막 단백질의 실시간 측정 : 수용체 상호 작용은 표면 플라즈몬 공명 (SPR)

다음 실험의 전반적인 목표는 표면 플라즈마와 공명을 사용하여 단백질 수용체 상호 작용을 입증하는 것입니다. 이것은 니트로 트리아세트산 또는 NT 매트릭스 위에 니켈 이온을 주입함으로써 달성됩니다. 다음으로 리간드(ligand)라고 불리는 단백질 중 하나는 블랭크 주입 후 센서 칩에 고정됩니다.

분석물이라고 하는 두 번째 단백질은 고정된 리간드 위에 주입됩니다. 두 단백질 간의 상호 작용을 감지하기 위해 결과는 두 단백질이 일시적으로 상호 작용하고 분석물이 리간드에서 분리됨을 보여줍니다. 상호 작용의 친화도는 두 단백질의 측정된 해리 및 해리 속도를 기반으로 계산할 수 있습니다.

풀다운(pull down) 또는 면역침전(immunoprecipitation)과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 종종 큰 생물학적 결과를 초래하는 일시적이거나 낮은 친화도 상호 작용을 식별할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 관심 단백질이 다른 단백질 또는 다른 작은 분자에 결합하는지 여부와 같은 생화학에서 상호 작용의 특성을 결정하고 친화도를 측정할 수 있는 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 샘플을 준비하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 정제된 단백질에서 모든 응집체를 제거합니다.

실행 중인 버퍼를 준비하고 영점 22미크론 필터를 사용하여 모든 버퍼와 단백질 샘플을 필터링합니다. 실행 중인 버퍼 병을 펌프 주입구에 연결하기 전에 필터가 단백질과 호환되는지 미리 확인하십시오. 러닝 버퍼를 10mL 따로 별도의 튜브에 보관하십시오.

그런 다음 버퍼 불일치를 방지하기 위해 실행 중인 버퍼에 대해 샘플을 희석합니다. 일반적으로 안정적인 리간드 동원해제를 위해서는 높은 리간드 농도와 반대로 낮은 흐름에서 더 긴 주입으로 낮은 리간드 농도를 사용하십시오. 높은 흐름에서 더 짧은 주입으로 농축된 리간드 스톡을 밀리리터당 약 20마이크로그램의 최종 농도로 실행 버퍼로 희석합니다. 마지막으로 분석물을 러닝 버퍼에 원하는 농도로 희석합니다.

친화성을 알 수 없는 시스템의 경우, 10 마이크로몰에서 10 아노 몰까지 다양한 분석물 농도를 10배 희석하여 테스트하십시오. 이 시연에서는 올리 히스티딘 태그로 단백질을 포획하는 데 적합한 NTA 결합 칩을 재사용합니다. 버퍼에서 저장된 칩을 꺼낸 후 이중 증류수로 완전히 헹구고 부드럽게 건조시킨 다음 원래 덮개에 넣습니다.

칩을 SPR 기기에 도킹하려면 센서 칩 도어를 열고 칩을 덮개에 넣습니다. 도어를 닫고 도크 칩을 누릅니다. 칩 셀 온도를 섭씨 25도로 설정합니다.

시료 격실을 섭씨 7도로 설정하여 실험 내내 단백질을 안정적으로 유지합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 로딩 및 스트리핑을 위한 용액을 준비한 후 SPR 기기를 실행 중인 버퍼로 프라임합니다. 다음 단계에서는 흐름을 분당 50마이크로리터로 설정합니다.

흐름 경로와 참조 빼기를 정의하여 여기에 설명된 결과를 얻습니다. 적절한 샘플 랙을 선택한 후 플로우 셀 번호 1, 플로우 셀 번호 2 및 플로우 셀 번호 1을 뺀 경로를 설정하고, 실행 중에 데이터가 저장되도록 실험을 시작하기 전에 결과 파일을 저장합니다. 각 실험은 주기로 구성됩니다.

각 사이클에서 수행된 주입을 명확하게 기록하고 리간드를 분리하여 완충액의 blank 주입과 분석물 주입을 다른 사이클로 로드합니다. 첫 번째 사이클은 칩 준비와 니켈 적재입니다. 흐름과 경로가 설정되었는지 확인한 다음 350밀리몰 EDTA를 1분 동안 주입하여 남아 있는 분자를 씻어냅니다.

그런 다음 유량을 분당 10마이크로리터로 설정합니다. 그런 다음 0.5 밀리몰 염화니켈을 2분 동안 주입합니다. 이제 칩 수지는 니켈 이온으로 코팅됩니다.

사이클 2는 리간드 고정화입니다. 유량을 분당 15마이크로리터로 설정하고 플로우 셀을 플로우 셀로 설정합니다. 두 번째, 반응 단위 또는 리간드 분자량의 10-20배인 R ru 값에 도달할 때까지 리간드 A를 주입합니다.

예를 들어, 50킬로달톤의 리간드를 501, 000RUS 사이로 로드합니다. 달성한 RU 값을 기록해 둡니다. 그런 다음 유량을 분당 15마이크로리터로 설정하고 플로우 경로를 플로우 셀 번호 1로 설정하고, 제어 리간드 B를 리간드 A와 동일한 RU 값까지 주입하여 빼기를 모니터링하고, 주입 길이를 제어하는 데 도움이 되는 sensori Graham 온라인을 사용합니다.

다음으로, 유량을 분당 50마이크로리터로 설정하고 플로우 경로를 플로우 셀 번호 1 및 플로우 셀로 설정합니다. 둘째, 기준선이 안정화될 때까지 5분에서 20분 동안 시스템을 세척합니다. 세 번째 주기는 블랭크 주입입니다.

이 주입은 공백 뺄셈을 위해 사용됩니다. 따라서 분석물 자체를 제외하고 분석물과 함께 주입될 모든 성분을 포함하십시오. 사출 길이는 평형에 도달하는 데 걸리는 시간에 따라 달라질 수 있습니다.

유량을 분당 15마이크로리터로 설정하고 플로우 셀을 플로우 셀 번호 1, 플로우 셀 번호 2, 플로우 셀 번호 1로 설정하고 플로우 셀에서 뺀 값을 설정합니다. 둘째, 안정적인 기준선을 얻기 위해 30초 동안 weight 명령을 삽입합니다. 그런 다음 13초 동안 실행 중인 버퍼를 삽입합니다.

해리 단계를 기록하기 위해 120-600초 동안 기다립니다. 이 단계의 길이는 kd에 따라 다릅니다. 해리가 느릴수록 이 단계가 더 길어져야 합니다.

사이클 4는 분석물 주입입니다. 사이클 3에서 사용된 정확한 조건을 복사하여 붙여넣어 나중에 이 두 주입을 뺄 수 있습니다. 랙의 슬롯 위치를 제어 용액이 있는 위치에서 분석물 용액이 있는 위치로 변경합니다.

예상 평형 해리 상수보다 약간 높은 농도를 선택합니다. 사전 지식이 없는 경우 하나의 마이크로몰을 좋은 시작점으로 선택하십시오. 버퍼 주입 및 분석물 주입을 두 번째로 수행한 후 사이클 7 칩 트립 오프를 수행합니다.

유량을 분당 50마이크로리터로 설정한 다음 1분 동안 350밀리 몰 EDTA를 주입합니다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다. 칩이 손상될 수 있으므로 3분 동안 한 번 주입하지 마십시오.

다음으로 0.25% sodium dcal sulfate를 1분 동안 주입합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다. 니켈 로딩 후 칩이 손상될 수 있으므로 3분을 한 번 주입하면 관심 트랜스포머가 플로우 셀 번호 2에서 최대 3, 500 R rus에 고정됩니다.

그런 다음 동일한 유속 및 주입 기간을 사용하여 제어 리간드를 1번 플로우 셀에 주입하고 처음에는 최대 3000R까지만 도달하여 두 플로우 셀에서 유사한 양의 단백질이 고정되도록 합니다. 제어 리간드는 최대 3, 500 RDU의 부하를 모니터링하면서 더 짧은 주입으로 추가로 로드됩니다. 계단 모양은 각 주입 시 플로우 셀 번호 1의 질량이 점진적으로 증가하는 것을 나타내며, 여기에 표시된 것은 플로우 셀에서 뺀 플로우 셀 번호 1입니다.

둘째, 동일한 하중을 달성하기 위해 리간드 주입 기간을 변경하는 것이 중요합니다. 대조적으로, 정량적 데이터를 얻는 데 사용되는 모든 농도에 대해 분석물 주입 지속 시간은 일정하게 유지되어야 합니다. 다양한 농도의 분석물이 주입됩니다.

여기에 표시된 것은 일정한 주입 길이로 다양한 농도의 분석물을 주입한 것입니다. 서로 다른 분석물 농도는 무작위 순서로 주입되며, 이중 블랭크 센추리 그램은 친화력과 속도 상수를 도출하기 위해 분석 전에 x축으로 정렬됩니다. 모델 부속품이 적용됩니다.

mod BCA 상호 작용에 대해 계산된 평형 해리 상수는 적당히 빠른 KA 및 빠른 KD를 마스터하면 마이너스 6 어금니에 대해 약 3 곱하기 10입니다. 이 기술은 이 비디오를 시청한 후 몇 시간 이내에 수행할 수 있습니다. 관심 단백질을 사용하여 SPR 실험을 설계하고 수행하는 방법을 잘 이해하고 있어야 합니다.