Name: 견인 힘 현미경의 세포 배양 표면 근처 지역화 기자 형광 구슬을위한 새로운 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 30 s
Description: 배우세요 견인 힘 현미경을 위한 폴리아크릴아미드 겔 제조법입니다. 형광 미소구체를 겔 표면 근처 1.6 µm 이내에 정밀 배치하여 세포가 가하는 기계적 힘을 정확히 측정할 수 있습니다.

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저자는 학제 간 혁신 이니셔티브 프로그램, 일리노이 대학을 감사드립니다, 12035을 부여합니다. SK는 국립 과학 재단 (NSF) 부여에서 UIUC에 투자되었다 0,965,918 IGERT : 세포 및 분자 역학 및 BioNanotechnology에 연구원의 차세대를 훈련.

제조 및 세포 배양 표면 근처에 포함 된 형광 미소와 강성을 변화의 PA 젤 관능. 1 상단 커버 유리 전표를 기능화 <ol><li> 청소 유리 커버 슬립 (# 1.0, 12mm의 DIAM.) 비누와 물, 에탄올 다음은 외부의 먼지를 제거합니다. </li><li> 도시 유리 커버들은 커버 슬립의 용이성과의 상호 작용을 용이하게 닿지 않도록되도록 강판의 표면 (즉, 피펫 팁 홀더)에 실수. </li><li> 코트 커버의 표면 전체가 폴리-D-라이신 1 시간 (도 1a)에 대한 (0.1 ㎎ / ㎖)와 함께 미끄러. </li><li> 이 시간 동안, 일 수행 0.1 μm의 직경의 콜로이드 용액 만 희석 탈 (DI) 물에 적색 형광 마이크로 스피어는 겔 표면에 20 μm의 2 당 약 1 마이크로 스피어의 입자 밀도를 얻었다. 다양한 희석의 결과는 그림 2를 참조하십시오. 이 dilutioN은 특정 실험의 필요성을 충족시키기 위해 변경 될 수있다. </li><li> 30 분 동안 초음파 물을 욕조에 희석 된 용액을 놓습니다. </li><li> 1 시간 후, 신중하게 각 커버 슬립을 들어 올려 공기와 바람을 불어 건조 핀셋을 사용합니다. 강판 표면에 건조 커버 전표를 돌려줍니다. </li><li> 각 커버 슬립 위에 초음파 목욕 및 피펫 150 μL의 희석 된 콜로이드 용액을 제거합니다. 10 분 (그림 1B)에 두십시오. </li><li> 주의 깊게 각 커버 슬립을 들어 올려 공기와 바람을 불어 건조 핀셋을 사용합니다. 사용할 준비가 될 때까지 건조 커버가 어둠 속에서 강판 표면과 가게에 미끄러 져 돌아갑니다. </li></ol> 직접 바닥이​​ 유리 페트리 접시에 PA 젤을 준비 2 <ol><li> 100 ° C로 예열 열판. </li><li> 유리 바닥 배양 접시의 원하는 수의 레이아웃 (14mm와 35mm 요리를 마이크로 웰, # 1.0) 화학 흄 후드의 평평한면에. </li><li> 97 % 3 - 아미노 프로필 trimethoxys 각 페트리 접시 마이크로 웰의 유리 부분을 덮리안 화학 활성화를위한 7 분 (3-APTES). 폴리스티렌의 열화를 방지하는 페트리 접시에서 플라스틱의 표면에 3-APTES 부주의 떨어지는 않도록주의하여주십시오. </li><li> 7 분 후, DI 워터와 페트리 접시를 작성하고 폐기물 용기에 폐기하십시오. </li><li> 를 반복 한 다음 각 요리에 대한 단계 2.4 배, 그리고 여분의 물을 제거하기 위해 페트리 접시를 흔들. 유리 부분은 물기가 없어 질 때까지 뜨거운 접시에 배양 접시를 놓습니다. </li><li> 핫 플레이트에서 배양 접시를 제거하고 화학 흄 후드에서 평평한 표면으로 돌아갑니다. </li><li> 화학 퓸 후드에서, 0.5 % 글루 타르 알데히드 용액을 잘 30 분 동안 용액으로 각각 페트리 접시의 유리 부분을 커버. 플라스틱의 열화를 방지하는 페트리 접시에서 플라스틱의 표면에 글루 타르 알데히드의 부주의 떨어지는 않도록주의하여주십시오. </li><li> 30 분 후, DI 워터와 페트리 접시를 채우고 씻어 폐기물 용기에 폐기하고 glutarald를 제거ehyde. </li><li> 를 반복 한 다음 각 요리에 대한 단계 2.4 배, 그리고 여분의 물을 제거하기 위해 페트리 접시를 흔들. 유리 부분은 물기가 없어 질 때까지 뜨거운 접시에 배양 접시를 놓습니다. </li><li> PA 겔 용액의 성분을 혼합하기 전에, 유리 바닥 겔의 짧은 협 허용들은 쉽게 접근 할 수 있도록 화학적 흄 후드로 기능화 된 유리 슬라이드를 이동 겔 용액을 혼합 한 후 배양 접시가. </li><li> 15 ㎖의 원심 관에, 표 1에 기재된 농도로 직접 연속적으로 40 % 비스 아크릴 아미드, 2 % 아크릴 아미드, 및 아크릴산을 혼합 행렬 원하는 탄성을 달성하기 위해 (출판 (10)로부터 적응 프로토콜). </li><li> 겔 용액을 완료하기 위해 필요한 매트릭스 탄성에 대응하는 표 1에 열거 개당 100 mM의 HEPES, 10 %의과 황산 암모늄,과 TEMED를 추가한다. </li><li> 즉시 유리 부의 중심에 겔 용액 15 μL 피펫배양 접시의. </li><li> 즉시 핀셋 기능화 된 유리 커버 슬립을 선택합니다. <ol><li> 형광 구슬이 젤 솔루션 측면 만드는 접촉이되도록 위에 유리 커버 슬립 플립. </li><li> 부드럽게 기능화 측 겔 (도 1C)와 접촉되도록 해주기 액체 PA 겔의 상단에 커버 슬립을 놓는다. 주 : 최상의 결과를 위해, 두 번째 사람은 다수의 배양 접시에 액체 PA 겔 용액을 피펫 팅하면서 부분적인 중합을 방지하기 위해 커버 슬립을 추가의 역할을 위해 권장된다. </li></ol></li><li> PA 젤 낮은 수준으로 중합 형광 나노 입자에 중력 효과를 방지 지원하기 위해 모든 페트리 접시를 뒤집습니다. </li><li> PA 젤의 원액이 눈에 띄게 그 원심 분리 관에서 중합했다 적어도 35 분 동안, 또는 때까지 기다립니다. </li><li> 다시 이상 배양 접시를 뒤집어 커버 슬립을 제거 지원하기 위해 PBS로 채운다. </li><li> 조심스럽게 커버 슬립의 둘레를 긁어 핀셋을 사용하여, 배양 접시의 유리 부와 커버 슬립의 개요와 접촉. 커버 슬립이 빠질 때까지 여러주기를 수행합니다. 커버 슬립을 제거하고 적절한 날카로운 물건 폐기 용기에 폐기하십시오. </li><li> 모든 커버 전표를 제거한 후, 형광 구슬은 겔 (그림 1D)에 전송 한 것입니다. 완전히 PBS와 PA 젤 커버 각 접시에 페트리 접시의 뚜껑을 배치하고 4 ° C에서 보관. </li></ol> 3 피브로넥틴과 PA 젤 기능화 <ol><li> 설립 프로토콜 11에 설명 된대로 다음과 같은 예 혼합 솔루션을 준비 : 솔루션을 적시 (137 mM의 NaCl을, 5 % (v / v)로 글리세롤) 및 2 배 접합 버퍼 (0.2 M 2 (N의 -morpholino) 에탄 술폰산 (MES), 10 % (v / v)로 글리세롤, 산도 4.5). </li><li> PA 겔을 함유하는 유리 - 바닥 접시에서 모든 PBS를 제거하는 생물학적 후드에서 진공 펌프를 사용한다. </li><li> 피펫테 겔이 완전히 침수 될 수 있도록 각 젤에 솔루션을 흡수. 적어도 1 시간 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 온난 한 에틸 3 - [3 - 디메틸 아미노 프로필] 카르 보디이 미드 히드로 클로라이드 (EDC) 및 실온의 N -hydroxysulfosuccinimide (NHS). </li><li> EDC의 10 배 용액 (150 mM의 DI 물에, 19 ㎎ / ㎖) 및 NHS (250 mM의 DI 물에, 29 ㎎ / ㎖)를 혼합한다. </li><li> 1 부를보기 배 EDC, NHS 1 부를 10 배, 3 부 DI 물, 및 5 중량 배 공액 버퍼를 섞는다. </li><li> 흡수 용액을 제거하는 생물학적 후드에서 진공 펌프를 사용합니다. 모든 유체가 겔 표면으로부터 제거되어 있는지 확인합니다. </li><li> 겔 표면을 커버하고 페트리 접시 (150 ~ 250 μL)의 유리 바닥을 잘 채울 수있는 충분한 NHS / EDC 솔루션을 추가합니다. 어둠 속에서 30 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 실온에서 해동 피브로넥틴. 일단 해동, 50 μg / ml의 피브로넥틴 솔루션을 만들기 위해 멸균 DI 물을 섞는다. </li><li> NHS / EDC의 솔루을 제거하는 생물학적 후드에서 진공 펌프를 사용하여기. 모든 유체가 겔 표면으로부터 제거되어 있는지 확인합니다. </li><li> 각 겔에 피브로넥틴 용액 150 μl를 추가합니다. 피브로넥틴의 부착을 허용하기 위해 35 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 35 분 후 최대 2 주 동안 4 ° C에서 각 페트리 접시 및 저장에 PBS를 추가합니다. </li></ol> 4 트랙션 포스 실험 <ol><li> 물을 욕조에 따뜻한 세포 미디어, PBS, 37 ° C에 트립신. </li><li> 젤 린스 사이에 PBS를 흡입, 멸균 PBS로 5 배, 그리고 후드에 덮여있는 상태로 둡니다 씻어. </li><li> 플라스크를 포함하는 셀에 1 ㎖의 트립신이 25cm 당을 추가합니다. 세포가 플라스크에서 해제 된 후, 세포 미디어 트립신을 희석 세포를 계산합니다. 겔 표면 영역에 기초하여, / cm 2 3,000 세포의 최종 세포 밀도 시드 젤 당 필요한 세포의 수를 결정한다. 희석 또는 셀 미디어 혼합물의 150 μL 세포의 숫자를 포함하도록 서스펜션을 집중한다. 세포 suspens의 나누어지는 150 μL각 젤에 이온. </li><li> 30 분 동안 인큐베이터에서 세포를 포함하는 페트리 접시를 놓습니다. 이어서, 신중 배양 접시를 제거하고 접시의 표면이 완전히 잠기도록 용지 (약 2 mL)로 페트리 접시의 나머지 부분을 채운다. </li><li> 이미지 수집 될 때까지 배양기에서 배양 접시를 다시 배치합니다. </li><li> , 미분 간섭 대비 (DIC) 프리즘을 삽입, 40 배 침수 목적을 삽입 mCherry 또는 이에 상응하는 형광 필터를 선택하고 환경 챔버를 켜 : 이미징 현미경 및 데이터 수집 시스템을 준비합니다. </li><li> 영상을 준비 할 때, 인큐베이터에서 한 페트리 접시를 제거하고 현미경 무대에 조심스럽게 놓습니다. DIC 이미징 페트리 접시의 뚜껑을 제거합니다. </li><li> 하나의 셀을 찾아 DIC의 셀의 하나의 정지 영상을 캡처합니다. </li><li> 현미경 스테이지를 이동하지 않고 형광하는 촬상 모드를 전환. 형광 마이크로 및 녹화에 초점미소 구체의 화상 함수 ord. </li><li> 조심스럽게 피펫으로 배양 접시에서 세포 미디어를 제거하고 0.05 % 트립신-EDTA를 추가합니다. </li><li> 이미지 셀 후 셀 아래 미소 구는 분리했다. </li><li> ImageJ에 12에서 사용 입자 영상 유속계 (PIV) 분석에 의한 세포 힘 변위 필드를 계산합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

이 방법을 사용할 때, 비드 용액 적절히 희석 및 비즈 원하는 직경에 기초하여 선택되는 것이 필수적이며, PA 겔 기판 강성이고 원하는 실험 탐구되는 현상의 크기 스케일. 상단 유리 커버 슬립을 기능화하기 전에 비드 솔루션을 희석 할 때주의를 기울여야한다. 겔 표면에 구슬 사이의 간격은 콜로이드 용액의 희석 배수를 변화시킴으로써 변경 될 수있다. 너무 용액을 희석하여 커버 슬립에 그 커플 구슬의 수를 감소시키고, 궁극적으로 겔 비드의 수를 감소시킬 것이다. 너무 적은 용액을 희석하는 것은 그들이 접촉과 서로 구별 될 수 없도록 겔 비드 너무 높은 밀도를 얻을 수있다. 완전히 통합 된 나노 입자의 존재를 방지하는 것이 불가능하지만, 희석 한 용액에 초음파의인가는 효과적으로 최소화 유모oparticle 집계. 우리는이 프로토콜에서 이용 콜로이드 용액의 10000 배 희석액을 3.64 × 10 8 비드 / ㎖의 비드 농도를 제공하고, 0.1 μm의 직경 구슬 0...

로컬 환경과 살아있는 세포의 기계적 상호 작용은 일반적으로 PA 젤을 이용하여 연구하고있다. 이러한 기판이 기판의 주요 이점 중 하나. 한 1997 Dembo 및 왕에 의해 설립 간단한 잘 특성화 프로토콜에 의존하는 그들의 강성 겔 용액의 특정 구성 요소의 농도를 변경함으로써 조절 될 수 있다는 것이다. 이것은 서로 다른 강성의 환경과 세포의 상호 작용을 연구하는 것이 바람직 플랫폼을 제공합니다. PA 젤은 세포 외 기질 (ECM) 단백질로 코팅하는 경우, 세포가 힘을 생성,이를 준수합니다. 셀 힘의 결과로,이 겔 탄성체로 변형된다. 이 변형은 세포 및 겔의 탄성 특성에 의해 가해지는 힘의 크기에 따라 달라진다. 다양한 연구 셀룰러 견인 세력을 조사하기 위해 PA 젤을 사용했다. PA 겔 제조의 한 변형에서, 형광 마이크로 스피어 (구슬) t을 포함하는다른 경직성이의 젤에 세포 견인 힘을 정량화하기 위해 젤을 hroughout. 셀 힘 부여되면, 비즈 겔 변형 전의 초기 위치로부터 변위. 변형 필드는 각각의 비드로부터의 변위를 측정한다. 이 변형 필드는 탄성 이론 및 견인력을 계산하는 겔의 탄성 특성과 함께 이용된다. 이러한 측정은 세포가 기계적으로 감지하고 해당 지역의 미세 세와 상호 작용하는 방법에 대한 통찰력을 제공합니다. 많은 널리 사용되는 PA 겔 제조 프로토콜에서 구슬은 액체의 비중 합 상태에서 PA 젤에 걸쳐 혼합된다. 완전히 중합 PA 젤은 볼륨에 걸쳐 형광 구슬이 포함되어 있습니다. 셀 견인력을 계산할 때, 겔 표면 (셀 기판 계면)에 가까운 가장 구슬 모니터링된다. 이러한 비드의 변위는 하중 calculatio의 간략화를 위해 세포 배양 표면에서 발생하는 것으로 가정명. 겔의 깊이 내의 비드의 실제 위치는 무시된다. 그러나, 탄성 매체 (예 PA 겔 등), 힘 적용 점에 가까운 비드 멀리 포인트로부터 비드보다 더 이동한다. 따라서, 셀룰러 트랙션의 과소에 표면에 그 결과로서 표면으로부터 말단 (비드 위치에서) 점의 변위를 치료. 에러의 정도는 표면으로부터의 비드의 거리에 의존한다. 오류가 비드의 위치의 지식없이 추정 될 수 없다. 매우 세포 배양 표면 근처 비드를 한정하는 간단한 방법의 필요성이 몇 가지 기술에 의해 해결되었다. 하나의 방법은 매우 표면 근처 움직임을 측정하는 상부 초점면에 비드 충분한 숫자가되도록 전체에 걸쳐 겔 비드의 밀도를 증가시키는 것이다. 또 다른 기술은 광으로부터 생균 이미징 촛점 촬상 챔버 건물 포함최상위 초점 평면에서만 비드 (4)를 수집한다. 다른 방법은 구슬 다섯없이 이미 중합 된 겔의 상단에 구슬을 포함하는 PA 젤의 매우 얇은 층을 오버레이 포함한다. 이러한 기술의 각각의 단점은 겔 내의 비드의 정확한 위치를 알 수없는 점이다. 이 비드의 변위 필드, 따라서 세포의 힘의 계산의 계산에 오류를 소개한다. 또 다른 기술은 설포 SANPAH 6을 이용하여 이미 중합 PA 겔의 상면에 접합 비드를 포함한다. 이 기술은 비드 만 PA 겔 위에 실로 보장하지만, 그들은 겔의 깊이에 매립되어있는 정도를 알 수있다. 이전 작품은 세포가 힘 마이크론 멀리 칠을 감지 할 수 있음을 제안했다 이것은 잠재적으로 세포의 동작을 변경할 수있는 세포에 대한 지역의 지형을 만들 수 있습니다. 최근에, 1 μm의 직경 F와 PA 젤을 패터닝하는 기술정규화 배열 luorescent 피브로넥틴 도트 마커 팔을 설립되었습니다. 이 경우, 형광 마커의 깊이가 알려져 있으며, 피브로넥틴 패턴 간접적 겔 표면 상에 인쇄 될 때, 본질적으로 제로이다. 그러나,이 방법은 ECM 단백질 1 μm의 직경 도트로 한정되는 바와 같이 세포가 부착 할 수있는 연속적인 환경을 제공하지 않는다. 완전히 매우 표면 근처 알려진 위치 PA 겔 내에 추적기 구슬을 통합하고이를 한정하는 방법이 아직 확립되어야한다. 여기서, 우리는 매우 PA 겔 내의 세포 배양 표면 근처 초점면에 μm의 직경 형광 비드 부 μM을 제한하는 기술을 개발한다. 겔은 전형적으로 두 개의 유리판 사이에 미 중합 액체 겔 용액을 개재하여 경화된다. 겔에 강하게 밀착되도록 플레이트 중 하나가 작용된다. 다른 작용 화하고 겔 경화 후에 제거된다. 우리는이 이동식 유리 스와 수정비즈의 층으로 코팅하여 rface. 기능화 및 비드 코팅 유리 표면 사이의 액체 겔을 끼운 후, 겔 비드 전송은 경화된다. 이것은 표면의 1.6 μM 내의 겔화 구슬 &#39;통합의 거리를 제한한다. 유리 바닥 페트리 접시는 젤이 경화되는 부착면으로 사용된다. 중합시 겔 평면형 표면을 형성하도록, 원형 유리 커버 슬립이 샌드위치에 유리 바닥 페트리 접시와 겔을 사용한다. 겔의 제조에 앞서, 상부 유리 커버 슬립은 양성 표면 전하를 산출, 폴리-D-라이신 (PDL)로 코팅된다. PDL은 압축 공기를 분출하고, 물에 비드 용액 커버 슬립 상에 증착된다. 우리는 음전하를 운반 카르 형광 마이크로 비즈를 이용하고, PDL로 처리하여 생성 된 양으로 대전 된 표면과 상호 작용. 압축 공기의 단일 층 커버 슬립 오프 비드 용액을 불어 후에구슬은 정전 건조 커버 슬립에 연결 상태를 유지합니다. 유리 슬라이드가 완전히 손상되지 않은 그대로 PA 겔로부터 제거됨에 따라 PDL 코팅은 겔 표면에 유리의 접착에 영향을 미치지 않는다. 유리 바닥 페트리 접시는 97 % 3 - 아미노 프로필 - trimethoxysliane 및 0.5 % 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde)로 처리하여 부착 만들어집니다. 원하는 경직성의 PA 젤은 표준 절차 구를 통해 비스 아크릴 아미드와 아크릴 아미드의 적절한 농도를 혼합하여 만들어집니다. 겔 용액의 액체 방울은 유리 바닥 배양 접시 상에 피펫 팅한다. 비드를 함유 유리 커버 슬립이 샌드위치에 페트리 접시와 겔을 사용한다. 겔이 경화 될 때, 상단 커버 슬립은 표면으로부터 1.6 μM 내에 PA 겔에 포함 된 비드를 남겨 제거된다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">시약</td></tr><tr><td>97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>70% 글루타르알데히드</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>111-30-8</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES 완충 용액</td><td>시그마 -알드리치</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>40 % 아크릴 아미드</td><td>시그마 -알드리치</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>2 % 비 사 크릴 아미드</td><td>시그마 -알드리치</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>0.1 &마이크로; m 형광 미세구체(mCherry)</td><td>Invitrogen</td><td>F8801</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin, Human, 1 mg</td><td>BD Biosciences</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모</td>늄 <td>Bio-RAD</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)</td><td>Bio-RAD</td><td>161-0801</td><td></td></tr><tr><td>폴리-D-라이신</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 염산염(EDC)&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-하이드록시설포숙신이미드 (NHS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 트립신-EDTA (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>아크릴산&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>147230</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>35 mm 유리 바닥 접시, 14mm 마이크로 웰 #1 커버 유리</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D35-14-1-N</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버 슬립, 12mm 직경. </td><td>테드 펠라, Inc.</td><td>26023</td><td></td></tr></tbody></table>년

견인 힘 현미경의 세포 배양 표면 근처 지역화 기자 형광 구슬을위한 새로운 방법

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA 젤 긴 제조 및 조정 자신의 탄성을 할 수있는 기능의 용이성으로 인해 세포 견인 힘을 연구하기위한 플랫폼으로 사용되어왔다. 기판은 세포 외 기질 단백질로 코팅되는 경우, 세포 부착 및 겔 겔 변형 일으키는 힘을 적용한다. 변형은 세포 견인 및 겔의 탄성 특성에 의존한다. 표면 변형 필드가 알려진 경우, 표면 정지 마찰은 탄성 론을 이용하여 계산 될 수있다. 겔 변형은 일반적으로 균일하게 겔화 형광 마커 비드 매립에 의해 측정된다. 젤 변형으로 프로브는 변위. 겔의 표면 근처에 프로브를 추적됩니다. 이러한 프로브에 의해보고 된 변위는 표면 변위로 간주됩니다. 표면에서 그들의 깊이는 무시됩니다. 이 가정은 견인력 평가에 오류를 소개합니다. 비드의 위치가 알려 져야하는 셀의 힘의 정확한 측정을 위해, 중요하다. 우리는 개발표면의 1.6 μm의 내 PA 젤에, 형광 마커 구슬, 직경 0.1 μm의 한을 제한하는 간단한 화학을 활용하는 기술. 우리는 코트 폴리-D-라이신 (PDL)과 형광 구슬 커버 슬립. PA 겔 용액을 커버 슬립과 접착면 사이에 개재된다. 형광 비드가 경화 중에 겔 용액에 옮긴다. 중합 후, PA 겔은 겔 표면에 비행기 주변에 형광 구슬이 포함되어 있습니다.

공 초점 이미징은 비즈 겔 표면 아래에 실제로 있다고 결정하고 젤 깊이 내 자신의 정확한 위치를 정량화하기 위해 사용되었다. 겔 내부 것과 다른 파장의 형광 비드 표면에 정착하도록 허용하고, 임베디드 형광 나노 입자 및 그 표면 사이의 거리가 중심 식별 알고리즘을 이용하여 계산 하였다. 겔 표면 상에 비드의 위치는 겔 세포가 표면에 부착시에 힘을인가의 상면에 대한 기준으로서 역할을한다. (적색 표면에 비즈, 반대로 함께 겔 녹색 비드) 고려 두 시나리오의 개략도가도 3에 도시된다. 알고리즘은 입체 중심 위치의 z-높이를 보간한다. 우리는 세 강성 젤 (1, 10, 40 kPa의) 두 개의 크기 (직경) 형광 구슬이 과정을 반복 (0.1 μm의 빨간색과 1 μm의 노란색, 녹색). 거리겔 내에서 비드와 다른 파장의 가장 가까운 이웃 사이에 결정되는 입체 중심을 기준으로했다. 4 구슬의 공간 분포를 보여줍니다 (상면 및 임베디드)와 YZ 평면에 투영 된 뷰 <strong...

형광 프로브를 함유하는 폴리 아크릴 아미드 (PA) 겔을 제조하기위한 전통적인 기술은 접착 표면 및 유리 슬라이드 사이에 겔을 개재 포함한다. 여기서, 우리는 폴리-D-라이신 (PDL) 및 형광 프로브이 슬라이드 코팅은 겔 표면으로부터 1.6 μM 내로 프로브 지역화 것을 보여준다.

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

이 절차의 전반적인 목표는 겔 표면 근처에 형광 미세구가 내장된 세포 배양을 위한 폴리 아크릴아미드 또는 PA 겔을 제작하는 것입니다. 이는 먼저 폴리 D 라이신으로 유리 커버 슬립을 기능화함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 유리 커버 슬립을 형광 마이크로스피어가 포함된 용액으로 코팅하는 것입니다.다음으로 PA 겔은 적절한 농도의 비스, 아크릴아미드 및 아크릴아미드를 혼합하여 제조되며, 기본 표면과 유리 커버 슬립의 기능화된 면 사이에 끼워져 있습니다. 마지막 단계는 겔 표면에 세포외 기질 단백질과 배양 세포로 겔을 기능화하는 것입니다. 궁극적으로, 견인력 현미경 검사는 세포 유도 기질 변형의 결과로 세포가 가하는 기계적 힘을 측정하는 데 사용됩니다.기존 PHL 제조와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 형광 마이크로스피어를 겔 깊이 내의 알려진 위치로 국소화하여 세포 견인력을 보다 정확하게 계산할 수 있다는 것입니다. 형광 비트가 PHL First Place로 적절하게 전달되도록 하기 위해 유리 커버 슬립을 기능화할 때 공간 경화를 수행해야 하므로 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 이전에 청소한 유리 덮개는 강판 표면에서 미끄러져 닿지 않습니다.커버 슬립과 쉽게 상호 작용할 수 있도록 커버 슬립의 전체 표면을 1시간 동안 폴리D 라이신(poly D lysine)당 밀리리터당 0.1mg으로 코팅합니다. 이 시간 도중, 1개에서 10, 0.1 마이크로미터 직경의 교질 해결책의 000 희석을 실행하십시오. 겔 표면에서 20제곱 미크론당 약 1마이크로스피어의 입자 밀도를 얻기 위해 탈이온수가 있는 적색 형광 마이크로스피어.희석된 용액을 초음파 수조에 30분 동안 넣습니다. 1시간 후 핀셋을 사용하여 각 커버 슬립을 조심스럽게 들어 올리고 공기로 말리십시오. 그런 다음 마른 덮개 슬립을 강판 표면으로 되돌립니다.희석된 콜로이드 용액이 초음파 수조에서 제거되면 용액 150마이크로리터를 각 덮개에 피펫으로 밀어 넣습니다. 10분 후 핀셋을 사용하여 각 커버 슬립을 조심스럽게 들어 올리고 공기로 말리십시오. 드라이 커버 슬립이 등급이 매겨진 표면으로 되돌려 놓으면 사용할 준비가 될 때까지 어두운 곳에 보관하십시오.다음으로, 화학 흄 후드의 평평한 표면에 원하는 수의 유리 바닥 페트리 접시를 배치합니다. 각 페트리 접시의 유리 부분을 덮습니다. 화학 활성화를 위한 7 분 동안 3개의 아미노 프로필 트리메틸의 97%를 가진 마이크로 우물.7분 후 페트리 접시에 탈이온수를 채우고 용액을 쓰레기통에 버리십시오. 각 페트리 접시의 유리 부분을 조심스럽게 덮습니다. 미리 준비한 0.5% 글루타르알데히드 용액으로 30분 동안 사용합니다.30분 후 페트리 접시에 탈이온수를 채우고 쓰레기통에 버리면 글루타르알데히드 가죽을 헹구고 제거할 수 있습니다. 폴리 아크릴아미드 겔 용액의 구성 요소를 혼합하기 전에 기능화된 유리 슬라이드를 화학 흄 후드로 이동하여 쉽게 접근할 수 있도록 하여 유리 바닥 페트리 접시와 젤을 빠르게 끼울 수 있습니다. 15 밀리리터 분리기 튜브에 겔 용액을 혼합 한 후 40 % bis 아크릴 아미드, 2 % 아크릴 아미드 및 아크릴산을 즉시 연속으로 혼합합니다.원하는 매트릭스 탄성을 달성하려면 100밀리몰 HEP, 황산염당 10%암모늄을 추가하고 원하는 매트릭스 탄성에 해당하는 양으로 팀을 이룹니다. 젤 용액을 완성하려면 즉시 15마이크로리터의 젤 용액을 페트리 접시의 유리 부분 중앙에 피펫으로 주입합니다. 핀셋으로 기능적인 유리 커버 슬립을 집어 든 후 형광 구슬이 젤 용액과 접촉하는 측면에 있도록 뒤집습니다.그런 다음 기능화된 면이 젤과 접촉하도록 이제 액체인 폴리 아크릴아미드 젤 위에 덮개를 부드럽게 놓습니다. 그런 다음 형광 나노 입자에 대한 중력 효과를 피하기 위해 모든 페트리 접시를 뒤집습니다. 폴리 아크릴아미드 겔의 낮은 수준으로 중합.중합 후 페트리 접시를 다시 뒤집고 BS로 채웁니다. 핀셋을 사용하여 페트리 접시의 유리 부분과 커버 슬립의 윤곽을 조심스럽게 접촉하여 커버 슬립의 둘레를 긁습니다. 여러 번의 스크래핑 주기에 따라. 커버 슬립을 제거하고 적절한 날카로운 쓰레기통에 버리십시오.커버 슬립을 모두 제거한 후 각 접시에 페트리 접시 뚜껑을 놓고 섭씨 4도에서 보관하십시오. 폴리아크릴아미드 겔이 실온으로 따뜻해지면 생물학적 후드의 진공 펌프를 사용하여 겔이 완전히 잠기도록 각 겔에 미리 준비한 겔 피펫이 담긴 유리 바닥 접시에서 PBS를 모두 제거합니다. 실온에서 최소 1시간 동안 배양한 후 미리 준비된 H-S-E-D-C 용액 150-250마이크로리터를 첨가하여 겔 표면을 덮고 페트리 접시의 유리 바닥 웰을 채웁니다.그런 다음 어두운 곳에서 30분 동안 실온에서 젤을 배양합니다. N-H-S-E-D-C 용액이 진공으로 제거되면 이전에 준비된 피브로넥틴 용액 150마이크로리터를 각 겔에 추가합니다. 다시 한 번, 피브로넥틴이 부착될 수 있도록 실온에서 35분 동안 배양합니다.이 시점에서 수조에서 세포 매체 PBS와 트립신을 섭씨 37도까지 가열합니다. 멸균 된 탈 이온수로 젤을 5 번 헹굽니다. 헹굼 사이에 물을 흡입하고 젤을 덮고 후드에 남겨 둡니다.25제곱센티미터당 1밀리리터의 트립신을 세포가 들어 있는 플라스크에 추가합니다. 플라스크에서 세포를 꺼낸 후 트립신을 세포 배지로 희석합니다. 그런 다음 겔 표면적을 기준으로 혈구 분석기를 사용하여 세포를 계산합니다.평방 센티미터당 3000개의 세포의 최종 세포 안착 밀도를 위해 겔당 필요한 세포 수를 결정하고, 150마이크로리터의 세포 배지 혼합물에 이 수의 세포가 포함되도록 현탁액을 희석 또는 농축합니다. 그런 다음 Eloqua는 각 젤에 50 마이크로 리터의 세포 현탁액을 주입합니다. 이 장소를 따라 Petri는 세포가 들어있는 접시를 30 분 동안 인큐베이터에서 추출합니다.인큐베이터에서 페트리 접시를 조심스럽게 꺼낸 후 접시 표면이 완전히 잠기도록 나머지 페트리 접시에 약 2밀리리터의 매체를 채웁니다. 이미지를 획득할 때까지 페트리 접시를 인큐베이터에 다시 놓습니다. 이미징을 위해 준비되면 페트리 접시 중 하나를 현미경 스테이지에 부드럽게 놓습니다.DIC 이미징을 위해 페트리 접시 뚜껑을 제거한 후 단일 세포를 찾고 현미경 스테이지를 이동하지 않고 DIC에서 세포의 단일 스틸 이미지를 캡처합니다. 이미징 모드를 형광으로 전환합니다. 형광 미세구에 초점을 맞추고 미세구의 이미지를 기록합니다.피펫으로 페트리 접시에서 세포 매체를 조심스럽게 제거하고 0.05%트립신 EDTA를 추가합니다. DIC 이미지에 초점을 맞추면 세포가 분리된 겔이 표시됩니다. 그런 다음 세포가 분리된 후 세포 아래의 미세구를 이미지화합니다.컨포칼 이미징을 사용하여 비드가 겔 표면 아래에 있는지 확인하고 정확한 위치를 정량화하기 위해 겔 내부와 다른 크기 및 파장의 형광 비드가 표면에 침전되도록 했습니다. 침전된 비드의 위치는 세포가 부착에 힘을 가하는 겔의 상단 표면에 대한 기준 역할을 합니다. 컨포칼 이미징 후, 내장된 형광 나노 입자와 표면의 나노 입자 사이의 거리를 계산했습니다.이 거리는 겔 내 비드의 정확한 깊이를 결정했습니다. 여기에 표시된 것은 YZ 평면의 비드 공간 분포 및 투영 뷰입니다. 사다리는 젤 표면에서 모든 구슬의 깊이를 제공합니다.0.1 미크론 비드의 평균 깊이는 619 나노 미터, 467 나노 미터, 278 나노 미터, 강성의 폴리 아크릴 아미드 겔의 경우 각각 10 및 40 킬로 파스칼입니다. 1 미크론 직경의 비드에 해당하는 깊이는 40 킬로 파스칼 겔에서 20 나노 미터, 10 겔에서 12 나노 미터, 1 킬로 파스칼 겔에서 1, 255 나노 미터입니다. 겔 전체에 분산된 비드의 깊이를 측정하고 깊이와 비교했습니다.제시된 기술을 사용합니다. 전통적인 제조 방법을 사용한 폴리 아크릴아미드 겔의 깊이 내에서의 비드 분산 변동성이 여기에 나와 있습니다. 섬유아세포 및 해당 형광 구슬 층에 대한 치환 필드가 여기에 나와 있습니다.이미지 주변 근처의 비드는 초점이 약간 맞지 않게 나타나는데, 이는 침수 대물렌즈로 인한 광학 효과입니다. 트립신이 첨가되면 세포가 표면에서 방출되어 변형된 폴리 아크릴아미드 겔 표면이 원래 상태로 돌아갑니다. 이 PHL 제조 및 기능화 기술을 마스터하면 제대로 수행되면 6시간 내에 완료할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 세포 배양 표면 근처의 겔 깊이 내의 알려진 위치에 국한된 형광 마이크로스피어를 사용하여 폴리 아크릴아미드 겔을 제조하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 세포 견인력을 보다 정확하게 계산할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오는 견인력 현미경 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 형광 비드가 내장된 연질 탄성 하이드로겔에 존재하는 세포외 기질에서 인간 대장암 세포의 세포 견인을 측정합니다. 형광 비드의 결과 변위는 적절한 소프트웨어를 사용하여 측정됩니다.

견인 세포 분석 분석: ECM에서 암세포가 가하는 견인력을 정량화하는 방법

이 동영상은 형광 변동 분광법(fluorescence fluctuation spectroscopy)을 사용하여 세포 간 접촉에서 세포 표면 단백질 간의 상호 작용을 감지하는 방법을 보여줍니다. 형광 단백질로 표지된 관심 대상인 막관통 접착 수용체를 발현하고 스펙트럼으로 분리된 두 개의 형광 표지를 가진 두 개의 서로 다른 세포 집단을 혼합함으로써, 서로 다른 색의 형광을 가진 두 인접 세포의 수용체 간의 trans-interaction은 형광 강도 변동의 교차 상관관계를 통해 평가됩니다.

세포 접촉에서 단백질 상호 작용을 연구하기 위한 형광 변동 분광법(Fluorescence Fluctuation Spectroscopy)

우리는 단일 T 림프구에서 힘 조절 단일 수용체-리간드 결합 역학과 칼슘 신호의 실시간 이미징을 동시에 측정하는 기술을 설명합니다.

형광 생체막 포스 프로브 : 하나의 세포에서 수용체 - 리간드 속도론의 동시 정량 및 바인딩에 의한 세포 내 신호

이들은 기계적 장력 송신 조직 항상성 및 개발에 관여하는 신호 전달 경로를 시작으로 세포 표면 유착은 mechanotransduction 중앙이다. 여기서는 리간드 피복 된 자성 마이크로 비드 접착 수용체 포스 응용 프로그램을 사용하여, 인장에 응답하여 활성화되는 생화학 적 경로를 해부위한 프로토콜을 제시한다.

자석 구슬을 사용하여 기계 인장에 대한 응답으로 세포 표면 접착 리모델링 분석

여기, 선물이 포스터 공명의 동시 사용에 대 한 프로토콜 에너지 전송 기반 긴장 센서 측정 단백질 역학 힘 민감한 측정을 사용 하는 photobleaching 후 단백질 부하 및 형광 복구를 측정 하 살아있는 세포 내 단백질 역학입니다.

살아있는 세포 형광 기술의 조합을 사용 하 여 힘에 민감한 단백질 역학의 측정

이 프로토콜은 참조가 없는 견인력 현미경으로 사용하기 위해 폴리(에틸렌 글리콜) 기반 하이드로겔에 내장된 형광 선한 마커의 3차원 배열을 제작하기 위해 다광자 리소그래피를 구현하기 위한 지침을 제공합니다. 플랫폼. 이 지침을 사용하여 3D 재료 변형률 측정 및 셀룰러 견인 계산이 단순화되어 고처리량 견인력 측정을 촉진합니다.

레퍼런스 프리 견인력 현미경 플랫폼 제작 및 구현

개발에 집단 세포 이동, 상처 치유, 그리고 암 전이 종종 성장 인자 또는 신호 분자의 그라데이션에 의해 유도. 여기에 설명된 견인 현미경과 미세 유체 시스템을 결합한 실험 시스템과 생화학 구이도하에서 집단 이동의 역학을 정량화하는 방법에 대한 데모입니다.

화학적 집단 이동을 위한 미세 유체와 통합된 견인 현미경 검사법

여기서 우리는 B 세포에 견인력 현미경 실험을 수행하는 데 사용되는 프로토콜을 제시한다. 우리는 연약한 폴리 아크릴아미드 젤의 준비와 그 기능성, 현미경에서의 데이터 수집 및 데이터 분석의 요약을 설명합니다.

B 림프구 활성화를 연구하는 견인력 현미경 검사법

이 프로토콜은 빠른 세포 롤링 접착 중에 접착 이벤트를 이미지화하기 위해 접착 발자국 분석기를 수행하는 실험 절차를 제시합니다.

접착 발자국 분석에 의한 세포 압연의 이미징 분자 접착

거의 UV 리소그래피 및 견인력 현미경 검사법은 마이크로패턴 하이드로겔의 세포력을 측정하기 위해 결합됩니다. 단일 셀의 표적 광 유도 방출은 동일한 샘플에서 많은 수의 측정을 가능하게 합니다.

견인력 현미경 검사법의 응용을 위한 하이드로겔 패터닝 기술을 사용하여 세포 접착 제어

진급하려면 성장 콘이 외부 환경에 대한 견인력을 발휘해야 합니다. 견인력의 생성은 액틴 역학 및 클러치 커플링에 의존합니다. 본 연구는 성장 콘 발전을 위한 액틴 역학, 클러치 커플링 및 견인력을 분석하는 방법을 설명합니다.

액틴 다이내믹스, 클러치 커플링, 성장 콘 발전을 위한 견인력 분석

배우세요 견인 힘 현미경을 위한 폴리아크릴아미드 겔 제조법입니다. 형광 미소구체를 겔 표면 근처 1.6 µm 이내에 정밀 배치하여 세포가 가하는 기계적 힘을 정확히 측정할 수 있습니다.

견인 힘 현미경의 세포 배양 표면 근처 지역화 기자 형광 구슬을위한 새로운 방법

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