Name: 단일 세포 및 3D 감금 단일 배아 주문 : 하이 콘텐츠 스크리닝을위한 새로운 장치 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: 배우세요 PDMS 마이크로캐비티 어레이를 이용한 3D 세포 배양 기술로 세포 소기관의 형태와 역학을 관찰하는 방법입니다. 이 기술은 2D 배양의 한계를 극복하고 생리학적 조건을 모사하여 약물 스크리닝 및 세포 생물학 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 안티 Giantin 항체, M. Labouesse 랩으로 우리를 제공하기위한 L. Brino (IGBMC 높은 콘텐츠 상영 시설하여 Illkirch, 프랑스)을 인정합니다. C.에 대한 간스 (IGBMC)와 B Séraphin 연구소. 효모 (IGBMC), 분열 효모 세포에 대한 형광 HeLa 세포 (MPI-CBG, 드레스덴), J. 모슬리 (다트머스 의과 대학)와 JQ 우 (오하이오 주립 대학)에 대한 E. Paluch 및 A. 하이 먼 신진에 대한; A. Hoël과 실험 도움 F. Evenou, 기술 지원을위한 C. 릭 (IBMC, 스트라스부르, 프랑스), 및 미세에 도움 JC Jeannot (펨토 - 일, 프랑스). 이 작품은 CNRS, 스트라스부르 대학, Conectus에서 기금에 의해 지원되었다, 라 파운데이션 부문은 라 공들인 MEDICALE와 스트라스부르의 CI-FRC를 붓는다.

<ol><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+Cell-Matrix+Adhesions+to+the+Third+Dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li>
<li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009).</li>
<li>Mandal, K., Balland, M., Bureau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoresponsive+Micropatterned+Substrates+for+Single+Cell+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Thermoresponsive Micropatterned Substrates for Single Cell Studies.</a> PLoS ONE. 7, e37548(2012).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).</li>
<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+the+third+dimension%3A+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> J Cell Sci. , (2012).</li>
<li>Ghibaudo, M., Di Meglio, J. M., Hersen, P., Ladoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+cell+spreading+within+3D-micropatterned+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Mechanics of cell spreading within 3D-micropatterned environments.</a> Lab Chip. 11, 805-812 (2010).</li>
<li>Greiner, A. M., Richter, B., Bastmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-Engineered+3D+Scaffolds+for+Cell+Culture+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Micro-Engineered 3D Scaffolds for Cell Culture Studies.</a> Macromol Biosci. 12, 1301-1314 (2012).</li>
<li>Khetan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation-mediated+cellular+traction+directs+stem+cell+fate+in+covalently+crosslinked+three-dimensional+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels.</a> Nat Mater. 12, 458-465 (2013).</li>
<li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+in+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices.</a> Nat Meth. 7, 969-971 (2010).</li>
<li>Devices and methods for observing the cell division. , WO/2010/092116 (2010).</li>
<li>Ochsner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-well+arrays+for+3D+shape+control+and+high+resolution+analysis+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Micro-well arrays for 3D shape control and high resolution analysis of single cells.</a> Lab Chip. 7, 1074-1077 (2007).</li>
<li>Devices and methods for observing cells with cell wall or invertebrate embryos with oblong eggshell . , WO2013144302 (2012).</li>
<li>Devices and methods for observing eukaryotic cells without cell wall. , WO2013135809 (2012).</li>
<li>Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening%3A+seeing+is+believing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotech%22%5BJournal%5D)">High content screening: seeing is believing.</a> Trends Biotech. 28, 237-245 (2010).</li>
<li>Wolfe, D., Qin, D., Whitesides, G. Microengineering in Biotechnology, Ch 3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolfe%2C+D+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Hughes, M. P., Hoettges, K. F. 583, Humana Press. 81-107 (2010).</li>
<li>Mehling, M., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+Biotech%22%5BJournal%5D)">Microfluidic cell culture.</a> Curr Op Biotech. 25, 95-102 (2014).</li>
<li>Wollrab, V., Thiagarajan, R., Wald, A., Kruse, K., Riveline, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Still+and+rotating+myosin+clusters+determine+cytokinetic+ring+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Still and rotating myosin clusters determine cytokinetic ring constriction.</a> Nat Commun. 7, 11860-11869 (2016).</li>
<li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+single+cells+identifies+a+rare+subset+of+circulating+tumor+cells+with+malignant+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of single cells identifies a rare subset of circulating tumor cells with malignant traits.</a> Integr Biol. 6, 388-398 (2014).</li>
<li>Eberwine, J., Sul, J. Y., Bartfai, T., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">The promise of single-cell sequencing.</a> Nat Meth. 11, 25-27 (2014).</li>
<li>Allen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cell-free+extracts+of+Xenopus+eggs+and+demembranated+sperm+chromatin+for+the+assembly+and+isolation+of+in+vitro-formed+nuclei+for+Western+blotting+and+scanning+electron+microscopy+%28SEM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of cell-free extracts of Xenopus eggs and demembranated sperm chromatin for the assembly and isolation of in vitro-formed nuclei for Western blotting and scanning electron microscopy (SEM).</a> Nat. Protocols. 2, 1173-1179 (2007).</li>
<li>Robbins, E., Marcus, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotically+Synchronized+Mammalian+Cells%3A+a+Simple+Method+for+Obtaining+Large+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitotically Synchronized Mammalian Cells: a Simple Method for Obtaining Large Populations.</a> Science. 144, (1964).</li>
<li>Whitfield, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-loop+binding+protein%2C+the+protein+that+binds+the+3%26%2334%3B+end+of+histone+mRNA%2C+is+cell+cycle+regulated+by+both+translational+and+posttranslational+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Stem-loop binding protein, the protein that binds the 3&#34; end of histone mRNA, is cell cycle regulated by both translational and posttranslational mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 20, (2000).</li>
<li>Straight, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+Temporal+and+Spatial+Control+of+Cytokinesis+with+a+Myosin+II+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dissecting Temporal and Spatial Control of Cytokinesis with a Myosin II Inhibitor.</a> Science. 299, 1743-1747 (2003).</li>
<li>Tang, J., Erikson, R. L., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Checkpoint+kinase+1+%28Chk1%29+is+required+for+mitotic+progression+through+negative+regulation+of+polo-like+kinase+1+%28Plk1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Checkpoint kinase 1 (Chk1) is required for mitotic progression through negative regulation of polo-like kinase 1 (Plk1).</a> Proc Natl Acad Sci. 103, 11964-11969 (2006).</li>
<li>Zahreddine, H., Zhang, H., Diogon, M., Nagamatsu, Y., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRT-1%2FCalreticulin+and+the+E3+Ligase+EEL-1%2FHUWE1+Control+Hemidesmosome+Maturation+in+C.+elegans+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">CRT-1/Calreticulin and the E3 Ligase EEL-1/HUWE1 Control Hemidesmosome Maturation in C. elegans Development.</a> Curr Biol. 20, 322-327 (2010).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+Methods%3A+Synchronization+and+Observation%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation.</a> JoVE. , e4019(2012).</li>
<li>Saha, S., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin-related+protein+Mid1p+coordinates+the+assembly+of+the+cytokinetic+contractile+ring+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Anillin-related protein Mid1p coordinates the assembly of the cytokinetic contractile ring in fission yeast.</a> Mol Biol Cell. 23, 3982-3992 (2012).</li>
<li>Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+Drug+Efficacy+and+Toxicology+in+Three+Dimensions%3A+Using+Synthetic+Extracellular+Matrices+in+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluating Drug Efficacy and Toxicology in Three Dimensions: Using Synthetic Extracellular Matrices in Drug Discovery.</a> Acc Chem Res. 41, 139-148 (2007).</li>
<li>Futamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphobase%2C+an+Encyclopedic+Cell+Morphology+Database%2C+and+Its+Use+for+Drug+Target+Identification%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphobase, an Encyclopedic Cell Morphology Database, and Its Use for Drug Target Identification.</a> Chem Biol. 19, 1620-1630 (2012).</li>
</ol>

우리는 공개 할게 없다.

복제 성형은 &#39;eggcups&#39;를 제조하기 위해 사용 하였다. 제조 공정은 클린 룸을 필요로하지 않는다; 연습이 필요할 수 있지만 그것은 쉽고 간단합니다. 특히, PDMS 스탬프을 떼면 고품질 &#39;eggcups&#39;의 넓은 영역을 생성하기 위해 가장 중요한 단계이다. 이 때문에, 특별한주의가이 단계에서 수행되어야한다. 이 단계를 반복하여 실패한 경우, 실란 화 플라즈마 결합 전에 플라즈마 클리너 파라미터를 최적화하기 위해 고려한다. 부족 실란 화는 PDMS 필름에 스탬프의 강한 고집으로 이어질 것입니다. 이 관찰되면 silanizing 시약 배양 시간이 증가 될 수있다. 다른 기술 및 물질 리간드 (피브로넥틴, 젤라틴, 콜라겐, 등)의 넓은 범위에 작용 화 될 수있는 &#39;eggcups&#39;를 제조하는데 적용될 수 있다는 것을 유의하여야한다. 특히 폴리스티렌 마이크로 공동 용이 CUS 의해 제조 될 수있다핫 엠보싱 기술을 톰-했다. 이 표준 배양 접시에서 얻어진 결과 생체 적합성과 ...

시험 관내 세포 - 기반 검정에서의 전류 (2D) 이차원이다. 이 구성은 포유 동물 세포에 대한 자연 아니므 한 생리 관련이 없다; 세포 모양, 크기 및 이기종 표현형의 다양성을 보여줍니다. 같은 비행기 및 세포 소기관의 극단적 인 표현형 (특히 스트레스 섬유) 내에서 무질서한 분포로, 심사 응용 프로그램에 적용 할 때 그들은 추가 심각한 한계를 제시한다. 이는 높은 예산이 매년 소비되는 약물 검사에 대한 임상 시험에서 특히 중요하다. 때문에 약물 검사의 초기 단계에서 인공 2D 문화 조건의 동물 모델에 적용 할 때이 약의 대부분은 비록 실패합니다. 또한,이 방법을 이용하여 특정 세포 소기관 적절 통상 관찰의 평면에 수직 한 평면에서 진화 구조 같은 세포 분열 동안 cytokinetic 액토 마이 오신 고리로서 가시화 될 수 없다. 약간새로운 2 차원 분석은 세포 골격 조직에서 상술 한 단점 중요한 통계는 2,3- 관찰되었다 극복하기 위해 제안되었다. 그러나 이러한 분석은 여전히 존재 하나 심각한 제한 : 세포는 세포가 3 차원 구조를 제시 생체 내에서 관찰되는 것과 대조적으로 매우 확산 표현형을 나타낸다. 배양 방법과 관련이 유물은 강화 된 스트레스 섬유 1,4,5으로 비 생리적 기능을 실행할 수 있습니다. 2D는 6,7 환경에 비해 입체 세포 배양 분석은 여러 장점을 제공한다. 그들은 생리 학적 관련성, 그리고 결과에 따라서 의미가있다. 예를 들어, 히드로 겔에 포함 된 세포는 3 차원 형상의 구조를 표시하지만, 그 모폴로지는 또 다른 하나의 셀에 8,9 다르다. 그러나, 그들의 모폴로지는 심사 응용 프로그램을 복잡하게 다른 하나의 셀에서 차이가있다. 또 다른 전략은 단일 포함하는 것입니다미세 공동 10, 11 셀. 셀의 위치, 모양, 극성 및 내부 세포 조직은 정상화 될 수 있습니다. 세포에 3D와 같은 아키텍처를 제공하는 외에, 마이크로 공동 또한 높은 콘텐츠 스크리닝 연구 10,12-14 수 있습니다; 단셀은 마이크로 어레이 및 세포 내 소기관으로 주문할 수 및 진화가 동시에 관찰 할 수있다. 이 규칙은 세포의 낮은 수 더 나은 시간 / 공간 해상도가 좋은 통계를 제공합니다. 유용한 화합물은 안정적으로 쉽게 식별 할 수 있습니다. 본 연구에서는 높은 콘텐츠 스크리닝 응용 10,12,13 대한 제조 및 새로운 3 차원 형상의 단일 세포 배양 시스템의 애플리케이션을 보여준다. 상기 장치는 탄성 중합체 마이크로 공동 (105 공동 / cm 2), 신조어 &#39;eggcups&#39;(EC)의 배열로 구성된다. 이 작품의 크기 및 EC의 총 부피는 개별 NIH3T3과 헬라 세포의 전형적인 볼륨에 최적화되어 있습니다세포 분열시. 원통형 - - 공동의 형태는 활성 프로세스의 시각화를위한 제대로 동양 세포 형태에 선택됩니다. 15,16 커버 슬립 복제 성형 유리에 부착 된 얇은 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 층 상으로 패턴 EC의 배열을 사용한다. 세포를 원심 분리에 의해 EC에 도입된다. 우리는 2D에서 동일한 세포에 비해 여기 관찰 및 3D (EC)의 세포 소기관 (액틴 스트레스 섬유, 골지 장치 및 핵)의 정상화를보고 (평면)의 표면. 우리는 또한 세포의 유사 분열 17시 cytokinetic 액토 마이 오신 링의 폐쇄로 활동 역학 과정의 관찰을보고합니다. 마지막으로, 우리는 신진 효모, 분열 효모와 C.와 같은 단단한 벽, 다른 시스템에서이 방법의 결과를 보여 모델 시스템의 넓은 범위에가는 방법의 적용 가능성을 확인 간스 배아. 우리는 옆에 상세하고 철저한 페이지를 표시순서 rotocol는 제작 및 3D 미세에 대한 &#39;eggcups&#39;을 적용합니다. 우리의 접근 방식은 간단하고 클린 룸을 필요로하지 않습니다. 우리는이 새로운 방법론은 배양 접시의 교체에, 약물 스크리닝 분석 및 맞춤 의학에 특히 흥미로운 일이 될 것으로 예상된다. 마지막으로, 우리의 장치는 암 (18) 또는 기초 연구 (19), 예를 들어, 외부 자극에 세포 응답의 분포를 연구하는데 도움이 될 것입니다.

<table><tbody><tr><td>ddH20 (ultrapure)</td><td>Millipore</td><td>-</td><td>항상 신선한 물을 사용하십시오.</td></tr><tr><td>파라 필름 (플라스틱 필름)</td><td>Bemis</td><td>PM-999</td><td>물방울을 사용하여 실험실 벤치에 파라 필름을 부착하고 완벽한 표면 평탄도를 보장합니다.</td></tr><tr><td>포토 마스크</td><td>Selba</td><td>-</td><td><a href="http://www.selba.ch/" name="RANGE! D4">http://www.selba.ch</a></td></tr><tr><td>실리콘 웨이퍼</td><td>Siltronix</td><td>-</td><td><a href="http://www.siltronix.com/">http://www.siltronix.com/</a></td></tr><tr><td>SU-8 포토레지스트</td><td>MicroChem</td><td>2000 series</td><td><a href="http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm">http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm&nbsp; </A></td></tr><tr><td>연기 속에서 작업이 필요합니다. 자세한 내용은 제조업체의 데이터 시트를 확인하십시오.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 개발자</td><td>MicroChem</td><td>-</td><td><a href="http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm">http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm&nbsp; </a></td></tr><tr><td>연기 속에서 작업하는 것이 필요합니다; 자세한 정보는</td><td></td><td></td><td></td>제조업체의 데이터 시트를 확인하십시오.</tr><tr><td>2-프로판올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19030</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&amp; region=CA">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&amp; region=CA</a></td></tr><tr><td>여러 회사에서 사용할 수 있습니다.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote (실리콘화 시약)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&amp; region=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&amp; 지역=FR&nbsp; </A></td></tr><tr><td>해로운, 연기 속에서 작업하는 것이 필요합니다. 자세한 내용은 제조업체의 데이터 시트를 확인하십시오.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>클로로 트리메틸 실란 (TMCS)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>386529-100ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&region=FR&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">TMCS는 급성 흡입 및 피부 독성을 일으키며 가연성이 높으므로(상당한 거리에서 점화 역화가 발생할 수 있음) 따라서 점화원에서 떨어진 흄 찬장에서 사용해야 합니다</td></tr><tr><td>니트릴 장갑</td><td>Kleenguard</td><td>57372</td><td><a href="http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m">http://www.kcprofessional. com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m</a></td></tr><tr><td>여러 회사에서 구할 수 있습니다.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립 #0</td><td>니트텔 유리</td><td>KN00010022593</td><td><a href="http://www.knittelglass.com/index_e.htm">http://www.knittelglass.com/index_e.htm</a></td></tr><tr><td>매우 약합니다. 부드럽게 조작하십시오.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>샤프 스트레이트 핀셋</td><td>SPI</td><td>0WSSS-XD</td><td>http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7</td></tr><tr><td>50ml 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp</td></tr><tr><td>여러 회사에서 구입할 수 있습니다.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>다우 코닝</td><td>실가드 184 키트</td><td><a href="http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx? R=131EN">http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx? R=131EN&nbsp; </a></td></tr><tr><td>패키지에는 PDMS 베이스와 경화제가 모두 포함되어 있습니다. 유사한 엘라스토머는 여러 회사에서 사용할 수 있습니다.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경 유리 슬라이드</td><td>Dutscher</td><td>100001</td><td><a href="http://www.dutscher.com/frontoffice/search">http://www.dutscher.com/frontoffice/search</a></td></tr><tr><td>여러 회사에서 구입할 수 있습니다.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM 고혈당 매체</td><td>Fisher Scientific</td><td>41965-039</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search? LBCID=12301479& 키워드=41965-039& store=과학& 나비=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search? LBCID=12301479& 키워드=41965-039& store=과학& 나비=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>소 송아지 혈청</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8056-500ML</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&amp; region=CA">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&amp; region=CA</a></td></tr><tr><td>0.25% 트립신-EDTA</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>25200-072</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&amp; store=과학& 나비=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& 검색 유형=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&amp; store=과학& 나비=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>14200-067</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&amp; store=과학& 나비=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& 검색 유형=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&amp; store=과학& 나비=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>PBS는 10배이며 ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-15 medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>21083-027</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&amp 를 사용하여 1배로 희석해야 합니다. store=과학& 나비=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& 검색 유형=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&amp; store=과학& 나비=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>CO2 제어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin이 없는 대기용 매체&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>F1141-5MG</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; 기간=F1141-5MG& 언어=ko& 지역=CA& focus=제품& N=0+220003048+219853082+219853286& 모드 = match % 20partialmax ">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; 기간=F1141-5MG& 언어=ko& 지역=CA& focus=제품& N=0+220003048+219853082+219853286& 모드 = match % 20partialmax < / a ></td></tr> <tr><td>페니실린 & 스트렙토마이신</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>15140-122</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&amp; store=과학& 나비=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& 검색 유형=CHEM">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&amp; store=과학& 나비=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=CHEM</a></td></tr><tr><td>페트리 접시 P35</td><td>Greiner</td><td></td> <td>627102<a href="http://www.greinerbioone.com/">http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/</a></td></tr><tr><td>페트리 접시 P60</td><td>Greiner</td><td>628163</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com/">http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/</a></td></tr><tr><td>페트리 접시 P94</td><td>Greiner</td><td>633179</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com/">http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/</a></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 3 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&amp; region=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&amp; 지역=FR&nbsp; </a></td></tr><tr><td>특히 눈에 해롭기 때문에 연기 속에서 작업해야 합니다. 자세한 내용은 제조업체의 데이터 시트를 확인하십시오.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>트리톤 0.5 %</td><td>시그마-알드리치</td><td>93443-100ML</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; 기간=93443-100ML& 언어=ko& 지역=CA& focus=제품& N=0+220003048+219853082+219853286& 모드 = match % 20partialmax ">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; 기간=93443-100ML& 언어=ko& 지역=CA& focus=제품& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax</a></td></tr><tr><td>Phallodin-Green 형광 Alexa Fluor 488</td><td>InVitrogen</td><td>A12379</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379? CID=search-a12379">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379? CID=검색-a12379&nbsp; </a></td></tr> <tr><td>1.5 ml 메탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>InVitrogen</td><td>A21245</td><td>1:200 PBS에 있는 희석 1x</td></tr><tr><td>토끼 polyclonal anti-Giantin</td><td>Abcam</td><td>ab24586</td><td>1:500 PBS에 있는 희석 1x</td></tr><tr><td><a href="http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html">http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html&nbsp 에 있는 분말을 녹입니다; </a></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>rabbit anti-anillin</td><td>Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin은 사이토키네시스(cytokinesis) 동안 RhoA, actin 및 myosin을 연결하는 골격 단백질입니다. 현재 생물학 18, 30&ndash; 6 (2008년).</td><td></td><td>PBS 1x</td></tr><tr><td>Anti-phosphotyrosine</td><td>Transduction Lab</td><td>610000</td><td></td></tr>에서 1:500 희석 <tr><td>http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000 Cy3 염소 anti-rabbit&nbsp;</td><td>잭슨 면역 연구</td><td>111-166-047</td><td><a href="http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp">http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp&nbsp; </a></td></tr><tr><td>1:1,000 희석, PBS 1x</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417&nbsp;</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&amp; region=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&amp; 지역=FR&nbsp; 1</td></tr><tr>분 <td></td><td></td><td></td>동안 </a><td>1mg/ml</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>G2025</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; 기간=G2025& 언어=ko& 지역=CA& focus=제품& N=0+220003048+219853082+219853286& 모드 = match % 20partialmax ">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; 기간=G2025& 언어=ko& 지역=CA& focus=제품& N=0+220003048+219853082+219853286& 모드 = match % 20partialmax < / a ></td></tr> <tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410-500ML</td> <td><a href = "http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; 기간=M8410-500ML& 언어=ko& 지역=CA& focus=제품& N=0+220003048+219853082+219853286& 모드 = match % 20partialmax ">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; 기간=M8410-500ML& 언어=ko& 지역=CA& focus=제품& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax</a></td></tr><tr><td>HeLa 세포</td><td>-</td><td>-</td><td>포유류 세포는 많은 회사에서 구할 수 있습니다. Table 1</td></tr><tr><td>NIH3T3 세포</td>를 참조하십시오. <td>ATCC-</td><td></td><td>포유류 세포는 많은 회사에서 구할 수 있습니다. Table 1</td></tr><tr><td>Fission yeast&nbsp; 참조.</td><td>-</td><td>-</td><td>균주에 대한 자세한 내용은 교신저자에게문의하십시오.&nbsp; Table 1</td></tr><tr><td>C. elegans worms</td><td>-</td><td>-</td><td>자세한 내용은 교신 저자에게나 연락하시기 바랍니다.&nbsp; 참조 표 1</td></tr><tr><td>YES (한천) + 5 보충제 포함</td><td>MP Biomedicals</td><td>4101-732</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&amp; s=검색">http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&amp; s=검색&nbsp; </a></td></tr><tr><td>준비를 위해: 상자에</td><td></td><td></td><td></td>주어진 지시사항을 따르십시오</tr><tr><td>YES (미디어) + 5개의 보충제 포함</td><td>MP Biomedicals</td><td>4101-522</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&amp; s=검색">http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&amp; s=검색&nbsp; </a></td></tr><tr><td>준비: EMM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(미디어)</td><td>MP Biomedicals</td><td>4110-012</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&amp; 상자에 나와 있는 지침을 따르십시오. s=검색">http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&amp; s=검색&nbsp; ><</td></tr><tr><td>준비: 상자에</td><td></td><td></td><td></td>적힌 지시사항을 따르십시오.</tr><tr><td>필터 멸균 EMM (미디어) - MP</td><td>Biomedicals</td><td>4110-012</td> 이미징 전용입니다<td>. 준비: 상자에 적힌 지시사항을 따르십시오. 필터는 0.22 &micro를 사용하여 매체를 살균합니다. 오토클레이브 대신 M 필터를 사용합니다. 이것은 매체에 투명도를 제공하고 자가형광을 감소시킵니다.</td></tr><tr><td>보충제 (EMM용)</td> <td>MP Biomedicals</td><td>4104-012</td><td><a href = "http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&amp; s=검색">http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&amp; s=검색</a></td></tr><tr><td>&nbsp;( 오토클레이브 또는 여과 전에 EMM 매체에 225 mg/L를 추가하십시오)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stericup 및 Steritop 진공 구동 멸균 필터</td><td>Millipore</td><td>-</td><td><a href="http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&amp; 탭1=2& 탭2 = 1#탭2 = 1 : 탭1 = 2 ">http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&amp; 탭1=2& 탭2=1#탭2=1:탭1=2</a></td></tr></tbody></table>

단일 세포 및 3d 감금 단일 배아 주문 : 하이 콘텐츠 스크리닝을위한 새로운 장치

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

생물 세포는 일반적으로 평면 (2D) 표면에서 관찰된다. 이 조건은 생리적없고, 표현형 및 모양이 매우 다양하다. 이러한 환경에서 세포 기반 스크리닝 따라서 심각한 한계를 가지고 : 세포 소기관은 이종 및 / 또는 특정 세포 소기관이 제대로 시각화 할 수없는 극단적 인 표현형, 세포의 형태 학적 및 크기를 표시합니다. 또한, 생체 내의 세포는 3 차원 환경에서의 위치; 이 상황에서, 세포는 주로하기 때문에 조직의 주변 세포 외 기질과의 상호 작용의 서로 다른 표현형을 보여줍니다. 표준화 및 세포 기반 검정을위한 생리 학적으로 관련 차원 환경에서 하나의 셀의 순서를 생성하기 위해, 여기에서 3D 관내 세포 배양 장치의 미세 가공 및 애플리케이션을보고한다. 이 장치는 마이크로 공동의 2 차원 배열 (일반적으로 10 5 공동 / cm 2), 단일 세포 또는 배아로 가득 각각 구성되어있다. 셀 포지기, 모양, 극성 및 내부 세포 조직은 3 차원 구조를 보여주는 다음 정규화된다. 우리는 커버 슬립에 부착 된 얇은 폴리 디메틸 실록산 상 &#39;eggcups&#39;(PDMS) 층 패턴 마이크로 공동의 배열을 복제 성형을 사용했다. 캐비티가 접착을 촉진하기 피브로넥틴으로 피복 하였다. 균체를 원심 분리에 의해 삽입 하였다. 충전 비율을 80 %까지 허용하는 각 시스템에 대해 최적화되었다. 배아 세포 생존이 확인되었다. 우리는 핵 및 골지 장치와 같은 세포 소기관의 시각화를 위해이 방법을 적용, 이러한 세포 유사 분열 동안 cytokinetic 반지의 폐쇄 활성 프로세스를 연구. 이 장치는 골지체와 핵 정렬에 대한 cytokinetic 링 폐쇄 및 압축 된 표현형 중에 이러한주기적인 축적과 미오신과 액틴의 불균질성과 같은 새로운 기능의 식별을 허용했다. 우리는 포유류 세포, 분열 효모, 출아 효모, C.하는 방법을 특징으로하는 엘레 w각각의 경우에 i 번째 특정 적응. 마지막으로,이 장치의 특성은 약물 스크리닝 분석 및 맞춤 의학에 특히 흥미합니다.

'eggcups'(EC)는 3 차원 환경에서 배향 배아 세포의 가시화를 허용하는 신규 한 고 함량의 스크리닝 방법이다. 또한, 표준 2 차원 (평면) 배양 물에서 관찰하기 어려운 몇몇 세포 과정은이 새로운 방법에 의해 관찰 할 수있다.도 1a (제 1 전술 한 프로토콜도 참조 EC 미세 가공하기위한 절차의 개요를 나타낸다 ). 상기 방법은도 1B. 간단한 빠르고 효율적인 특수 장비의 필요없이 임의이며 1c는 대형 포토 각각 'eggcups'의 확대 된 주사 전자 현미경 이미지를 나타낸다. 이 관찰 될 수있는 바와 같이, 그 형상 및 크기가 매우 규칙적. 이 방법은 매우 유연; 다른 모양 및 크기를 쉽게 제조되고 다른 모델 시스템에 적용될 수있다. 'eggcups'의 치수는 다음과 같이 선택되었다 : 치수이들이 구형 있고 그 직경은 EC 직경에 대한 좋은 지표로 하였다 : 분열을 거쳐 세포의 2D 표면 상에 측정 하였다. 예를 들어 세포 ...

우리는 세포와 배아를 연구하는 장치와 새로운 방법을보고합니다. 단일 세포는 정확하게 마이크로 공동 어레이에 정렬됩니다. 그들의 3D 감금은 생리 학적 조건에서 발생하는 3D 환경을 향한 단계이며 소기관 방향을 수 있습니다. 세포의 모양을 제어함으로써,이 설정은 표준 분석에보고 된 변동성을 최소화 할 수 있습니다.

단일 세포 및 3D 감금 단일 배아 주문 : 하이 콘텐츠 스크리닝을위한 새로운 장치

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

다음 실험의 전반적인 목표는 생리학적 조건에서 발생하는 3D 환경을 모방한 일련의 미세공동에서 세포 소기관의 형태와 역학을 관찰하는 것입니다. 핵분열 효모와 같은 단단한 벽을 가진 세포의 경우, 충치가 세포 구조를 조직하고 방향을 잡을 수 있습니다. 이것은 먼저 마스터에서 PDMS 기둥 배열을 제작하여 복제 성형을 통해 달걀 컵이라고 하는 PDMS 미세 공동 배열을 얻음으로써 달성됩니다.두 번째 단계로, 난자 컵은 세포 외 기질의 단백질로 기능화되고 원통형 맞춤형 플라스틱 조각이 있는 튜브에 도입되어 미세공동 샘플을 지지하고 각 미세공동에 개별 포유류 세포를 도입할 수 있습니다. 다음으로, 세포로 채워진 난자 컵을 제거하고 3D 감금에서 세포의 표현형 및 동적 과정을 연구하기 위해 관심 약물 또는 화합물과 함께 배양합니다. 세포의 방향에 따라 표준 2D 체외 분석과 비교할 때 관찰되는 세포 표현형 및 새로운 동적 구조의 차이를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.표준 2D 세포 배양 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 난자 컵의 포유류 세포가 논리적 미시환경과 유사한 3D 환경을 경험하지만 정렬되고 표준화된 등급으로 배열된다는 것입니다. 순서와 방향은 또한 핵분열 효모의 경우 상당한 개선입니다. 이 방법은 세포 골격 및 약물 발견 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 High Content Screening을 통해 신약 및 항암 약물을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 의미는 암과 같은 다중 요인 질병의 진단으로 확장되는데, 약물 스크리닝 분석은 달걀 컵을 통해 쉽게 수행 및 분석할 수 있기 때문에 이 방법은 개인 맞춤형 의료에 특히 흥미롭습니다. 이 방법은 개별 포유류 세포와 핵분열 효모 세포의 조직화된 구조와 역학에 대한 내부 열쇠를 제공할 수 있으며, C.elegans 및 ri-so-flu-a와 같은 배아 개발, 조직 연구에도 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 일련의 마이크로 캐비티 또는 달걀 컵이 복제 성형에 의해 커버 슬립에 부착된 폴리디메틸실록산 또는 PDMS 층에 패턴화됩니다.첫 번째 단계는 마스터의 제작이며, 이는 표시되지 않지만 텍스트 프로토콜에 설명되어 있습니다. 마스터가 만들어지면 다음 단계는 PDMS 복제본을 만드는 것입니다. 50 밀리리터 튜브에 가교제와 프리폴리머를 1:10 중량 대 중량 또는 부피 대 부피 비율로 총 30g으로 철저히 혼합합니다.튜브를 1, 800회 g에서 5분 동안 원심분리하여 기포를 제거합니다. PDMS를 마스터 위에 부드럽게 떨어뜨립니다. 거품이 나타나면 혼합물의 가스를 제거하십시오.샘플을 섭씨 65도의 오븐에 4시간 동안 넣습니다. PDMS가 치료된 후 메스를 사용하여 약 10개에서 5번째 미세구멍 또는 달걀 컵을 포함하는 약 1제곱센티미터의 관심 영역을 부드럽게 자릅니다. PDMS 스탬프를 부드럽게 떼어냅니다.복제 성형 절차를 시작하려면 30초 동안 산소 플라즈마 처리로 PDMS 스탬프를 활성화합니다. 활성화된 stamp는 먼지가 쌓이지 않도록 밀폐된 페트리 접시에 임시로 보관하십시오. 흄 후드에서 작업할 경우, 15밀리리터 캡 옆의 페트리 접시에 구조물이 위를 향하거나 거꾸로 향하도록 활성화된 PDMS 스탬프를 놓습니다.캡에 200마이크로리터의 트리메틸클로로실란을 채웁니다. 페트리 접시를 닫고 스탬프가 7분 동안 염분화되도록 합니다. PDMS st를 놓습니다.amp구조를 거꾸로 하여 스핀 코터에 넣습니다.구조물 위에 액체 PDM을 한 방울 떨어뜨립니다. 1500RPM에서 30초 동안 스핀 코팅하여 구조물 위에 PDMS의 얇은 층을 증착합니다. 스탬프를 섭씨 65도의 오븐에 4시간 동안 넣어 침전된 스핀 코팅된 PDMS 층을 경화시킵니다.다음으로, 산소 플라즈마 세정제에 유리 커버 슬립과 함께 PDMS 스탬프를 거꾸로 30초 동안 배치하여 얇은 PDMS 층을 활성화합니다. 즉시 스탬프를 유리 커버 슬립과 접촉시키고 접착을 위해 핀셋으로 스탬프 표면 전체를 부드럽게 누릅니다. 그 후 약 10초 동안 스탬프 위에 일정한 압력을 유지하십시오.30분 후, 달걀 컵을 분리하기 위해 커버 슬립에서 스탬프를 부드럽게 떼어냅니다. 샘플을 깨뜨리지 않도록 매우 주의하십시오. 달걀 컵을 에탄올로 철저히 헹구고 말리십시오.PDMS 달걀 컵이 유리 덮개에 있지 않고 고정 해제 단계에서 미끄러지고 분리된 경우 플라즈마 클리너의 설정을 조정하고 복제 성형 절차를 다시 시작하는 것이 좋습니다. 나중에 샘플을 쉽게 조작할 수 있도록 경화된 PDMS의 작은 조각을 커버 슬립의 가장자리에 접착하는 것이 좋습니다. 이 비디오에 제시된 포유류 세포의 경우, PDMS 표면은 세포외 기질의 접착 단백질로 기능화되어야 합니다.산소 플라즈마 클리너에 달걀 컵을 30초 동안 친수건조시킵니다. 그 후, 달걀 컵을 자외선으로 5분 동안 살균한다. 난자 컵 전체를 덮을 수 있도록 피브로넥틴 용액을 소량 떨어뜨리고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.샘플이 건조되지 않도록 보호하십시오. 플라스틱 분배 피펫을 사용하여 약 1ml의 PBS로 달걀 컵을 부드럽게 헹굽니다. 총 3회 반복합니다.다음으로, 맞춤형 원통형 플라스틱 조각을 50ml 튜브에 넣습니다. 튜브에 13ml의 세포 배양 배지를 추가합니다. 매체는 샘플의 완전한 침수를 보장하기 위해 원통형 조각보다 최소 2cm 위에 도달해야 합니다.날카롭고 곧은 핀셋을 사용하여 PDMS 손잡이로 샘플을 잡고 달걀 컵을 튜브 내부에 조심스럽게 놓고 플라스틱 조각의 위쪽 위에 놓이고 완전히 잠길 때까지 커버 슬립을 부드럽게 누릅니다. 난자 컵에 도입될 세포는 80-100% 포화도로 배양하고 5ml의 배양 배지에 재현탁해야 합니다. 달걀 컵 위에 200 마이크로 리터의 세포를 피펫으로 얹어 달걀 컵 위에 가능한 한 중앙에 세포를 떨어 뜨리되 신체 접촉은 피합니다.이렇게 하면 샘플의 파손 및/또는 손상을 방지할 수 있습니다. 50 밀리리터 튜브를 1, 800 회 g에서 2 분 동안 원심 분리하십시오. 달걀 컵 위에 또 다른 200 마이크로 리터의 세포를 피펫으로 넣고 1, 800 회 g에서 2 분 동안 다시 원심 분리하십시오.충전 비율을 최적화하기 위해 총 세 번 반복합니다. 마지막 원심분리 후 현미경으로 계란 컵의 충전 비율을 확인하십시오. 핀셋을 사용하여 PDMS 핸들을 잡고 달걀 컵의 세포를 방해하지 않도록 튜브에서 샘플을 조심스럽게 제거하고 샘플을 배지가 있는 페트리 접시에 넣습니다.달걀 컵에 없는 여분의 세포를 제거하려면 미세 구조 어레이의 각 측면 옆에서 위아래로 세 번 부드럽게 피펫팅하여 헹굽니다. 마지막으로, 배지를 새로운 배지로 교체하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다. 고정된 세포 소기관을 관찰하려면 고정된 샘플이 든 달걀 컵을 epifluorescence inverted microscope의 스테이지에 놓고 60x oil objective를 선택합니다.이 예에서 샘플은 골지체, 핵 및 액틴 섬유가 염색된 NIH 3T3 섬유아세포입니다. 난자 컵과 세포가 관찰 평면에 올 때까지 명시야광을 사용하여 조심스럽게 초점을 맞춥니다. 관심 영역을 선택하고 초점을 맞춘 다음 이미지 캡처를 시작합니다.달걀 컵을 현미경 홀더에 넣고 10%FCS L15 세포 배양 배지 1ml를 채워 이 절차를 시작합니다. s에 홀더를 설치하십시오.tage 현미경의. 증발을 방지하려면 홀더 위에 유리 뚜껑을 놓으십시오.60x 오일 대물렌즈가 장착된 상형광 도립 현미경으로 세포를 관찰합니다. 이 예는 유사분열 중 사이토카인틱 고리 폐쇄에 관여하는 두 가지 핵심 분자인 형광 표지된 미오신 및 액틴을 발현하는 HeLa 세포를 사용합니다. 관심 영역을 선택하고 GFP 또는 Texas Red 채널을 사용하여 사이토키네틱 고리를 찾습니다.초점을 정확하게 맞춥니다. 링이 완전히 닫힐 때까지 두 채널 모두에서 자동 수집을 실행합니다. 달걀 컵의 주사 전자 현미경 이미지는 달걀 컵의 모양과 크기가 매우 규칙적임을 보여줍니다.분열 효모와 같은 단단한 벽을 가진 세포의 경우, 난자 컵은 사이토키네틱 고리의 방향을 지정할 수 있습니다. 포유류 세포의 경우, 3D 난자 컵과 2D 평평한 표면의 세포를 비교하면 전자는 균질한 구형과 같은 표현형을 가진 질서 있는 배열을 형성하는 반면 후자는 무질서하고 이질적인 형태를 나타내는 것으로 나타났습니다. 난자컵에 있는 세포는 또한 스트레스 섬유의 수가 감소하는 것을 보여주는데, 이는 블레비스타틴(Blebbistatin) 치료의 중간 정도의 효과에서 알 수 있습니다.2D 배양의 골지체는 일반적으로 확장된 표현형을 보이는 반면, 달걀 컵에서는 더 압축된 표현형을 보여줍니다. 이것은 골지체 표현형의 정량화에 의해 확인되었습니다. 마지막으로, 2D 표면에서는 세포핵이 무작위 방향인 반면, 난자 컵에서는 야생형 세포와 블레비스타틴 처리된 세포 모두에서 xy-평면에서 직각 방향입니다.핵 구형도 값을 측정하면 난자 컵이 세포핵의 정상적인 구형도에 영향을 미치지 않는다는 것이 밝혀집니다. 그러나 난자컵에서 야생형과 블레비스타틴으로 처리된 세포의 차이는 난자컵이 2D로 마스킹된 약물의 실제 효과를 드러내고 있음을 시사합니다. 난자 컵을 사용한 살아있는 세포 연구를 통해 표준 배양에서는 볼 수 없는 새로운 활성 과정을 식별할 수 있습니다.예를 들어, 유사분열 동안 사이토카네틱 고리가 닫히면서 방사상으로 움직이는 미오신 (myosin)의 주기적인 축적이 HeLa 세포에서 관찰되었습니다. 일단 숙달되면, 달걀 컵은 복제품에서 6시간 이내에 준비할 수 있으며, 세포를 채우는 작업은 약 15분 안에 완료할 수 있습니다. 이 과정을 시도하는 동안 연구 대상 세포에 대한 난자 컵의 크기를 갖는 것이 중요합니다.이 절차는 대량 스크리닝 활동을 위한 제약 회사의 고함량 스크리닝 플랫폼과 개별 특정 치료법을 평가할 때 환자의 개인화된 진단 분석에 추가로 적용될 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 계란 컵 미세 충치를 제작하고 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 난자 컵은 포유류 세포와 같이 벽이 없는 개별 세포에서 효모 및 배아와 같은 벽이 있는 시스템에 이르기까지 다양한 유사한 시스템에 대한 표준화 및 질서를 생성합니다.

ordering-single-cells-single-embryos-3d-confinement-new-device-for

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 단일 세포를 분리하고, 관심 세포를 농축하고, 미세유체 기반 단세포 다중 시스템에서 제브라피시 세포를 포획하고, 단일 세포에서 유전자 발현을 평가하는 방법을 설명합니다.

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

여기에서는 고효율 단세포 분리 및 장기 클론 배양을 가능하게 하는 새로운 마이크로웰 설계 개념을 활용하는 미세유체 플랫폼으로 단일 세포를 분리 및 배양하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼

Zebrafish 태아 그리고 애벌레의 microinjection 많은 zebrafish 모델에서 사용 되는 중요 하지만 어려운 기술 이다. 여기, 우리 미 도구 안정화에 도움의 범위와 microinjection 및 이미징 zebrafish의 방향 제시.

최적화 된 Microinjection 및 Zebrafish 애벌레의 이미징 microstructured 장치

우리는 반복 패턴 형성을 얻기 위해 3 차원 기질에서 초기 셀 클러스터 모양을 제어 하기 위한 절차를 제시. 포함 하는 두 개의 다른 hydrogels 입방 장치 다 방향 영상 조직 패턴 형성에 대 한 달성 하기 위해 채택 된다.

반복 패턴 형성을 위한 하이브리드 젤 큐브 장치에 초기 3D 셀 클러스터 제어

우리는 셀과 다중 세포 소기관으로 3D 문화와 실험을 위한 장치를 구성 하는 방법을 설명 합니다. 이 장치는 정의 된 화학 유인 구배가 있는 3D 미세 환경에서 가용성 신호에 대 한 셀룰러 응답을 분석 할 수 있습니다. 유기 체는 약한 시끄러운 입력의 검출에 단일 세포 보다 낫다.

화학 유인 그라데이션에 대 한 다중 세포 반응의 3D 분석

이 프로토콜은 살아있는 3차원 이미징을 위해 세균 샘플을 준비하고 장착하는 방법과 이러한 이미지에서 대장균의 3차원 모양을 재구성하는 방법을 설명합니다.

정확한 세포 표현과 정확한 단백질 국소화를 위한 세균 세포의 3차원 이미징

이 작품은 한 번의 하룻밤 실행에 80-100 C. 예쁜 꼬마 배아에서 배아의 동시 3D 시간 경과 영상을 허용하는 반 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 또한 데이터 분석을 간소화하기 위해 이미지 처리 및 시각화 도구가 포함되어 있습니다. 사용자 정의 리포터 균주와 이러한 방법의 조합은 배아 발생의 상세한 모니터링을 가능하게.

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

장기의 전체 3D 구조 및 세포 함량뿐만 아니라 원래 조직과 의학적 유사성은 여기에 설명된 단세포 분해능 3D 이미징 프로토콜을 사용하여 포획될 수 있다. 이 프로토콜은 원기, 크기 및 모양이 다양한 광범위한 오르가노이드에 적용할 수 있습니다.

단세포 분해능 3차원 알래기 알코노이드

여기에 제시된 프로토콜은 플레이트 기반의 고함량 이미저를 사용하여 배아 발달 중에 여러 Drosophila 배아를 마이크로주입하고 동시에 이미지화하는 프로토콜이다.

자동 고함량 분석기를 사용하여 수행된 살아있는 세포 현미경 검사법을 위한 Drosophila 배아 준비 및 미세 주입

이 프로토콜은 대규모 고함량 스크리닝 및 분석에 적합한 방식으로 세 가지 유형의 구상체를 생산하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한, 이들이 스페로이드 및 개별 세포 수준에서 어떻게 분석될 수 있는지를 보여주는 예들이 제시된다.

고함량 스크리닝 및 분석 응용을 위한 구상체의 대규모 생산을 위한 강력한 방법

배우세요 PDMS 마이크로캐비티 어레이를 이용한 3D 세포 배양 기술로 세포 소기관의 형태와 역학을 관찰하는 방법입니다. 이 기술은 2D 배양의 한계를 극복하고 생리학적 조건을 모사하여 약물 스크리닝 및 세포 생물학 연구에 활용됩니다.

단일 세포 및 3D 감금 단일 배아 주문 : 하이 콘텐츠 스크리닝을위한 새로운 장치

더 많은 동영상 탐색