양자의 축삭 교통 수단의 실시간 이미징 차 뉴런에서 BDNF를 도트 표지

이 절차의 전반적인 목표는 실시간 이미징을 통해 뇌 유래 신경 영양 인자 또는 BDNF의 역행성 축삭 수송을 추적하는 것입니다. 이것은 먼저 폴리리신으로 코팅된 커버 슬립에 미세유체 챔버를 조립하여 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 해리된 쥐 E 18 해마 뉴런을 해부하여 미세유체 챔버의 세포체 구획에 도금합니다.

다음으로, 뉴런을 배양하여 마이크로 홈을 가로질러 축삭돌기가 챔버의 축삭 구획으로 확장될 수 있도록 합니다. 마지막 단계에서는 BDNF로 표시된 양자점이 축삭 구획에 추가됩니다. 궁극적으로 형광 현미경 검사는 해마 뉴런의 축삭 내에서 BDNF 움직임을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

B-D-F-E-G-I-P 또는 BDFM 체리 라벨링과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 양자점으로 BDF를 라벨링하면 축삭 내 단일 BDF 이량체의 광 이미징을 통해 절차가 수행될 것임을 입증할 수 있다는 것입니다. 왼쪽 3 개에서 포스트 점을 그리고, 1 % aox에서 미세 유체 챔버를 손으로 씻는 것으로 시작한 다음 milli Q 물로 30 분 헹굼을 세 번 수행합니다. 그런 다음 챔버를 70% 에탄올로 손으로 세척한 후 층류 후드의 파라몬에 건조시키고 챔버의 양면을 자외선으로 20분 동안 살균한 다음 방사된 챔버를 실온에서 파라미드로 밀봉된 멸균 15cm 접시에 보관합니다.

다음으로 24 x 40mm를 담근다. 첫 번째 유리 커버는 로테이터에서 하룻밤 동안 10% 염산을 주입한 다음 마지막 세척 후 물로 30분 동안 세 번 세탁합니다. 각 커버 슬립을 100% 에탄올에 담궈 소독한 다음 분젠 버너에서 불을 붙이고 실온의 멸균 페트리 접시에 건조하게 보관합니다.

커버 슬립을 코팅하려면 15cm 배양 접시에 놓고 각각 0.7ml의 0.01% 폴리 L 라이신을 겹겹이 쌓습니다. 조직 배양 후드에서 1시간 배양 후 덮개 슬립을 멸균수로 다시 세 번 헹구고 진공 청소기로 건조시킨 후 6cm 배양 접시에 넣습니다. 그런 다음 마이크로 홈 면이 아래를 향하도록 멸균된 챔버 중 하나를 폴리 L 라이신 코팅된 커버 슬립에 놓습니다.

마이크로 홈을 만지지 않도록 주의하고 마이크로 피펫 팁을 사용하여 챔버를 부드럽게 누르고 조립된 미세유체 챔버를 단단히 밀봉합니다. 이제 E 17에서 E 18 쥐 2마리를 2ml의 해부 완충액이 들어 있는 15ml 원뿔형 튜브에 넣고 매번 5ml의 해부 완충액으로 조직을 세 번 헹굽니다. 그런 다음 가능한 한 많은 세척액을 제거하고 900마이크로리터의 신선한 해부 완충액을 추가하여 조직을 소화합니다.

다음으로, 100마이크로리터의 2.5%트립신을 조직에 넣고 튜브를 섭씨 37도의 수조에 넣습니다. 10분 동안 소화한 후 DNA 100마이크로리터를 첨가하고 화염 광택 PE 유리 피펫을 사용하여 혼합 직후 조직을 5-10회 부드럽게 위아래로 평가합니다. 2ml의 도금 매체로 tryin을 담금질하고 파편이 조직 배양 후드에서 5분 동안 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다.

다음으로, 2ml의 상등액을 깨끗하고 멸균된 15ml 원추형 튜브에 조심스럽게 옮기고 세포 소생액을 스핀다운합니다. 펠릿을 50 마이크로 리터의 도금 매체에 현탁 한 다음 계산 한 후 15-20 마이크로 리터의 세포 현탁액을 미세 유체 챔버의 한 구획에 적재합니다. 세포가 커버 슬립에 부착될 수 있도록 챔버를 10분 동안 배양한 다음 더 많은 도금 매체를 추가하여 챔버의 두 구획을 채웁니다.

배양 하루 후, 도금 배지를 세포체와 축삭 격실 모두에서 유지 배지로 교체합니다. 3일째에는 해마 뉴런의 축삭돌기가 마이크로 홈을 가로질러 5일에서 7일 사이에 축삭돌기 구획에 도달하기 시작합니다. 이 기간 동안 BDNF Axonal Transport라고 표시된 양자의 라이브 이미징 전에 24-48시간마다 배양 배지의 절반을 새로운 유지 관리 배지로 교체하십시오.

BDNF가 고갈되는 동안 2시간 동안 30분마다 BDNF free serum free neuro basal media로 미세유체 챔버의 두 구획을 철저히 헹구고, 50 nano molar mono biotinylated BDNF dimer를 50 nano molar quantum으로 배양합니다. 6 5 5 스트리핀 콘주게이트를 얼음 위에서 신경 기저 매체에 60분 동안 투여합니다. 그런 다음 축삭돌기 구획의 배지를 섭씨 37도에서 4시간 동안 BDNF로 표시된 300마이크로리터의 양자점 배지로 교체하여 BDNF로 표시된 양자점이 세포체 구획으로 확산되는 것을 최소화합니다.

배양, 예열 및 도립 현미경이 끝날 때 축삭 격실보다 세포체 격실에서 항상 더 높은 수준의 배지를 유지하는 것이 매우 중요하며, 장비가 예열되는 동안 섭씨 37도의 일정한 온도와 5%의 이산화탄소로 100 x 오일 대물렌즈와 환경 챔버가 장착되어 있습니다. 미세유체 챔버에서 BDNF라고 표시된 결합되지 않은 양자점을 씻어낸 다음 텍사스 적색 여기 및 방출 큐브 세트를 사용하여 양자점 6 5 5 신호를 시각화합니다. 마지막으로, CCD 카메라를 사용하여 총 2분 동안 초당 1프레임의 속도로 중간 축삭 내의 타임랩스 이미지를 캡처합니다.

QD가 없는 축삭돌기가 없는 마이크로 홈을 침투를 위한 제어로 사용하고 적절한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 BDNF 수송을 분석합니다. 양자점 라벨링 BDNF 신호 전송의 타임 랩스 이미징에서 양자점 신호는 축삭돌기가 있는 대부분의 마이크로 홈에서 관찰되는 반면, 축삭이 없는 마이크로 홈에서는 양자 신호가 보이지 않으며, 이는 축삭돌기 구획에서 양자점 신호의 확산이 거의 또는 전혀 없음을 나타냅니다. 여기 세포 본체 구획으로. 해마 뉴런 축삭의 80마이크로미터 길이의 분절은 100초 동안 형광으로 기록되었습니다. 총 6명입니다.

이미징 중에 양자 BDNF 신호가 명확하게 관찰되었으며 3개는 세포체를 향해 단방향으로 이동하는 것이 관찰되었습니다. 하나의 신호가 약 70초 내에 전체 필드를 가로지르는 세포체로 부드럽게 이동하는 것이 관찰되었습니다. 또 다른 하나는 처음 20초 동안 역행 방향으로 이동하다가 10-20초 동안 전방암 운동으로 전환한 다음 마지막 20초 동안 세포체를 향해 다시 방향을 바꾸는 것이 관찰되었습니다.

세 번째 사건은 역행 방향으로 움직이다가 움직임 중간에 약 20초 동안 멈추는 것도 관찰되었습니다. BDNF 수송이라고 표시된 양자점의 첫 번째 대표적인 차임 그래프에서 BDNF로 표시된 양자점은 약 60초 만에 80마이크로미터 필드를 가로지르는 세포체를 향해 빠르고 부드럽게 움직였습니다. 이 두 번째 크로노그래프에서 매우 짧은 멈춤과 함께 양자 BDNF는 120초 동안 약 50마이크로미터를 역행 방향으로 이동했으며 최소 3개의 더 긴 멈춤 세그먼트가 있었습니다.

마지막으로, 산점도는 BDNF로 표시된 각 단일 양자점의 이동 속도, 평균 속도 및 일시 중지 시간을 측정합니다. BDNF로 표시된 양자점의 이동 속도는 초당 0.47에서 1.97마이크로미터까지 비교적 빨랐으며, 평균 초당 1.06 플러스 또는 마이너스 0.05마이크로미터였습니다. 수송 중 BDNF가 일시 중지되기 때문에 평균 속도는 초당 0.48 플러스 마이너스 0.03 마이크로미터로 이동 속도보다 훨씬 낮았으며, 평균 정지 시간은 개발 후 15.88 플러스 마이너스 1.30초였습니다.

이 기술을 통해 신경 과학 분야의 연구자들은 건강한 뉴런과 질병 뉴런에서 신경 영양 호르몬 및 수용체 이동을 탐구할 수 있습니다.