인간의 간질 수술 후 두피 조직의 다중 전극 어레이 레코딩

이 절차의 전반적인 목표는 인간 간질 피질 조직에서 생체 외, 간질 및 발작과 같은 사건의 다중 전극 어레이 기록을 수행하여 세포 및 네트워크 수준 모두에서 간질 활동, 시작, 전파 및 항간질 약물의 효과의 기저에 있는 기본 메커니즘을 다루는 방법을 제공하는 것입니다. 이것은 먼저 수술 중 약리내성 간질 환자의 인간 피질 조직을 조심스럽게 절제함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 자르기 전에 혈전, 혈관, 수막, 과도한 백질을 제거하는 것입니다.

다음으로 조직 블록을 400미크론 조각으로 자릅니다. 마지막 단계는 느린 관류로 높은 산소 공급과 온도 제어의 계면 조건에서 슬라이스를 유지하는 것입니다. 궁극적으로 다중 전극 어레이 기술은 자발적인 interictal과 같은 활동을 기록하고 ictal과 같은 이벤트를 유발하는 데 사용됩니다.

본 연구실은 신경 세포가 인간에서 병리학적 네트워크 활동을 생성할 수 있는 방법을 연구하기 위해 대뇌 생리병리학에서 신경교세포 상호 작용의 역할을 조사합니다. 우리는 최근 목 관리 및 무릎 Petri 병원과 협력하여 인간 간질, 수술 후 피질 조직의 다중 전극 어레이 기록을 구축했습니다. 오늘은 넥 케어 병원(Neck Care Hospital)의 신경외과 의사인 토마스 블로(Thomas Blo)와 라피스 병원(Lapis Hospital)의 펠드 간질 전문의이자 연구원, 그리고 제 연구실의 엘레나 DOI 박사후 연구원과 함께 이러한 기술을 수행하고 잘 활용하는 방법을 시연할 것입니다.

인간 간질 조직 수집에서 생체 외 MEA 기록에 이르기까지, 간질 환자를 치료하기 위해 인간 피질 조직 ECT를 사용하면 특정 네트워크에서 상호 연결된 기능적으로 유지되는 인간 간질 뉴런과 신경교세포를 직접 탐색할 수 있습니다. 체외 조사에서 인간 조직은 생체 내에서 완전히 해결할 수 없는 단일 세포 및 네트워크 활동, 이온 기반 메커니즘에 접근할 수 있습니다. 인간 피질 조직에 대한 MEA 기록은 외발성 및 발작 전파의 기저에 있는 세포 메커니즘과 같은 간질 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 의미는 병변 간질과 그 치료법으로 확장되는데, 이는 약물 내성의 메커니즘과 인간의 피질 절편에 기록된 발작과 같은 사건에 대한 항간질제의 효과를 이해할 수 있기 때문입니다. 시험관 내. e, e, g 또는 생체 내 마이크로 전극과 같은 기존 방법에 비해 다중 전기 어레이의 주요 장점은 조직의 여러 측면에서 전위 및 다중 단위 활성의 비침습적이고 동시 자극 및 기록할 수 있다는 것입니다.

절차를 시작하려면 먼저 하부에 증류수를 채워 계면 챔버를 준비하십시오. 그런 다음 챔버를 탄수화물 공급원에 연결합니다. 다음으로, 슬라이스 챔버의 평평한 부분에 맞도록 렌즈 티슈 조각을 자릅니다.

거품이 슬라이스에 도달하기 전에 입력 라인에서 빠져나갈 수 있도록 입력 튜브 옆에 놓습니다. 그 후, 렌즈 티슈 조각과 같은 길이의 가닥 면사 두 개를 자릅니다. 챔버의 평평한 부분의 측면에 놓고 연동 펌프의 유량을 분당 1 밀리리터로 설정하십시오.

그런 다음 챔버 바닥 부분의 물에 대한 산소 공급을 켭니다. 그런 다음 온도 조절기를 섭씨 37도로 설정합니다. 계면 챔버의 상부를 파라폼 조각으로 덮고 온도가 상승하고 안정화될 때까지 최소 30분 동안 기다립니다.

이제 두 개의 가는 집게, 주걱, 작은 숟가락, 칼날, 유리 페트리 접시 두 개, 브러시 두 개, 시아노아크릴레이트 접착제가 포함된 해부 도구를 준비합니다. 다음으로 슬라이싱을 위한 매개변수를 설정하여 비브라토를 준비합니다. 이 절차에서는 제조된 자당 기반 A CSF를 영하 80도의 냉동고에서 꺼내 슬러시로 분쇄합니다.

발암원으로 산소를 공급하십시오. 그런 다음 A CSF 슬러시 250ml를 유리병에 옮기고 수술실에서 조직 채취를 위해 얼음을 채운 doer 병에 보관합니다. 표준 전신 마취 하에서 신경 항행 시스템을 사용하여 피질의 정확한 위치 파악을 가능하게 합니다.

그런 다음 피부를 절개한 다음 뼈에 버 홀을 만든 다음 개두술을 합니다. 다음으로 뼈 피판을 부드럽게 들어 올리고 가위로 경막을 엽니다. 그 후 간질 피질의 블록 절제술을 수행하고 광범위한 응고를 피합니다.

1cm 두께의 피질 블록을 잘라 산소가 함유된 냉동 자당(Sucrose based A CSF)에 넣습니다. 그 후, 기계적 충격을 피하되 가능한 한 빨리 동결 자당 기반 A CSF의 조직을 실험실로 옮깁니다. 이제 페트리 접시와 비브라토 버퍼 트레이에 자당 기반 산소화된 A CSF 슬러시를 채우고 A CSF 슬러시에 발암물질로 계속 산소를 공급합니다.

그런 다음 숟가락으로 병에서 티슈를 조심스럽게 꺼내 페트리 접시에 넣습니다. 집게를 사용하여 혈전, 혈관 및 수막을 조심스럽게 제거하여 자르는 동안 저항을 피하십시오. 조직의 반대쪽과 가능한 한 평행한 평평한 표면을 얻기 위해 블레이드로 조직의 면을 자릅니다.

그런 다음 횡피질 절편을 준비하기 위해 조직을 비브라토 표본 플레이트에 붙입니다. 그런 다음 버퍼 트레이에 넣고 400미크론 두께의 슬라이스를 저속으로 자릅니다. 다음으로 주걱과 브러시로 렌즈 티슈 몇 장을 자릅니다.

이 렌즈 조직 조각을 계면 챔버로 옮깁니다. 녹음하기 전에 최소 1시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 이 절차에서는 관류 시스템을 연동 펌프에 연결하고 MEA 시스템을 컴퓨터에 연결합니다.

그런 다음 내부에 빈 MEA 칩을 넣습니다. 다음으로, MEA 챔버의 캐뉼러 요소를 섭씨 37도로 가열하기 위한 온도 컨트롤러를 설정합니다. 산소가 공급된 A CSF의 관류를 분당 5-6밀리리터로 시작합니다.

그런 다음 녹음 소프트웨어를 엽니다. 모든 MEA 전극이 잘 연결되어 있고 관류로 인한 소음이 없는지 확인하십시오. 이제 유리 페트리 접시에 따뜻한 녹음 A CSF를 붓습니다.

렌즈 조직을 잡아 인터페이스 챔버에서 페트리 접시로 슬라이스를 옮깁니다. 그런 다음 용액에 담그어 조직에서 조각을 조심스럽게 분리하거나 작은 브러시를 사용하여 쉽게 분리할 수 있습니다. 그런 다음 MEA 칩에 A CSF를 채웁니다.

플라스틱 지날 피펫이 있는 주걱을 사용하여 슬라이스를 MEA 칩으로 옮깁니다. 용액을 부드럽게 제거하여 슬라이스가 전극 영역에 부착되도록 하고 백금 앵커로 제자리에 고정합니다. 그런 다음 MEA 칩에 CSF 녹음 1ml를 추가하고 증폭기에 넣습니다.

그런 다음 분당 5-6밀리리터로 관류를 시작합니다. 그런 다음 MEA 기록 영역에서 슬라이스 위치를 확인합니다. MEA 모니터 소프트웨어를 사용하여 필요한 경우 조정하십시오.

피질층에서 녹음하고 사진을 찍으려면 녹음을 시작하십시오. 이것은 MEA 전극에 의해 기록된 인간 피질 절편 활동의 대표적인 흔적입니다. 정상적인 A CSF에서는 마그네슘이 없는 6밀리몰 칼륨 A CSF로 관류 15분 후 자발적인 활동과 같은 간헐적 활동을 관찰할 수 있습니다.

첫 번째 발작이 나타나고 2-3분 간격으로 다른 발작이 뒤따릅니다. 파란색 추적은 확대된 활동을 보여줍니다. 이 패널은 250Hz에서 필터링된 데이터 고역 통과를 보여주며, 이를 확대하면 다중 장치 활성을 알 수 있습니다.

6 밀리 몰 칼륨 A CSF. 각 사각형은 12 x 12 MEA 어레이의 전극을 나타내며 82번째 시간 창을 보여줍니다. 점선은 MEA 어레이에 상대적인 피질 표면의 위치를 나타냅니다.

이 비디오를 시청한 후에는 인간 피질 조직을 안전하게 운반하는 방법, 실행 가능한 코르티코 건선을 준비 및 보관하는 방법, 자연 및 유도 간질 활동에 대한 MEA 기록을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 절차를 시도하는 동안 병원의 임상 팀과 실험실의 연구원 간의 긴밀한 협력이 중요합니다. 인체 조직으로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 가능한 전염병을 피하기 위해 장갑을 착용하는 것과 같은 보호를 항상 수행해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 형광 이미징, 패치 램프, 기록, 스파이크 분류 및 조직학적 분석과 같은 다른 기술을 em EA 기록과 결합하여 시냅스 특성, 단일 세포 거동, 이온 역학 및 세포 및 분자 이상을 집단 활동과 연관시킬 수 있습니다.

인간 간질 조직에 대한 MEA 기록을 수행하면 연구자가 병변 간질을 탐구하여 외형성 및 약사 저항성의 기저에 있는 메커니즘과 이 현상에서 신경교세포 상호 작용의 역할을 명확히 할 수 있는 길을 열 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.