2014년 9월 2일
텔로머라제는 신생아 뇌와 성인 뇌의 뚜렷한 영역에서 발현됩니다. 우리는 마우스 뇌의 다양한 영역에서 텔로머라제 활성을 분석하고 남성과 여성 마우스 뇌 간의 텔로머라제 활성의 차이를 감지하기 위한 무독성 시간 절약 TRAP 분석을 제시합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 정상적인 뇌 조직에서 텔로머라제 활성을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 다양한 뇌 조직에서 추출한 전체 세포 단백질 추출물을 활성 텔로머라제 효소의 공급원으로 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 텔로머라제 활성에 필요한 기질과 뉴클레오티드를 포함하는 특정 텔로머라제 반응 혼합물에 동일한 양의 단백질 추출물을 첨가하는 것입니다.
다음으로, 텔로머라제 반응 생성물을 PCR로 증폭하고 고분해능 aros gel 전기영동으로 분석합니다. 마지막 단계는 aros gel을 고감도 DNA 염색제로 염색하여 증폭된 텔로머라제 반응 생성물을 시각화하는 것이며, 궁극적으로 이 thoma ray의 반복 증폭 프로토콜 분석은 다양한 뇌 조직에서 thoma ray의 활성에 해당하는 6개의 염기쌍 증가, DNA 사다리를 보여줍니다. 방사성 트랩 분석 또는 상용 트랩 분석 키트와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 프로토콜이 상대적으로 시간과 비용 효율적인 대안을 제공한다는 것입니다.
이 방법은 뇌 조직의 활동에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 살아있는 조직이나 세포 배양에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하기 전에 각각 5ml의 링거 용액이 들어 있는 15ml 튜브 3개를 준비합니다. 안락사된 쥐의 뇌를 제거한 후 얼음 위에 튜브를 놓습니다.
뇌 조직의 손상을 방지하기 위해 얼음처럼 차가운 링거 용액으로 몇 초 동안 뇌를 헹굽니다. 수술용 칼을 사용하여 소뇌와 뇌간을 전두엽 피질에서 분리합니다. 다음으로, 뇌간에서 소뇌를 분리한다.
전두엽에서 후각구를 제거하고 전두엽에서 전두엽을 잘라냅니다. 3개의 뇌 영역을 지정된 15밀리리터 튜브에 넣고 각 튜브의 조직을 균질화합니다. 다음으로, 신선한 얼음 차가운 링거 용액을 추가하여 각 튜브에 동일한 부피가 포함되도록 800 회 G에서 7 분 동안 원심 분리기를 제거하고 상층액을 제거하고 100 마이크로 리터의 챕 슬라이스를 추가합니다.
각 튜브에 버퍼를 공급합니다. 1ml 주사기에 용액을 약 10회 통과시키고 21게이지 누들과 얼음에서 30분 동안 배양하여 잘 섞습니다. 30분 후 각 튜브의 내용물을 새 마이크로 원심분리기 튜브에 옮기고 30분 동안 원심분리기
를 합니다.13에, 000배, G는, 새로운 마이크로 분리기 관으로 supinate를 옮깁니다. 이전에 확립된 방법을 사용하여 단백질 농도를 측정한 후 단백질 추출물을 섭씨 영하 80도에서 10마이크로리터의 분취량으로 보관합니다. 단백질 추출물 희석액을 위한 적절한 수의 라벨링된 마이크로 원심분리 튜브와 얼음 위의 다음 용액을 위한 텔로머라제 반응 완충액을 준비하여 프로토콜의 이 부분을 시작합니다.
10 x 트랩 반응 혼합물, DS 프라이머, dn tps, 초순수 및 단백질 추출물은 단백질 추출물의 용액을 마이크로리터당 1마이크로그램의 최종 농도로 희석합니다. 초순수를 사용하여 오염 또는 텔로미어 반응을 방지하기 위해 필터 팁을 사용하여 모든 피펫팅을 수행합니다. 각 샘플에는 여러 샘플에 대해 2마이크로리터의 트랩 믹스, 1마이크로리터의 TS 프라이머, 1마이크로리터의 DN NTP 및 15마이크로리터의 초순수로 구성된 텔로미어 반응 혼합물이 필요합니다.
이 부피에 샘플 수에 1을 더한 값을 곱하고, 각 반응 튜브에 19마이크로리터의 MASE 반응 혼합물을 추가한 다음 1마이크로리터의 희석된 단백질 추출물을 추가합니다. 최종 부피가 20마이크로리터인 경우 반응 튜브를 섭씨 30도로 예열된 수조에 45분 동안 넣습니다. THRES 반응이 끝나기 15분 전에 CX 프라이머, 티타늄 택 버퍼, 초순수 등의 용액을 사용하여 THRES 반응 생성물의 증폭을 준비합니다.
각 샘플에는 여러 샘플에 대해 2.5마이크로리터의 티타늄 테크 버퍼, 1마이크로리터의 CX 프라이머, 2마이크로리터의 초순수 및 0.5마이크로리터의 티타늄 테크 중합효소로 구성된 PCR 반응 혼합물이 필요합니다. 이 부피에 샘플 수와 2를 곱합니다. 각 PCR 튜브에 6마이크로리터의 PCR 반응 혼합물을 추가하고 각 튜브에 메이스 반응과 함께 전체 부피를 추가합니다.
26마이크로리터의 최종 부피의 경우 PCR 열순환기에 PCR 튜브를 삽입하고 섭씨 90도에서 2분 동안 다음 프로그램을 실행한 다음 30초 동안 섭씨 94도의 34회 주기를 실행합니다.섭씨 60도에서 30초, 섭씨 72도에서 45초. 그리고 마지막 2분은 섭씨 72도에서 진행됩니다.
PCR 반응이 완료되면 PCR 산물을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 미니 젤을 주조하기 위해 달걀 장미를 먼저 준비하려면 완충 용액 부피의 2-4배인 비커에 냉각된 TBE 전기영동 완충액 25ml와 교반 막대를 추가하고 교반을 시작합니다. 그런 다음 1.125g의 고해상도 aros 분말을 천천히 뿌립니다.
용액이 빠르게 저어지는 동안 별 막대를 제거합니다. 비커를 플라스틱 랩으로 덮고 환기를 위해 작은 구멍을 뚫습니다. 아그로를 칠 때 아그로스를 완전히 녹이기 위해 끓는점에 도달하는 것이 중요합니다.
생성된 거품이 넘치지 않도록 전자레인지의 비커에 주의를 기울여 주십시오. 전자레인지에 비커를 저전력으로 3분 동안 가열한 후 고출력으로 전환하고 엎지르지 않도록 주의하면서 용액을 짧은 펄스로 가열합니다. 수평 미니 젤 장치에 젤을 던지고 젤이 섭씨 4도에서 20분 동안 겔을 응고시킨 후 실온에서 응고시킵니다.
전기영동에 사용하기 전에 각 레인에 25마이크로리터의 트랩 샘플을 로드하고 겔이 작동하는 동안 섭씨 4도의 냉장실에서 3시간 동안 110볼트로 실행합니다. 0.1 몰 염화나트륨이 함유된 이중 증류수 50밀리리터에 10, 000 x 핵산 염색 원액 15마이크로리터를 첨가하여 3 x 핵산 염색 작업 용액을 준비합니다. 샘플의 전기영동이 완료되면 실온에서 20분 동안 부드럽게 흔들어 겔을 염색합니다.
마지막으로 302나노미터 파장의 UV 트랜스 일루미네이터를 사용합니다. 트랩 사다리를 보기 위해 DNA 밴드 텔로미어 활성은 기존 트랩 분석법과 수정된 트랩 분석 모두에 의해 마우스 뇌 영역에서 감지되었습니다. 텔로미어 DNA 산물의 더 나은 시각화 및 해상도는 DNA ladder의 길이와 강도에서 볼 수 있는 변형된 분석으로 관찰되었습니다.
변형된 트랩 분석법에서 단백질 추출물의 농도 감소를 사용했을 때 텔로미어 DNA 산물의 점진적인 감소가 관찰되었는데, 이는 낮은 농도의 단백질에서 텔로미어 활성을 검출하는 민감도를 시사하며, 생후 1개월 된 암컷 마우스와 수컷 마우스의 3개 뇌 영역에서 변형된 분석에 의한 텔로미어효소 활성의 검출은 유의한 차이를 보이지 않았다. 그러나 생후 3개월 된 생쥐에서는 소뇌에 비해 전두엽과 뇌간에서 더 높은 텔로머라아제 활성이 나타나는데, 이는 DNA 띠의 강도와 DNA 산물 사다리의 길이에 의해 밝혀졌습니다. 쥐가 성인으로 전환되는 동안 토마 레이의 활동은 전두엽에서 증가하고 뇌간과 소뇌에서는 감소합니다.
오메 텔로미어 활동은 또한 암컷의 전두엽에서 더 높은 것으로 보입니다. 남성의 경우 뇌간과 소뇌의 텔로미어 활동이 더 높은 것과는 대조적으로, 이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 6-7시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 선택한 조직에서 토마 활성을 쉽게 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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본 연구는 쥐 뇌 조직에서 텔로머라아제 활성을 분석하기 위한 무독성 TRAP 분석법을 제시합니다. 수컷과 암컷 뇌 간의 텔로머라아제 활성 차이를 강조합니다.
Telomerase activity profiling in brain tissue supports target validation in neurodegenerative disease research by linking enzyme function to neuronal survival and oxidative stress resistance. The non-radioactive TRAP assay enables quantitative, reproducible measurement of telomerase dynamics across brain regions, sex, and age, providing mechanistic de-risking for target engagement studies. This assay facilitates predictive confidence in early discovery by establishing a translatable biomarker pathway for neuroprotective compound screening.
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, enabling telomerase activity as a measurable endpoint in neurotherapeutic development.