쥐과 밸브 내피 세포의 분리

이 절차의 전반적인 목표는 내피 리포터를 사용하여 배아 및 성체 마우스에서 심장 판막, 내피 세포가 풍부한 집단을 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 모든 승모판, 삼첨판, 대동맥 및 폐 심장 판막 첨판을 포함하는 심심실 부위를 주의 깊게 해부함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 일련의 효소 처리로 조직을 처리하여 판막 조직을 해리하고 개별 세포를 방출

이 과정이 아홉 번 반복됩니다. 그런 다음 세포와 파편이 포함된 용액을 필터를 통과시켜 세포 파편이 없는 단일 세포 현탁액을 보장합니다. 마지막 단계는 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 해리된 세포를 분류하고 수집하는 것입니다.

궁극적으로, 충분히 많은 농축 판막 내피 세포 집단을 in vitro 배양 및 분자 분석에 사용할 수 있습니다. 이 접근 방식에서는 마우스에서 심장 판막 내피 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 생체 분자 도구는 마우스 모델에서 잘 확립되어 있습니다.

이를 통해 심장 판막 연구에 사용할 수 있는 확장된 실험 설계 세트를 사용할 수 있습니다. 또한 배아에서 심장 판막 내피 세포를 분리하면 이전에는 실현 불가능했던 발달 연구를 수행할 수 있습니다. 시작하자.

수술 도구는 기구 트레이에 고압멸균하여 완전히 멸균하십시오. 수술 부위는 70% 에탄올을 분사하여 소독해야 합니다. 여기에는 현미경 및 현장에서 접촉할 수 있는 기타 장비가 포함됩니다.

다음 용액은 모두 실험 직전에 준비해야 합니다. 해리 완충액, 분류 완충액 및 배양하는 경우 VEC 배양, 배지 및 GFP 음성 배양 배지. 이러한 각 용액은 0.2 미크론 필터로 멸균해야 하며, 그 후에는 이산화탄소 후에 사용할 때까지 용액을 얼음에 보관해야 합니다.

쥐의 질식, 경추 탈구가 뒤따랐습니다. 박리 가위를 사용하여 흉강을 엽니다. 여기서 마우스는 tie two GFP에 대해 동형접합적이거나 사실 분류에 필요한 연령 일치 음성 대조군입니다.

다음으로 심장과 폐를 노출시킵니다. 그런 다음 집게로 대동맥을 움켜쥐고 몸에서 떼어낸다. 심장을 부분적으로 잠기게 합니다.

접시에 담긴 차가운 HBSS 접시에서 부착된 폐 조직을 제거하여 심장을 해부할 준비를 하려면 샘플을 오염시킬 수 있는 비판막증 내피 세포를 제거하는 것이 중요합니다. 먼저 심실관 고리를 얻으려면 심방을 심장에서 부드럽게 당겨 제거합니다. 다음으로, 면도날을 사용하여 심실을 절단하고 AV 판막 바로 아래를 절단하면 대동맥 부위가 손상되지 않은 상태로 유지되어야 합니다.

다음으로, 이관의 한쪽을 절개하여 링을 열고 겸자를 사용하여 심방심실 판막 구조를 노출시킵니다. 판막 첨판이 노출되도록 심근을 부드럽게 놀립니다. 그들은 심근 위에 조밀한 흰색 조직입니다.

이제 심실 심실 판막이 아직 부착되어 있는 경우 cordi tendai를 부드럽게 분리합니다. 그리고 그 과정에서 반월상 판막 구조를 포함하지 않는 폐동맥과 대동맥벽의 근위부를 제거합니다. ECS가 제거될 수 있으므로 판막 첨판을 손상시키지 않고 남아 있는 심근을 가능한 한 많이 제거합니다.

샘플을 오염시킬 수 있는 판막이 아닌 내피 세포를 제거하기 위해서는 신중한 해부가 중요합니다. 따라서 4개의 판막을 모두 그대로 유지하면서 주변 조직을 최대한 많이 제거하십시오. 마지막으로, 잘라낸 심장 판막 부위를 1.5ml 튜브에 1ml의 차가운 HBSS가 있는 넣고 튜브를 얼음 위에 둡니다.

이 기술을 사용하여 피펫으로 성체 또는 E 14.5 동물의 분리된 판막 조직을 준비합니다. 조직이 있는 튜브에서 HBSS를 제거합니다. 그런 다음 1밀리리터의 해리 완충액과 4마이크로리터의 DNA 1을 다시 추가합니다.

dissociation buffer와 DN의 조직을 섭씨 37도에서 7분 동안 완만하게 회전하며 배양합니다. 7분 후, 세포를 해리하는 데 도움이 되도록 조직을 위아래로 세 번 피펫팅합니다. 약 15초 동안 침전시킨 후 해리된 세포를 포함하는 상층액을 수집합니다.

세포를 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 말 혈청을 첨가하여 15 밀리리터 원뿔형의 콜라겐 분해 효소 반응을 종료합니다. 이것은 첫 번째 수집 부분입니다.

이제 침전 된 조직의 튜브로 돌아가서 해리 완충액과 DNA를 다시 추가하십시오. 절차를 반복하여 두 번째 분수를 수집합니다. 총 9개의 세포 현탁액이 수집될 때까지 이 과정을 계속 반복합니다.

이제 70미크론 나일론 필터를 통해 분획된 모든 컬렉션을 단일 튜브에 전달하여 세포의 파편이 없는 현탁액을 만듭니다. 튜브를 400GS에서 5분 동안 회전시켜 세포를 펠릿으로 수집합니다. 그런 다음 펠릿을 1밀리리터의 분류 버퍼에 다시 현탁시키고 텍스트에서 다루는 팩스로 분석할 수 있을 때까지 얼음 위에 보관하십시오.

프로토콜 세포 배양 및 염색은 또한 타이 투 GFP 형질전환의 텍스트 프로토콜 조직 절편에 의해 다루어집니다. 마우스는 성인에서, E 14.5 배아는 성인에서 수집했습니다. 판막 내피 세포는 내피 마커 CD 31로 확인되었으며 GFP를 coex로 발현하는 것으로 밝혀졌습니다.

E 14.5 배아에서 분리된 동일한 세포. 또한 동시 발현 CD 31 및 GFP 팩스 분석을 통해 성체 및 E 14.5 배아에서 제조된 세포에서 GFP 양성 및 음성 세포 집단을 식별했습니다. 와일드 타입 C 57 블랙 6.

성체 세포는 GFP 양성 세포 집단에서 GFP 매개 변수 유전자 발현을 설정하는 데 사용되었으며 GFP 음성 세포 집단에서 정량적 PCR로 GFP 양성 세포를 비교했습니다. 내피 마커는 높았고 근세포 마커는 매우 낮았습니다. GFP 음성 세포에서.

판막 간질 세포 마커가 높았습니다. 두 세포 집단은 2주 후에 별도로 배양되었습니다. GFP 양성 세포는 형태학을 중심으로 CD 31을 발현했습니다.

대조적으로, GFP 음성 세포는 9일 후에 형태학적으로 중간엽 같은 것을 취했습니다. 이 세포는 또한 개발 후 VIC 마커 알파 SMA를 발현했습니다. 이 기술은 심장 판막 생물학 분야의 연구자들이 생쥐 모델에서 발달 및 질병의 메커니즘을 탐구한 다음 인간 집단으로 번역할 수 있는 길을 열었습니다.