Name: 의 전체 순서의 NGS 분석을위한 Transposase 기반 기술에 의해 gDNA를 농축 BRCA1 BRCA2, 9 유전자 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 학습하세요 트랜스포자제 기반 기술을 활용한 11개 DNA 손상 복구 유전자의 차세대 염기서열 분석 방법입니다. 이 프로토콜은 gDNA 농축과 효율적인 시퀀싱을 통해 유전적 변이를 신속하게 검출할 수 있습니다.

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우리는 Ligue contre le Cancer de Côte d'Or와 Centre Georges-François Leclerc의 재정적 지원에 감사드립니다. 원고를 편집해 준 필립 바스터블(Philip Bastable)에게 감사한다.

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</ol>

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

NGS 장치 및 기술의 광범위한 사용은 암과 유전 질환의 연구에 새로운 기회를 제공하고 있습니다. 전체 게놈 염기 서열 또는 RNA 서열에 더하여, 다수의 환자에서 선택된 서열의 gDNA를 다량의 분석을 동시에 진단에 큰 가능성을 제공한다. 여기에, 우리는 중간 서열 분석 장치 (자재 / 장비의 표)와 동시에 24 명에서 11 완전한 유전자를 연구하는 Nextera 기술을 사용하여 (필요시) 특정 디자인을 개발했다. 이 프로토콜은 오류의 위험이 낮은 환자의 관심사에 대한 신속한 대응을 가능하게 데이터를 신속하게 생성 할 수 있습니다. 도 6에 도시 된 바와 같이, 생거 시퀀싱 검출 모든 유전 적 변이는 또한 transposase 기반 제조 키트를 사용하여 검출 하였다. 이 방법은 특히 직접 분석 복잡한 INDEL의 변화에​​ 대해, 신뢰성과 쉽게 해석 할 수있다. 그럼에도 불구하고, 중요하다마이너스 가닥에있는 유전자,이 뉴클레오티드 (반전)없이 보완 할 필요가 있습니다입니다. 본 연구는 11 전체...

2010 년 (기본적으로 여성) 거의 1백50만명는 전 세계적으로 유방암을 개발했다. 그러나, 이들의 경우 5-10 %의 유전 있다고 추정된다. 유전성 유방암과 난소 암의 1에 관련된 거의 이십년 전, BRCA1과 BRCA2가 확인되었다. 약 15 년 전 이후로, BRCA1 및 BRCA2 코딩 영역은 유방암과 난소 암에 대한 유전 적 소인을 결정하는 순서가되었다. BRCA1 및 BRCA2의 변화는 이들 영역의 분석을 효과적으로 스크리닝 충분하지 않은 것을 시사 선택된 가족이 10-20 %가 검출된다. 최근, BRCA1 및 BRCA2의 비 - 코딩 서열 (프로모터, 인트론, 3 &#39;UTR)의 분석은 새로운 돌연변이 / 변형 유방암 3-6의 높은 위험에 링크 될 수 있다는 것을 강조 하였다. BRCA1과 BRCA2 단백질은 (상동 재조합 수리에 참여하고 있습니다수많은 파트너 (7)에 의해 완료 HHR). BRCA1 또는 BRCA2의 변화는 DNA 복구에 결함을 유발하지만, 다른 파트너는 유방암 위험에 영향을 미칠 수있다. 이 가설은 BRIP1 8 이후 확인 된 것으로 나타나고 PALB2 9는 각각 자궁 경부 암과 유방암에 대한 입증 영향을 미친다. 또한, 다른 두 &quot;중등도 위험&quot;유방암 감수성 유전자, ATM 및 CHEK2는 또한 정기적으로 열 연구 할 수있다. 이 연구에 이어, 우리는 동시에 상대적으로 매우 쉽고을 사용하여 24 명에서 11 유전자 (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80 및 TP53)를 분석 할 수있는 프로토콜을 개발하기로 결정 매체 처리 장치 및 농축 transposase 시퀀싱 기술을 기반으로 빠른 프로토콜. 감사합니다이 기술로, 우리는 2500 염기쌍의 인트론 영역이 포함되지 않은 RAP80, (: 176,381,588-176,390,180 CHR5)을 제외하고, 3&#39;-UTR의 단부에 프로모터 개시로부터 완전한 유전자 서열. 이는 2734 프로브 연구에 대한 1,000,300 염기쌍의 합계를 나타냅니다. 일반적으로 BRCA1과 BRCA2 엑손 서열은 20 명 미만 환자의 1.5 개월을 필요로 생거 시퀀싱에 의해 분석된다. 본 프로토콜 (도 1)와 동일한 시간에, 75 개 이상 11 명의 환자에 대한 완전한 유전자를 분석 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1001</td><td>염기서열분석/중간 처리량 장치</td></tr><tr><td>Nextera Enrichment kit</td><td>Illumina</td><td>FC-123-1208</td><td>트랜스포사제 기반 기술</td></tr><tr><td>300 사이클 카트리지</td><td>Illumina</td><td>15033624</td><td></td></tr><tr><td>AMPure 비드</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>자기 정제 구슬</td></tr><tr><td>마그네틱 스탠드</td><td>Alpaqua</td><td>A32782</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트</td><td>Life Technologies</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>MIDI 96웰 플레이트</td><td>Biorad</td><td>AB0859</td><td></td></tr><tr><td>Microseal A</td><td>Biorad</td><td>MSA-5001</td><td>이 씰은 PCR 증폭에만 필요합니다. 실험 전반에 걸쳐 다른 표준 씰을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td>염기서열분석 장치와 함께 제공됨 Experiment Manager 소프트웨어 인터넷 주소: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new 제조업체 웹 사이트 도구</td></tr></tbody></table>

의 전체 순서의 ngs 분석을위한 transposase 기반 기술에 의해 gdna를 농축 brca1 brca2, 9 유전자

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

차세대 시퀀싱의 광범위한 사용은 암 연구 및 진단을위한 새로운 길을 열었습니다. NGS는 거대한 암에 대한 새로운 데이터의 양, 특히 암 유전학을 가져올 것이다. 현재의 지식과 미래의 발견은 필요한 암의 유전 적 소인에 관여 할 수있는 유전자의 거대한 숫자를 연구 할 것입니다. 이러한 관점에서, 우리는 DNA 손상의 복구에 관여하는 유전자의 완전한 11 공부 Nextera 설계를 개발 하였다. 이 프로토콜은 안전하게 동시에 24 명에서 11 유전자 (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80 및 TP53) 프로모터에서 3&#39;-UTR을 연구하기 위해 개발되었다. transposase 기술과 gDNA를 농축에 따라이 프로토콜은, 다중화를 샘플링 할 수있는 유전자 진단 덕분에 시간의 측면에서 큰 장점을 제공합니다. 이 프로토콜은 혈액 gDNA를 안전하게 사용할 수있다.

샘플 QC 결과 표적 유전자의 서열을 결정하는 본 방법의 기능은 gDNA를 (도 2a)의 품질 및 tagmentation 단계의 품질에 기초한다. tagmentation은 (도 2b를 참조하면, 상부 패널) 충분하지 않은 경우, 시퀀스는 만족스럽지 않을 것이다. 전술 한 바와 같이, tagmentation 정제 후, gDNA를 약 300 bp의 단편의 대부분 (도 2B, 하부 패널)로 1000 염기쌍 150로부터 염기쌍 조각으로 tagmented한다. 라이브러리 제제의 끝에서, 라이브러리 품질 Bioanalyser을 사용하여 판정한다. 얻어진 프로파일 tagmentation 후 그러나 단편 높은 숫자 (도 2C)와 대략 동일해야한다. 라이브러리 품질 1C 그림과 동일하지 않은 경우...

NGS 염기서열분석을 위한 gDNA 농축은 체질적 돌연변이 연구를 위한 쉽고 강력한 도구입니다. 이 기사에서는 DNA 손상 복구에 관여하는 11개 유전자의 전체 염기서열을 간단히 분석하는 절차를 제시합니다.

의 전체 순서의 NGS 분석을위한 Transposase 기반 기술에 의해 gDNA를 농축 BRCA1 BRCA2, 9 유전자

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

다음 실험의 목적은 트랜스포사제 기반 기술을 기반으로 하는 매우 쉽고 비교적 빠른 프로토콜로 11개 유전자의 염기서열을 동시에 분석하는 것입니다. 이는 트랜스포사제(transposase)의 작용에 의해 달성되어 어댑터와 직접 결찰된 300개의 염기쌍 DNA 단편을 얻습니다. 특정 프로브를 사용한 첫 번째 캡처는 관심 영역의 샘플을 강화합니다.이 단계를 다시 한 번 반복하여 타겟 염기서열만 얻습니다. 다음으로, PCR 증폭은 염기서열 정렬과 생물정보학 분석을 기반으로 유전자의 유전적 변이를 보여주는 결과를 얻기 위해 물질의 양을 증가시키기 위해 수행된다. Sanger 염기서열분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 2주 이내에 11개의 완전한 유전자에 대한 24개의 passion을 분석할 수 있는 뛰어난 용량입니다.절차를 시연하는 것은 제 연구실의 기술자인 Sandy가 맡을 것입니다. 먼저 DNA enrichment kit에서 모든 시약을 준비합니다. 준비가 되면 약 50나노그램의 게놈 DNA를 96웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 25마이크로리터의 TDE 완충액을 추가한 다음 5마이크로리터의 TDE 1 완충액을 추가하여 멘테이션을 시작합니다.각 웰에 피펫을 50마이크로리터로 설정하고 전체 부피를 10회 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다. 잠시 원심분리기를 한 다음 준비가 되면 플레이트를 열순환기에 넣습니다. ST 용액을 소용돌이치고 샘플이 들어있는 각 웰에 15마이크로리터를 추가합니다.피펫을 65마이크로리터로 설정하고 전체 부피를 위아래로 부드럽게 피펫팅한 다음 10회 배양하고 원심 주입 전에 실온에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 이전에 혼합된 정제 마그네틱 비드 52마이크로리터를 각 웰 혼합물에 추가하고 원심분리 전에 실온에서 10분 동안 배양합니다. 비드를 에탄올로 세척한 후 마그네틱 스탠드에서 플레이트를 제거하고 22.5마이크로리터의 RSB 버퍼를 추가합니다.혼합 후 플레이트를 마그네틱 스탠드에 놓고 2분 동안 배양합니다. 상층액이 완전히 투명하게 나타나는지 확인하십시오. 20마이크로리터의 스내트를 새 96웰 플레이트로 부드럽게 옮깁니다.PCR 증폭의 첫 번째 라운드를 시작하려면 20마이크로리터의 LP PMM과 인덱스 1 및 인덱스 2 각각 5마이크로리터를 각각 추가합니다. 플레이트를 잘 혼합하여 접착 Micros EAL 필름으로 덮습니다. 원심분리 후 플레이트를 Thermocycler에 놓고 프로그램 1을 실행합니다.첫 번째 PCR 라운드에서 수율을 정제하고 측정한 후 최대 12개의 샘플을 당겨 첫 번째 혼성화를 시작합니다. 새로운 96웰 플레이트에서 각 풀의 최종 부피가 40마이크로리터를 완전히 초과하지 않도록 NCT 하나의 용액을 혼합하고 각 웰에 50마이크로리터를 추가합니다. CSO 10마이크로리터를 첨가한 후 플레이트를 혼합하고 밀봉합니다.원심분리 후 플레이트를 열순환기에 넣고 프로그램을 실행합니다. 2. 첫 번째 혼성화 세척의 경우 열순환기와 원심분리기에서 플레이트를 제거합니다. 접착 커버를 매우 조심스럽게 간단히 제거합니다.플레이트에서 100마이크로리터의 반응 혼합물을 새 MIDI 96 웰 플레이트로 옮기고 250마이크로리터의 웰 Vortex SMB 솔루션을 추가합니다. 실온에서 30분 동안 배양하기 전에 플레이트를 혼합하고 밀봉하십시오. supena를 세척하고 버린 후, 비드가 들어있는 웰에 잘 혼합 된 WS 2 용액 200 마이크로 리터를 넣고 완전히 혼합하여 전체 부피를 새로운 96 Well 플레이트로 트랜스 이송합니다.플레이트를 밀봉하고 열 순환기에 넣습니다. 써모사이클러를 섭씨 42도에서 30분 동안 실행합니다. 완료되면 즉시 플레이트를 마그네틱 스탠드에 2분 동안 놓습니다.상층액이 완전히 투명하게 나타나는지 확인하십시오. 씰을 제거하고 즉시 모든 상층액을 버리십시오. 마그네틱 스탠드에서 플레이트를 제거합니다.200 마이크로 리터의 잘 혼합 된 Ws 3 용액을 비드가 들어있는 우물에 넣고 완전히 혼합합니다. supinate를 세척하고 제거한 후 플레이트를 밀봉하고 잠시 원심 분리기를 사용하여 잔류 supine natant를 끌어 내립니다. 플레이트를 마그네틱 스탠드에 2분 동안 놓습니다.잔류 supinate를 폐기하십시오. 그런 다음 마그네틱 스탠드에서 플레이트를 제거합니다. 미리 준비한 믹스 23마이크로리터를 추가합니다.혼합 후 플레이트를 밀봉하고 원심분리하기 전에 실온에서 5분 동안 그대로 두십시오. 21마이크로리터의 세이트를 새로운 96웰 플레이트로 옮긴 후 각각 4마이크로리터의 ET 2 용액을 추가합니다. 원심 주입 전에 플레이트를 잘 혼합하고 밀봉하십시오.두 번째 혼성화를 시작하려면 접착 필름을 제거하고 25마이크로리터의 라이브러리에 50마이크로리터의 NCT 1개, 10마이크로리터의 CSO와 15마이크로리터의 PCR 등급 물을 추가합니다. 원심분리 후 플레이트를 열순환기에 넣고 프로그램을 실행합니다. 2. 새로운 96웰 플레이트에서 이전 단계에서 20마이크로리터의 진화가 혼합되었습니다.25 마이크로 리터의 T-C-P-M-M과 5 마이크로 리터의 PPC로 혼합 및 원심 분리 후 플레이트를 밀봉합니다. 다음으로, 플레이트를 thermocycler에 넣고 다음 날 프로그램 3을 실행하고 플레이트를 원심분리하고 비드를 에탄올로 세척합니다. 마그네틱 스탠드에서 플레이트를 제거하고 30마이크로리터의 RSB 버퍼를 추가합니다.플레이트를 섞어 2분 동안 배양합니다. 실온에서 96웰 플레이트를 마그네틱 스탠드에 놓고 5분 동안 또는 S 상층액이 완전히 투명해질 때까지 배양합니다. 28마이크로리터의 스내트를 새 96웰 플레이트로 부드럽게 옮깁니다.마지막 단계는 프래그먼트 분석기 또는 QPCR을 사용하여 라이브러리의 품질을 확인하는 것입니다. 실행하는 동안 클러스터 밀도는 밀리미터 제곱미터당 801, 000K 사이여야 합니다. 서로 다른 이미지는 저밀도, 고밀도, 완벽한 밀도에 해당합니다.이 기술로 얻은 결과는 생물정보학을 사용하여 점 또는 인델 돌연변이로 해석하기가 매우 쉽습니다. 염기 변경이 표시되고 삭제되거나 삽입된 시퀀스가 직접 식별됩니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3일 이내에 완료할 수 있습니다.

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점 돌연변이 수리 CRISPR/Cas9 및 SsODN 인간 세포에 의해 촉매의 기능으로 현지 변이 검사 하는 표준 방법론

이 원고 ctDNA, 응급실이에서 낮은 주파수의 돌연변이 검출 하는 기술을 설명 합니다. 이 메서드는 두 방향 오류 수정, 특별 한 배경 필터 및 효율적인 분자 신안의 독특한 사용에 의해 분화 된다.

다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 CtDNA에서 희소 한 변이의 탐지

BRCA1 돌연변이를 가진 사람들은 BRCA1 변이체의 기능의 정확한 평가를 보증하는 암 발전의 고위험이 있습니다. 본명, 우리는 살아있는 세포에서 표적 C:G ~T:A 변환을 가능하게 하는 CRISPR 매개 사이토신 베이스 편집기를 사용하여 BRCA1 변이체의 기능적 평가를 위한 프로토콜을 기술했습니다.

CRISPR 중재 베이스 편집기사용 BRCA1 변종 기능 평가

이 기사에서는 면역 염색 및 크로마틴 면역 침전의 필수적인 단계를 소개합니다. 이 프로토콜은 일반적으로 DNA 손상 관련 세포 프로세스를 연구하고 DNA 복구에 연루된 단백질의 모집을 시각화하고 정량화하기 위하여 이용됩니다.

엔도누블레스 기반 사이트 별 DNA 손상을 시각화하고 정량화

여기에 제시된 것은 CD4 프로모터 근처의 이중 가닥 파단 복구와 관련된 돌연변이를 확인하는 데 사용할 수있는 sgRNA/CAS9 엔도뉴클레아제 및 차세대 시퀀싱 프로토콜입니다.

차세대 시퀀싱을 사용하여 CD4 프로모터 근처의 CAS9 유도 이중 가닥 파단의 복구와 관련된 돌연변이 확인

이 비디오는 현장 하이브리드화, 2 개의 다른 유전자의 공간과 시간적 표현식 패턴이 젊은 여자는 배아에서 시각 될 수있는 방법 2 색 전체 마운트를 보여줍니다. 이 방법은 원래 데이비드 윌킨슨, 도밍고스 헨리크, 필 잉엄 데이비드 이쉬 - Horowicz에 의해 도입되었다.

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

학습하세요 트랜스포자제 기반 기술을 활용한 11개 DNA 손상 복구 유전자의 차세대 염기서열 분석 방법입니다. 이 프로토콜은 gDNA 농축과 효율적인 시퀀싱을 통해 유전적 변이를 신속하게 검출할 수 있습니다.

의 전체 순서의 NGS 분석을위한 Transposase 기반 기술에 의해 gDNA를 농축 BRCA1 BRCA2, 9 유전자

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