평면 바닥의 공기 해제 플랫폼 : 새로운 방법이 깨어에 현미경 또는 전기 생리학과 행동을 결합하여 자유롭게 설치류 이동
2014년 6월 29일
이 방법은 탐색 및 동물의 머리의 확고한 고정을 필요로 미세한 영상 또는 단일 세포 전기 생리학 녹음하는 동안 탐험하는 마우스 유형, 친숙한 환경을 만듭니다.
안녕하세요, 저는 헬싱키 대학교 근거리 과학 센터(Near Science Center)의 대학원생인 헬 린(Hel Lin)입니다. 오늘 저와 제 동료들은 깨어 있는 머리를 고치는 방법, 그러나 그렇지 않으면 자유롭게 움직이고 행동하는 동물에서 광학 및 전기 생리학적 기록을 수행하는 방법을 보여줄 것입니다. 우리의 방법은 마우스가 탐색하고 탐색할 수 있는 실질적이고 친숙한 환경을 만듭니다.
동물의 머리를 단단히 고정해야 하는 현미경 이미징 또는 단세포 전기생리학적 기록 중에 만성 두개골 창을 이식하고 쥐를 동물의 발 아래를 미끄러지듯 움직이는 이동식 홈 케이지에 익숙화합니다. 평평한 표면에서 이동하는 동안 모바일 홈 케이지는 두 개의 광자 이미징을 위해 표준 정립 현미경 아래에 배치하거나 웨이크 마우스 뇌에서 패치 클램프 기록을 위해 설정된 전기 생리학에 배치할 수 있습니다. 여기에 제시된 모든 실험 절차는 지역 윤리 위원회의 승인을 받았습니다.
우리는 발표된 프로토콜에 따라 두개골 창을 이식하고 두개골 창 이식 시 약간의 수정을 가합니다. 이 회복 기간 동안 동물은 최소 2주 또는 3주 동안 회복할 수 있으며, 창은 일반적으로 투명도를 회복합니다. 수술 후 잔류 염증의 징후가 있는 동물은 실험에서 제외됩니다.
연구를 위해 선택된 동물을 훈련시켜 머리에 고정하는 습관을 들이도록 합니다. 이동식 홈 케이지에서 5분에서 10분 동안 마우스를 침착하게 다루고 갑작스러운 움직임과 소음을 피한 다음 홈 케이지로 되돌립니다. 이 절차를 동일하지 않은 간격으로 두세 번 반복합니다.
이동식 홈 케이지는 머리를 고정하기 전에 동물을 마취하지 않고 머리를 고정할 수 있습니다. 헝겊을 사용하여 마우스를 불균일한 간격으로 두세 번 감쌉니다. 동물이 감싸져 있는 동안 침착함을 유지하도록 합니다.
그렇지 않으면 마우스가 완전히 익숙해질 때까지 절차를 반복하십시오. 취급이 완료된 후 다음날 이동식 가정용 케이지에서 하루에 두 번 생쥐 훈련을 시작하십시오. 각 훈련 세션 전에 동물의 무게를 잰다.
체중 감소량이 10% 이상인 동물은 연구에서 제외해야 합니다. 훈련된 동물의 크기에 맞게 머리 고정 팔의 위치를 조정합니다. 이동식 홈 케이지 장치의 공기 흡입구를 표준 실험실 가압 공기 배출구에 연결합니다.
공수된 가정용 케이지의 자유 부양에 공기 압력이 충분한지 확인하십시오. 이동식 홈 케이지에서 길들여진 동물의 훈련을 시작하십시오. 마우스를 헝겊으로 싸서 고정시킵니다.
동물의 머리에 부착된 금속 홀더를 머리 고정 암에 삽입하고 나사를 조여 단단히 고정합니다. 공기 흐름을 켜서 공수된 홈 케이지를 공중에 띄우십시오. 헝겊을 제거하고 마우스가 집 케이지를 탐색할 수 있도록 합니다.
첫 번째 훈련 세션 동안 생쥐는 얼어붙고 떨리는 행동과 꼬리 발기를 보일 수 있습니다. 동물이 소음에 익숙해지도록 하려면 예를 들어 라디오 번역을 사용하거나 모든 훈련 세션과 실험 중에 녹음된 음악 및 음성을 사용하여 주변 소리에 지속적으로 노출되도록 합니다. 만성 스트레스를 피하려면 교육 세션의 첫 번째 시간 동안 밝은 조명 조명을 사용하십시오.
첫 1시간이 지나면 어둠 속에서 훈련을 실시하고 근적외선 카메라를 사용하여 동물의 행동을 모니터링하십시오. 훈련 세션이 완료되면 나사를 풀어 머리 고정 팔에서 동물을 풀어줍니다. 다음 훈련 세션 전에 최소 2시간 동안 동물을 가정용 케이지로 되돌려 놓습니다.
두 개 이상의 다른 마우스와 함께 마우스를 케이지에 보관하면 스트레스 수준이 줄어듭니다. 선택적으로, 공수된 케이지를 동물과 함께 가정용 케이지에 배치할 수 있습니다. 이것은 환경을 풍요롭게 하고 이동식 가정용 케이지에 동물의 거주지를 강화할 수 있습니다.
마지막 훈련 세션 동안 생쥐는 머리 고정에 익숙해졌으며 공수된 홈 케이지 주변을 침착하게 탐색하는 Stressless 행동을 보여야 합니다. 가시광선이 없을 때, 근적외선 카메라 또는 광학 컴퓨터 마우스로 케이지의 움직임을 모니터링하여 마우스 운동의 궤적을 추적할 수 있습니다. 1-2시간 이상 지속되는 장시간 훈련 세션 중에는 수동으로 또는 이동식 홈 케이지 프레임에 부착된 피펫 홀더를 사용하여 마우스에게 식수를 제공하는 것이 좋습니다.
다음 다이어그램은 일반적인 실험 연구의 타임라인을 요약한 것입니다. 이 연구는 마우스를 다루기 2주 전에 두개골 창을 이식하는 것으로 시작하여 하루에 두 번 8회의 훈련 세션으로 계속됩니다. 일반적인 연구에는 몇 시간에서 며칠 또는 몇 주 간격으로 간격을 둔 여러 이미징 세션 또는 패치 클램프 기록 세션이 포함됩니다.
광학 및 전기 생리학 실험은 모두 인지 또는 행동 자극 및 판독과 병행하여 수행할 수 있습니다. Two Photon Microscopy는 설치류 뇌의 깊은 피질층에 있는 세포 및 심지어 세포 내 구조를 실시간으로 시각화할 수 있는 고유한 비선형 광학 기술입니다. 이광자 현미경 이미징 실험을 수행하려면 훈련된 동물을 이동식 홈 케이지에 넣고 스토퍼를 조정하여 현미경 광학 장치가 우발적으로 손상되지 않도록 보호합니다.
두개골 창의 커버 유리를 청소하여 먼지 입자를 제거합니다. 커버 유리에 침수 액체를 떨어뜨립니다. 물은 빠르게 증발하기 때문에 점액을 사용하는 것이 좋습니다.
이 플랫폼은 형광 현미경의 광시야 모드와 장거리 통과 방출 필터를 사용하여 일반적인 전동 광학 테이블 위에 배치할 수 있습니다. 뇌 혈관 구조를 평가하고 관심 영역을 선택합니다. 피질 혈관 구조를 머리가 고정되고 고정된 동물의 꼬리 정맥에 주입하기 위해, 70 킬로 달튼, 텍사스 레드 활용 텍스트 Tran.
이 이미지 시퀀스는 이동식 홈 케이지 주위를 탐색하는 동안 행동하는 쥐의 피질에 있는 장소와 동맥의 타임랩스 기록을 보여줍니다. vessel lumen을 가로질러 그려진 선의 프로파일을 플로팅하면 vessel diameter의 변화와 개별 vessel segments의 운동성을 측정할 수 있습니다. 동맥과 정맥의 혈류 속도는 혈관 벽과 평행하게 그려진 선을 따라 선 스캔으로 측정할 수 있습니다. 벌금.
뉴런 형태학의 세부 사항은 대만 프로모터 하의 뉴런 하위 집단에서 YFP를 발현하는 형질전환 마우스에서 시각화할 수 있습니다. 이 두 Zacks는 마취된 동물과 깨어 있는 동물 사이의 이미징 안정성을 비교합니다. 오른쪽 패널은 케타민 자일라진 혼합물로 마취된 동물의 수상돌기를 보여줍니다.
왼쪽 패널은 이동식 주택 케이지 주위를 걷는 깨어 있는 동물의 수상돌기 이미지를 보여줍니다. 깨어 있는 동물의 개별 척추 형태는 마취된 마우스와 동일한 신뢰성과 정밀도로 분석할 수 있습니다. 동물이 달리는 동안 뇌의 변위는 일반적으로 1-1.5 마이크로 미터를 초과하지 않습니다.
이러한 이동은 수평 방향으로 발생하며 매우 드물게 이미징 평면의 이동을 초래하여 모션 아티팩트의 보정이 필요하지 않습니다. 대부분의 경우, 깨어 있는 살아 있는 뇌의 신경 활동을 만성적으로 모니터링하는 능력은 신경계의 조직과 기능을 이해하는 데 필수적입니다. tie one G Camp three transgenic 마우스를 사용하여 이동식 홈 케이지에서 행동하는 깨어 있는 마우스의 자발적인 신경 활동을 이미지화합니다.
이 타임 랩스 이미지 시퀀스는 신경 세포체, nites 및 axons에서 칼슘 스파이크의 대표적인 예를 보여줍니다. 내재적 신호에 기반한 광학 이미징을 사용하면 기능 영역의 공간 분포를 매핑하여 내재적 광학 이미징 실험을 수행할 수 있습니다. 훈련된 동물을 카메라 대물렌즈 아래에 위치한 가정용 케이지에 넣습니다.
덮개 유리를 먼지로부터 청소하십시오. 글리세롤 한 방울을 넣고 5mm 원형 커버 슬립으로 덮습니다. 고속 카메라의 위치를 조정하십시오.
반대쪽 비브라 반대편에 공기 송풍 튜브가 있는 매니퓰레이터를 놓습니다. 녹색 조명을 사용하여 선박 지도를 이미지화합니다. 피질 혈관 아래 약 400마이크로미터의 피질 깊숙이 초점을 맞춥니다.
카메라 앞에 대역 통과 필터를 놓고 빨간색 조명으로 피질을 비춥니다. 마우스가 플랫폼에 최소 30분 동안 적응할 수 있도록 허용합니다. 6분 에피소드 동안 기본 활동을 기록합니다.
총 6분 동안 10초마다 에어 퍼프로 비브라를 자극합니다. 이 이미지는 0.05헤르츠의 주파수에서 진동 자극에 반응하여 체성 감각 피질을 따라 전파하는 신경 활동을 보여줍니다. 단세포 전기생리학적 기록을 수행하려면 거꾸로 된 두개골 창을 이식한 훈련된 동물을 이동식 홈 케이지에 넣습니다.
천천히 조심스럽게 금속 홀더에서 커버 유리를 제거합니다. 피질 완충액을 새로 고치고 지혈 탐폰으로 두개골 창에 파편을 청소합니다. 접지 전극을 피질 완충액에 놓습니다.
패치 cl을 채웁니다.amp 피펫에 세포 내 용액을 넣습니다. 전동 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 기록 피펫에 양압을 가하고, 피펫을 피질로 깊숙이 넣고, 관심 세포와 기가 씰(giga seal) 접촉을 얻습니다. 기록 후 피펫을 제거하고 피질 완충액을 새로 고친 다음 커버 유리를 금속 홀더에 접착제로 붙여서 두개골 창을 닫습니다.
공수된 가정용 케이지를 사용하면 이미징 및 전기 생리학을 학습, 재활 또는 불안 관련 행동과 같은 고전적인 행동 패러다임과 결합할 수 있습니다. 후각은 생쥐의 중요한 감각 입력이며 기억력 테스트의 자극 및 신규함에 대한 반응 평가에 사용할 수 있습니다. 습관성 후각 테스트를 수행하려면 훈련된 동물을 이동식 주택 케이지에 넣고 입양할 수 있도록 합니다.
30분 동안 양면 접착 테이프를 사용하여 수돗물에 적신 깨끗한 솜 조각을 이동식 홈 케이지의 내벽에 부착합니다. 5분 후, 가정용 케이지 벽의 깨끗한 솜을 바닐라 냄새가 나는 액체에 적신 새 솜으로 교체하십시오. 바닐라 향에 5분 동안 노출되는 것을 세션 사이에 5분 간격으로 3회 반복합니다.
냄새에 대한 관심 수준을 측정합니다. 동물이 목표 구역을 향하는 데 소비하는 누적 시간과 이동식 주택 케이지 이동의 총 시간을 계산합니다. 마지막 다섯 번째 세션 동안 사회적으로 중요한 냄새를 나타냅니다.
새 면 어플리케이터에 이성 쥐의 소변 몇 방울을 적십니다. 신규함에 대한 반응을 평가하려면 이동식 주택 케이지를 4개의 구역으로 나눕니다. 서로 마주 보는 두 개의 면 조각을 부착합니다. 색.
첫 번째 시도 동안 가정용 케이지 벽의 바깥쪽에 마커로 코딩하십시오. 깨끗한 면 두 개를 놓습니다. 그런 다음 둘 다 바닐라 1% 추출물에 담근 면으로 교체하십시오.
세 번째 시도에서 바닐라 코튼을 1번 구역에 넣고 1% 바나나 추출물에 적신 면 조각을 구역에 넣습니다. 두 번째, 냄새가 없는 것에 대한 선호도를 측정합니다. 동물이 냄새가 나지 않는 곳을 마주하는 데 소비하는 시간을 다른 구역을 마주하는 누적 시간의 백분율로 계산합니다.
안녕하세요, 저는 헬싱키 대학의 신경과학 센터의 수석 연구원인 레오 키로(Leo Kiro)입니다. 동영상을 재미있게 시청하고 유용하게 사용하셨기를 바랍니다. 우리는 지난 5년 동안 생체 내 현미경 검사에 대해 Twofold로 작업해 왔으며, 미학은 뇌 기능, 혈류 및 모든 것을 방해하기 때문에 일반 및 미용의 사용은 항상 큰 관심사였습니다.
그리고 오늘 저는 우리가 깨어 있는 동물을 대상으로 작업하고, 안정적인 현미경 이미징 실험을 수행하고, 이전에 마취된 동물에서 얻은 결과를 검증하고 검증할 수 있게 되어 기쁩니다. 모바일 홈 케이지의 사용과 오늘 발표한 방법은 일반적으로 생체 내 연구의 관련성을 높이고 새롭고 획기적인 결과로 이어질 것이라고 확신
하며 기대하고 있습니다.개요
이 방법은 마우스가 동물의 머리를 단단히 고정해야 하는 현미경 이미징 또는 단일 세포 전기 생리학 기록 중에 탐색하고 탐험할 수 있는 실체적이고 친숙한 환경을 만듭니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 신경과학
- 전기생리학
- 현미경학
배경
- 정확한 이미징 및 전기 생리학 기록을 위해 머리 고정이 필수적입니다.
- 만성 두개골 창을 통해 장기간 뇌 활동을 관찰할 수 있습니다.
- 실험 설정에 익숙해지는 것은 동물의 스트레스를 줄이는 데 중요합니다.
- 2광자 현미경을 통해 생체 내 세포 구조를 시각화할 수 있습니다.
연구 목적
- 깨어 있고 행동하는 마우스에서 광학 및 전기 생리학 기록을 수행하는 방법을 개발합니다.
- 실험 중 스트레스를 최소화하는 친숙한 환경을 만듭니다.
- 행동 자극에 반응하는 뇌 활동 연구를 용이하게 합니다.
사용된 방법
- 만성 두개골 창 설치.
- 머리 고정을 위한 이동식 홈 케이지 사용.
- 이동식 홈 케이지에 익숙해지도록 마우스를 훈련합니다.
- 행동 중 2광자 이미징 및 패치 클램프 기록.
주요 결과
- 마우스는 기록 중 이동식 홈 케이지를 성공적으로 탐색했습니다.
- 마취 없이 머리 고정을 달성하여 자연스러운 행동이 가능했습니다.
- 2광자 현미경은 뇌 혈관의 실시간 이미징을 제공했습니다.
- 익숙해지 훈련 후 동물의 스트레스 수준이 감소했습니다.
결론
- 이 방법은 보다 자연스러운 환경에서 뇌 기능 연구를 가능하게 합니다.
- 익숙해지 훈련은 스트레스 최소화와 데이터 품질 향상에 중요합니다.
- 이미징과 전기 생리학의 조합은 신경 동학 이해를 향상시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This method enables stable, high-resolution imaging and electrophysiology in awake, behaving rodents, addressing a critical limitation in preclinical neuroscience where anesthetic confounds reduce translational relevance. By combining behavioral paradigms with cellular-level readouts, it supports mechanistic de-risking of therapeutic targets involved in cognition, sensory processing, and neural circuit function. The approach enhances predictive confidence in early discovery by aligning animal model data with naturalistic brain states.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in neural circuits without anesthetic-induced confounds on neuronal activity or neurovascular coupling.
- Operational Value: Supports functional validation of targets involved in learning, memory, and sensory processing through concurrent behavior and physiology monitoring.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized platform for quantifying neuronal and vascular responses to behavioral stimuli, enabling assay readiness for compound screening.
- Operational Value: Facilitates reproducible, longitudinal measurements of brain function across days or weeks, supporting assay stability and cross-session comparability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical validation by allowing chronic monitoring of neuronal dynamics in disease-relevant behavioral contexts.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by reducing biological variability introduced by anesthesia or restraint.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, enabling iterative refinement of targets based on behaving-animal physiology.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by linking cellular activity to naturalistic behaviors such as exploration and habituation.
- Screening: Enables quantitative, behavior-linked readouts (e.g., calcium fluxes, vascular dynamics) for evaluating compound effects on neural circuit function.
- Analytics: Generates spatiotemporal maps of neuronal and vascular activity that inform dose-response and target engagement assessments.
- Translational Research: Enhances continuity to preclinical models by preserving ethological relevance in neural readouts.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable, platform-compatible capability for repeated use across multiple projects and imaging modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive validity of preclinical data by capturing brain function in awake, behaving states.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility through habituation protocols and stable head fixation without anesthesia.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by reducing mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-aware prioritization of targets based on functional relevance in naturalistic brain circuits.
Implementation Considerations
- Expertise in neurosurgical techniques such as chronic cranial window implantation and head plate attachment.
- Access to two-photon microscopes, electrophysiology rigs, and environmental control systems for airflow and monitoring.
- Standardized training protocols for animal habituation to minimize variability across operators and studies.
- Adaptation considerations for different mouse strains, ages, and behavioral paradigms.
- Practical limitations include the need for prolonged training periods and careful monitoring of animal health and weight during habituation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
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Title
1:12
Cranial Window Implantation
1:33
Training
5:35
Applications: Two-photon Microscopy Imaging
8:41
Applications: Intrinsic Optical Imaging
9:59
Applications: Electrophysiology
10:54
Behavioral Experiments
11:08
a) Habituation-dishabituation Olfactory Test
12:17
b) Reaction to Novelty
13:03
Conclusions
