단일 세포 및 3D 감금 단일 배아 주문 : 하이 콘텐츠 스크리닝을위한 새로운 장치

다음 실험의 전반적인 목표는 생리학적 조건에서 발생하는 3D 환경을 모방한 일련의 미세공동에서 세포 소기관의 형태와 역학을 관찰하는 것입니다. 핵분열 효모와 같은 단단한 벽을 가진 세포의 경우, 충치가 세포 구조를 조직하고 방향을 잡을 수 있습니다. 이것은 먼저 마스터에서 PDMS 기둥 배열을 제작하여 복제 성형을 통해 달걀 컵이라고 하는 PDMS 미세 공동 배열을 얻음으로써 달성됩니다.

두 번째 단계로, 난자 컵은 세포 외 기질의 단백질로 기능화되고 원통형 맞춤형 플라스틱 조각이 있는 튜브에 도입되어 미세공동 샘플을 지지하고 각 미세공동에 개별 포유류 세포를 도입할 수 있습니다. 다음으로, 세포로 채워진 난자 컵을 제거하고 3D 감금에서 세포의 표현형 및 동적 과정을 연구하기 위해 관심 약물 또는 화합물과 함께 배양합니다. 세포의 방향에 따라 표준 2D 체외 분석과 비교할 때 관찰되는 세포 표현형 및 새로운 동적 구조의 차이를 보여주는 결과를 얻을

표준 2D 세포 배양 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 난자 컵의 포유류 세포가 논리적 미시환경과 유사한 3D 환경을 경험하지만 정렬되고 표준화된 등급으로 배열된다는 것입니다. 순서와 방향은 또한 핵분열 효모의 경우 상당한 개선입니다. 이 방법은 세포 골격 및 약물 발견 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 High Content Screening을 통해 신약 및 항암 약물을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 의미는 암과 같은 다중 요인 질병의 진단으로 확장되는데, 약물 스크리닝 분석은 달걀 컵을 통해 쉽게 수행 및 분석할 수 있기 때문에 이 방법은 개인 맞춤형 의료에 특히 흥미롭습니다. 이 방법은 개별 포유류 세포와 핵분열 효모 세포의 조직화된 구조와 역학에 대한 내부 열쇠를 제공할 수 있으며, C.elegans 및 ri-so-flu-a와 같은 배아 개발, 조직 연구에도 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 일련의 마이크로 캐비티 또는 달걀 컵이 복제 성형에 의해 커버 슬립에 부착된 폴리디메틸실록산 또는 PDMS 층에 패턴화됩니다.

첫 번째 단계는 마스터의 제작이며, 이는 표시되지 않지만 텍스트 프로토콜에 설명되어 있습니다. 마스터가 만들어지면 다음 단계는 PDMS 복제본을 만드는 것입니다. 50 밀리리터 튜브에 가교제와 프리폴리머를 1:10 중량 대 중량 또는 부피 대 부피 비율로 총 30g으로 철저히 혼합합니다.

튜브를 1, 800회 g에서 5분 동안 원심분리하여 기포를 제거합니다. PDMS를 마스터 위에 부드럽게 떨어뜨립니다. 거품이 나타나면 혼합물의 가스를 제거하십시오.

샘플을 섭씨 65도의 오븐에 4시간 동안 넣습니다. PDMS가 치료된 후 메스를 사용하여 약 10개에서 5번째 미세구멍 또는 달걀 컵을 포함하는 약 1제곱센티미터의 관심 영역을 부드럽게 자릅니다. PDMS 스탬프를 부드럽게 떼어냅니다.

복제 성형 절차를 시작하려면 30초 동안 산소 플라즈마 처리로 PDMS 스탬프를 활성화합니다. 활성화된 stamp는 먼지가 쌓이지 않도록 밀폐된 페트리 접시에 임시로 보관하십시오. 흄 후드에서 작업할 경우, 15밀리리터 캡 옆의 페트리 접시에 구조물이 위를 향하거나 거꾸로 향하도록 활성화된 PDMS 스탬프를 놓습니다.

캡에 200마이크로리터의 트리메틸클로로실란을 채웁니다. 페트리 접시를 닫고 스탬프가 7분 동안 염분화되도록 합니다. PDMS st를 놓습니다.amp구조를 거꾸로 하여 스핀 코터에 넣습니다.

구조물 위에 액체 PDM을 한 방울 떨어뜨립니다. 1500RPM에서 30초 동안 스핀 코팅하여 구조물 위에 PDMS의 얇은 층을 증착합니다. 스탬프를 섭씨 65도의 오븐에 4시간 동안 넣어 침전된 스핀 코팅된 PDMS 층을 경화시킵니다.

다음으로, 산소 플라즈마 세정제에 유리 커버 슬립과 함께 PDMS 스탬프를 거꾸로 30초 동안 배치하여 얇은 PDMS 층을 활성화합니다. 즉시 스탬프를 유리 커버 슬립과 접촉시키고 접착을 위해 핀셋으로 스탬프 표면 전체를 부드럽게 누릅니다. 그 후 약 10초 동안 스탬프 위에 일정한 압력을 유지하십시오.

30분 후, 달걀 컵을 분리하기 위해 커버 슬립에서 스탬프를 부드럽게 떼어냅니다. 샘플을 깨뜨리지 않도록 매우 주의하십시오. 달걀 컵을 에탄올로 철저히 헹구고 말리십시오.

PDMS 달걀 컵이 유리 덮개에 있지 않고 고정 해제 단계에서 미끄러지고 분리된 경우 플라즈마 클리너의 설정을 조정하고 복제 성형 절차를 다시 시작하는 것이 좋습니다. 나중에 샘플을 쉽게 조작할 수 있도록 경화된 PDMS의 작은 조각을 커버 슬립의 가장자리에 접착하는 것이 좋습니다. 이 비디오에 제시된 포유류 세포의 경우, PDMS 표면은 세포외 기질의 접착 단백질로 기능화되어야 합니다.

산소 플라즈마 클리너에 달걀 컵을 30초 동안 친수건조시킵니다. 그 후, 달걀 컵을 자외선으로 5분 동안 살균한다. 난자 컵 전체를 덮을 수 있도록 피브로넥틴 용액을 소량 떨어뜨리고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

샘플이 건조되지 않도록 보호하십시오. 플라스틱 분배 피펫을 사용하여 약 1ml의 PBS로 달걀 컵을 부드럽게 헹굽니다. 총 3회 반복합니다.

다음으로, 맞춤형 원통형 플라스틱 조각을 50ml 튜브에 넣습니다. 튜브에 13ml의 세포 배양 배지를 추가합니다. 매체는 샘플의 완전한 침수를 보장하기 위해 원통형 조각보다 최소 2cm 위에 도달해야 합니다.

날카롭고 곧은 핀셋을 사용하여 PDMS 손잡이로 샘플을 잡고 달걀 컵을 튜브 내부에 조심스럽게 놓고 플라스틱 조각의 위쪽 위에 놓이고 완전히 잠길 때까지 커버 슬립을 부드럽게 누릅니다. 난자 컵에 도입될 세포는 80-100% 포화도로 배양하고 5ml의 배양 배지에 재현탁해야 합니다. 달걀 컵 위에 200 마이크로 리터의 세포를 피펫으로 얹어 달걀 컵 위에 가능한 한 중앙에 세포를 떨어 뜨리되 신체 접촉은 피합니다.

이렇게 하면 샘플의 파손 및/또는 손상을 방지할 수 있습니다. 50 밀리리터 튜브를 1, 800 회 g에서 2 분 동안 원심 분리하십시오. 달걀 컵 위에 또 다른 200 마이크로 리터의 세포를 피펫으로 넣고 1, 800 회 g에서 2 분 동안 다시 원심 분리하십시오.

충전 비율을 최적화하기 위해 총 세 번 반복합니다. 마지막 원심분리 후 현미경으로 계란 컵의 충전 비율을 확인하십시오. 핀셋을 사용하여 PDMS 핸들을 잡고 달걀 컵의 세포를 방해하지 않도록 튜브에서 샘플을 조심스럽게 제거하고 샘플을 배지가 있는 페트리 접시에 넣습니다.

달걀 컵에 없는 여분의 세포를 제거하려면 미세 구조 어레이의 각 측면 옆에서 위아래로 세 번 부드럽게 피펫팅하여 헹굽니다. 마지막으로, 배지를 새로운 배지로 교체하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다. 고정된 세포 소기관을 관찰하려면 고정된 샘플이 든 달걀 컵을 epifluorescence inverted microscope의 스테이지에 놓고 60x oil objective를 선택합니다.

이 예에서 샘플은 골지체, 핵 및 액틴 섬유가 염색된 NIH 3T3 섬유아세포입니다. 난자 컵과 세포가 관찰 평면에 올 때까지 명시야광을 사용하여 조심스럽게 초점을 맞춥니다. 관심 영역을 선택하고 초점을 맞춘 다음 이미지 캡처를 시작합니다.

달걀 컵을 현미경 홀더에 넣고 10%FCS L15 세포 배양 배지 1ml를 채워 이 절차를 시작합니다. s에 홀더를 설치하십시오.tage 현미경의. 증발을 방지하려면 홀더 위에 유리 뚜껑을 놓으십시오.

60x 오일 대물렌즈가 장착된 상형광 도립 현미경으로 세포를 관찰합니다. 이 예는 유사분열 중 사이토카인틱 고리 폐쇄에 관여하는 두 가지 핵심 분자인 형광 표지된 미오신 및 액틴을 발현하는 HeLa 세포를 사용합니다. 관심 영역을 선택하고 GFP 또는 Texas Red 채널을 사용하여 사이토키네틱 고리를 찾습니다.

초점을 정확하게 맞춥니다. 링이 완전히 닫힐 때까지 두 채널 모두에서 자동 수집을 실행합니다. 달걀 컵의 주사 전자 현미경 이미지는 달걀 컵의 모양과 크기가 매우 규칙적임을 보여줍니다.

분열 효모와 같은 단단한 벽을 가진 세포의 경우, 난자 컵은 사이토키네틱 고리의 방향을 지정할 수 있습니다. 포유류 세포의 경우, 3D 난자 컵과 2D 평평한 표면의 세포를 비교하면 전자는 균질한 구형과 같은 표현형을 가진 질서 있는 배열을 형성하는 반면 후자는 무질서하고 이질적인 형태를 나타내는 것으로 나타났습니다. 난자컵에 있는 세포는 또한 스트레스 섬유의 수가 감소하는 것을 보여주는데, 이는 블레비스타틴(Blebbistatin) 치료의 중간 정도의 효과에서 알 수 있습니다.

2D 배양의 골지체는 일반적으로 확장된 표현형을 보이는 반면, 달걀 컵에서는 더 압축된 표현형을 보여줍니다. 이것은 골지체 표현형의 정량화에 의해 확인되었습니다. 마지막으로, 2D 표면에서는 세포핵이 무작위 방향인 반면, 난자 컵에서는 야생형 세포와 블레비스타틴 처리된 세포 모두에서 xy-평면에서 직각 방향입니다.

핵 구형도 값을 측정하면 난자 컵이 세포핵의 정상적인 구형도에 영향을 미치지 않는다는 것이 밝혀집니다. 그러나 난자컵에서 야생형과 블레비스타틴으로 처리된 세포의 차이는 난자컵이 2D로 마스킹된 약물의 실제 효과를 드러내고 있음을 시사합니다. 난자 컵을 사용한 살아있는 세포 연구를 통해 표준 배양에서는 볼 수 없는 새로운 활성 과정을 식별할 수 있습니다.

예를 들어, 유사분열 동안 사이토카네틱 고리가 닫히면서 방사상으로 움직이는 미오신 (myosin)의 주기적인 축적이 HeLa 세포에서 관찰되었습니다. 일단 숙달되면, 달걀 컵은 복제품에서 6시간 이내에 준비할 수 있으며, 세포를 채우는 작업은 약 15분 안에 완료할 수 있습니다. 이 과정을 시도하는 동안 연구 대상 세포에 대한 난자 컵의 크기를 갖는 것이 중요합니다.

이 절차는 대량 스크리닝 활동을 위한 제약 회사의 고함량 스크리닝 플랫폼과 개별 특정 치료법을 평가할 때 환자의 개인화된 진단 분석에 추가로 적용될 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 계란 컵 미세 충치를 제작하고 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 난자 컵은 포유류 세포와 같이 벽이 없는 개별 세포에서 효모 및 배아와 같은 벽이 있는 시스템에 이르기까지 다양한 유사한 시스템에 대한 표준화 및 질서를 생성합니다.