마이크로 실리콘 캔틸레버의 이용은 세포 수축 기능을 평가하기 위해 체외

다음 실험의 목적은 통제된 체외 환경에서 자극에 반응하여 배양된 근육 섬유의 수축 활성을 측정하는 것입니다. 이것은 마이크로 스케일 실리콘 캔틸레버에 해리된 근육 세포를 도금하고 이러한 모노 핵 세포의 융합을 유도하여 근관이라고 하는 섬유를 형성함으로써 달성됩니다. 분화된 근육 세포를 지원하는 이러한 캔틸레버 칩은 리그에 칩을 배치한 후 근육 수축에 대한 반응으로 캔틸레버 편향을 측정하는 데 사용되는 레이저 및 광 검출기를 지원하도록 수정된 전기 생리학 현미경으로 전송됩니다.

레이저는 캔틸레버 끝에 초점을 맞추도록 배치되고 광 검출기도 마찬가지로 편향된 빔을 포착하도록 정렬됩니다.전기 또는 화학적 처리에 대한 반응으로 근육 수축으로 인해 발생하는 캔틸레버 편향의 정도를 보여주는 결과를 얻어 시딩된 세포의 수축 프로파일을 실시간으로 직접 측정할 수 있습니다. 궁극적으로 캔틸레버 변위를 처리하여 힘의 판독값을 제공할 수 있습니다. 이 시스템은 약물 치료, 질병, 상태 또는 운동 프로토콜에 대한 반응으로 수축 기능의 변화를 평가하기 위한 잠재적인 고처리량 테스트 베드를 제공하기 위해 다중화됩니다.

패치 클램프 전기 생리학과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 기능 분석을 위한 이 방법이 비침습적이며 고처리량 연구에 쉽게 적용할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 임상 평가 전에 적절한 용량 반응 농도를 식별하는 것과 같은 약물 개발 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 이 기법의 함의는 다양한 병리학적 표현형을 가진 세포의 기능적 성능을 실시간으로 조사할 수 있는 수단을 제공하기 때문에 여러 근육 질환 치료로 확장됩니다.

그것은 또한 심장과 평활근 살균한, 이전에 준비된 공가 칩 및 70%ethanol 해결책에 있는 13의 F 덮개 미끄러짐과 같은 다른 조직 체계를 위해 사용될 수 있고 교류 두건에서 공기 건조하는 것을 허용합니다. 그런 다음 13F 커버 슬립 위에 개별 캔틸레버 칩을 놓습니다. 표준 12웰 플레이트 내부에는 사용 중인 세포 유형에 최적화된 생체 고분자 또는 표면 변형으로 캔틸레버가 코팅됩니다.표준 세포 배양 프로토콜에 따르면 표면 코팅은 당사의 준비 방법을 사용하여 30분이 걸리지만 연구자의 특정 배양 프로토콜에 따라 변경될 수 있습니다.

Reese는 세포를 특정 성장 매체에서 원하는 농도로 만든 다음 100 마이크로 리터의 세포 현탁액을 캔틸레버 칩 표면에 올려 매체의 거품이 캔틸레버 창을 완전히 덮도록합니다. 칩이 들어있는 플레이트를 인큐베이터로 옮기고 이 도금 기간 후 최소 1시간 동안 세포가 부착되도록 합니다. 멸균 집게를 사용하여 13F 커버 슬립이 없는 깨끗한 우물로 칩을 옮기고 각각에 1ml의 성장 배지를 추가합니다.

플레이트를 인큐베이터로 되돌리고 체외 유지 관리를 위한 표준 프로토콜에 따라 세포를 유지하십시오. 커버 슬립에서 가열된 배양 접시를 직립 전기생리학 현미경의 스테이지에 놓습니다. 현재 세포 공급 매체 3ml를 가열된 현미경에 추가합니다.

가열된 배양 접시 내부에 15mm의 이격 거리로 스테인리스 스틸 전극을 무대에 장착합니다. 자기장 자극, 다양한 강도, 주파수 및 파형의 펄스를 생성할 수 있는 펄스 발생기에 연결하여 시스템이 적절한 경우 세포의 자기장 자극을 생성할 수 있도록 합니다. XY 병진 스테이지에 장착된 헬륨 네온 레이저를 현미경 테이블 아래쪽에 볼트로 고정합니다.

그런 다음 레이저 빔이 캔틸레버 평면에 대해 30도 각도로 가열된 배양 접시의 바닥을 통과하도록 레이저를 조정합니다. 다음 볼트, 현미경 스테이지 아래쪽의 XY 변환 스테이지에 장착된 사분면 광 검출기 모듈. 반사된 레이저 빔이 4개의 사분면의 중앙에 떨어지도록 위치를 조정합니다.

텍스트 프로토콜에 제공된 순서도를 참조하여 캔틸레버를 가로질러 스캔하는 선형 액추에이터를 제어하는 소프트웨어 프로그램을 작성합니다. 캔틸레버 해석 하드웨어 및 관련 소프트웨어를 켭니다. 가열된 s를 삽입하십시오.tage mrta를 매체에 넣고 섭씨 37도를 읽을 때까지 기다립니다.

다음으로, 캔틸레버 칩을 s에 삽입하십시오.tage 캔틸레버가 s의 오른쪽을 향하도록 합니다.tage. 현미경 광원을 켭니다. 현미경의 초점을 맞춰 캔틸레버의 가장자리를 view그리고 레이저 광 검출기 제어 소프트웨어를 사용하여 캔틸레버가 스테이지 캔틸레버의 오른쪽 방향이라고 가정하고 캔틸레버 끝에 레이저 빔을 배치합니다.

하나는 배열의 왼쪽 상단에 위치한 숫자이며 숫자는 16까지 내려갑니다. 왼쪽 하단에 있습니다. 캔틸레버 17은 오른쪽 상단 위치에 있으며 32까지 실행됩니다.

오른쪽 하단에서 녹음 소프트웨어에서 재생을 누릅니다. 광 검출기를 제어하는 스테퍼 모터를 조정하여 신호가 x 및 y 프레임 모두에서 0을 읽도록 광 검출기를 배치합니다. 그런 다음 레이저 광 검출기 제어 소프트웨어에서 캔틸레버를 한 위치로 설정합니다.

그런 다음 레이저를 캔틸레버 16의 끝으로 이동합니다. 광 검출기의 위치를 반복하고 레이저 광 검출기 제어 소프트웨어에서 캔틸레버 16 위치를 설정합니다. 이제 레이저를 캔틸레버 32의 끝으로 이동합니다.

광 검출기의 위치를 반복하고 레이저 광 검출기 제어 소프트웨어에서 캔틸레버 32 위치를 설정합니다. 마지막으로 레이저를 캔틸레버 17의 끝으로 이동합니다. 광 검출기의 위치를 반복하고 레이저 광 검출기 제어 소프트웨어에서 캔틸레버 17 위치를 설정합니다.

현미경 광원을 끈 다음 실험실의 오버헤드 조명을 끕니다. 녹음 소프트웨어에서 녹음을 누릅니다. 펄스 발생기 하드웨어를 40밀리초 및 5볼트 펄스(1헤르츠의 주파수)로 설정합니다.

그런 다음 기계를 켭니다 레이저 광 감지기 제어 소프트웨어를 사용하여 32개의 캔틸레버 어레이를 스캔하도록 하드웨어를 설정합니다. 각 지점에서 5초씩 멈춥니다. 32개의 캔틸레버 스캔이 완료되면 자극기를 끕니다.

그런 다음 녹음 소프트웨어를 중지하고 데이터 파일을 불러옵니다. 각 캔틸레버에서 기록된 트레이스를 검사합니다. 수축 활동의 증거.

수축은 피크로 정의됩니다. 편향이 기준선보다 0.1볼트 이상 높으면 양수 응답이 있는 각 캔틸레버를 기록해 두십시오. 레이저 광 검출기 제어 소프트웨어의 스캔 프로토콜에서 응답하지 않는 캔틸레버를 제거합니다.

그런 다음 활성 캔틸레버를 자극 없이 다시 스캔하여 세포의 자발적인 수축 활성을 판독할 수 있습니다. 다음으로, 배지에 치료용 화합물을 첨가하여 배양된 세포의 기능적 출력에 미치는 영향을 관찰합니다. 광시야 전기 자극을 사용하거나 사용하지 않는 복합 런 스캔을 추가한 후, 장시간 동안 세포를 전기적으로 자극하여 피로 평가를 수행한 다음, 최대 힘이 특정 임계값 이하로 떨어지는 데 걸리는 시간을 측정하기 위해 수축 수준을 스캔합니다.

운동 뉴런이 근육과 함께 배양으로 유지되는 실험에서는 운동 신경 근관 치료를 통한 신경근 접합 형성을 측정하고, 신경 자극제 또는 시냅스 억제제로 캔틸레버 공동 배양을 측정하고, 자발적 활동의 증가 및 감소를 스캔하고, 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 캔틸레버 편향 데이터를 분석합니다. 캔틸레버에서 수축 세포를 성공적으로 배양하는 것은 표준 세포 배양 기술을 사용하는 비교적 간단한 절차입니다. 표준 전기생리학 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터를 분석하여 최대 힘, 최대 힘에서 최대 힘까지의 시간 및 절반 이완까지의 시간과 같은 관련 기능적 특성의 계산을 용이하게 할 수 있습니다.

확장된 자극 프로토콜은 배양된 세포의 피로 속도를 평가할 수 있는 수단을 제공하므로 이 시스템에서 얻을 수 있는 생리학적 데이터의 수준이 넓어집니다. 캔틸레버 배양 시스템은 골격근 근관이 있는 배양 시스템에 운동 뉴런을 포함하도록 수정할 수 있으며, 이를 통해 체외에서 신경근 시냅스 형성을 평가할 수 있습니다. 이러한 배양에서 자발적 수축 활성의 속도는 글루타메이트와 같은 뉴런 특이적 자극제에 의한 치료에 대한 반응으로 수축 속도와 비교됩니다.

글루타메이트에 의해 유도된 수축률의 증가가 관찰된 모든 것은 아세틸콜린 방출 및 후속 근관 활성화로 이어지는 배양된 뉴런의 활성화를 시사합니다.글루타메이트 유도 활성의 중단을 유도하는 아세틸콜린 수용체 차단제, DTU 라인과 같은 시냅스 억제제를 사용한 치료는 이러한 배양에서 기능적 신경근 시냅스의 존재에 대한 추가 증거를 제공합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마이크로 실리콘 캔틸레버를 사용하여 배양된 골격근의 기능적 특성을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.