Name: electroporation하여 병아리 배아 척수에서 차동 유전자 발현의 RNA-SEQ 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 학습하세요 병아리 배아 척수의 전사체 분석을 위한 in ovo 전기천공 및 RNA-seq 방법을. 이 기술은 발달 신경생물학 연구에서 유전자 발현 수준을 정량적으로 평가하는 데 활용됩니다.

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CYIY는 FAPESP (2012/14421-5)에 의해 지원되며 FMV는 FAPESP (2009/53695-0)의 펠로우십에 의해 지원됩니다. 이 작업에 사용된 RNA-Seq 라이브러리의 준비 및 염기서열분석을 해준 University of California, Davis의 DNA Technologies Core, 고처리량 염기서열분석 데이터 분석 도구를 위한 우수한 무료 인터페이스를 제공한 Galaxy 팀, 실험실 공간에서 촬영할 수 있도록 해준 Marianne Bronner 박사에게 감사드립니다.

1. Electroporate HH12-13 닭 배아의 신경 튜브 OVO의 관심의 구조물 형질 전환의 만족 수준이 개인의 빠른 식별을 가능하게하기 위해, 바람직하게는 시스 트론 성적 증명서, 형광 기자를 사용하거나 인터 바이러스 2A 펩타이드 (11)와 함께 관심의 단백질에 융합. 참고 :이 단계에 대한 일반적인 배양 시간은 37.8 ° C에서 약 48 시간이다. <ol><li> 18 G X 1 1/2 바늘에 연결된 주사기와 알부민의 3 ㎖를 제거한 후 계란에있는 작은 창을 엽니 다. 배아 시각화를 향상시키기 위해, 배아 1-4 아래 멸균 링거액에서 1:50 희석 인도 소량의 잉크를 분사. </li><li> 멸균 링거액과 배아를 커버 한 후, 2.5 μg의이 신경관의 후방 말까지 DNA가 채우기 / 때까지 μL를 포함하는 10 mM 트리스 - 염산, pH를 8.2 및 0.1 % 식품 염료 (F, D &amp; C) 솔루션을 주입후뇌 지역까지. 상기 측면 영역을 따라 4mm (1)에 의해 분리 된 위치 백금 전극 (직경 0.5 mm)를 electroporate하고 (4) 사이의 100 밀리 초 간격으로 5 내지 50 밀리 초 펄스 및 20 V를 제공한다. </li><li> 전기 후, 그들은 무대 HH23에 도달 할 때까지 더 48 시간 동안 조작 배아를 배양시키고, 형광 실체 현미경을 이용하여 측면 지역에서 형질의 높은 수준을 제시 개인을 식별 할 수 있습니다. NOTE : 일렉트로 후 배양 기간은 실험의 목적에 의존한다. 일렉트로 플라스미드는 2 시간이 후에 상당한 발현 수준을 생성 할 수있다. 관심 조발성 유전자에 놓여 있다면 따라서, 이후 일렉트로 잠복기가 감소 될 수있다. </li></ol> 2. 수확 성공적으로 배아 형질과 일렉트릭 척수 반쪽을 해부하다 참고 :이 절차는 각 10 배아 및 수익률 1 ~ 3 시간까지 지속-2 배아 당 μg의 총 RNA. 신경 튜브의 해부는 좋은 움직임을 필요로하고 연습 세션은 실험 시료에 적용하기 전에해야 할 수 있습니다. <ol><li> 의 RNase의 오염 제거 용액 또는 4 시간 12 150 ℃에서 소성하여 금속 해부 도구의 오염을 제거하고 DEPC 처리 된 PBS를 준비합니다. 만 새로운 인증의 RNase없는 plasticware에 사용합니다. NOTE : 수확 후에는 박리시의 RNase 오염을 방지하기 위해 표준 치료를 수행하는 것이 중요하다. </li><li> 미세 해부 가위와 정립 수집 숟가락을 사용하여 배아를 수확. 100mm 페트리 접시에 차가운 DEPC 처리 된 PBS에서 배아를 보관하십시오. </li><li> 미세 핀셋으로 (전방 사지 꽃 봉 오리와 후방 사지 새싹의 전방 한계의 후방 한계 사이의) 전체 측면 영역을 잘라 차가운 DEPC 처리 된 PBS를 포함하는 새로운 요리에이 부분을 전송할 수 있습니다. </li><li> 세 가지를 관통하는 두 개의 미세 유리 바늘을 사용하여신경 튜브와 근축 중배엽 사이의 배아 각각의 배 외측면에 가리 킵니다. </li><li> 중앙 구멍에 두 개의 유리 바늘을 소개하고 천천히 신경관 전후방 축을 따라 그 중 하나를 멀리 이동합니다. 첫 번째 움직임에 의해 도달되지 않은 구멍에 대해이 단계를 반복합니다. 미세 핀셋으로 분리 된 근축 중배엽를 제거합니다. </li><li> 옆으로 배아를 돌려 신경관과 척색 사이의 핀셋의 끝을 삽입하고 두 개의 구조를 분리하는 전후방 축 방향의 반대 방향으로 그들을 밀어 넣습니다. 참고 :이 또한 중배엽의 대부분은 여전히​​ 신경 튜브에 부착 제거해야합니다. </li><li> 필요한 경우 가볍게 핀셋의 또 다른 쌍의 신경 튜브를 잡고 핀셋으로 잡아 당겨 부착 된 상태로 유지 mesodermic 조직의 더 큰 조각을 제거합니다. 완료되면, 부드럽게를 사용하여 추운 DEPC 처리 된 PBS를 포함하는 다른 요리에 신경 튜브를 전송의 RNase없는 유리 파스퇴르 피펫은 수동 피펫 펌프에 연결된 모든 튜브 해부 될 때까지 얼음에 보관하십시오. </li><li> 두 부분으로 신경 튜브를 나눈다. 이를 위해, 루멘에 핀셋의 폐쇄 된 한 쌍의 날카로운 끝을 삽입하고 그것을 통해 핀셋을 이동하여 지붕 판을 엽니 다. 그 후, 핀셋 팁 바닥 판을 절단하여 절반을 분리. </li><li> 정렬 얼음처럼 차가운 DEPC 처리 된 PBS로 가득 1.5 ML 튜브에 형광 해부 범위 및 전송에서 비 일렉트로 반쪽에서 일렉트로. 필요한 경우, 플라스틱 벽에 부착 된 조직을 분리하고 튜브의 침전을 촉진하기 위해 부드럽게 마이크로 튜브를 가볍게. </li><li> 3 초 동안 100 XG에 스핀과 1 ml의 마이크로 피펫으로 가능한 한 PBS로 매우 천천히 제거합니다. 어떤 배아 물질이 피펫 팁에 흡입되어있는 경우 모니터하기 위해 마이크로 튜브를 통해 빛난다 광원을보고하는 동안이 작업을 수행; 이 경우, 천천히 방전 centrifuga를 반복기. </li><li> 신경관 절반 당 RNA 추출을위한 분해 용액 70 μl를 추가하고 내용을 혼합 튜브를 가볍게. 격렬하게 5 분와 소용돌이 실온에서 인큐베이션. 5 분 배양과 와동 두 번 더 반복합니다. -80 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 다음 단계에 대한 충분한 수율을 보장하기 위해 샘플 당 최소 8 신경관 반쪽를 수집합니다. 여러 전기 / 해부 세션이 신경 튜브의 충분한 수를 축적해야하는 경우 작은 샘플을 풀. 각 조건에 대한 중복 또는 삼중 충분한 샘플을 보관합니다. </li></ol> 3. Purify는 RNA와 Illumina의 시퀀싱 라이브러리를 준비 <ol><li> -80 ° C 저장에서 샘플을 제거하고 15 ~ 30 분 동안 얼음에 배치합니다. 완료 될 때까지 실온에서 해동을 다시 시작합니다. </li><li> 와동 잘 5 분 동안 실온에서 떠난다. 1 분 15,000 XG에 다시 소용돌이 원심 분리기는 불용성 물질을 펠렛. </li><li> 새로운 튜브에 뜨는을 전송및 총 RNA 분리 키트 설명서 지침에 따라 RNA 추출을 진행합니다. 농도를 증가시키기 위해 최소의 부피로 용출시켰다. NOTE : 청소 후 DNase를 처리 RNA-SEQ 셋 게놈 DNA 서열의 오염 가능성을 피하기 위해 권장된다. </li><li> 내용물을 혼합하고 품질 관리 분석을위한 5 μl를 제거하는 튜브 톡. 라이브러리 준비까지 C ° -80에서 나머지 샘플을 보관; 이들 샘플은 RNA의 분해를 방지하기 위해 단 한번만 해동되어야한다. </li><li> RNA 6000 나노 키트를 사용하여 Bioanalyzer 상품에 정제 된 RNA를 실행; RIN 값은 최소 7 위의 진행을해야합니다. </li><li> 일루미나 호환 RNA-SEQ 라이브러리 준비 키트를 사용하여 라이브러리를 생성하고 하나의 읽기 (100) BP를 생성하기 위해 설정 HiSeq 악기의 한 차선에서 4 라이브러리에 멀티 플렉스. 가능하면, 잠재적 인 기술 유물을 최소화하기 위해 같은 실행의 모든​​ 샘플을 포함한다. 참고 :이 5000 만 R까지 양보해야대부분의 유전자 (13)에 대한 커버리지를 얻을 수있을만큼보다 더 샘플, 당 EADS. </li></ol> 4. 갤럭시 공용 서버 (10)에 RNA-SEQ 데이터 집합을 비교. 참고 : 서버 저장 공간이 제한되며 많은 샘플을 비교 실험 필터링 단계에서 생성 된 중간 파일의 삭제를 요구할 수있다. <ol><li> (갤럭시 공개 서버에 사용자 계정을 만듭니다 <a href="https://usegalaxy.org/">https://usegalaxy.org</a> ) 및 FTP는 fastq 형식으로 Illumina의 데이터 세트를 업로드 할 수 있습니다. </li><li> NGS에서 FastqGroomer (14) 도구를 사용하여 업로드 된 파일 준비 : 품질 관리 및 조작 메뉴를; 품질 평가 점수가 이미 Phred + 33 (생거)으로 인코딩 된 경우, 단순히 각각의 데이터 세트에 대한 속성에서 fastqsanger하는 파일 형식을 변경하여이 단계를 건너 뜁니다. </li><li> QC 및 조작 나를 : 일반 NGS에서 FastQC 도구를 사용하여 각 데이터 세트의 품질 분석뉴. 참고 :이 읽기의 끝을 트리밍에 사용되는 매개 변수에 대한 추정치를 제공하므로 특별한주의가 염기 서열의 품질 별, 염기 서열의 콘텐츠에 대한 결과 그래픽 고려되어야한다. </li><li> 트림 3 &#39;폐기 읽는 도구 NGS에서 FASTQ 품질 트리머 (14) 사용하여 낮은 품질의 데이터로 끝나는 : 품질 관리 및 조작 메뉴를 표시합니다. 만 3 &#39;가 20 아래 품질 평가 점수에 대한 종료 처리하기 위해 도구를 설정합니다. </li><li> 클립 도구 (사용하여 읽기에서 어댑터 시퀀스를 제거 <a href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a> QC 및 조작 메뉴 : NGS 아래 참조). 왼쪽보다 45 bp의 입력에 사용되는 어댑터의 순서로 읽어 버리고 모두 클리핑 및 비 클리핑 된 시퀀스를 포함하는 출력을 선택할 수있는 도구를 설정합니다. 또한, 가장 낮은 품질의 기지가 이미 마지막 단계에서 제거 된 이후 알 수없는 기지와 시퀀스를 폐기하지 않는 선택. </lI&gt; <li> 도구 트림 시퀀스 (사용 <a href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a> NGS 아래)가 FastQC에 의해 검출 된 5 &#39;시퀀스 바이어스 (일반적으로 10)를 제거하기 위해 읽기의 ​​품질 관리 및 조작 메뉴를 첫 번째 기지 트림. 참고 :이 시점에서, 다시 FastQC을 실행하고 데이터 세트의 품질이 향상되었는지 확인하기 위해 이전의 분석과 비교하는 것이 좋습니다. </li><li> 다운로드 일루미나 iGenomes에서 UCSC 게놈 브라우저의 최신 닭 게놈 어셈블리를 풀고 ( <a href="http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn">http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn</a> ) 전체 게놈 FASTA 형식 파일 및 유전자 주석 GTF 형식의 파일을 업로드 데이터 가져 오기 메뉴에서 도구 파일 업로드를 사용하여 갤럭시 역사. </li><li> 지도하에 얼 라이너 (15)를 사용 TopHat2 닭 게놈에 각 샘플에 대해 읽NGS : RNA 분석 메뉴. 역사에서 게놈을 사용하기로 선택한다 (단계 4.7에서 업로드 FASTA 파일을 선택합니다). </li><li> RNA 분석 메뉴 : NGS에서 커프스 16 사용하여 각 샘플에 대한 예측 사체를 구축 할 수 있습니다. 가이드로 참조 주석을 사용한다 (단계 4.7에서 업로드 GTF 파일을 선택)하고 옵션을 켭니다 (역사, 단계 4.7에서 FASTA 파일에서) 바이어스 보정을 수행하고 다 읽어 올바른 사용하도록 선택합니다. </li><li> RNA 분석 메뉴 : NGS에서 Cuffmerge (16)를 사용하여 모든 샘플에 대한 예측 transcriptomes를 병합합니다. (역사, 단계 4.7에서 FASTA 파일) 및 시퀀스 데이터 (단계 4.7에서 GTF 파일) 참조 주석을 사용하여 선택합니다. </li><li> RNA 분석 메뉴 : NGS에서 Cuffdiff 16 사용하여 각 샘플에 대한 TopHat2에 의해 생성 된 BAM 파일을 비교. 필드 성적 증명서에서 나를 선택rged 사체는 Cuffmerge에 의해 생성 옵션 (역사, 단계 4.7에서 FASTA 파일에서) 바이어스 보정을 수행 켜고 다 읽어 올바른 사용합니다. </li><li> 정렬 차동 표현은 필터에서 도구 정렬을 사용하여 숫자 열 (13) (Q 값)의 상승 테이블을 테스트하고 메뉴를 정렬합니다. 참고 : 유전자 / 가장 낮은 Q 값을 제시한다 실험 조건 사이에 상당한 차이 식을 보여주는 성적 증명서. </li><li> 범위 그래프를 시각적으로 결과를 확인하려면 먼저 도구가 BEDTools 메뉴에서 게놈 범위 (17)의 BedGraph를 작성하여 bedGraph 형식으로 BAM 파일을 변환합니다. 보험이없는 지역의보고를 사용하지 않도록 설정, 별개의 간격으로 접합 항목을 처리하고 모든 데이터 세트가 비교되는 염기 서열 깊이를 정규화 계수로 적용 범위를 확장하기 위해 선택합니다. </li><li> 을 사용하여 중요 인물 형식 얻어진 bedGraph 파일 변환도구 가발 / BedGraph - 투 - 중요 인물 ( <a href="http://www.genome.ucsc.edu/">http://www.genome.ucsc.edu/</a> ) 변환 형식 메뉴에서. UCSC 게놈 브라우저 (사용자 지정 트랙으로 중요 인물 파일을 업로드 <a href="http://www.genome.ucsc.edu/">http://www.genome.ucsc.edu/</a> galGal4 어셈블리)와 데이터 세트의 범위를 시각적으로 관심의 유전자를 검색 할 수 있습니다. </li></ol>

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여기에서 우리는 닭 척수의 전기 후 효과 분석을위한 지침을 제공합니다. DNA 벡터의 전기가 더 자주 관심의 유전자를 과발현하는 데 사용되지만, 하나는 또한 유전자 기능 녹다운 조건 19-21를 생성하는 siRNA를 위해 우성 네거티브 quimeric 또는 전구체 단백질을 코딩하는 구조를 이용할 수있다. 실제로, 이득 - 및 기능 상실 분석 모두에 기인 사체 프로파일의 비교는 차별적 따라서 전위가 더 구체적인 효과를 발견하는 데, 각 조건에 반대 방식으로 유전자 발현을 지적 할 수있다. 임의의 방법은 RNA 추출 하류인가 같이, RNA-SEQ 라이브러리의 합성 출발 물질의 최소 초기 량을 필요로한다. 이 프로토콜로, 8 배아는 약 10 μg의 총 RNA의 항복하기에 충분해야한다. 적절한 작업 농도를 손상시키지 않고 개인의 낮은 숫자로 시작하는 것은 아마도작은 부피의 최종 희석 있도록 RNA 추출 시스템의 사용으로 가능. <p class="jove_c...

OVO 전기에 DNA 1-5을 구성하여 부분적으로 생체 내에서 배아 구조에 감염 될 수있는 빠르고 저렴한 방법을 나타 내기 때문에 살아있는 유기체에 유전 연구는 자주 모델로 닭 배아를 사용합니다. 이러한 pCIG 6 pMES 7과 같은 목적 유전자와 함께 형광 리포터를 함유 한 증명서를 인코딩 시스 트론 발현 벡터, 하류 분석 배아를 처리하기 전에 실체 현미경을 이용하여 원하는 영역에 형질 전환 품질의 빠른 확인을 허용한다. DNA 시퀀싱 최근 발전으로, 그것은 RNA-SEQ 8,9을 사용하여 RNA 샘플들로부터 디지털 전 사체 발현 프로파일을 획득하는 것이 가능하다. 따라서, 대신 그러한 계내 혼성화, 면역 조직 화학 및 qPCR에,의 cDNA 라이브러리의 제조에서와 같이 병렬로 몇 유전자 산물의 분석을 가능하게 시간이 걸리는 방법높은 처리량 시퀀싱 전 사체의 정보를 제공 할 수있다. 모든 단일 유전자의 발현 수준에 대한 효과 실험 관찰 차례로 사용 구조체에 의해 변경 경로에 강력한 통찰력을 제공 할 수있다. 이 사용 유기체의 게놈 어셈블리를 사용할 수있는 경우 특히 쉽고, 따라서 병아리 배아는 다시 적당한 모델이다. 사용자가 신뢰할 수있는 게놈 시퀀싱 센터에 액세스하는 경우, 주요 문제는 고품질의 RNA 샘플을 획득한다. 본 연구는 생성 된 데이터 세트의 실리코 분석을 위해 RNA-SEQ 적합한 형질 신경 튜브뿐만 아니라 하류 단계로부터 RNA 샘플을 얻는 방법을 설명한다. 48 시간 배양 한 다음 HH12-13에 전기 한 후, 형질 전환 된 트렁크 척수 절반은, 리보 뉴 클레아가없는 상태에서 해부 즉시 용해 및 추가 RNA 정화 및 라이브러리는 준비 될 때까지 매우 낮은 동결에 의해 분해로부터 보호했다이온. 갤럭시 공공 서버 (10)는 높은 처리량 시퀀싱 데이터 분석을위한 무료 자원에 대한 액세스를 제공합니다. 등록 된 사용자를 위해 제공되는 공간의 크기는 국부적 계산 된 기반 구조에 대한 필요성을 제거, 소형 실험에 충분하다. RNA-SEQ 데이터 분석 필터링, 정렬 및 유전자 발현의 정량 / 비교를 포함한다. RNA-SEQ 데이터 분석에 대한 일반적인 가이드 라인이 있지만, 필터링 파라미터 시퀀싱의 품질에 크게 의존 할 것으로 예상되며, 원 데이터의 품질 관리 분석을 통해 결정되어야한다. 이 프로토콜은 획득 및 생체 내에서 형질 전환 닭의 배아 척수에서 RNA-SEQ 프로파일을 비교하는 단계에 대해 설명합니다. 대표적인 결과, 빈 벡터로 형질 개의 독립 제어 샘플들로부터 얻어진 데이터 세트의 비교 방법은 재현성 및 차등 EXPRES의 식별을 허용한다는 것을 보여 주었다실험 샘플에 나오지도 성적 증명서. 따라서, 이러한 방법의 응용이 크게 하나의 실험 후에 발견의 수를 증가하고, 따라서 후속 조사를 위해 큰 데이터 세트를 제공하는 잠재력을 가지고있다.

<table><tbody><tr><td>인도 잉크</td><td>모든 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18G x 1 1/2 바늘</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>3 ml 주사기</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>트리스</td><td>MP Biomedicals</td><td>819620</td><td></td></tr><tr><td>F D & C Blue 1</td><td>Spectra Colors Corporation</td><td>5.FC.0010P0</td><td>DNA 주입을 시각화하는 데 사용되는 식품 염료</td></tr><tr><td>Ringer's solution (1 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 7.2g NaCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>S-9888</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0.37g KCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0.225g CaCl2&#8226; 2H2O</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0.217 g Na2HPO4.7H2O</td><td>시그마-알드리치</td><td>S-9390</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0.02g KH<서브>2</서브>PO<서브>4</서브></td><td>시그마-알드리치</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - ddH2O를 800ml로 조정하고 pH를 7.4</td><td></td><td></td><td></td>%로 조정합니다</tr><tr><td>. &nbsp; &nbsp; &nbsp; - ddH2O에서 1 L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 필터 및 오토클레이브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS(인산염 완충 용액)(1L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - NaCl 시</td><td>그마-알드리치</td><td>S-9888</td><td></td> 8g</tr><tr><td>; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0.2g KCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 1.15g Na2HPO4&#8226; 7H2O</td><td>시그마-알드리치</td><td>S-9390</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0.2g KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - ddH2O를 800ml로 조정하고 pH를 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp로 조정합니다. &nbsp; &nbsp; &nbsp; - ddH2O에서 1L 및 필터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 1ml DEPC(디에틸피로카보네이트)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D-5758</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 세게 흔들고 실온</td><td></td><td></td><td></td>에서 밤새 그대로 두십시오</tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 오토클레이브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>체 스푼</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 60 x 15mm 폴리스티렌 페트리 접시</td><td>Corning Life Sciences</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase 오염 제거 솔루션</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>파인 포인트 수술용 가위</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스트레이트 파인 포인트 핀셋</td><td>Any 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: 1.1 x 75 mm 유리 모세관 튜브로 만든 유리 바늘</td><td>Kimble Chase</td><td>40A502</td><td></td></tr><tr><td>9 ''유리 파스퇴르 피펫</td><td>모든 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수동 피펫 펌프</td><td>모든 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>투명 1.5ml 마이크로 원심 분리기 폴리 프로필렌 튜브</td><td>Corning Life Sciences</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심 분리기</td> RNA 안정화를 위한 <td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAlater 솔루션</td><td>Life Technologies</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>RNA수성 총 RNA 분리 키트</td><td>Life Technologies</td><td>AM1912</td><td></td></tr><tr><td>분자 생물학 등급 에탄올</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 나노 키트</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>2100 전기영동 바이오분석기 기기</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Truseq RNA 시료 전처리 키트 v2</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001/RS-122-2002</td><td></td></tr></tbody></table>

electroporation하여 병아리 배아 척수에서 차동 유전자 발현의 rna-seq 분석

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

병아리 신경관의 난자 전기천공법은 신경 발달 중 유전자 기능을 식별하는 빠르고 저렴한 방법입니다. 이러한 실험적 조작 후 차등적으로 발현된 전사체의 게놈 전체 분석은 형질주입된 구조체로 인한 다운스트림 효과에 대한 거의 완전한 그림을 밝힐 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이 연구는 전기천공법과 차등적으로 발현된 전사체 식별 사이의 모든 단계를 포함하는 형질주입된 배아 척수 샘플의 전사체를 비교하는 간단한 방법을 설명합니다. 첫 번째 단계는 전기천공법(electroporation)에 대한 지침과 리보뉴클레아제가 없는 환경에서 HH23 배아에서 형질주입된 척수 반쪽을 해부하기 위한 지침과 전사체 염기서열분석에 적합한 고품질 RNA 샘플 추출에 대한 지침으로 구성됩니다. 다음 단계는 Galaxy 공용 서버에서 RNA-Seq 데이터 세트를 필터링하고 비교하기 위한 일반적인 지침이 있는 생물정보학 분석으로, 중소 규모 실험을 위한 로컬 계산 구조의 필요성을 제거합니다. 대표적인 결과는 해부 방법이 고품질 RNA 샘플을 생성하고 두 대조 샘플에서 얻은 전사체가 본질적으로 동일하다는 것을 보여주며, 이는 실험 샘플에서 차등 발현 유전자를 검출하기 위한 중요한 요구 사항입니다. 또한, 대조군 샘플과 비교한 후 DNA 구조체의 실험적 과발현을 시각적으로 확인할 수 있는 한 가지 예가 제공됩니다. 이 방법의 적용은 척수 조기 발달에 관여하는 신경 요인의 기능에 대한 새로운 발견을 촉진하는 강력한 도구가 될 수 있습니다.

설명 된 방법을 검증하기 위해, 두 개의 제어 샘플은 빈 벡터 pMES 7 삽입 닭 SCRT2 (18)의 아연 손가락 도메인을 인코딩 SCRT2-ZNF를, 구성이 포함 된 동일한 벡터로 형질 전환 된 배아에서 하나의 샘플에 electroporation하여 배아에서 발생했다. 각 11-22 μg의 총 RNA를 산출 샘플은 8 ~ 12 배아의 풀에서 얻었다. 모든 3 개의 시료 고품질 RNA이 프로토콜로 얻을 수있는 것을 보여주는 Bioanalyzer 기기 (도 1)로 수행 품질 검사로 (10)의 최적 RIN 값을 얻었. 서열 분석 후, 기재 필터링 프로세스가 판독의 83~91% 배향 률을 증가 (데이터 미도시). 예상 한 바와 같이, 전 세계적으로 산포도에 비해 두 제어 샘플에서 transcriptomes의 비교 (그림 2) 명확한 차이를 보이지 않았다 및 피어슨 상관 계수는 0...

이 비디오는 in ovo electroporation으로 transfection 후 절개된 병아리 배아 척수 샘플에 대해 전체 전사체 분석을 수행하기 위한 기본 단계를 보여줍니다.

electroporation하여 병아리 배아 척수에서 차동 유전자 발현의 RNA-SEQ 분석

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

이 절차의 전반적인 목표는 전기천공된 병아리 배아 척수에서 모든 유전자 및 샘플의 발현 수준을 평가하는 것입니다. 이것은 먼저 난자(ovo)에서 초기 배아 신경관의 오른쪽을 뚫고 배아를 원하는 단계로 다시 배양함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 RNA가 없는 환경에서 성공적으로 transfection된 신경관 반쪽을 절개하고 가능한 한 빨리 용해를 진행하는 것입니다.세 번째 단계는 RNA를 분리하고 샘플을 라이브러리 준비 및 고처리량 염기서열분석에 적용하는 것입니다. 마지막 단계는 데이터 세트를 처리하여 시퀀싱 아티팩트를 제거하는 것입니다. 품종을 게놈에 매핑하고 각 유전자에 발현 수준을 할당합니다.궁극적으로, 결과는 대조군 및 실험 조건에서의 발현 수준 비교를 통해 다르게 발현된 유전자를 보여줄 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 신경관 절제술로 매우 중요합니다. 단계는 배아 조작에 익숙해야 하기 때문에 배우기 어렵습니다.이 시연을 위해 배아는 신경관에서 GFP 발현 구조체로 형질전환되었습니다. 배아당 1-2마이크로그램의 총 RNA를 수집하기 위해 최대 10개의 배아를 연구하는 데 2시간을 할애할 준비를 합니다. RNA가 없는 상태에서 미세한 해부 가위와 SVE 수집 스푼을 사용하여 배아를 채취하고 각 배아를 차갑게 옮깁니다.DEPC 처리. PBS는 모든 신경관 분리 단계에 대해 솔루션을 사용했으며, 사지 싹 사이에 있는 배아의 전체 옆구리를 제거하기 위해 미세한 핀셋을 사용하여 진행했습니다. 이 부분을 조직 등쪽이 위로 향하게 하여 신선한 차가운 용액으로 옮깁니다.두 개의 가는 유리 바늘을 사용하여 신경관과 두정 중배엽 사이의 배아의 각 등쪽 측면에 있는 세 개의 점을 천공합니다. 이제 두 개의 유리 바늘을 중앙 천공에 삽입하고 AP 축을 따라 멀리 이동합니다. 필요에 따라 각 천공을 통해 이 작업을 수행하여 궁극적으로 주배엽을 분리하고 이 조직을 제거 및 폐기합니다.다음으로, 배아를 옆으로 돌리고 신경관과 결절 사이에 두 개의 핀셋 끝을 삽입합니다. AP 축을 따라 밀어 분리하여 구조를 분할합니다. 신경관에서 더 큰 조직 조각을 핀셋으로 부드럽게 고정하면서 여분의 중배엽을 족집게로 제거하여 마무리합니다.그런 다음 신경관을 신선한 차가운 용액으로 부드럽게 옮깁니다. 수동 펌프가 있는 유리 피펫을 사용하여 필요한 모든 신경관을 수집하고 진행하기 전에 얼음 위에 보관하십시오. 이제 각 신경관을 두 개의 반으로 나눕니다.날카로운 끝 핀셋을 루멘에 삽입하고 지붕 플레이트를 뜯습니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 바닥판을 자르고 조직을 반으로 나눕니다. 형광 해부 현미경을 사용하여 전기화된 것과 그렇지 않은 반쪽을 분류합니다.분류된 신경관 반쪽을 새 용액이 있는 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 이 튜브를 튕겨 모든 조직을 바닥으로 내려갑니다. 그런 다음 100GS에서 몇 초 동안 튜브를 회전시킵니다.그런 다음 밝은 조명 아래에서 매우 조심스럽게 스내트를 흡인합니다. 조직이 당겨지면 천천히 배출하고 회전을 반복합니다. 신경관 반쪽에서 용액이 제거되면 신경관당 70마이크로리터, 용해 완충액의 절반을 튜브에 추가합니다.튜브를 튕겨 실온에서 5분마다 15분 동안 배양한 다음 튜브를 격렬하게 소용돌이치고 RNA를 정제하기 위해 RNA를 수집하는 작업을 진행합니다.염기서열분석을 위해 샘플당 최소 8개의 신경관 반쪽을 갖습니다. 섭씨 영하 80도에서 보관된 다른 라이스 신경관 컬렉션은 컬렉션에 통합될 수 있습니다. 먼저 얼음에서 15분에서 30분 동안 해동한 다음 실온에서 해동을 완료합니다.해동되면 모든 샘플을 격렬하게 소용돌이치고 5분 동안 그대로 두십시오. 다음 와동 표본은 다시 15, 1 분 동안 000 GS에 그(것)들을 분리기로 만드십시오. 불용성 물질을 제거하려면 상층액을 새 튜브로 옮기고 추출을 진행하십시오.RNA 분리 키트를 사용하여 가능한 최대 농도에서 RNA를 회피하여 프로세스를 완료합니다. 이 프로토콜은 필요한 공간 할당량을 보장하기 위해 Galaxy 웹 사이트 계정이 필요합니다. 먼저, 품질 점수가 Shred plus 33에 이미 인코딩되어 있지 않은 경우 FTP는 FASTQ 파일을 사이트에 업로드합니다.먼저 NGS QC 및 조작 메뉴에서 FASTQ 그루머 도구를 사용하여 업로드된 데이터 세트를 준비합니다. 그렇지 않으면 속성에서 파일 형식을 FASTQ 발신자로 변경합니다. 그런 다음 NGS QC 및 조작 메뉴에서 FAST QC 도구를 사용하여 데이터 세트의 일반적인 품질을 분석합니다.동일한 메뉴에서 FASTQ 품질 트리머를 선택하여 품질이 낮은 세 개의 프라임 끝을 버립니다. 품질 점수가 20 이상인 경우 처리해야 합니다. 이제 같은 메뉴에서 클립 도구로 이동합니다.이 도구를 설정하여 염기쌍이 45개 미만인 읽기를 삭제합니다. 어댑터 시퀀스를 입력합니다. 베이스를 알 수 없는 읽기를 버리는 옵션을 비활성화하고 잘린 시퀀스와 클리핑되지 않은 시퀀스를 포함할 출력을 선택합니다.트리밍 시퀀스 도구를 계속 진행합니다. 이를 사용하여 읽기의 첫 번째 염기를 잘라 FAST qc에 의해 감지된 5개의 소수 시퀀스 바이어스를 제거할 수 있습니다. 다음 단계는 Illumina I 게놈 사이트에서 최신 닭 게놈 어셈블리를 다운로드하고 압축을 푸는 것입니다.그런 다음 전체 게놈 더 빠른 형식 파일과 유전자의 주석 GTF 형식 파일을 Galaxy History에 업로드하십시오. 이제 N-G-S-R-N-A 분석 메뉴에 액세스하고 top hat two 도구를 선택하여 각 샘플에 대한 판독을 게놈에 매핑합니다. Galaxy History에서 업로드된 fasta 파일을 참조 게놈으로 선택합니다.다음으로, 동일한 메뉴에서 커프 링크 도구를 선택하여 예측된 전사체를 구축합니다. 각 샘플에 대해 참조 주석 가이드로 사용할 GTF 파일을 선택합니다. 시퀀스 데이터에 대해 Perform bias correction using the FASTA file(FASTA 파일을 사용하여 바이어스 보정 수행)을 선택하고 use multi read correction(다중 읽기 보정 사용) 옵션을 활성화합니다.그런 다음 커프 병합 도구를 사용하여 모든 조립 전사체를 병합합니다. 이 도구를 사용하여 참조 주석에 대한 GTF 파일과 시퀀스 데이터에 대한 FASTA 파일을 선택합니다. 이제 RNA 분석 메뉴 아래에 있는 커프 TIFF 도구를 사용하여 각 샘플에 대해 top hat two에서 생성된 BAM 파일을 비교합니다.transcripts 필드에서 cuff merge에 의해 생성된 merge transcriptome을 선택하고 옵션을 활성화합니다. 다중 읽기 보정을 사용하고 시퀀스 데이터에 대한 FASTA 파일을 사용하여 바이어스 보정을 수행합니다. 다음 단계는 차등 테이블을 정렬하는 것입니다.Q 값 열을 사용하여 필터 및 정렬 메뉴에서 정렬 도구를 선택합니다.실험 조건 간에 유의한 차이가 있는 염기서열은 13열에서 가장 낮은 Q 값을 갖습니다. 이제 커버리지 그래프를 살펴보십시오. 먼저 옵션 아래의 침대 도구 메뉴 아래에 있는 변환 도구를 사용하여 BAM 파일을 침대 그래프 파일로 변환하고, 적용 범위가 없는 지역에 대한 보고를 비활성화하고, 접합된 항목을 고유한 간격으로 처리하도록 선택합니다.또한 실험의 모든 범위를 정규화하는 요인으로 범위를 확장합니다. 그런 다음 형식 변환 메뉴의 도구를 사용하여 결과 베드 그래프 파일을 큰 가발 형식으로 변환하고 큰 가발 파일을 사용자 정의 트랙으로 UCSE 서버에 업로드합니다. USCS 게놈 브라우저 페이지에서 빈 PS 벡터를 발현하는 신경관을 RNA에 대해 수확한 설명된 방법을 사용하여 데이터 세트의 시각적 범위를 위해 GAL 4 어셈블리 및 유전자 검색을 사용합니다.이것은 중복으로 수행되었으며 결과 RNA는 예상대로 최적의 RIN 값이 10인 매우 높은 품질이었습니다. 중복된 빈 벡터 대조군의 전사체에 대한 전체 비교에서는 명확한 차이가 없었으며 Pearson 상관 계수는 포인트 99였습니다. 또한, scratch two zinc finger 도메인을 발현하는 실험 샘플에서 scratch two 유전자 염기서열에 매핑된 판독 횟수가 분명하게 증가했습니다.따라서 이 방법은 예측된 농축을 탐지할 수 있을 만큼 민감했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 배아 신경관을 분리할 수 있을 것이며 프로토콜의 섹션 4에 있는 실리콘 분석 단계에 따라 IC 데이터 세트를 처리하고 비교하여 다르게 발현된 유전자를 찾는 방법을 잘 이해할 수 있을 것입니다.

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신경과학

이 동영상은 이용 배아 여자 척수에서 뉴런의 유전자 정의된 그룹의 axonal 경로를 시각화하는 방법을...

활용 칙 신경 튜브에서 뉴런의 유전 정의된 그룹 Axonal 경로를 벗기기 비켜에서 Electroporation

우리는 마우스 배아 조직에서 조직 특정 유전자 발현의 시작하는 동안이나 이후에 조직 특정 유전자의 상호 작용 요소를 식별하는 방법은 염색질의 immunoprecipitation (칩)을 보여줍니다. 그것이 정상적인 배아 발달 동안 발생으로이 프로토콜은 조직 특정 유전자 활성화의 연구에 대해 광범위하게 적용되어야합니다.

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

기능과 midbrain dopaminergic 뉴런의 발달 동안 유전자의 규정을 평가하기 위해 관련된 방법을...

Dopaminergic 신경 세포 개발에서 유전자 기능을 유학 칙의 Midbrain에서 비켜 Electroporation에

신경 튜브의 유전자 발현은 세포 유형의 특정, 추적 방식으로 downregulated 할 수있는이 방법이 설명되어 있습니다. 우리는 방법을...

오픈 책 준비에 DiI 주입하여 개발 신경 튜브와 Phenotypes의 평가에 miRNA 기반 Plasmids의 비켜 Electroporation에

발달 신경 생물학의 근본적인 문제는 어떻게 신경 네트워크가 배아 뇌에 설립되어있다. 여기에서 우리는 크레 / 훈제 연어 - 플라스미드와 지느러미의 interneurons 레이블을 다양한 발달 단계에서 자신의 축삭 돌기 시냅스 목표를 추적하는 조류 후뇌의 PiggyBac 매개 DNA 전위 시스템과 같은 새로운 유전 도구와의 electroporation 기술을 결합했다.

병아리 배아에서 축삭 궤적과 시냅스 대상을 추적하는 후뇌의 일렉트로

우리는 두 개 또는 세 개의 차원 배양체를 발생시키기위한 뮤린 배아 줄기 세포를 사용하는 기술을 설명한다. 우리는 다음 전구 세포 마커 면역과 면역에 의해 분화의 상태를 분석하기 위해 레티노 산, 방법에 의한 배아 신체 세포의 신경 분화를 유도하는 방법을 설명합니다.

두와 입체 배아 체에서 마우스 배아 줄기 세포의 레티노 산에 의한 신경 분화 분석

조류와 포유류의 청각 뇌간 신경은 빠른 청력 엔코딩에 특화되어있어 정상적인 청력 기능을위한 기본적인 과정입니다. 이러한 뉴런은 배아 뒷다리의 뚜렷한 전구체에서 발생합니다. 우리는 청각 발달 과정에서 유전자 기능을 연구하기 위해 닭 배아의 뒷배부에 유전자를 발현시키기 위해 일렉트로 포 레이션을 이용하는 기술을 제시한다.

닭 오라클 Brainstem의 Ovo Electroporation에서

여기, 우리는 chromatin immunoprecipitation (칩) 및 칩 seq 라이브러리 준비 프로토콜 낮은 풍부한 닭 배아 샘플에서 글로벌 epigenomic 프로 파일 생성을 설명 합니다.

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

여기에 제시된 프로토콜은 CAS9-gRNA 복합체를 척수 중앙 운하에 주입하고 전기 포공에 의해 액소로틀 척수에서 시간 및 공간 제한 유전자 녹아웃을 수행하는 프로토콜입니다.

CAS9 단백질-gRNA 복합체의 전기 포출을 통해 악소로틀 척수 신경 줄기 세포의 직접 유전자 녹아웃

여기에서 우리는 척추동물 Xenopus laevis 배아에서 알려진 조직 운명을 가진 세포 계통의 질량 분석 기반 단백질체 특성 분석을 설명합니다.

발달 중인 (개구리) 배아의 세포 계통 유도 질량 분석법 단백질체학

학습하세요 병아리 배아 척수의 전사체 분석을 위한 in ovo 전기천공 및 RNA-seq 방법을. 이 기술은 발달 신경생물학 연구에서 유전자 발현 수준을 정량적으로 평가하는 데 활용됩니다.

electroporation하여 병아리 배아 척수에서 차동 유전자 발현의 RNA-SEQ 분석

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