Name: 마우스 뇌의 다양한 지역에서 텔로 머라 제 활동 : 비 방사성 텔로 머라 제는 증폭 프로토콜을 반복 (TRAP) 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 배우세요 마우스 뇌 조직에서 텔로머라제 활성을 측정하는 비방사성 TRAP 분석법을. PCR 증폭과 고해상도 겔 전기영동을 활용하여 뇌 영역별 및 성별 차이를 효율적으로 분석하는 방법입니다.

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이 작업은 B.G. Negev 기술과 Linda Powers의 기여로 부분적으로 지원되었습니다.

동물 실험은 벤 구리온 대학 (IL-39-08-2010) 동물 실험 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 1 마우스 뇌 단백질 추출 <ol><li> 각 얼음에 5 ㎖의 링거액과 장소 튜브를 포함하는 15 ㎖를 3 튜브를 준비합니다. </li><li> (주의 - 화학 후드를 사용) 아이소 플루 란 마취를 사용하여 마우스를 희생 자궁 전위 즉시 참수 한 다음 10 ~ 20 초. </li><li> 두개골로부터 뇌를 제거하고 뇌 조직의 손상을 방지 빙냉 링거액으로 몇 초간 린스. </li><li> 수술 블레이드를 사용하여, 전두엽 피질에서 소뇌 (CR) 및 뇌간 (BS)를 분리합니다. 다음으로, 뇌간에서 소뇌를 분리하고 정면 피질 전두엽 (FL)를 잘라; 전두엽에서 후각 망울을 제거합니다. 지정된 15 ml의 튜브에 3 뇌 영역을 배치합니다. </li><li> 각 튜브에서 조직을 균질화. FR 추가환경 안전 보건 차가운 얼음 링어의 솔루션은 각각의 튜브는 X g 800에서 7 분 동안 같은 볼륨 원심 분리기가 포함되어 있습니다. </li><li> 상층 액을 제거하고 각 튜브에 CHAPS 용해 버퍼의 100 μl를 추가합니다. 21 G 바늘을 1 ml의 시린지를 통해 용액을 여러 차례 (~ 10)를 통과시킴으로써, 잘 혼합하고, 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다. </li><li> 13,000 × g으로 30 분 동안 새로운 마이크로 원심 분리 관 및 원심 분리 관에 각각의 내용을 전송. 새로운 마이크로 원심 분리기 튜브에 상청을 전송하고 이전에 설정된 방법을 사용하여 단백질 농도를 결정한다. -80 ° C에서 10 μL의 분취 량의 단백질 추출물을 저장합니다. </li></ol> 인스트루먼트, 반응 솔루션 및 단백질 희석 계산의 2 TRAP 분석 준비 <ol><li> 단백질 추출물의 희석 및 텔로 머라 반응 버퍼 표시된 마이크로 원심 분리기 튜브의 적절한 수를 준비합니다. 오염을 방지하기 위해 필터 정보를 사용하여 프로토콜의 모든 피펫 팅을 수행한다. </li&gt; <li> TRAP 반응 믹스 10 배, TS 프라이머의 dNTP의, UPW 단백질 추출물 (시약 및 시약의 농도에 대한 자료의 표 참조) : 얼음에 다음과 같은 솔루션을 해동. </li><li> 초순수 (UPW)를 이용하여 1 μg / μL의 최종 농도의 단백질 추출물 용액을 희석. </li></ol> 3 텔로 머라 제의 반응 <ol><li> 마이크로 원심 분리기 튜브에 다음을 추가하여 텔로 머라 아제 반응 믹스를 준비 : 2 μL 트랩 믹스 (10 배), 1 ㎕의 TS 프라이머 (0.1 μg), 1 μL의 dNTPs를 (10 mM)을 15 μL의 UPW를. 다수의 샘플의 경우, 샘플 1을 더한 수에 의해, 상기 볼륨을 곱한다. </li><li> 각 반응 관에 반응 믹스 19 μl를 추가하고 20 μL의 최종 볼륨에 대한 각 튜브에 희석 된 단백질 추출물 (1 μg 단백질)의 1 μl를 추가합니다. </li><li> 45 분 동안 30 ° C 예열 수조에서 반응 튜브를 놓습니다. </li></ol> (4) PCR 반응 <ol><li> 다섯 마일ACX 프라이머, 티타늄의 Taq 버퍼, UPW : n은 텔로 머라 아제의 반응이 끝나기 전에, 다음과 같은 솔루션을 해동. </li><li> 2.5 ㎕의 티타늄의 Taq 완충액 (10 배), 1 μL의 ACX 프라이머 (0.1 μg), 2 μL (IC가 사용되는 1 μL) UPW 0.5 μL 티타늄의 Taq 중합 효소 : 마이크로 원심 분리 튜브에 다음을 첨가하여 PCR 반응 혼합물을 준비 (50 배). 다수의 샘플의 경우, 샘플이 플러스의 수에 의해, 상기 볼륨을 곱한다. </li><li> PCR의 6 μl를 각 PCR 튜브에 혼합하고 26 μL의 최종 볼륨에 대한 각 튜브에 텔로 머라 아제 반응 (20 μL)의 전체 볼륨을 추가합니다. </li><li> PCR의 열 자전거 타는 사람에 PCR 튜브를 삽입하고 다음 프로그램을 실행합니다 : - 90 ° C - 2 분. - 94 ° C -. 30 초 * - 60 ° C -. 30 초 * - 72 ° C -. 45 초 * - 72 ° C - 2 분. -20 ° C에서 보관 PCR 제품. * = 34주기 </li></ol> 5 아가로 오스 미니 GE의리터 준비, 샘플을 실행하고, 젤 염색 <ol><li> 25 ㎖의 냉각 된 전기 영동 완충액 (TBE) 및 완충액의 2-4 배 부피 천천히 고해상도 (HR) 아가로 오스 분말 1.125 g의 용액을 급속하게 교반하면서 뿌리고 비이커에 교반 막대를 추가 . 교반 막대를 제거, 환기를위한 작은 구멍에 플라스틱 포장과 피어스와 비커 커버. 다음 3 분 동안 &quot;낮은&quot;전원을 전자 레인지에서 비커를 가열을 &quot;높음&quot;으로 전원 스위치 및 유출의 원인이 될 수 있습니다주의 짧은 펄스에서 솔루션을 가열한다. 가열에 의해 생성 된 거품이 몇 초 후에 큰 기포가되어 사라지면, 아가로 오스가 준비되어 있습니다. </li><li> 젤은 실온에서 응고 후 겔을 사용하기 전에 4 ° C에서 20 분 동안 진정 할 수 있도록 수평 미니 젤 장치에 젤을 캐스팅. </li><li> 25 TRAP 샘플 ㎕의 (20 μL 트랩 PCR 제품과 5 ㎕의 6 배 겔 로딩 염료)와 각 레인을 넣고 11에서 실행4 ° C 차가운 방에서 3 시간 동안 0 V. </li><li> 15 ㎕의 10,000 배 핵산 얼룩, 0.1 M 염화나트륨 (0.29 g)을 50 ㎖의 증류수 (DDW)에 원액을 추가하여 솔루션을 작업 핵산 얼룩 배를 준비합니다. 부드럽게 진탕하면서 20 분 동안 겔을 염색. </li><li> TRAP 사다리 DNA 밴드를 볼 수 302 nm 파장과 자외선 트랜스 일루미네이터를 사용합니다. </li></ol>

<ol><li>Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+telomerase+in+cell+senescence+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis.</a> Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).</li>
<li>Cong, Y., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+human+telomerase+beyond+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Actions of human telomerase beyond telomeres.</a> Cell Res. 18, 725-732 (2008).</li>
<li>Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTichon%2C+A+%22Curr.Mol.+Med%22">Curr.Mol. Med</a>. 13, 1010-1022 (2013).</li>
<li>Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+TERT+associates+to+RNA+granules+in+fully+mature+neurons%3A+Role+in+the+translational+control+of+the+cell+cycle+inhibitor+p15INK4B%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B.</a> PloS one. 8, e66602(2013).</li>
<li>De Jesus, B. B., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+telomerase+activation+in+extending+health+span+and+logevity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Potential of telomerase activation in extending health span and logevity.</a> Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).</li>
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<li>Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+telomerase+activity+and+TERT+expression+during+brain+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice.</a> J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).</li>
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<li>Eitan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Telomerase-increasing+compound+in+mouse+brain+delays+the+onset+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis.</a> EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).</li>
<li>Kim, N. W., Wu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+quantification+and+characterization+of+telomerase+activity+by+the+telomeric+repat+amplification+protocol+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP).</a> Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

PCR 4에서 텔로 머라 제 반응 3) 텔로 머라 제 반응 생성물의 증폭 - 뇌 조직 2)의 특정 영역에서 1) 단백질 추출 텔로 머라 아제에 의해 프라이머 신장 TS : TRAP 분석법을 통해 마우스 뇌에서 텔로 머라 제 활성의 분석은 4 주요 단계로 구성 고해상도 아가 로즈 겔을 사용하는 PCR 제품) 분리. DNA 사다리의 PCR 제품 및 PAGE 분리의 민감한 검출을위한 방사성 dCTP 년대의 사용이 수정 TRAP 분석은 기존의 분석에서 상승의 두 가지 주요 문제를 해결합니다. 고해상도 아가 로스 젤 시퀀싱 PAGE를 다루기 힘든 비교 텔로 머라 제 반응 생성물의 검출 (DNA 사다리)을 단순화한다. 또한, 핵산은 DNA 염색 소량의 검출에 필요한 감도가 높은 무독성 용액이다. 특별한주의는 다음과 같은 중요한 단계 고려되어야한다 : 1) 최소 조직 제거 및 균질화 사이의 시간을 유지하는) 단백질의 무결성이 보존하는 용...

텔로 머라 제는 텔로 머라 이루어지는 리보 역전사 효소 (TERT)의 텔로 머라 제 촉매 서브 유닛, 및 RNA 성분 (TERC)이다. 텔로 머라 제의 표준 역할은 따라서 게놈 무결성 및 세포 증식 일을 촉진, 텔로미어 끝까지 반복 서열 (TTAGGG)을 추가하여 텔로미어의 적절한 길이를 유지하는 것입니다. 그것은 다양한 손상 에이전트 (2)에 의해 유도 된 세포 사멸에 대한 저항성을 부여하는, 즉 추가의 역할은 셀에 TERT에 기인하고, 산화 적 스트레스 (3)로부터 인간 중간 엽 줄기 세포를 보호하고, 긍정적 인 RNA를 TIA1 위해 그 연관에 의해 완전히 분화 ​​된 신경 세포 친 생존 역할 과립 4. 효소 발현과 활동 수준이 단단히 비 분할 세포 5,6 규제하는 동안 TERT는 표현 주로 체세포 분열 세포와 암의 대부분의 유형에서 활동한다. 연구는 연구에 그것을 보여 주었다TERT의 mRNA가 성인 7로 낮은 수준에서 유지하면서 odent 뇌는 텔로 머라 제 활성은 출생 후의 일 10에 의해 감지된다. 다른 연구는 성인 하위 심실 영역, 후각 망울, 해마 내에서 텔로 머라 제 활성을 입증하고, 성인 소뇌 피질 8. , 주입 된 생쥐 SOD1 유전자 변형의 근 위축성 측삭 경화증 질환의 발병 및 진행을 지연 - 우리는 최근 뇌 및 척수에서 텔로 머라 제 발현 및 활성을 증가 신규 화합물은 N-메틸-D-아스파 테이트 (NMDA)의 신경 보호 효과를 발휘한다는 증명 마우스와이 마우스 (9)의 척수 운동 신경 세포의 생존을 증가했다. 완전히 뉴런에서 뇌에서 텔로 머라 제의 친 생존 역할을 이해하기 위해서는 뇌의 여러 지역에서 텔로 머라 제 활성의 검출을위한 간단하고 비교적 빠르고 민감한 분석법을 개발하는 것이 필수적이다. 텔로미어 연구EPEAT 증폭 프로토콜 (TRAP)의 텔로 머라 제 활성의 표준 및 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 조합 한 공지 민감한 분석이다. 이 분석에서, 텔로 머라 제는 TTAGGG는 텔로 머라 제 기질에 TS 역방향 프라이머를 사용하여 6 염기쌍 (BP) DNA 래더 생성 PCR 증폭 하였다 (TS 프라이머), 올리고 뉴클레오티드, 반복 추가 -. ACX 32 P가 표지 된 dCTP의은을 검출하는데 사용된다 PCR 제품의 낮은 양. DNA 시퀀싱은 사다리 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (PAGE)에 의해 해결된다. 두 DNA 밴드의 강도와 DNA 사다리의 길이는 활성 효소 분자의 양 및 그들의 processivity 각각 10을 반영한다. 이것은 전통적인 분석 몇가지 큰 어려움을 가지고 : (밤새 두 경우) 시퀀싱 PAGE 겔 주행의 시간 소비 및 방사성 생성물 막을 노광 처리 할 크고 단단한 방사성 물질에 노출 될 위험. </p&gt; 이 프로토콜은 개선 된 비 방사성 아가 미니 젤 기반의 분석을 제공합니다. DNA 래더 6 BP 4.5 % 고해상도 아가 로스 겔을 이용하여 해결하고 검출은 매우 민감한 핵산 염색을 이용하여 달성된다. 아가 고해상도 미니 겔 민감한 핵산 얼룩을 이용하는 조합은 분석의 취급이 용이 구비 방사능 노출의 위험을 제거하고 크게 몇 시간 삼일부터 전체 검정 시간을 단축.

<table><tbody><tr><td>트랩 믹스 (10x)</td><td></td><td></td> <td>수동으로 제작, UPW에서 다음을 혼합합니다 : 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg / ml BSA, 0.5 % TWEEN (Sigma에서 구입). 부분 표본은 -20 &deg;C에서 동결됩니다.</td></tr><tr><td>Ringer의 용액</td><td></td><td></td><td>수동으로 만든 경우 DDW에서 다음을 혼합하십시오 : 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4&middot; H2O, 2mM MgSO4, 26mM NaHCO3, 1.802g/L D-(+)-포도당 무수.</td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>민라드 INC.</td><td>NDC 60307-110-10</td><td>화학 후드에서 조심스럽게 다루</td></tr>십시오 <tr><td>dNTP(10 mM)</td><td>Sigma</td><td>D7295</td><td></td></tr><tr><td>TS 프라이머(5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3')</td><td></td><td>DRY 형식으로 주문하고 필요한 농도에 따라 UPW를 추가한</td>Sigma <td></td> DNA 올리고</tr><tr><td>ACX 프라이머(5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3')</td><td>DRY</td> 형식으로 주문한 Sigma <td></td><td>DNA 올리고 요구 사항에 따라 UPW를 추가했습니다. 농도</td></tr><tr><td>: Titanium Taq Polymerase / Buffer</td><td>Clontech</td><td>S1792 / S1793</td><td></td></tr><tr><td>고해상도 아가 로스</td><td>Sigma</td><td>A4718</td><td>모든 고품질 고해상도 아가 로스는 sutible</td></tr><tr><td>미니 젤 장치</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4466</td><td></td></tr><tr><td>핵산 염색 (GEL-RED)</td> <td>비오튬</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>IC 프라이머 (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3')</td> DRY 형식으로 주문된 <td>시그마</td><td></td><td>DNA 올리고 및 필요한 농도에 따라 추가된 UPW</td></tr><tr><td>CHAPS 용해 완충액</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>9852S</td> 1mM 초순수(UPW)<td>의 최종 농도에 PMSF(프로테아제 억제제) 추가</td></tr> 생물학 <tr><td></td><td>산업</td><td>01-866-1B</td><td></td></tr><tr><td>CD-1 마우스</td><td>HARLAN Laboratories INC.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 뇌의 다양한 지역에서 텔로 머라 제 활동 : 비 방사성 텔로 머라 제는 증폭 프로토콜을 반복 (trap) 분석

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

텔로 머라 제, 리보은 텔로미어의 길이를 유지하고, 따라서 게놈 무결성, 증식 및 수명을 증진 할 책임이있다. 이러한 뉴런 비 분열, 활성이 높은 세포 생존을 위해 그 중요성이 가능한 제안 또한, 텔로 머라 제는 산화 적 스트레스로부터 미토콘드리아를 보호하고 아폽토시스에 대한 저항성을 부여한다. 우리는 이전에 다양한 마우스 뇌 영역에서 텔로 머라 제 활성 및 발현을 증가하고 산화 적 스트레스로부터 운동 신경 세포를 보호하기 위해 신규 한 텔로 머라 활성제의 능력을 보여 주었다. 이러한 결과는 텔로 머라 다양한 병변에서 뉴런의 보호에 관여한다는 개념을 강화한다. 뇌의 텔로 머라 아제의 역할을 강조하기 위해, 우리는 여기에 남성과 여성의 마우스 뇌의 텔로 머라 아제의 활동과 연령에 대한 의존도를 비교합니다. TRAP 분석은 다양한 조직이나 세포주에서 텔로 머라 제 활성을 검출하기위한 표준 방법이다. 여기에서 우리는 analy을 보여CHAPS를 이용한 단백질 추출을 비 변성에 의한 마우스 뇌의 세 지역에서 텔로 머라 제 활성의 SIS는 표준 TRAP 분석의 변형에 의해 버퍼 용해 하였다. 이 2 단계 분석에서 내인성 텔로 머라 제는 TTAGGG 6 BP 반복보기 (텔로 머라 제 반응)을 첨가하여 텔로 머라 제의 특정 기판 (TS 프라이머)로 뻗어. 텔로 머라 제 반응 생성물 (6) 혈압 증가의 DNA 래더를 생성 PCR 반응에 의해 증폭된다. DNA 래더의 분석은 매우 민감한 핵산 염색 얼룩 이어 4.5 % 고해상도 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 이루어진다. 32 P가 DNA 검출 및 DNA 래더를 해결하기위한 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 위해 방사성 dCTP의 레이블 이용하는 전통적인 TRAP 분석법에 비해,이 프로토콜은 마우스의 뇌에서 텔로 머라 제 활성을 평가하는 능력을 입증위한 TRAP 분석법을 절약 무독성 시간을 구비 telomeras 차이를 검출다양한 여성과 남성 마우스의 뇌 영역에서의 전자 활동.

전체 세포 단백질 추출물은 1과 3 개월의 나이에 3 CD-한 여성과 3 CD-한 수컷 마우스에서 파생 된, 전두엽 (FL), 뇌간 (BS)과 소뇌 (CR)에서 제조 하였다 수정 TRAP 분석 및 방사성 TRAP 분석에 대한 이전 2개월 세의 나이에 3 CD-한 수컷 마우스. 텔로 머라 제 활성은 변형 된 TRAP 분석을 이용하여 1 μg의 단백질들을 추출 검출 및 2 μg 단백질은 방사성 TRAP 분석을 위해 추출 하였다. 방사성 TRAP 분석에 의해 수정 된 TRAP 분석에 의하여 텔로 머라 제 활성의 검출 1C 대 DNA 래더 (도 1a의 길이와 강도로 본 텔로 머라 DNA 제품의 더 나은 시각화 및 해상도가 변경됨 분석으로 관찰되는 것을 알 와 1D). 텔로 머라 DNA 제품의 점진적 감소는 아교 모세포종 U-251 세포주 유래의 단백질 추출물의 농도가 감소 할 때, 관찰 sugge 사용했다단백질의 낮은 농도에서 ...

텔로머라제는 신생아 뇌와 성인 뇌의 뚜렷한 영역에서 발현됩니다. 우리는 마우스 뇌의 다양한 영역에서 텔로머라제 활성을 분석하고 남성과 여성 마우스 뇌 간의 텔로머라제 활성의 차이를 감지하기 위한 무독성 시간 절약 TRAP 분석을 제시합니다.

마우스 뇌의 다양한 지역에서 텔로 머라 제 활동 : 비 방사성 텔로 머라 제는 증폭 프로토콜을 반복 (TRAP) 분석

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

이 절차의 전반적인 목표는 정상적인 뇌 조직에서 텔로머라제 활성을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 다양한 뇌 조직에서 추출한 전체 세포 단백질 추출물을 활성 텔로머라제 효소의 공급원으로 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 텔로머라제 활성에 필요한 기질과 뉴클레오티드를 포함하는 특정 텔로머라제 반응 혼합물에 동일한 양의 단백질 추출물을 첨가하는 것입니다.다음으로, 텔로머라제 반응 생성물을 PCR로 증폭하고 고분해능 aros gel 전기영동으로 분석합니다. 마지막 단계는 aros gel을 고감도 DNA 염색제로 염색하여 증폭된 텔로머라제 반응 생성물을 시각화하는 것이며, 궁극적으로 이 thoma ray의 반복 증폭 프로토콜 분석은 다양한 뇌 조직에서 thoma ray의 활성에 해당하는 6개의 염기쌍 증가, DNA 사다리를 보여줍니다. 방사성 트랩 분석 또는 상용 트랩 분석 키트와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 프로토콜이 상대적으로 시간과 비용 효율적인 대안을 제공한다는 것입니다.이 방법은 뇌 조직의 활동에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 살아있는 조직이나 세포 배양에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하기 전에 각각 5ml의 링거 용액이 들어 있는 15ml 튜브 3개를 준비합니다. 안락사된 쥐의 뇌를 제거한 후 얼음 위에 튜브를 놓습니다.뇌 조직의 손상을 방지하기 위해 얼음처럼 차가운 링거 용액으로 몇 초 동안 뇌를 헹굽니다. 수술용 칼을 사용하여 소뇌와 뇌간을 전두엽 피질에서 분리합니다. 다음으로, 뇌간에서 소뇌를 분리한다.전두엽에서 후각구를 제거하고 전두엽에서 전두엽을 잘라냅니다. 3개의 뇌 영역을 지정된 15밀리리터 튜브에 넣고 각 튜브의 조직을 균질화합니다. 다음으로, 신선한 얼음 차가운 링거 용액을 추가하여 각 튜브에 동일한 부피가 포함되도록 800 회 G에서 7 분 동안 원심 분리기를 제거하고 상층액을 제거하고 100 마이크로 리터의 챕 슬라이스를 추가합니다.각 튜브에 버퍼를 공급합니다. 1ml 주사기에 용액을 약 10회 통과시키고 21게이지 누들과 얼음에서 30분 동안 배양하여 잘 섞습니다. 30분 후 각 튜브의 내용물을 새 마이크로 원심분리기 튜브에 옮기고 30분 동안 원심분리기를 합니다.13에, 000배, G는, 새로운 마이크로 분리기 관으로 supinate를 옮깁니다. 이전에 확립된 방법을 사용하여 단백질 농도를 측정한 후 단백질 추출물을 섭씨 영하 80도에서 10

telomerase-activity-various-regions-mouse-brain-non-radioactive

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

EpiMark 5 HMC 5 - MC 분석 키트는 분석하고 spe cific 로커스 이내 5 methylcytosine 5 - hydroxymethylcytosine을 quantitate하는 데 사용할 수 있습니다. 키트는 β - glucosyltransferase (T4 - BGT)를 이용한 효소 반응을 통해 5 - HMC의 수산기 그룹에 포도당의 추가에 의해 5 - HMC에서 5 - MC를 구별. 5 HMC는 CCGG의 맥락에서 발생하면,이 수정은 아닌 cleavable 사이트에 cleavable MspI 사이트를 변환합니다.

Balb / C 뇌 조직에 높은 민감도는 5 hydroxymethylcytosine 감지

정확하고, 짧은 정교하고 저렴한 방법은 여러 조직과 QRT-PCR을 사용하여 종 텔로미어 길이를 평가하는 것을 설명합니다. 또한, 우리는 텔로미어 길이 보완 백본 시험으로 telomerase의 활동을 평가하는 간단한 분석을 설명합니다.

텔로미어의 길이와 텔로 머라 제 활성을 세포 노화의 음과 양

우리는 라벨 및 신생아 쥐의 유전형과 그들로부터 차의 연결을 문화를 생성하는 절차에 대해 설명합니다. 유전자형은 신속하고 효율적이며 신뢰성 및 자동 핵산 추출 할 수 있습니다. 이 neonatally 치명적인 마우스와 유전자형의 이전 완료를 필요로 그들의 문화에 특히 유용합니다.

동물의 신속한 유전자형은 뇌 신경 세포의 차 문화 구축에 이어

텔로미어와 텔로머라제는 노화와 종양 형성에 필수적인 역할을 합니다. 이 프로토콜의 목표는 두 개의 쥐 유도성 텔로머라제 넉인 대립유전자를 생성하는 방법과 조직 퇴행/재생 및 암 연구에 이를 활용하는 방법을 보여주는 것입니다.

조직의 변성 / 재생 및 암의 연구에서 설치류 유도 성 텔로 머라 대립 유전자를 활용

RNA in situ hybridization (ISH)는 세포와 조직에서 RNA를 시각화할 수 있습니다. 여기에서는 RNAscope ISH와 면역조직화학 또는 조직학적 염료의 조합을 사용하여 마우스와 인간 뇌 섹션에서 축삭돌기에 국한된 mRNA를 검출하는 방법을 보여줍니다.

고해상도를 사용하여 뇌 섹션에서 Axonally 지역화 된 mRNA를 검출<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

인간의 telomerase 역전사 (TERT) telomeric DNA 뿐만 아니라 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동을 통해 이중 가닥 RNA 합성. 여기, 내 생 TERT의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동을 검출 하기 위하여 새로 설립된 된 분석 결과 설명 합니다.

인간의 Telomerase 역전사 단백질의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동의 반 정량적 검출

여기, 선물이 단일 subtelomere에서 MS2 시퀀스 태그를 포함 하는 암 세포 클론을 생성 하는 프로토콜. MS2 GFP 시스템에 의존 하는이 방법은 생 성적표의 telomeric 반복 포함 된 RNA (테라)에서 살아있는 세포에서 단일 telomere 표현의 시각화 수 있습니다.

Telomeric 반복 포함 된 RNA 테라에서 살아있는 세포에서 단일 Telomere 표현 시각화 하 암 세포 클론의 세대

여기서, 우리는 비-랜덤 X 염색체 불 활성화와 함께 실행 가능한 여성 뮤 린 모델을 생성 하는 프로토콜을 설명 하 고, 즉 임산부-상속 된 X 염색체는 세포의 100%에서 불활성 이다. 우리는 또한 생체 내에서 비활성 X 염색체의 약리학 적 재 활성화의 타당성, 내성 및 안전성을 테스트 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다.

비활성 X 염색체에 대 한 Mecp2의 약리학 적 재 활성화를 위한 비 랜덤 마우스 모델

저희는 액 적 디지털 중 합 효소 연쇄 반응에 사용 되는 표준 telomere 반복 증폭 프로토콜 (TRAP) 분석 법을 성공적으로 전환 했습니다. DdTRAP 이라고 불리는이 새로운 분석은 더 민감하고 정량적 이며, 다양 한 인간 세포 내에서의 텔로 활동에 대 한 더 나은 검출 및 통계적 분석을 가능 하 게 합니다.

물방울 디지털 트랩 (ddTRAP): Telomere 반복 증폭 프로토콜의 적응은 디지털 중 합 효소 연쇄 반응에 액 적

유도성 트랜스제닉 계보 추적 마우스 라인을 사용하여 줄기 세포 및 그의 자손을 형광단으로 영구적으로 표시하는 능력은 생체내에서 활성화, 증식, 이동 및/또는 분화의 공간적 및 시간적 분석을 가능하게 한다. 계보 추적은 혈통 헌신, 개입에 대한 반응 및 다능성에 대한 새로운 정보를 나타낼 수 있습니다.

성인 마우스 뇌에서 유도성 형광 표지 줄기 세포의 계보 추적

배우세요 마우스 뇌 조직에서 텔로머라제 활성을 측정하는 비방사성 TRAP 분석법을. PCR 증폭과 고해상도 겔 전기영동을 활용하여 뇌 영역별 및 성별 차이를 효율적으로 분석하는 방법입니다.

마우스 뇌의 다양한 지역에서 텔로 머라 제 활동 : 비 방사성 텔로 머라 제는 증폭 프로토콜을 반복 (TRAP) 분석

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