Name: 마이크로 실리콘 캔틸레버의 이용은 세포 수축 기능을 평가하기 위해 체외 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 학습하세요 마이크로 실리콘 캔틸레버를 이용한 근육 세포 수축 기능 평가 방법을. 레이저 및 광검출기로 캔틸레버 변위를 측정하여 실시간 힘을 분석하고 고처리량 약물 스크리닝에 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 건강 허가 번호 R01NS050452 및 R01EB009429의 국립 연구소에 의해 투자되었다. 캔틸레버 칩의 제조는 코넬 대학교 (Cornell University)에있는 나노 제조 시설에서 공동 작업자에 의해 외부에서 수행 하였다. 캔틸레버의 제조 공정에서 사용되는 모든 설비는이 설비에 위치했다. 캔틸레버 마이크로 제조 그들의 도움 맨디 에슈와 Jean-마티유 보호 해주는 특별 감사. 캔틸레버 기능의 비디오 애니메이션 UCF의 합성 현실 연구실에서 찰스 휴즈, 알렉스 Zelenin 에릭 임페리얼에 의해 생성되었습니다.

1 캔틸레버 칩 제작 설명 제조 단계의 일러스트에 대한 자세한 내용은 그림 1에 나와 있습니다. <ol><li> 오븐에서 실리콘 - 온 - 절연체 (SOI) 웨이퍼를 배치하고이를 탈수 20 분 동안 125 ° C에서 굽는다. </li><li> 플라즈마를 이용하여 탈수 한 SOI 웨이퍼의 무늬 층 상에 산화 규소 1.5 μm의 두께 층을 증착은 화학 기상 증착 (PECVD)을 첨단 공구. </li><li> 장치 층이 위를 향하도록 스핀 코터 척에 웨이퍼를 놓습니다. , 웨이퍼 중심 확인 1000 RPM / sec로 가속에 60 초간 3000 rpm에서 웨이퍼의 중심과 스핀에 P20 프라이머 2 ㎖를 분배. P20 프라이머 장치 층에 포토 레지스트의 접착을 촉진시킨다. </li><li> 웨이퍼 스핀 코터의 척에있는 동안, O 1,000 RPM / sec로 가속에서 60 초 동안 3000 rpm에서 S1818의 웨이퍼의 중심에 포토 레지스트 스핀 2 ㎖를 분배포토 레지스트의 1.5 μm의 두께 층을 btain. </li><li> 핫 플레이트에 웨이퍼를 놓고 1 분 동안 115 ° C에서 소프트 베이크를 수행합니다. </li><li> 디바이스 층 상에 포토 레지스트 마스크로부터 캔틸레버 패턴을 전사하기 위해 포토 리소그래피 콘택트 마스크 얼 라이너를 사용하여 하드 콘택트 UV 노광을 수행한다. 125 엠제이 / S1818 포토 레지스트 cm (2)의 노광 에너지 값에 기초한 노출 시간을 계산한다. </li><li> 부드럽게 앞뒤로 흔들어 섞으면 웨이퍼를 1 분간 726 MIF 포토 레지스트 현상액에 웨이퍼를 침지하여 포토 레지스트를 개발한다. </li><li> 탈 이온화 (DI) 물과 웨이퍼를 씻어 바람직 스핀 세척 건조기 (SRD) 도구를 사용하여, 그것을 건조. </li><li> 아세톤에 적신 면봉을 사용하여 (가장자리에서 5mm까지) 웨이퍼의 가장자리에서 포토 레지스트를 제거합니다. </li><li> 포토 레지스트면이 위를 향하도록, 깊은 반응성 이온 에칭 (DRIE) 도구에서 웨이퍼를로드하고, 데비을 통해 패턴 화 된 실리콘 층을 에칭 조리법을 실행CE 층. 에칭 정지로서 매립 산화막 기능하므로 완전한 에칭을 보장 할 필요가있을 것으로 예상되는 것보다 100 % 이상의 사이클 50 %로 에칭을 수행한다. </li><li> 포토 레지스트를 제거하기 위해 20 분 동안 뜨거운 레지스트 욕 용액에 웨이퍼를 배치했다. DI 워터와 웨이퍼를 씻어 빠른 덤프 - 린서 (QDR)에 웨이퍼를 전송합니다. 포토 레지스트 스트립을 따라 헹구고 웨이퍼를 건조 SRD 도구에서 웨이퍼를로드합니다. 예상대로 캔틸레버 패턴이 나타날 수 있도록 현미경으로 웨이퍼를 검사한다. </li><li> PECVD 도구를 사용하여 웨이퍼의 장치 층에 언 도핑 실리콘 산화물의 1 μm의 두께 층을 증착. 상기 처리 단계 동안 캔틸레버 보호 층 등이 산화물 층 기능한다. </li><li> 웨이퍼의 뒷면의 처리를 시작하도록 대향 핸들 층과 스핀 코터의 척에 웨이퍼를 배치했다. 확인 웨이퍼는 3,000 rpm에서 P20의 웨이퍼의 중심에 프라이머, 스핀 2 ㎖를 분배, 중앙1000 RPM / 초 가속에 60 초 동안. </li><li> 웨이퍼 스핀 코터의 척에있는 동안의 6.5 μm의 두께의 층을 얻기 위해 1,000 RPM / sec로 가속에서 45 초 동안 2000 rpm에서 웨이퍼의 중심과 스핀 상 SPR220-4.5 포토 레지스트 2 ㎖를 분배 포토 레지스트. </li><li> 2 분 동안 115 ° C에서 소프트 베이크을 수행하기 위해 근접 핫 플레이트에 웨이퍼를 놓습니다. </li><li> 앞 / 뒷면 정렬 가능한 포토 리소그래피 콘택트 노광 장치를 사용하여, 전방 측 캔틸레버 패턴이면 윈도우 마스크를 정렬 및 처리 층 상에 포토 레지스트를이면 윈도우 마스크로부터 패턴을 전사하기 위해 하드 콘택트 UV 노광을 수행한다. 480 엠제이 / SPR220-4.5 감광액 cm (2)의 노광 에너지 값에 기초하여 계산 된 노출 시간을 사용한다. </li><li> UV 노광 후, 웨이퍼는 다음 처리 단계 이전에 30 분 동안 어두운 영역에 남아하자. </li><li> 웨이퍼에 침지하여 포토 레지스트를 개발2 분 동안 726 MIF 포토 레지스트 개발 부드럽게 앞뒤로 웨이퍼를 떨고있다. </li><li> 탈 이온화 (DI) 물과 웨이퍼를 씻어 바람직 스핀 세척 건조기 (SRD) 도구를 사용하여, 그것을 건조. </li><li> 12 시간 동안 90 ° C의 오븐에서 웨이퍼를 놓습니다. </li><li> 불소 가스와 RIE 시스템 및 산화물을 에칭하기위한 레시피를 이용하여 상기 웨이퍼의이면에 산화 실리콘 층을 에칭. 웨이퍼의이면에 패터닝 된 산화물은 추가 처리를위한 에칭 마스크로서 작용한다. 노광 창에 실리콘 산화물이 완전히 에칭되도록하여 현미경으로 웨이퍼를 검사한다. </li><li> 아세톤에 담근 클린 룸 면봉을 사용하여 (가장자리에서 5mm까지) 웨이퍼의 가장자리에 포토 레지스트를 제거합니다. </li><li> DRIE와 도구의 웨이퍼를 적재 및 에칭 정지 같이 매립 산화물 층 (500)으로 기능하는 μM의 깊이로 패터닝 처리 층을 에칭 레시피를 실행. 의 과열을 방지하기 위해, 복수의 런에이 에칭 분할실리콘의 에칭에 모순이 발생 웨이퍼. 이 에칭 단계는 완전히 캔틸레버 아래의 실리콘을 제거한다. </li><li> 캔틸레버 아래의 매몰 산화물 층과 상기 캔틸레버의 위에 보호 산화물 층을 제거하기 위해, 25 % 희석 HF 에칭 제를 사용하는 습식 에칭 단계를 수행한다. 참고 :이 단계는 실리콘 캔틸레버의 바닥면을 해제하고 또한 레이저로 캔틸레버를 조사 할 수있는 액세스를 제공하기 위해 아래 창을 엽니 다. </li><li> DI 물 화장실의 시리즈와 함께 조심스럽게 건조 질소를 이용하여 웨이퍼를 헹군다. 캔틸레버가 기지만을 지원하기 때문에, 직접 칸틸 레버에 DI 물 또는 불활성 가스의 강제 스프레이를 사용하지 않는다. </li><li> 핸들 층 에칭 단계 동안 생성 쪼개짐 라인을 따라 웨이퍼로부터 개개의 칩을 쪼갠다. </li></ol> 2 세포 배양 <ol><li> 이전에 게시 된 방법 17에 따라 13F 된 커버를 준비합니다. 참고 : 만약 13F 코브rslips는 사용할 수 없으며, 95 ° 이상의 접촉각이 소수성으로 모든 표면이 사용될 수있다. </li><li> 캔틸레버 칩 및 70 % 에탄올 용액 중의 13F 커버 슬립을 소독하고 흐름 후드에서 공기 건조하도록 허용. </li><li> 표준 12 웰 플레이트 내부 13F 된 커버의 상단에 각각의 캔틸레버 칩을 놓습니다. </li><li> 외투 세포 유형에 대해 최적화 생체 고분자 또는 표면 변형에 캔틸레버는 표준 세포 배양 프로토콜에 따라 사용된다. </li><li> 원하는 농도의 특정 성장 배지에서 세포를 다시 일시. 참고 :이 프로토콜은 캔틸레버 창을 통해 떨어지는 원하는 캔틸레버 표면에 부착하지 세포의 상당수가 발생합니다. 세포 제제 따라서 커버 슬립 표준 제제에 비해 3-4 배 더 집중해야한다. 예를 들어, 쥐 골격근 위성 세포의 파종은 일반적 500-700 셀 / 평방 mm 15,16의 시딩 밀도를 이용하여 수행된다및 / 평방 mm 2000 세포에서 캔틸레버 기판에 사용됩니다. 최적화 실험은 적절한 파종 밀도를 확인하기 위해 새로운 셀 소스로 수행되어야한다. </li><li> 매체의 기포가 완전히 캔틸레버 창 커버 보장 캔틸레버 칩 표면에 세포 현탁액 200 μl를 피펫. 매체가 창을 통해 심지 및 캔틸레버의 상단에 고정 기포를 형성하지 않으면 13F의 커버 슬립을 장착하고 도금을 다시 시도. </li><li> 인큐베이터에 칩을 함유하는 접시를 전송하고 세포가 적어도 1 시간 (바람직하게는 2 ~ 3 시간)에 대해 부착 할 수있다. </li><li> 이 도금 기간이 지나면 성장 배지 1 ㎖와 문화를 13F coverslip에없이 깨끗하고 잘에 칩을 전송하고, 상단까지 멸균 집게를 사용합니다. </li><li> 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다. </li><li> 커버 슬립에 체외 유지 보수를 위해 자신의 표준 프로토콜에 따라 세포를 유지한다. 골격근 세포,세포가 합류가 필요합니다이되면 매체 조성물의 스위치는 myotube 형성을 유도한다. </li></ol> 캔틸레버 변형 분석을위한 하드웨어 및 소프트웨어의 3 설치 <ol><li> 수직 전기 생리학 현미경의 무대로 가열 된 배양 접시를 놓습니다. </li><li> 가열 현미경 단계로 세포가 현재 (+ 10 mM의 HEPES)에 현탁 된 공급 매체의 3 ML을 추가합니다. </li><li> 15mm의 이격 거리에서 가열 된 배양 접시의 안쪽에 스테인리스 전극을 장착하고, 펄스 발생기에 가변 강도, 주파수 및 파형의 필드 자극 펄스를 생성 할 수있는 그들을 연결 시스템들 자극을 생성 할 수 있도록 적절한 때 세포의. </li><li> , 현미경 테이블의 밑면에, XY 병진 스테이지 상에 장착 헬륨 - 네온 레이저를 볼트와, 레이저 빔이 30 ° 각도로 상대 금지로 가열 된 배양 접시의 바닥을 통해 향하도록하여 조정할캔틸레버의 평면 전자. </li><li> , 현미경 스테이지의 밑면에, XY 병진 스테이지 상에 장착 사분면 광 검출기 모듈을 볼트와 4 사분면의 중앙 반사 레이저 빔 토지.도 2를하도록 위치를 조정하여 설정할 하드웨어의 개요를 제공한다 설명 된 프로토콜을 구현하는 데 필요한. </li><li> 캔틸레버에 걸쳐 스캔 선형 액추에이터를 제어하는​​ 소프트웨어 프로그램을 작성합니다. 도 3에서 제공하는 흐름도를 참조하여 소프트웨어 프로그램을 작성한다.이 시스템을 사용하기 위해 프로그램 된 그래픽 인터페이스는도 4에 제공된다. </li></ol> 4 녹음 캔틸레버 편향 데이터 <ol><li> 캔틸레버 분석 하드웨어 및 관련 소프트웨어를 켭니다. </li><li> 중간에 가열 단계 서미스터를 삽입하고 37 ° C를 읽을 때까지 기다립니다. </li><li> cantileve와 함께 무대에 캔틸레버 칩을 삽입스테이지의 오른손쪽으로 향한 RS. </li><li> 현미경 광원을 켜십시오. </li><li> 캔틸레버 가정하면 스테이지의 오른쪽, 캔틸레버 (1)에 배향되어보기로 캔틸레버의 가장자리를 가져오고 캔틸레버 1 NOTE의 팁에 레이저 빔을 위치 시키도록, 레이저 / 광 검출기 제어 소프트웨어를 사용하는 현미경 초점 배열의 왼쪽 상단에 위치 하나이며, 숫자는 왼쪽 아래에서 아래로 16까지 실행합니다. 캔틸레버 (17)는 우측 상단 위치에 있고, 오른쪽 아래 (도 5a)에서 (32)에 실행된다. </li><li> 눌러 레코딩 소프트웨어의 "놀이". </li><li> 신호가 광 검출기를 제어하는​​ 스텝퍼 모터를 조정함으로써, x 및 y의 범위에 모두 "0"을 읽을 수 있도록 광 검출기를 배치. </li><li> 레이저 / 광 검출기 제어 소프트웨어에서 설정 캔틸레버 한 위치 (그림 4). </li><li> . 단계 4.7를 반복 캔틸레버 (16)의 끝 부분에 레이저를 이동하고 cantilev 설정ER 레이저 / 광 검출기 제어 소프트웨어 (16)에 위치. </li><li> 레이저 / 광 검출기 제어 소프트웨어의 단계 4.7. 및 설정 캔틸레버 (32)의 위치를​​ 반복 캔틸레버 (32)의 끝 부분에 레이저를 이동합니다. </li><li> 레이저 / 광 검출기 제어 소프트웨어의 단계 4.7. 및 설정 캔틸레버 (17)의 위치를​​ 반복 캔틸레버 (17)의 끝 부분에 레이저를 이동합니다. </li><li> 현미경 광원 및 실험실에서 오버 헤드 빛을 끄십시오. </li><li> 레코딩 소프트웨어 눌러 "레코드". </li><li> 1 Hz의 주파수에서 40 밀리 초, 5 V 펄스에 대한 펄스 발생기 하드웨어를 설정하고 기기 전원을 켭니다. NOTE : 선택적으로,이 시점에서 특정 셀 소스에 대한 최적의 자극 프로토콜을 사용, 명시된 설정 인간 및 설치류 세포 12,13,15,16 소스를 사용하여 수집 된 데이터에 기초하여 가이드 라인이다. </li><li> 레이저 / 광 검출기 제어 소프트웨어를 사용하여, 각각에 5 초 동안 정지, 캔틸레버 어레이 (32)를 가로 질러 스캔 할 하드웨어 설정전자. </li><li> 캔틸레버 (32)의 스캔이 완료되면, 다음 기록 소프트웨어를 중단하고 데이터 파일을 불러 자극기를 끄. </li><li> 수축 활동의 증거에 대한 각각의 캔틸레버에서 기록 추적을 검사합니다. 긍정적 인 반응과 함께 각 캔틸레버를 기록해 둡니다. 편향 기준선 위에 적어도 0.1 V이면 수축 피크로서 정의된다. </li><li> 레이저 / 광 검출기 제어 소프트웨어에 스캔 프로토콜에서 모든 응답하지 캔틸레버를 제거합니다. </li><li> 활성 캔틸레버이어서 세포의 자발적인 수축 활성의 판독을 얻기 위해 자극없이 재검사 될 수있다. </li><li> 배양 된 세포의 기능의 출력에 미치는 영향을 관찰하기 위해 중간에 치료 학적 화합물을 첨가 한 다음, 함께 또는 넓은 전기장 자극없이 검사를 실행. </li><li> 장기간 전기적 및 CONTR의 주사 레벨 셀을 자극하여 피로 평가를 수행 actility는 특정 임계 값 아래로 떨어 피크 힘 걸리는 시간을 측정합니다. </li><li> 운동 신경이 근육과 공동 문화 유지된다 실험에서 신경 근육 신경 자극과 운동 신경 - myotube 캔틸레버의 공동 문화의 치료를 통해 접합 형성 (예 : 글루탐산) 또는 시냅스 억제제를 측정 (예를 들어, D-tubocurarine) 및 스캔 자발적인 활동의 증가와 감소는 각각 16. </li><li> 계획된 실험의 요구에 의해 결정으로 특정 검사를 수행합니다. </li></ol> 캔틸레버 편향 데이터의 분석 (5) <ol><li> 사용 스토니 방정식 15 전지 층 또는 myotube (파스칼 단위), 및 (나노 뉴튼) 셀룰러 수축력의 직접 측정에서 응력의 판독에 (볼트) 것의 캔틸레버 편향 데이터를 변환 (아래에 설명) 개질 : 광고 / 51,866 / 51866eq1.jpg "/&gt; 식 1 <img alt="식 (2)" fo:content-width="2in" width="300" src="/files/ftp_upload/51866/51866eq2.jpg"> 식 (2) </li><li> δ = 캔틸레버 팁 편향 및 응력 myotube 의해 제조하는 경우, σ C 균일 후막보기 캔틸레버, C 검출부의 전체 폭을 가정 myotube 의해 생성 = 응력 = 사진에 레이저 위치 전압 관련 시스템 특정 계수 검출기, θ = 캔틸레버의 평면에 레이저 및 검출기 상대적인 각도, E 실리콘은 실리콘의 탄성률 = t시는 캔틸레버의 두께 = t F = myotube 두께, V의 Si =의 독 송비 규소, L = 캔틸레버 길이 검출기 캔틸레버 선단으로부터 레이저의 P = 경로 길이, w 개략은도 6에 제공된다. </li><li> 균일 한 필름이 myotube이다 가정 myotube에 힘 스토니의 적용에 사용 된 응력으로부터 힘의 계산 및 추정 셀 단면적을 동일시하여, 3을 수학 식 이어지는 막의 힘 같다 식. <img alt="식 (3)" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51866/51866eq3.jpg"> 식 (3) </li><li> 기능 데이터 수집 후, 면역 세포 화학 분석을 위해 캔틸레버 칩을 수정하거나 표준 기술을 사용하여 단백질 또는 DNA 분석을위한 세포를 사용한다. </li><li> 선택적으로 나중 포인트에서 기능적 성능을 재평가하기 위해 인큐베이터 대신 분자 분석을위한 준비에 세포를 반환. </li></ol>

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셀룰러 수축 증거 마이크로 캔틸레버를 분석하는데 중요한 단계는 현미경 스테이지 내의 캔틸레버 칩의 배치 및 배열 코너 캔틸레버 팁과 레이저와 광 검출기의 후속 정렬이다. 이 정확하게 수행하지 않은 경우, 소프트웨어는 잠재적으로 데이터를 수집하는 동안 위음성의 축적으로 이어지는 배열 잔존 캔틸레버의 위치를​​ 추정 할 수 없습니다. 운영자는 캔틸레버 칩이 레이저의 위치를​​ 교정하기 전에 배양 접시의 바닥과 높이 누워 될 수 있도록주의를 기울여야한다. 칩 접시 각도 앉는 경우, 편향된 레이저 빔의 경로를 변경하고 데이터 수집을 혼동한다. 기능 공기 테이블은 데이터를 수집하는 동안 배경 진동을 상쇄하기 위해 사용되어야합니다. 이 연구 홍보에 사용되는 캔틸레버의 얇은 두께 (약 4 μm의)ovides 높은 수축 활성에 대한 민감도,하지만 진동 감도를 증가하는 부작용이있다. 운영자는 배경 판독을 줄이기 위해, 데이터 기록시 가능한 한 적게 하드웨어 주위에 이동주의를 기울여야한다. 무...

인간과 설치류 모두에서 근육 세포의 체외 배양은 수십 년 동안 가능했습니다1,2. 그러나 표준 커버슬립 제제는 생화학적 평가에 유용하지만 세포의 주요 기능적 출력(수축성)에 대한 분석을 용이하게 하지 못하므로 세포 성숙 및 성능을 평가하기 위한 수단으로서 가치가 다소 제한적입니다. 이러한 체외 배양에서 얻을 수 있는 데이터의 양을 최대화하기 위해서는 이러한 세포의 기능적 성능을 실시간으로 평가할 수 있는 구성으로 세포를 수용할 수 있는 시스템의 개발을 진전시킬 필요가 있습니다. 다수의 3차원 근육 모델의 확립은 이러한 요구를 충족시키는 데 약간의 진전을 이루었으며, 이러한 시스템은 in vitro3-5에서 배양된 근육 세포의 수축 능력을 평가하는 수단으로 많은 출판물에서 사용되었습니다. 이러한 시스템은 조직 모델링 및 재구성 연구에 매우 중요하지만 단일 세포 반응 연구에 대한 적용 가능성은 제한적입니다. 단일 섬유 연구가 필요한 경우, 복잡하고 노동 집약적인 생체 외 방법론이 유일한 옵션으로 남아 있습니다6-10. 더욱이, 약물 개발 및 스크리닝 프로토콜을 위한 복잡한 다중 장기 플랫폼의 개발을 향한 현재의 움직임은 비침습적이고 쉽게 확장할 수 있으며 지원 세포 및 조직 모델과 쉽게 통합되는 시스템의 구축을 필요로 합니다11. 
마이크로 스케일 캔틸레버는 단일 세포 / 세포12,13의 작은 집단의 기능적 수축 능력을 평가하기위한 간단한 방법을 제공합니다. 이 기술은 수정된 원자력 현미경(AFM) 기술14을 기반으로 하며, 레이저 및 광 검출기 시스템을 사용하여 배양된 근관 수축 활성에 대한 반응으로 마이크로 스케일 캔틸레버 편향을 측정합니다. 그런 다음 수정된 Stoney의 방정식을 사용하여 근관의 응력과 관찰된 기판 편향15를 생성하기 위해 근관이 가하는 힘을 계산합니다. 다중화 캔틸레버 어레이의 동시 평가를 가능하게 하는 스캐닝 프로그램이 작성되어 약물 독성/효능 연구를 위한 중등도에서 높은 처리량 응용 프로그램을 제공할 수 있습니다15,16. 이러한 기술은 in vivo 에서 약물 효능을 예측하기 위한 기능적 전임상 분석법 개발에 매우 중요한 것으로 입증될 수 있습니다.또한, 실리콘에 캔틸레버 칩을 제조해도 면역 염색, 웨스턴 블로팅 및 PCR과 같은 표준 생체 분자 분석을 위한 세포의 분석 후 처리를 방해하지 않습니다. 
이 원고는 마이크로 실리콘 캔틸레버의 제조 및 준비, 하드웨어 및 소프트웨어 설정, 이러한 칩에서 배양된 수축 세포의 기능을 평가하기 위한 운영 지침에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 이러한 표면에서 세포의 도금 및 유지 관리를 위해 표준 세포 배양 기술을 구현할 수 있으므로 신뢰할 수 있는 배양 매개변수가 존재하는 모든 수축 세포 유형을 이 장치와 쉽게 통합할 수 있어야 합니다. 이 시스템에서 사용되는 비교적 간단한 2D 배양 매개변수는 다른 세포 모델의 통합 또는 근육과 상호 작용할 수 있는 세포 유형(예: 신경 분포 뉴런)을 간단하게 추가할 수 있도록 하여 포유류 시스템의 보다 복잡한 기능적 체외 분석 및 다중 장기 모델 개발에서 이 모델의 적용 가능성을 크게 높입니다.

<table><tbody><tr><td>기본 쥐 근육 성장 매체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 매체</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>1x</td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>1x</td></tr><tr><td>G5 보충제</td><td>Life Technologies</td><td>17503-012</td><td>1x</td></tr><tr><td>Glial-Derived 신경 영양 인자</td><td>세포 과학</td><td>CRG400B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>뇌 유래 신경 영양 인자</td><td>세포 과학</td><td>CRB600B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>섬모 신경 영양 인자</td><td>세포 과학</td><td>CRC400A</td><td>40 ng/ml</td></tr><tr><td>신경 영양</td> 인자 세포 <td>과학</td><td>CRN500B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>신경 영양 호르몬 -4</td><td>세포 과학</td><td>CRN501B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>산성 섬유아세포 성장 인자</td><td>생명 기술</td><td>13241-013&nbsp;</td><td>25 ng / ml</td></tr><tr><td>심장 자극 호르몬-1</td><td>세포 과학</td><td>CRC700B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>헤파린 황산염</td><td>시그마</td><td>D9809&nbsp;</td><td>100 ng / ml</td></tr><tr><td>백혈병 억제 인자</td><td>시그마</td><td>L5158&nbsp;</td><td>20 ng / ml</td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Sigma</td><td>V0132</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>기본 쥐 근육 분화 매체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NB Activ 4</td><td>Brain Bits LLC</td><td>NB4-500</td><td></td></tr><tr><td>장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>클래스 2 적색 다이오드 레이저</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>광 검출기</td><td>Noah Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Model 2100 Pulse 자극기</td><td>AM 시스템</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B 디지타이저</td><td>축삭 기기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>패치 클램프 현미경 및 스테이지</td><td>올림푸스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>델타 T4 배양 접시 컨트롤러</td><td>Bioptechs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axoscope 소프트웨어</td><td>분자 장치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW 소프트웨어</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 oC, 5% CO2 인큐베이터</td><td>NAPCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Class 2 미생물 흐름 후드</td><td>Labconco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫 및 팁</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

마이크로 실리콘 캔틸레버의 이용은 세포 수축 기능을 평가하기 위해 체외

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

더 많은 예측과 관련된 생물학적 시험 관내 분석법의 개발은 시드 세포의 기능 평가를 용이 다목적 세포 배양 시스템의 발전에 입각한다. 이를 위해 마이크로 캔틸레버 벤딩 기술은 기판의 수축에 의한 평가를 통해, 뼈, 심장, 및 평활근 세포를 포함한 세포 유형의 범위의 수축 기능을 측정 할 수있는 플랫폼을 제공한다. 다중화 된 캔틸레버 어레이의 적용은 약물의 효능과 독성 질환 표현형 및 진행뿐만 아니라, 신경 근육 및 기타 세포 - 세포 상호 작용을 평가하기위한 높은 처리량 프로토콜 중등도 개발 수단을 제공한다. 이 논문은이 목적을 위해 신뢰할 수있는 캔틸레버 어레이를 제조하기위한 상세하고, 이들 표면에 성공적으로 세포 배양에 필요한 방법을 제공한다. 또한 설명은 기능적 항문을 수행하는 데 필요한 단계를 제공한다수축성 세포 유형의 ysis는 신규 한 레이저 및 광 검출기 시스템을 사용하여 이러한 배열에서 유지. 하이라이트 정밀도 및이 시스템을 사용하여 가능 수축력의 분석 재현성을 제공하는 자연 대표 데이터뿐만 아니라, 연구의 넓은 범위는 이러한 기술이 적용될 수있다. 이 시스템의 성공은 널리 채택 수단 조사관 티슈 성능 질환 개발 및 신규 한 치료 적 처치에 대한 응답의 더 정확한 예측 선도, 시험관 내에서 신속, 저비용으로 기능 연구를 수행하기 위해 제공 할 수있다.

캔틸레버에 수축성 세포의 성공적인 배양은 표준 세포 배양 기술 (도 5)를 이용하여, 비교적 간단한 절차이다. 수축 세포를지지 캔틸레버 백분율 세포 유형에 따라 달라질 것은 검사 및 특정 배양 기술이 채용되고있다. 쥐의 뒷다리에서 파생 된 기본 배아 세포를 사용하여 수축 활동이 조사 캔틸레버의 12 %에서 검출되었다 (N = 4). 설명 된 레이저와 광 검출기 시스템을 사용 수축력 분석 시드 세포의 기능 성숙에 관한 정확한 실시간 데이터를 제공한다. 도 7에 도시 된 바와 같이 표준 전기 생리 소프트웨어의 사용 범위는, 이러한 반 이완 피크 포스, 포스 피크 시간, 및 시간 등의 중요한 기능적 특성의 계산을 용이하게, 원시 데이터를 분석하는데 사용될 수있다. 후속 데이터 수집 처리 문화권 치료 화합물 수 있습니다와 약물 중독이없는 기능적 특성의 비교함으로써 화합물의 활성과 생체 반응의 후속 예측의 평가를 가능하게한다. 더욱이, 확장 된 자극 프로토콜 ...

이 프로토콜은 시험 관내에서 근육 세포의 수축력을 측정하기위한 유연한 배양 표면과 같은 실리콘 마이크로 캔틸레버의 사용을 설명한다. 셀룰러 수축 측정 기록하고, 시험 관내에서 수축력을 측정하는 비 침습적이고 확장 가능한 시스템을 제공하고, 힘의 판독 값으로 변환 할 수 외팔보 굽힘을 야기.

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

다음 실험의 목적은 통제된 체외 환경에서 자극에 반응하여 배양된 근육 섬유의 수축 활성을 측정하는 것입니다. 이것은 마이크로 스케일 실리콘 캔틸레버에 해리된 근육 세포를 도금하고 이러한 모노 핵 세포의 융합을 유도하여 근관이라고 하는 섬유를 형성함으로써 달성됩니다. 분화된 근육 세포를 지원하는 이러한 캔틸레버 칩은 리그에 칩을 배치한 후 근육 수축에 대한 반응으로 캔틸레버 편향을 측정하는 데 사용되는 레이저 및 광 검출기를 지원하도록 수정된 전기 생리학 현미경으로 전송됩니다.레이저는 캔틸레버 끝에 초점을 맞추도록 배치되고 광 검출기도 마찬가지로 편향된 빔을 포착하도록 정렬됩니다.전기 또는 화학적 처리에 대한 반응으로 근육 수축으로 인해 발생하는 캔틸레버 편향의 정도를 보여주는 결과를 얻어 시딩된 세포의 수축 프로파일을 실시간으로 직접 측정할 수 있습니다. 궁극적으로 캔틸레버 변위를 처리하여 힘의 판독값을 제공할 수 있습니다. 이 시스템은 약물 치료, 질병, 상태 또는 운동 프로토콜에 대한 반응으로 수축 기능의 변화를 평가하기 위한 잠재적인 고처리량 테스트 베드를 제공하기 위해 다중화됩니다.패치 클램프 전기 생리학과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 기능 분석을 위한 이 방법이 비침습적이며 고처리량 연구에 쉽게 적용할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 임상 평가 전에 적절한 용량 반응 농도를 식별하는 것과 같은 약물 개발 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 이 기법의 함의는 다양한 병리학적 표현형을 가진 세포의 기능적 성능을 실시간으로 조사할 수 있는 수단을 제공하기 때문에 여러 근육 질환 치료로 확장됩니다.그것은 또한 심장과 평활근 살균한, 이전에 준비된 공가 칩 및 70%ethanol 해결책에 있는 13의 F 덮개 미끄러짐과 같은 다른 조직 체계를 위해 사용될 수 있고 교류 두건에서 공기 건조하는 것을 허용합니다. 그런 다음 13F 커버 슬립 위에 개별 캔틸레버 칩을 놓습니다. 표준 12웰 플레이트 내부에는 사용 중인 세포 유형에 최적화된 생체 고분자 또는 표면 변형으로 캔틸레버가 코팅됩니다.표준 세포 배양 프로토콜에 따르면 표면 코팅은 당사의 준비 방법을 사용하여 30분이 걸리지만 연구자의 특정 배양 프로토콜에 따라 변경될 수 있습니다.Reese는 세포를 특정 성장 매체에서 원하는 농도로 만든 다음 100 마이크로 리터의 세포 현탁액을 캔틸레버 칩 표면에 올려 매

utilization-microscale-silicon-cantilevers-to-assess-cellular

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

여기 셀 강성을 측정 할 수있는 빠르고 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법의 일반적인 원리는 세포 표면에 micropipette를 통해 적용 잘 정의 된 부정적인 압력에 대한 응답으로 막 변형을 측정하는 것입니다. 이 방법은 기판에 연결된 세포의 biomechanical 속성을 연구 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다.

기판에 연결된 전지의 Micropipette의 열망은 셀 강성을 추정하기 위해

이 동영상은 전기 세포-기질 임피던스 감지(ECIS)를 사용하여 대동맥 평활근 세포(SMC) 수축을 측정하는 방법을 설명합니다. ECIS는 세포의 이동을 측정하며 수축을 측정하는 신뢰할 수 있는 방법입니다.

체외 SMC 수축 측정: 전기 세포 기질 임피던스 감지를 사용하여 평활근 세포 수축을 평가하는 비침습적 방법

살아있는 세포의 기계적 변형률에 대한 실시간 반응을 측정할 수 있도록 맞춤형 모터 구동 기계식 액추에이터를 사용하여 새로운 이미징 프로토콜이 개발되었습니다. 기계생물학과 관련된 이 시스템은 컨포칼 또는 원자력 현미경으로 거의 실시간 이미징을 허용하면서 최대 20%까지 균주를 적용할 수 있습니다.

기계 스트레치 동안 라이브 세포 이미징

여기에서는 상피-중간엽 전이를 거친 중간엽 세포에서 수축 기능을 평가하기 위한 겔 수축 분석법의 개발 및 적용에 대해 설명합니다.

개발<em&gt; 체외</em&gt; 분석은 중간 엽 세포를 시행 한 상피 - 중간 엽 전환의 수축 기능을 평가하는

기계적 힘은 세포 이동을 제어하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 유리 마이크로파이펫 및 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 변형될 수 있는 탄성 하이드로겔의 사용을 입증하여 세포 구조 및 이동의 변화를 유도하기 위해 국소 강성 구배를 가진 세포를 자극한다.

세포 운동 및 관련 신호 이벤트의 기계적 제어를 평가하기위한 단일 세포 Durotaxis 분석

이 프로토콜은 피부 심장 근구를 사용하여 심장 기능의 추출 및 평가 기술을 단계별로 설명하는 것을 목표로합니다. 이 방법론은 마우스에서 남성에 이르기까지 다른 심장 위치에서 수집 할 수있는 작은 냉동 생검을 사용하여 myofilament 기능의 측정 및 급성 변조를 허용합니다.

피부 심근세포를 이용한 심장 기능의 체외 평가

여기에 제시 나노 뉴턴 해상도와 스트라이드 근육 myofibrils의 수축 특성을 평가하는 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 간섭 계기반 광학 힘 프로브를 사용하여 설정을 사용합니다. 이 설정은 높은 신호 대 잡음 비율로 데이터를 생성하고 myofibrils의 수축 운동의 평가를 가능하게합니다.

골격 근육 생검에서 Myofibrils를 분리하고 나노 뉴턴 해상도 포스 트랜스듀서로 수축 기능을 결정합니다.

이 논문은 원발성, 환자 특이적 인간 대동맥 평활근 세포 및 진피 섬유아세포의 분리 및 배양을 위한 explant 배양 기반 방법을 기술한다. 또한, 세포 수축 및 후속 분석을 측정하기위한 새로운 방법이 제시되며, 이는 이들 세포의 환자 별 차이를 연구하는 데 사용될 수 있습니다.

일차 환자 특이적 대동맥 평활근 세포 및 체외에서 반정량적 실시간 수축 측정의 분리

이 연구는 형광 단백질 마이크로패턴의 시각화된 변위를 기반으로 단일 세포 수축력의 단순화되고 핸드오프 정량화를 위해 마이크로웰 형식으로 형광 표지된 엘라스토머 수축성 표면(FLECS) 기술을 활용하기 위한 유연한 프로토콜을 제시합니다.

마이크로 패턴화된 엘라스토머를 이용한 단일 세포 수축성의 단순화된 고처리량 분석

골격근 기능은 전통적으로 힘들고 처리량이 적은 접근법을 사용하여 분리된 근육 섬유의 수축성을 정량화하여 평가할 수 있습니다. 여기에서는 하이드로겔에 내장된 근육 섬유의 수축성을 정량화하기 위한 광학 기반의 고처리량 방법을 설명합니다. 이 접근법은 약물 스크리닝 및 치료제 개발에 적용됩니다.

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여기서는 등방성 및 단축 변형 파형을 세포에 적용하면서 조절 가능한 강성과 맞춤형 단백질 매트릭스를 가진 기질에서 배양을 지원하는 새로운 장치를 소개합니다. 이 간단하고 경제적인 플랫폼 덕분에 연구자들은 기초 연구와 질병 관련 맥락에서 기계적 단서가 세포 기능을 어떻게 조절하는지 조사할 수 있습니다.

시험 관 내 세포 신장 및 영상 촬영을 위한 새로운 플랫폼

학습하세요 마이크로 실리콘 캔틸레버를 이용한 근육 세포 수축 기능 평가 방법을. 레이저 및 광검출기로 캔틸레버 변위를 측정하여 실시간 힘을 분석하고 고처리량 약물 스크리닝에 활용할 수 있습니다.

마이크로 실리콘 캔틸레버의 이용은 세포 수축 기능을 평가하기 위해 체외

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