효율적인위한 킬러 인공 항원 제시 세포 (KaAPC) 체외 인간의 항원 특이 T 세포의 고갈

이 실험의 전반적인 목표는 자가 반응성 또는 원치 않는 T 세포 집단의 고갈을 위해 비세포 HLA IG 기반 킬러 인공 항원 제시 세포 또는 K-A-A-P-C를 생성하는 것입니다. 이는 HLA IG 분자와 Antifa 단클론 항체를 세포 크기의 철 덱스트란 입자에 먼저 공유 연결함으로써 달성되며, 두 번째 단계에서 K-A-A-P-C는 적절한 기능을 보장하기 위해 유세포 분석을 특징으로 합니다. 다음으로, K-A-A-P-C에는 원치 않는 항원 특이적 T 세포 집단을 표적으로 하는 다양한 관심 펩타이드가 로드됩니다.

궁극적으로, 유세포 분석을 수행하여 동족 물질이 적재된 T 세포의 항원 특이적 항지방 매개 사멸을 측정할 수 있습니다. 카-아-파-씨. 우리는 세포 기반 킬러 항원 제시 세포를 개발하는 과정에서 문제가 발생하면서 동시에 비트 기반 플랫폼을 개발하면서 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 면역 세포 조절 기술 먼저 K-A-A-P-C를 생성하려면 스톡에서 250마이크로리터의 에폭시 비드와 새로 준비된 붕산염 완충액 250마이크로리터를 멸균 스크류 탑 유리 바이알에 추가합니다.

바이알을 자석에 올려 2분 후에 비드가 부착되도록 하고 버퍼를 흡인하고 자석에서 바이알을 제거합니다. 또 다른 밀리리터의 보어 8 버퍼로 비드를 한 번 세척한 다음 550마이크로리터의 HLA A 2 IG 및 안티-휴먼 CD 95 MAB에 재현탁합니다. 바이알을 부드럽게 흔들어 비드와 항체를 혼합한 다음 24시간 동안 섭씨 4도의 회전체에서 비드를 배양합니다.

다음 날, 300G과 실온에서 2분 동안 비드를 회전시키고 바이알을 자석에 다시 놓습니다. 2분 후 로딩 버퍼를 흡인합니다. 자석에서 바이알을 제거하고 조심스럽게 흔들면서 1ml의 세척 버퍼로 비드를 씻습니다.

세 번째 세척 후 1ml의 새 비드 세척 버퍼에 바이알을 넣어 잔류 단백질 결합 부위를 차단합니다. 다음 날, 구슬을 다시 돌리고 바이알을 자석에 다시 놓습니다. 2분 후 세척 버퍼를 흡입합니다.

자석에서 바이알을 제거하고 KAPC에 PBS 1ml를 추가합니다. 구슬의 품질을 확인하려면 K-A-A-P-C의 1.5 번 10을 팩스 튜브에 넣고 1 밀리리터의 팩스 세척 버퍼 Resus로 세척하십시오. 비드 펠릿을 100 microlit의 세척 버퍼에 현탁시키고 1 μl의 anti mouse IgG, 1 PE, HLA A, 2 IG 및 anti mouse IG MFI TC를 검출하기 위해 1 μl를 첨가하여 anti-human CD 95 MAB를 검출합니다.

그런 다음 섭씨 4도에서 15분 배양 후 1ml의 팩스 세척 버퍼 Resus로 비드를 세척합니다. 250마이크로리터의 세척 버퍼에 현탁시키고 펩타이드 로딩을 위해 유세포 분석기에서 샘플을 판독합니다. K-A-A-P-C를 10번에서 7번까지 두 번 새 멸균 유리 바이알에 넣습니다.

그런 다음 비드를 자석에 2분 동안 놓은 후 PBS를 흡인하고 5마이크로그램의 펩타이드가 포함된 500마이크로리터의 새 PBS에 비드를 재현탁합니다. 바이알에 날짜와 로드된 펩타이드의 이름인 K-A-A-P-C를 표시합니다. 그런 다음 로드된 K-A-A-P-C를 섭씨 4도에서 최소 3일 동안 보관하여 A-K-A-A-P-C in vitro killing assay를 수행하기 위해 HLA A 2 IG 이량체에 충분한 펩타이드를 로딩합니다.

모든 유리 펩타이드를 제거하기 위해 시연된 대로 K-A-A-P-C가 로드된 펩타이드를 최소 6회 세척합니다. 그런 다음 K-A-A-P-C와 2회 10회에서 5회 항원 특이적 T 세포를 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 48시간 배양 후 1:1 비율로 200마이크로리터의 공동 배양 배지에 있는 96웰 원형 바닥 플레이트의 샘플당 하나의 웰로 전달합니다. 샘플을 적절한 해당 팩스 튜브로 옮기고 1ml의 nexin five 결합 버퍼로 세척합니다.

다음으로, 펠릿을 100 마이크로 리터의 nexin five binding buffer에 재현탁 한 다음 실온에서 nexin five FITC 1 마이크로 리터와 7 a a d 5 마이크로 리터에 샘플을 배양합니다. 10-15분 후, 1ml의 nexin five binding buffer로 샘플을 세척하고 250μl의 nin five binding buffer에 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 즉시 유세포 분석기에서 샘플을 판독합니다.

K-A-A-P-C는 HLA A 2 IG 및 Antifa MAB를 동시에 표시하며, 이는 세포 기반 접근 방식에 비해 코딩 또는 형질 도입 효율에 의해 변경되지 않으며 생산 중에 쉽게 조절될 수 있습니다. K-A-A-P-C는 동족 펩타이드가 적재될 때 체외에서 항원 특이적 T 세포를 고갈시킬 수 있는 반면, 비동족 펩타이드가 적재되면 고갈될 수 있습니다. K-A-A-P-C는 T-세포를 고갈시키지 않으므로 K-A-A-P-C는 항원 특이적 방식으로 T세포 자멸사를 유도합니다.

그 후, K-A-A-P-C가 서로 다른 T-세포 특이성의 혼합물에서만 항원 특이적 T세포를 선택적으로 고갈시키는 데 사용될 때, 최소한의 세포독성이 이웃 T세포로 누출됩니다. 따라서 K-A-A-P-C는 체외 항원, 인간 활성화 항원 특이적 T 세포의 항원 특이적 고갈을 위한 정교한 도구이며 개발 후 자가면역 질환 및 동종이식 거부 반응 치료에 임상적으로 적용할 수 있습니다. 이 기술은 세포 면역학 분야의 연구자들이 T 세포 매개 자가면역 질환 및 이식 거부 반응의 치료를 위한 새로운 접근 방식을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.