시오. 비드 펠릿을 100 microlit의 세척 버퍼에 현탁시키고 1 μl의 anti mouse IgG, 1 PE, HLA A, 2 IG 및 anti mouse IG MFI TC를 검출하기 위해 1 μl를 첨가하여 anti-human CD 95 MAB를 검출합니다.그런 다음 섭씨 4도에서 15분 배양 후 1ml의 팩스 세척 버퍼 Resus로 비드를 세척합니다. 250마이크로리터의 세척 버퍼에 현탁시키고 펩타이드 로딩을 위해 유세포 분석기에서 샘플을 판독합니다. K-A-A-P-C를 10번에서 7번까지 두 번 새 멸균 유리 바이알에 넣습니다.그런 다음 비드를 자석에 2분 동안 놓은 후 PBS를 흡인하고 5마이크로그램의 펩타이드가 포함된 500마이크로리터의 새 PBS에 비드를 재현탁합니다. 바이알에 날짜와 로드된 펩타이드의 이름인 K-A-A-P-C를 표시합니다. 그런 다음 로드된 K-A-A-P-C를 섭씨 4도에서 최소 3일 동안 보관하여 A-K-A-A-P-C in vitro killing assay를 수행하기 위해 HLA A 2 IG 이량체에 충분한 펩타이드를 로딩합니다.모든 유리 펩타이드를 제거하기 위해 시연된 대로 K-A-A-P-C가 로드된 펩타이드를 최소 6회 세척합니다. 그런 다음 K-A-A-P-C와 2회 10회에서 5회 항원 특이적 T 세포를 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 48시간 배양 후 1:1 비율로 200마이크로리터의 공동 배양 배지에 있는 96웰 원형 바닥 플레이트의 샘플당 하나의 웰로 전달합니다. 샘플을 적절한 해당 팩스 튜브로 옮기고 1ml의 nexin five 결합 버퍼로 세척합니다.다음으로, 펠릿을 100 마이크로 리터의 nexin five binding buffer에 재현탁 한 다음 실온에서 nexin five FITC 1 마이크로 리터와 7 a a d 5 마이크로 리터에 샘플을 배양합니다. 10-15분 후, 1ml의 nexin five binding buffer로 샘플을 세척하고 250μl의 nin five binding buffer에 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 즉시 유세포 분석기에서 샘플을 판독합니다.K-A-A-P-C는 HLA A 2 IG 및 Antifa MAB를 동시에 표시하며, 이는 세포 기반 접근 방식에 비해 코딩 또는 형질 도입 효율에 의해 변경되지 않으며 생산 중에 쉽게 조절될 수 있습니다. K-A-A-P-C는 동족 펩타이드가 적재될 때 체외에서 항원 특이적 T 세포를 고갈시킬 수 있는 반면, 비동족 펩타이드가 적재되면 고갈될 수 있습니다. K-A-A-P-C는 T-세포를 고갈시키지 않으므로 K-A-A-P-C는 항원 특이적 방식으로 T세포 자멸사를 유도합니다.그 후, K-A-A-P-C가 서로 다른 T-세포 특이성의 혼합물에서만 항원 특이적 T세포를 선택적으로 고갈시키는 데 사용될 때, 최소한의 세포독성이 이웃 T세포로 누출됩니다. 따라서 K-A-A-P-C는 체외 항원, 인간 활성화 항원 특이적 T 세포의 항원 특이적 고갈을 위한 정교한 도구이며 개발 후 자가면역 질환 및 동종이식 거부 반응 치료에 임상적으로 적용할 수 있습니다. 이 기술은 세포 면역학 분야의 연구자들이 T 세포 매개 자가면역 질환 및 이식 거부 반응의 치료를 위한 새로운 접근 방식을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

killer-artificial-antigen-presenting-cells-kaapc-for-efficient-vitro

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

본 논문은 인간의 말초 혈액 mononuclear 세포의 alloantigen 특정 anergy를 유도하는 간단한 기술을 설명합니다. 기술은 아닌 alloreactive 기증자의 세포를 생성하는 임상 적용할 수 있습니다. 이러한 세포의 주입은 면역 reconstitution를 개선하고 all​​ogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 독성을 줄일 수 있습니다.

공동 stimulatory 신호 봉쇄와 Alloantigen 자극에 의​​해 사람 말초혈 Mononuclear 세포 Alloantigen 특정 Anergy의 유도

유도 및 항원에 특정한 T 세포의 확장을위한 새로운 DC 독립적인 방법을 설명합니다. HLA A2 - IG 기반의 인공 항원 제시 세포 (aAPC)을 효율적으로 다양한 항원 특이성의 CTL 확장 HLA - A2 제한 펩티드와 함께로드됩니다. 이 기술은 CTL 기반 입양 immunotherapy에 대한 잠재력을 보유하고 있습니다.

효율에 대한 HLA - IG 기반 인공 항원 제시 세포 예 생체내</em인간 CTL의> 확장

여기 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 사용하여 대량 T 세포 인구에서 인간의 NKT 세포를 활성화하고 확장하는 방법을 설명합니다. CD1d 기반 aAPC의 사용은 기능 NKT 세포의 높은 숫자를 생성하기위한 표준화 된 방법을 제공한다.

인공 항원은 세포 (aAPC) 중재의 활성화와 자연 킬러 T 세포의 확장을 제시

이 비디오는 항원 펩타이드가 로드된 MHC-Igs 및 항-CD28 항체로 기능화된 자기 나노입자 기반 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 사용하여 희귀 항원 특이적 CD8+ T 세포를 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. aAPC와 항원 펩타이드 표적 T 세포 수용체를 특이적으로 발현하는 CD8+ T 세포의 상호 작용 후 in vitro 확장은 이 CD8+ T 세포 집단의 농축 및 확장을 초래합니다.

항원 특이적 CD8+ T 세포의 나노 입자 기반 농축 및 증식

이 비디오는 종양 항원 특이적 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포의 생체 외 생성 기술을 보여줍니다. 형질전환 RNA를 운반하는 레트로바이러스 벡터는 인터루킨-2가 보충된 배지에서 비장 세포와 혼합되어 T 세포의 생존과 증식을 촉진합니다. 그런 다음 혼합물을 재조합 인간 피브로넥틴 단편으로 코팅된 플레이트로 옮기고 원심분리하여 바이러스와 세포의 융합을 촉진함으로써 RNA가 숙주 게놈에 통합되고 종양 항원을 표적으로 하는 표면 결합 CAR을 생산할 수 있도록 합니다.

종양 특이적 키메라 항원 수용체 T 세포를 생성하기 위한 생체 외 기술

CD19 별 키메라 항원 수용체 (자동차)를 표현하는 T 세포는 우리의 첫번째 인 인간 유전자 치료 시험에서 B-세포 malignancies의 investigational 치료로 주입됩니다. 우리는을 사용하여 T 세포의 유전자 변형을...

임상 신청<em&gt; 잠자는 숲속의 미녀</em유전자 주변과 배꼽 탯줄 혈액에서 T 세포를 수정하는 셀을 제시&gt;과 인공 항원

여기, 우리는 빨리 그리고 reproducibly 생물학적 영감, 생 분해성 유일 항 원 제시 세포 (aAPC) 가변 크기, 모양, 및 T 셀 확장 비보 전 또는 vivo에서 표면 단백질 프레 젠 테이 션을 생성 하는 프로토콜을 제시 .

이방성 고분자 인공 항 원 제시 세포 CD8 + T 세포 활성화의 제조

항 원 특정 T 세포는 특성 또는 그들의 매우 낮은 주파수로 인해 치료에 활용 하기 어렵다. 우리이 세포를 풍부 하 게 항 원 특정 T 세포에 바인딩할 수 있는 자석 입자를 개발 하는 프로토콜을 제공 하는 여기, 그리고 그들에 게 몇 가지 확장 특성 및 치료에 대 한 배.

풍부 하 고 확장 하는 자성 나노 입자와 희귀 한 항 원 특정 T 세포

본 문서에서는 3차원(3D) 흉선 배양 시스템에 의해 종양 항원 특이적 유도 만능 줄기 세포 유래 흉선 이주자(iTE)를 생성하는 새로운 방법을 설명한다. iTE는 증식, 기억 형성 및 종양 억제 능력을 가진 순진한 T 세포와 밀접하게 관련된 T 세포의 균질한 서브세트이다.

뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

본 호는 시험관 내 및 생체 내에서 사용하기 위해 많은 수의 기능성 T 세포를 산출하는 것을 목표로 항원 특이적 CD8 T 세포의 생성및 시험관 내 확장에 대한 프로토콜을 설명합니다.

자가 면역 당뇨병 모델에서 기능 테스트를 위한 항원 특이적 원발성 원발성 T 세포의 고효율 생성

이 문서에서는 OP9/DLL1 공동 배양 시스템을 사용하여 기능성 종양 항원 특이적 유도 만능 줄기 세포 유래 CD8αβ+ 단일 양성 T 세포를 생성하는 방법을 설명한다.

종양 항원 특이적 T 세포의 생성을 위한 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여

학습하세요 킬러 인공 항원 제시 세포(KaAPC)를 생성하여 체외에서 항원 특이 T 세포를 선택적으로 고갈시키는 방법을. 이 기술은 자가면역 질환 치료를 위한 세포 면역요법에 활용됩니다.

효율적인위한 킬러 인공 항원 제시 세포 (KaAPC) 체외 인간의 항원 특이 T 세포의 고갈

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