Name: 인간 전혈에서 실시간 세포 독성 분석 실험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 배우세요 인간 전혈에서 실시간 세포 독성 분석 방법을 통해 항체의 암세포 사멸 효능을 정량적으로 평가하는 기술을 익히세요. 이 방법은 단일세포 해상도로 약물 효과를 측정하여 동물 실험 전 체외 평가를 가능하게 합니다.

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우리는이 일 [R33 CA174616-01A1]을 자금 NIH에서 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)의 IMAT 프로그램을 감사합니다.

1. 대상 셀 준비 <ol><li> 37 O C에서 (10 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS), 4 ㎚ L 글루타민, 500 IU / ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신, RPMI 1640 배지) 성장 배지에서 표적 세포 (예. 라지 림프종 세포)를 유지 5 % CO 2 인큐베이터. </li><li> 15ml의 튜브에 표적 세포 펠릿 시료를 원심 분리기. 원심 분리 시간은 다른 세포 유형에 따라 달라집니다; 라지 세포에 대한 468 XG에 3 분 동안 원심 분리. </li><li> 먼저 상층 액의 표면에 형성하는 거품을 대기음, 전체 상층 액을 제거합니다. </li><li> 튜브에 PBS의 10 ML을 추가합니다. 세포 덩어리를 분리시킨 솔루션을 피펫 팅에 의해 여러 번 아래로 세포를 다시 일시 중지합니다. </li><li> 원심 분리기 468 X g에서 3 분의 샘플. </li><li> 상등액의 표면에 형성하는 기포를 대기음, 전체 상층 액을 제거한다. </li></ol> 세포 마이크로 어레이 2. 준비 <ol><li> Obtain 세포 부착 96 웰 플레이트 키트 또는 단일 셀 어레이 8 웰 챔버 슬라이드 (재료 / 시약의 표 참조). </li><li> 키트에서 DNA 시약에 액티베이터의 1.2 μl를 적용합니다. , 유리 병 캡을 반전, 부드럽게 솔루션을 혼합 흔들어. </li><li> 이 솔루션은 실온에서 20 분 동안 반응 할 수 있습니다. </li><li> (15 ML 튜브에서) 표적 세포 펠렛에 혼합 용액을 적용합니다. </li><li> 500 nM의 최종 농도 세포질 녹색 형광 염료를 추가한다. </li><li> 오비탈 쉐이커상에서 RT에서 30 분 동안 혼합 용액 및 염료로 표적 세포를 부화. </li><li> 5 ml의 PBS로 두 번 세포를 씻어, 10 ml의 성장 배지에서 세포를 재현 탁. </li><li> 각 웰 단계 2.7에서 용액 100 μl를 적용합니다. hemacytometer를 이용하여 세포 수를 계산. 확인 세포 수를 잘 당 6 ~ 10 × 10월 4일에서 1일까지 × 5 사이의 세포를 다양합니다. </li><li> 실온에서 배양 10 ~ 15 분 후, 부드럽게 200-30로 두 번 샘플을 씻어0 μL 성장 미디어는 언 바운드 세포를 제거합니다. 참고 : 약 5 ~ 10 μL 성장 미디어는 세척 후 각 웰에 남아 있습니다. </li></ol> 3. 전체 혈액 세포 독성 분석 실험 <ol><li> 물론 각각의 샘플에 인간의 전체 혈액의 180 μl를 추가합니다. </li><li> ㎖ / 5mg을에 항 CD20 항체 용액을 얻어서하도록 일련의 희석을 수행하는 50, 20, 10, 5, 2, 1, 1.5 ㎖의 튜브에 항 CD20 항체 용액 0.5 ㎍ / ml로. 각 샘플 잘 삼중를 만들기 위해 항 -CD20 항체의 농도를 각각 20 μl를 추가합니다. </li><li> 각 웰에 500nM의 최종 농도로 요오드화 프로피 듐을 추가한다. </li><li> 16 시간 동안 5 % CO 2로 37 ° C에서 얻어진 플레이트를 인큐베이션. </li><li> 이미지 슬라이드 또는 8 배 배율 자동 이미징 시스템을 96 웰 플레이트에 세포. </li><li> 결과를 정량화하는 자동 촬상 시스템의 셀 카운팅 프로그램을 사용한다. 주 : 자동 촬상 시스템의 소프트웨어는 단순 제공단계별 세포 계수에 대한 작업을. 이 소프트웨어를 사용하는 프로토콜은 제공자의 웹 사이트에서 확인할 수있다. </li><li> 소프트웨어의 메인 페이지에서 [리뷰 결과]를 선택합니다. </li><li> [샘플 저​​장 한 파일]을 선택합니다. </li><li> 제 1 게이트는 FITC 강도가&gt; (50), 다음 게이트 TxRed가 강도&gt; (20)을 의미 의미한다. </li><li> [플레이트 개요]를 선택합니다. </li><li> [내보내기 테이블]을 선택합니다. 참고 :이 프로그램의 비율 세포 살해 공식은 다음과 같습니다 : % 표적 세포 살해 = (녹색과 빨간색 두 염색 된 세포의 # / 세포의 # 녹색 스테인드) * 100 % </li></ol>

<ol><li>Hutchinson, L., Kirk, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+drug+attrition+rates--where+are+we+going+wrong%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">High drug attrition rates--where are we going wrong.</a> Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).</li>
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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.

WCA는 이상적으로 이러한 CDC와 ADCC 분석 9-11, 같은 및 전임상 동물 시험 전에 기존 대상 검사 한 후 사용 단일 셀 해상도 12-16,와 체외 안티 - 암 검진 도구에서 중요하다. 현재, 이러한 CDC 또는 ADCC 분석 1 차 대상 심사 분석은 모든 단순화 된 미디어 또는 버퍼 시스템에서 수행됩니다. 그러나 이러한 단순화 된 완충 시스템에서 효능을 보여 약물 후보는 항상 더 복잡한 전혈 시스템에서 효과적이지 않다. 따라서, WCA는 전통적인 타겟 상영 비싼 동물 연구 간의 격차 가양 줄이고, 따라서 동물 실험 또는 인간 임상 시험에서 예방 고장을 방지 할 수있다. WCA는 인간 전혈의 함량 약물 효능을 테스트하기 위해 전임상 연구에서 작업 연구자 유익 할 것이다. 유동 세포 계측법을 사용하여 죽은 자와 살아있는 세포를 계산하는 것은 적혈구 CE의 완전한 용해가 필요합니다순서 LLS가 표적 세포를 검출한다. 유동 세포 계측법 위에 WCA 기술...

제약 산업에서의 최근의 진보는 종양 세포 항체 및 개인화 된 암 치료의 특정 식별을 실현하는데 관심이 높아진있다; 그러나, 여러 가지 장애물 공정에서 발생된다. 전임상 개발에 항암 활성을 에이전트의 단 5 %의 단계 II-III 시험 1, 2에 충분한 효능을 표시 한 후 라이센스가 부여됩니다. 많은 예제 인해 서로 다른 혈액 성분 3-5 그 항 종양 약물은 인간에 주로 실험 동물에 다르게 동작 보여 주었다으로 임상 전략 (생체 외 및 생체 내) 최적입니다. 항암 약물 스크리닝 플랫폼의 필요성을 해결하기 위해 비싼 동물 실험 및 임상 시험 전에 체크 포인트를 제공하기 위해, 인간 전혈 세포 독성 분석 (WCA)는 더욱 중요한 생물학적 환경에서 항 종양 약물의 효능을 평가하기 위해 제안된다.전혈 세포 독성 분석은 항체 및 인간 전혈의 다른 약물 후보 개별 세포의 반응을 평가할 수있다. WCA는 높은 처리량과 높은 함량 촬상 6 높은 처리량 셀 위치 결정 기술을 통합하여 개발된다. 자동화 된 이미징 시스템을 이용하여 모두 거실과 사균의 수는 고정밀 도로 측정 할 수있다. 인해 표적 세포가 동일한 초점 평면 상에 고정된다는 사실 때문에, WCA는 적혈구의 제거없이 실시간 정량적 세포 독성 분석을 제공 할 수있다. 또한, 자동 촬상 시스템은 그 특정 기준에 도달 한 경우에만 표적 세포 (예., 형광 표지 된 세포 및 세포 형태) 등의 여러 가지 이점 게이팅되고 처리를 제공한다. 또한, 하루에 144 판의 생산을 허용한다. 결과적으로,이 영상 능력과 처리량이 높은 C의 실행을 허용ontent 동시에 높은 처리량 실험. WCA 및 자동화 된 이미징 시스템을 조합함으로써, 높은 처리량 정량 세포 독성 분석은 더욱 중요한 생물학적 환경에서 달성 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>셀 부착 96웰 플레이트 키트&nbsp;</td><td>Adheren</td><td>AP9601</td><td></td></tr><tr><td>현탁액 단일 세포 어레이 8웰 챔버 슬라이드</td><td>Adheren</td><td>SS0801</td><td></td></tr><tr><td>Adherent 단일 세포 어레이 8웰 챔버 슬라이드</td><td>Adheren</td><td>SS0802</td><td></td></tr><tr><td>림프종 세포주 CD20+</td><td></td><td>ATCC CCL-86</td><td>라지 세포</td></tr><tr><td>림프종 세포주 CD20-ATCC</td><td></td> <td>CRL-8083</td><td>MC/CAR</td></tr><tr><td>RPMI 1640(L-글루타민 포함</td>)<td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Fetal 소 혈청</td><td>Thermo</td><td>SH30070.01HI</td><td></td></tr><tr><td>Peni/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Cytosolic dye</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td>세포 추적기 Green</td></tr><tr><td>Rituxan (바이오시밀러)&nbsp;</td><td>Eureka Therapeutics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인간 전혈</td><td>Allcells</td><td>WB001</td><td></td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물</td><td>시그마</td><td>P4170-10MG</td><td></td></tr><tr><td>자동 이미징 시스템</td><td>분자 장치</td> 공급업체 <td>Cell Reporter</td><td>에 문의</td></tr><tr><td>세포 계수 프로그램</td><td>분자 장치</td> 공급업체 <td>Cell Reporter</td><td>에 문의</td></tr></tbody></table>

인간 전혈에서 실시간 세포 독성 분석 실험

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

전반적인 세​​포 독성의 시간 정보에 대한 액세스를 허용 생균 기반 전혈 세포 독성 분석 (WCA)는 높은 처리량 셀 측위 기술 개발된다. 표적 종양 세포 인구 먼저 배열 형식으로 고정화에 미리 프로그램 및 녹색 형광 세포질 염료로 표시되어 있습니다. 셀 어레이의 형성에 이어, 항체 약물은 인간 전혈과 조합하여 첨가한다. 요오드화 프로피 듐 (PI)는 다음 세포 사멸을 평가하기 위해 첨가된다. 셀 어레이는, 자동 촬상 시스템으로 분석된다. 세포질 염료를 대상으로 종양 세포 인구 레이블하지만, PI는 죽은 종양 세포 인구 레이블. 따라서, 표적 암 세포의 사멸 율은 죽은 표적 세포의 수에 표적 세포 생존 수를 계산함으로써 정량화 할 수있다. 이 방법으로, 연구자들은 시간 의존적 농도 의존적​​ 세포 독성 정보에 액세스 할 수있다. 놀랍게도, 유해 라디오 없다화학 물질이 사용된다. 여기에 제시된 WCA는 림프종, 백혈병 및 고형암 세포주에서 테스트되었습니다. 따라서, WCA는 연구자가 관련성이 높은 생체 조건에서 약물의 효능을 평가할 수 있습니다.

항 CD20 항체 및 림프종 세포 (라지 세포 및 MC / CAR)은 전혈 세포 독성 분석 (WCA) 7,8 입증하는 모델 시스템으로 선택되었다. MC / CAR 세포들은 멤브레인 CD20 낮은 카피 수 있었는 라지 세포는 세포 표면 상 CD20의 높은 카피 수 있었다. 표적 세포는 먼저 녹색 형광 세포질 염료 녹색 염색 96 웰 플레이트에 배열했다. 10000 - 50000 림프종 표적 세포를 각 웰에 고정화 하였다. 갓 그린 인간 전혈 180 ㎕를 각 웰에 첨가 하였다. 항 CD20 항체는 농도 구배 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가 하였다. 37 ° C에서 16 시간 배양 한 후, 세포 수는 녹색 형광 세포 및 적색 형광 세포의 수를 분석하여 자동 화상 카메라를 통해 정량적으로 평가 하였다. 림프종 표적 세포가 모두 동일한 초점 평면 상에 배열 되었기 때문에, 각 셀의 형광도 레모 않고 직접 검출되었다웰에 혈구 ving. 도 1에</st...

전혈 세포 독성 분석 (WCA)는 형광 현미경 및 자동화 된 화상 처리와 높은 처리량 셀 위치 결정 기술을 통합하여 개발 된 세포 독성 분석이다. 여기서, 우리는 항 CD20 항체로 처리 림프종 세포가 세포 독성 정량적 분석을 제공하는 인간 전혈에서 실시간 분석 할 수있는 방법을 설명한다.

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

이 절차의 목적은 단일 세포 해상도로 인간 전혈에서 표적 암세포의 세포 독성을 측정하는 것입니다.먼저, 표적 암세포의 단일 세포 어레이가 생성됩니다. 인간 전혈을 세포 어레이에 추가하고 항체와 같은 약물을 적용합니다. 그런 다음 세포를 프로피듐, 요오드화물과 같은 세포 생존도 염료로 배양하고 고처리량 이미징을 사용하여 빨간색으로 염색된 죽은 표적 암세포의 수를 측정하여 궁극적으로 약물 세포 독성 효능을 제공합니다.LDH 및 크롬 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이미징 기능을 갖춘 인간 전혈에서 암세포 사멸을 수행할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 동물 연구 전에 세포 부착 96을 획득하여 시작하기 전에 시험관 내에서 항체 세포 독성을 평가할 수 있습니다. 웰 플레이트 키트 또는 단일 셀 속도 8 웰 챔버 슬라이드, 96 웰 플레이트가 사용됩니다.키트의 DNA 시약이 들어 있는 튜브에 활성제 1.2마이크로리터를 바르고 바이알을 뚜껑을 덮고 뒤집고 부드럽게 흔들어 용액을 혼합합니다. 용액이 실온에서 20분 동안 반응하도록 합니다. 그 동안 대상 세포를 준비합니다.이 시연에서는 Raji 림프종 세포가 표적 세포 역할을 합니다. CO2 인큐베이터에서 보충된 RPMI 1640 배양 배지, 섭씨 37도에서 유지하십시오. 실험을 위해 대상 라히 세포를 준비하려면 5-1,000만 개를 15밀리리터 원뿔형 튜브 원심분리기에 3분 동안 468회 G.스핀 후 피펫을 사용하여 supinate 표면에 형성된 기포를 흡인합니다.그런 다음 전체 supinate를 제거하고 버리십시오. 다음으로 튜브에 PBS 10ml를 추가합니다. 세포 덩어리를 분해하기 위해 용액을 위아래로 퍼싱하여 세포를 재현탁시키고, 원심분리 후 468배 G씩 3분 동안 세포를 다시 원심분리하고, 앙와위작용제의 표면에 형성된 기포를 흡인하고, 키트의 활성제 및 DNA 용액을 20분 동안 배양한 후 이전과 같이 전체 앙와위스제를 제거 및 폐기합니다.혼합 용액을 15ml 튜브의 대상 세포 pal에 적용합니다. 세포 펠릿을 분해하기 위해 용액을 피펫팅합니다. 다음으로, 최종 농도 500 나노몰에서 녹색 형광 세포질 염료를 추가합니다.혼합 용액과 염료가 포함된 타겟 세포를 오비탈 셰이커에 놓고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 5ml의 PBS로 세포를 두 번 세척하고 와셔 사이를 원심분리하고 다시 현탁시킵니다. 적절한 부피의 RPMI 1640에

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연구

JoVE Journal

Medicine

의학

크롬 출시 분석, 세포 독성 T 세포의 활동을 검출하기위한 일반적인 분석은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 본 문서에서, 항원 특이 CD8 T 세포와 인간의 유방암 종양 라인 SKBR3를 사용하여 임피던스 기반의 접근 방식은 세포의 살해를 감지하는 기능에 대해 조사 하였다.

xCELLigence 시스템으로 CR51 릴리스 분석을 비교하여 인간 Her2neu 특정한 CD8 T 세포의 최적 세포 독성 활동 결정

이 비디오는 암세포에 대한 사이토카인 유도 살해(CIK) 세포의 세포독성 능력을 측정하는 체외 기술을 보여줍니다. 표적 암세포와 CIK 세포를 공동 배양하면 형광 생존도 염료를 사용하여 죽은 암세포를 식별하고 유세포 분석을 사용하여 정량화하여 CIK 세포의 세포독성 효과를 추정합니다.

사이토카인 유도 살해 세포의 세포독성 능력을 연구하기 위한 체외 분석

이 비디오는 실시간 전기 임피던스 측정을 통해 암세포에 대한 CAR T 세포 활성을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 임피던스의 변화를 추적하면 암세포 세포 용해를 유도하는 CAR T 세포의 효과를 평가하여 세포 독성 능력에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

CAR T 세포의 효능을 평가하기 위한 실시간 체외 세포분해 분석

우리는 종양 대상 세포와 incubated 때 T 세포의 세포 독성을 측정 할 수있는 단일 셀 높은 처리량 분석을 설명합니다. 이 방법은 spatially 정의 비율에서 T 세포와 대상 세포를 한정하는 하위 nanoliter 우물 (~ 100,000 우물 / 배열)의 조밀 한, 탄성 배열을 사용하고 이펙터 - 대상 활용 및 후속 apoptosis를 모니터링하는 형광 현미경에 연결된다.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

이 프로토콜은 민감한 세포 기반 세포 독성 분석을 설명합니다. 이 분석은 effector CD8+ T 세포의 수가 증가할 때 살아있는 표적 CD4+ T 세포의 빈도 감소를 열거함으로써 항원 특이적 CD8+ T 세포의 세포 용해 활성을 직접 평가할 수 있습니다.

세포독성 활성을 측정하기 위한 세포 기반 유세포 분석 분석

이 작업은 인간 혈액 샘플에서 NK(Natural Killer) 세포 수와 NK 세포 독성을 정확하고 빠르게 측정하기 위한 고급 워크플로우를 설명합니다.

인간의 전체 혈액 자연 살해 세포 용 균성 활동의 유세포 분석

양적 인간의 자연 킬러 세포의 세포 독성 활동을 결정 하는 흐름 cytometry 기반 방법은 여기에 표시 됩니다.

인간 NK 세포 활동의 평가 대 한 흐름 Cytometry 기반 세포 독성 분석 실험

우리는 액체 및 고체 종양 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포의 효능을 평가하기 위해 시험관내 세포분석 시스템을 정량적으로 실시간으로 기술한다. 이 프로토콜은 다른 면역 이펙터 세포뿐만 아니라 조합 치료를 평가하기 위해 확장 될 수있다.

고체 및 혈액암 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포를 위한 실시간 힘 분석

전혈 기반 면역분석은 진단 및 연구 목적으로 항원 특이적 면역을 분석할 수 있는 간편하고 자원 효율적인 도구를 제공합니다. 이 기사는 소아 환자 및 소동물을 위한 소량 버전을 포함하여 진균 및 바이러스성 병원체에 대한 숙주 면역의 포괄적인 분석을 위해 이중 공동 자극을 갖춘 최적화된 전혈 기반 프로토콜을 제공합니다.

진균 및 바이러스성 병원체에 대한 숙주 면역의 항원 특이적 분석을 위한 이중 공동 자극을 사용한 전혈 분석

여기에서는 단일 세포 수준에서 세포 사멸을 조사하기 위해 하나의 T 세포와 암 표적 세포를 캡슐화하는 이중 에멀젼 방울을 만드는 방법을 설명합니다. 이 방법은 많은 T 세포 집단 내에서 세포독성 분자와 표적 세포 사멸을 모두 이중 정량화할 수 있습니다.

단일 세포 수준에서 키메라 항원 수용체 T 세포를 평가하기 위한 액적 기반 세포 독성 분석

이 프로토콜은 생세포 영상과 유세포분석을 사용하여 인간 자연 살해 세포의 자연 키메라 항원 매개 매개 항체 의존성 세포독성을 일관되게 측정하기 위한 표준화된 시험 관 내 워크플로우를 제공합니다.

키메라 항원 수용체와 치료용 항체에 의해 증강되는 NK 세포 독성을 생세포 영상 및 유동 세포분석을 이용해 정량화합니다

배우세요 인간 전혈에서 실시간 세포 독성 분석 방법을 통해 항체의 암세포 사멸 효능을 정량적으로 평가하는 기술을 익히세요. 이 방법은 단일세포 해상도로 약물 효과를 측정하여 동물 실험 전 체외 평가를 가능하게 합니다.

인간 전혈에서 실시간 세포 독성 분석 실험

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