Name: 의 전파 Homalodisca의 coagulata 바이러스-01를 통해 Homalodisca vitripennis 세포 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: 학습하세요 Homalodisca vitripennis 세포 배양을 이용한 HoCV-1 바이러스 증식 및 RNA 정량 분석 방법을. 이 기술은 바이러스-숙주 상호작용 연구에 효과적인 모델을 제공합니다.

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이 프로젝트에 대한 자금 지원에 대해 Texas Pierce's Disease Research and Education Program과 USDA-APHIS에 감사드립니다. 또한 컨포칼 현미경 검사에 도움을 주신 텍사스 대학교 타일러 보건 과학 센터의 Hema Kothari에게도 감사드립니다.

1 세포 배양 참고 : 미국 농무부 농업 연구 서비스 (. 포트 피어스, FL USA)에서 박사 웨인 헌터 연구소에 의해 설립 Homalodisca vitripennis 세포주 초기 섬유 아세포 및 단일 층을 포함하여 혼합 된 세포 단계로 구성된 실험실 주식을 시작하는 데 사용되었다. <ol><li> 이 25cm 배양 플라스크에 20-24 ℃의 온도 범위에서 유지 무균 실험실 환경에서 다음 절차를 수행한다. </li><li> 육성 및 H2G + 매미충 매체, 수정 WH2의 꿀벌 미디어 10 (표 1)를 사용하여 25cm 두 조직 배양 플라스크에 문화를 유지한다. </li><li> 53 %의 습도 ~로 24 ° C에서 배양 플라스크를 품어. </li><li> , 비정상적인 세포 성장을 확인, 예를 들면 문화의 성장을 모니터링 잠재적 인 오염 물질을 모니터링하고 막에 걸쳐 성장 진행 상황을 확인하기 위해 총 배율 100 배의 (TM)에 거꾸로 현미경을 사용하여진짜야면. </li><li> 문화 표면을 방해하지 않고 10 일 - 매 7 완전한 매체 변화 (~ 플라스크 당 4 ㎖의 배양 배지)를 수행합니다. </li><li> 문화 표면 세포를 해리 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 포함하는 0.25 % 트립신을 사용하여 세포 성장 (합류)에 포함 약 80 % 인 경우에 문화를 전달합니다. 각 배양 플라스크에 3 ㎖ 트립신 및 시간의 짧은 시간 동안 배양 효소 (들)를 노출 - ~ 2 추가 - 완전한 세포 분리를 달성하기 위해 (5-10 분). </li><li> 효소 활동을 중지하고 원심 분리를위한 원뿔 튜브에 전체 솔루션을 전송 - 문화 플라스크 (들) (3 ML ~ 2)에 새로운 배지의 동일한 금액을 추가합니다. </li><li> 350 × g으로 6 분 동안 4 ° C에서 원심 분리하여 펠렛 세포. </li><li> 세포 펠렛을 방해하지 않고 상층 액을 제거하고 각 튜브에 ~ 신선한 매체의 8 ML을 추가합니다. 부드럽게 피펫을 사용하여 세포를 균질화. </li><li> 1에서 분할 문화 : 2 비율 25 센티미터이 플라스크 (~ 셀 soluti의 4 ML플라스크 당에) 떠날 갓 통과 현탁 배양에서 세포가 플라스크의 표면에 확실하게 부착 할 수 있도록하기 위해 48 시간 동안 방해받지. NOTE : 1cm 2의 성장면과 48 웰 멸균 조직 배양 플레이트에서 세포 배양이 가능하다 그들이 ~ 250 μL에 배지의 부피의 감소와 함께 배양 플라스크와 동일하게 유지 될 수있다. </li></ol> 2 전체 바이러스 추출 <ol><li> 바이러스 양성 H.의 몸 전체를 균질화 ~ 10 초 간격에 대한 텍싱 0.02 % 나트륨 디 에틸 삼수화물 (DETCA)와 인산염 완충액에서 vitripennis, 산도 ~ 7.2, 아니 현재 조직의 더 큰 덩어리가 없을 때까지. 4 ° C에서 4 시간 또는 4 ° C에서 16 시간 동안 22,000 XG에 대한 124500 XG에서 슈퍼 스피드 원심 분리를 통해 바이러스의 압축을 풉니 다. 상단에 침전물을 형성하는 경우, 멸균 면봉 (11)를 제거합니다. </li><li> 상층 액을 버린다. </li><li> 펠렛을 수집하고0.4 % 나트륨 데 옥시 콜산-4 % 폴리에틸렌 글리콜 데실 에테르 (BRIJ 52)을 함유하는 5 ㎖의 10 mM의 인산 완충액 (전술 DETCA), pH가 7.2 ~ 녹인다. <ol><li> 잘 섞어 펠릿, 튜브 측으로부터 펠릿을 제거하고, 필요한 경우 용액까지 분쇄. </li><li> 펠릿이 필요한 경우 솔루션에 가서 2 튜브 (11)에 결합 할 수 있도록 ~ 5 ㎖의 단위로 10 개 mM의 인산 버퍼를 추가합니다. </li></ol></li><li> 15 분 11 300 XG에 용액을 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 제거하고 0.45 μm의 필터를 통해 솔루션을 전달하고 대규모 수집 관 (11)의 여과를 수집합니다. </li><li> 분자량 투석막에 전송 여액을 10 ㎜의 11 필요한 경우에는 DETCA을 함유하지 않는 인산염 완충액 (pH 7)를 소량 사용하여, 3.5 가와사끼 (MWCO)를 잘라. </li><li> 4 ° C에서 DDH 2 O로 가득 큰 비커에 투석막을 놓습니다. DDH 2 O마다 시간의 F 변경또는 5-6 시간, 멤브레인 (11)의 흰색 침전물이 형성 될 때까지. </li><li> 막 내에서 정제 된 바이러스를 모아 둘 DDH O. 90 μL로 용액 10 μl를 첨가하여 10 배 희석 계열로 100 % 바이러스 용액을 가하지 100000 : 그 후 1의 희석에 도달 할 때까지 DDH 2 O의 또 다른 90 μL로 희석의 10 μl를 추가합니다. </li><li> -80 ° C에서 보관 바이러스 솔루션입니다. </li></ol> 3 바이러스 성 복제 <ol><li> 세포 성장이 (세포가 평균 속도로 성장하는 경우 약 72 시간 후 - 패스) 80 %의 합류 때까지 48 웰 배양 플레이트에서 종자 세포는 모든 행을 성장. </li><li> 세포 성장이 포화 상태에 도달하면 희석시킨 바이러스와 세포의 각 행에 접종, 즉, 1:10 희석 한 행, 하나의 하나의 행 : 위쪽 행 (100)를 제외한 희석 등. 대조군으로 맨 위 행을 사용하여 볼륨 컨트롤로 각 웰에 DDH 2 O의 10 μl를 추가합니다. <ol><li> 종래 바이러스 배양 모든 웰의 초기 접종하여 각 행의 제 1 웰을, 실험 세포 수와 비교 시작 기준선 세포 농도를 확립 해리 및 카운트하기 위해. </li></ol></li><li> 배양 플레이트에게 pH 변화를 나타내는 매체의 모든 색상 변경 및 세포 형태의 변경에 대한 바이러스 접종 후 매 24 시간을 모니터링합니다. </li><li> 100X TM에서 도립 현미경을 이용하여 각 시점에서의 테스트 플레이트의 이미지 한 칼럼. </li><li> 각 24 시간 시점에서 이미지화 된 열에서 모든 매체를 제거하고 -80 ° C에서 RNA 추출 및 바이러스 정량 또는 장기적으로 -20 ° C에 그것을 단기를 저장합니다. </li><li> 셀 PELLE 다시 중단 효소 활성 및 신선한 배지 ~ 250 μl를 중지 0.25 % 트립신 EDTA 및 신선한 배지 만 ~ 250 μl를 사용하여 1.9, - 이전의 단계 1.6에 기재된 바와 같이 매체를 제거한 후 웰로부터 세포를 해리t. </li><li> 일주 이상 각 24 시간 동안 세포 분리 한 후 세포 수를 수행 할 수있는 세포를 포함하는 각각의 튜브에 0.4 %의 트리 판 블루 염색의 10 μl를 추가합니다. 얼룩이 세포 수를 수행하기 전에 10 분 동안 앉아 할 수 있습니다. <ol><li> 얼룩뿐만 아니라 비 가능한 세포 통풍 관을 시작합니다 스테인 노출 또는 가능한 세포의 1 시간 이내에 세포 수를 수행합니다. </li></ol></li><li> 천천히 마이크로 피펫을 사용하여 표준 혈구의 각 측면에 염색 세포 용액 10 μL를 추가한다. 허용 용액을 공기 방울을 방지하기 위해 모세관 현상에 의해 흡수된다. </li><li> 혈구 양쪽 가능한 (착색되지​​ 않은) 셀의 개수 (혈구에서 16 제곱의 4 카운트에 해당)를 카운트. 제거 된 컬럼의 각 웰에 세포 수를 수행합니다. </li><li> 각 열에서 세포 수를 평균 전체 셀 카운트 수 구하는 다음의 공식을 사용 X 희석 인자 (세포 / 4의 평균 수) = X (10)의 셀 수가 <sup는&gt; 4 ML. 이 배양 세포 밀도 또는 생존 세포의 수이다. </li></ol> 세포 배양에서 4 바이러스 추출 <ol><li> 처리 H. 제거 효소 활동을 중지하기 위해 0.25 % 트립신 EDTA와 신선한 매체 만 ~ 250 μl를 사용하여 1.8 - 배양 플라스크에서 vitripennis 세포는 이전 단계 1.6에 설명 된대로. </li><li> 상층 액을 버린다. </li><li> 2.8 - 이전 단계 2.3에 설명 된 프로토콜 다음 배양 세포에서 바이러스의 압축을 풉니 다. </li></ol> 5 RNA 추출 <ol><li> 제조 업체의 프로토콜 당 액체 샘플을 위해 설계된 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 - 클로로포름 추출을 사용하여 각 한 주 바이러스 시험에서 수집 된 매체 샘플에서 RNA를 추출합니다. </li><li> 스토어는 -80 ° C에서 샘플을 추출 하였다. </li></ol> 6 RT-PCR <ol><li> 사용하여 기존의 PCR을 실행하여 RT-PCR을위한 바이러스 성 기준을 설정프라이머 쌍 HoCV RT-PCR 프라이머 1 (정방향 5&#39;-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 &#39;- ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3 5&#39;리버스 &#39;) 바이러스가 몸 전체 H.에서 분리 vitripennis. </li><li> 제목 PCR 생성물을 0.1 % 에티 디움 브로마이드를 함유하는 2 % 아가 로즈 젤에서 120 V에서 60 분간 전기 영동 겔. </li><li> 겔에서 밴드를 절제하고 제조자의 프로토콜에 따라 겔 추출 키트를 사용하여 정제. </li><li> 수영장은 모두 절제 젤 정제 제품 또한 기본 에탄올 침전에 의해 정화. 전체 시료 농도를 증가 트리스 EDTA (TE)의 약 30 μL로 침전 생성물을 용출. </li><li> 핵산 검출 용 230분의 260 파장 설정을 사용하여 분광 광도법을 통해 풀링 된 cDNA 샘플에서의 수준을 정량화. </li><li> 57 NG에 이르기까지 정제 된 시료의 10 배 용액을 희석 시리즈를 수행 / 57 AG / μL (10 -18)에 μL. 유사한 직렬 희석 제가 설명 수행N 농도 조건에서의 차이에 대한 조정이 이루어 2.8. </li><li> 미량의 성적 증명서의 신뢰성 정량화와 Q​​RT-PCR 키트를 사용하여 QRT-PCR을 수행하여 희석 시리즈의 검출 한계를 결정합니다. 참고 : 5 × 10 -3 사본보다 바이러스 농도가 낮은는 검출되지 않습니다. </li><li> 단계 5.1에서 전술 한 바와 같이 실험 샘플에서 RNA를 추출하고 분광 광도계를 사용하여 정량화. </li><li> 클리 무료 물을 사용 μL / 5 NG 모든 추출 된 샘플을 정상화. </li><li> 다음과 같이 25 ㎕의 반응이 낮은 사본 번호를 감지 할 수있는 능력을 한 단계 QRT-PCR 키트를 사용하는 것으로, 중복에, 모든 샘플에 QRT-PCR을 수행 : 50 ° C 10 분 동안 유지; 5 분 동안 95 ° C에서 개최; 10 초, 30 초 동안 60 ° C, 95 ° C의 30주기; 각 단계에서 5 초 동안 99 °의 C - 50에서 녹아. <ol><li> 각각의 반응 혼합물은 1X maste 12.5 μl를 포함하도록 마스터 믹스 만들기R 믹스, 앞으로 프라이머의 1.0 μL (0.3 μM), 역방향 프라이머의 1.0 μL (0.3 μM), 역전사 효소 및 표준화 값을 기반으로 템플릿의 변수 금액의 0.25 μL. </li><li> 의 RNase 무료 물 25 μL에 총 반응 볼륨을 가져와. </li><li> 각 PCR에 다섯 표준 농도는 다음 복사본 번호와 함께 실행 같습니다 × 10 -10 5, 5 × 10-8, 5 × 5 × 10 -4 -6 10, 5 × 10 -2 사본. 각 실행의 시작 부분에 초기 취득시 소음을 줄이기 위해 단지 10 배 -2.5의 형광 아래에 각 실행에 대한 임계 값을 설정합니다. </li></ol></li></ol> 7 공 초점 현미경 <ol><li> 물론 각 직경 18mm를 측정 열두 웰 플레이트 포함 유리 커버 슬립에 Homalodisca vitripennis 세포를 성장. </li><li> 단층이 달성되면, 사일 동안 플레이트에 24 시간마다 하나의 칼럼을 접종한다. 각 C 있는지 확인olumn 잘 컨트롤이 포함 낮은 바이러스 희석 (1시 10분)도 높은 바이러스 성 희석 (1 : 100,000) 잘. 단계 2.8에서 얻은 바이러스 솔루션을 사용합니다. </li><li> 다섯째 날에 모든 미디어를 제거하고 두 번 1X PBS (산도 7.4)로 세포를 씻어. </li><li> 30 분 동안 4 ° C에서 차가운 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정합니다. </li><li> 1X 인산염의 500 μL은 세포에 생리 식염수 (PBS)를 버퍼에 추가하고 저속에서 로커에 RT에서 10 분 동안 씻어. 세포를 세 번 씻으십시오. </li><li> 그들을 Permeabilize 하시려면하는 세포에 0.1 % 트리톤 X-100의 500 μl를 추가합니다. 실온에서 10 분 동안 앉아 보자. </li><li> 세포를 씻고 다시 같은 이전 단계 7.5에 설명. </li><li> RT에서 세포를 차단하기 위해 5 % 소 혈청 알부민 (BSA) 용액 500 μl를 추가. 2 시간 동안 앉아서 다음 제거하자. </li><li> 1X PBS가 5 % BSA를 포함하는 250와 F-액틴에 대한 얼룩에 각 웰에 희석 250 μl를 추가 : 재고 로다 민 레드 - 복합 phalloidin (RCP) 하나를 희석. </li><li> 알루미늄 f를 커버 플레이트오일은 표백에서 염료를 방지하고 4 ° CO / N에서 세포를 배양한다. </li><li> 배양 12 시간 후 RCP를 제거하고 세포의 핵을 염색하기 위해, 5 % BSA를 함유하는 1X PBS에 희석하여 6-diamidino-2-페닐 인돌 (4)의 250 μL &#39;(DAPI) (250 μg / ㎖)로 대체 . </li><li> 1 시간 동안 RT에서 DAPI를 포함하는 세포를 배양한다. </li><li> 이전 단계 7.5에 설명 된대로 1X PBS로 세포를 세 번 씻으십시오. </li><li> 조심스럽게 우물 된 커버를 제거하고 방지 페이드 시약 장착 미디어를 사용하여 슬라이드를 현미경 마운트합니다. </li><li> 공 초점 현미경으로 볼 때까지 슬라이드 박스 차광에서 건조하도록 허용합니다. 염료가 빠르게 사라질 수로보기는 가능한 한 빨리 슬라이드를 준비했다. </li><li> 63X (오일) 계획 - apochromate 렌즈를 포함하는 현미경 장착 공 초점 영상 시스템을 이용하여 염색 된 세포. <ol><li> 543 ± 10 nm의 여기 및 Rhoadmine 레드 conjucated phalloidin 대 575 ± 10 nm의 방출에 레이저 파장을 설정DAPI 대, 및 369 ± 10 nm의 여기 및 450 ± 30 nm의 방출. </li><li> 모든 이미지를 얻기 위해 감지기 동일한 이득과 오프 설정 설정을 사용합니다. </li><li> 화상 처리에 적합한 소프트웨어를 사용하여 이미지를 관리하는 소프트웨어에 정렬 및 수입 원하는 이미지와 이미지 프로세스. </li></ol></li></ol>

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</ol>

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침략 농업 종의 유입에 대한 상승 우려는 새로운 해충과 병원균에 대한 방어 할 수있는 새로운 방법론에 대한 수요 증가로 이어질했다. 질병 예방과 관리의 초점은 병원체 벡터의 관리를 포함하고이 연구의 주된 목표였다. 경제적 실용화가 큰 영역 위에 있지만 저비용 12에서 대량으로 필요하기 때문에 농업용 병원체 경로를 관리하는 생물 농약이 유형을 생성하는 결정에 중요한 역할을한다. 연구 및 개발을위한 세포 배양을 이용하는 방법은 점점 일반화되고있다 이와 같이, 본 연구의 영향은 중요합니다. 경제적으로 통합 해충 관리 (IPM) 전략을 확인하는 것은 전 세계적으로 계속 성공적인 농업 생산의 핵심이며, 본 연구의 결과는 IPM 전략을 개선하고 소문의 PD의 발생을 감소시키는 발전에 기여한다. H. vitripennis 세포 배양은 전파와 눈에 보이는 형태 저하없이 년 이상 유지되었다. 통로 번호 대폭 세포 대사 및 성장...

유리 날개의 명사수 (Homalodisca vitripennis Germar 1821)는 북미 1, Xylella fastidiosa (X를 fastidiosa)의 지배적 인 벡터로 포도 ​​나무 (PD)의 피어스 병의 인과 에이전트를 확인되었습니다. 곤충 인구 관리는 빨리 캘리포니아와 미국 남부에서 포도 재배 산업이 파괴 문제를 해결하기위한 연구의 초점이되었다. 가족에 속하는 양의 감지, 단일 가닥 RNA 바이러스는 Dicistroviridae, Homalodisca는 coagulata 바이러스-01 (HoCV-01) 야생 H.에서 발견되었습니다 vitripennis 인구와 살충제로 곤충의 저항을 낮추고, 그 인구 2-4에서 사망률이 증가하는 것으로. 방법의 개발을 효과적으로 후방 H. 감염합니다 실험실 환경에서 성년 vitripennis 때문에 어려웠을 <em&gt; H. vitripennis는 기주 식물 5-8의 다양한 요구 다른 단계 별 영양 필요가있다. 특정 시설 후면 라이브 H.에 필요한 미국에서 vitripennis; 따라서, 세포 배양 물은 더 경제적이고 실용적인 대안뿐만 아니라 HoCV-01 검출 및 복제 2,9 점점 중요하다. H.의 세포 배양을위한 기본적인 방법 확립하면서 vitripennis는 바이러스 2로, 이러한 방법은 아직 생물학적 조절제의 상업 생산에 이용되지 않은, 설명되어 있습니다. 다음 절차의 전체적인 목적은 생물학적 방제 제로서 이용하​​기에 적합한 HoCV-0129의 높은 농도를 생성하는 것이다. 바이러스 성 복제는 왜 성공적으로 H. 육성 및 최적화 된 살아있는 세포를 필요로 vitripennis 문화는 바이러스의 수익성 수준을 생산의 발전에 매우 중요합니다.

<table><tbody><tr><td>코닝 세포 배양 플라스크</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430168</td><td>표면적 25 cm2, 경사 넥, 캡(플러그 씰)</td></tr><tr><td>Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td>도립 현미경 및 카메라</td></tr><tr><td>트립신-EDTA 솔루션</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049</td><td>0.25 %, 멸균 여과, BioReagent, 세포 배양에 적합, 2.5g 돼지 트립신 및 0.2g EDTA &bull; Hanks&prime 리터당 4Na; 페놀이 빨간색이 함유된 균형 잡힌 소금 용액</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 멀티웰 배양 플레이트</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8937</td><td>48웰(뚜껑으로 처리한 TC)</td></tr><tr><td>DETCA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>228680</td><td>나트륨 디에틸디티오카르바메이트 삼수화물</td></tr><tr><td>Corning 보틀탑 진공 필터 시스템</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431206</td><td>셀룰로오스 아세테이트 멤브레인, 기공 크기 0.45 &mu; m, 멤브레인 면적 54.5 cm2, 필터 용량 500 ml</td></tr><tr><td>Brij 52</td><td>Sigma Aldrich</td><td>388831</td><td>폴리에틸렌 글리콜 헥사데실 에테르</td></tr><tr><td>인산염 완충 용액</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5244</td><td>멸균수로 10mM로 희석된 100 mM으로 수용</td></tr><tr><td>TRIzol LS</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5304</td><td>For 전기영동</td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7637</td><td>BioReagent, 분자생물학용,</td></tr><tr><td>분말 QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect qRT-PCR 키트</td><td>Qiagen</td><td>204243</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>시약 등급, 결정질</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td>인산염 완충 식염수</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>로다민 적색 결합 팔로이딘</td><td>Life Technologies</td><td>R415</td><td>로다민 팔로이딘은 적색-주황색 형광 염료인 테트라메틸로다민</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td>에 접합된 친화성이 높은 F-액틴 프로브입니다.</tr><tr><td>ProLong Gold Antifade 시약</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>LSM510 메타 컨포칼 시스템</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM Zen 2007 소프트웨어</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grace' s 곤충 배지(보충, 1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8142</td><td>H2G+ 매뚜기 배지 L</td></tr><tr><td>-히스티딘 일수화물</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8125</td><td>H2G+ 잎매미 배지</td></tr><tr><td>배지 199 (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4530</td><td>H2G+ 잎벌레 배지 배지</td></tr><tr><td>1066 (1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0422</td><td>H2G+ 잎벌레 배지 성분</td></tr><tr><td>행크' s Balanced Salts (1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51322C</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>L-Glutamine (100x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G3126</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>MEM, 아미노산 mix (50x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56419C</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>1 M MgCl solution</td><td>, Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>H2G+ leafhopper medium component</td></tr><tr><td>Pen-Strep (w/ 글루타민)</td><td>시그마 알드리치</td><td>G6784</td><td>H2G+ 매미용 매체 성분</td></tr><tr><td>니스타틴</td><td>시그마 알드리치</td><td>N6261</td><td>H2G+ 매뚜기 매질 성분</td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>시그마 알드리치</td><td>46305</td><td>H2G+ 매뚜기 매엽 매질 성분</td></tr><tr><td>포도당</td><td>알드리치 시그마</td><td>D9434</td><td>H2G+ 매뚜기 배지 성분</td></tr><tr>소<td>태아 혈청</td><td>시그마 알드리치</td><td>F2442</td><td>H2G+ leafhopper 배지 구성품</td></tr></tbody></table>

의 전파<em&gt; homalodisca의 coagulata 바이러스-01</em&gt;를 통해<em&gt; homalodisca vitripennis</em&gt; 세포 배양

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

유리 날개 사격의 명수 (Homalodisca vitripennis)은 미국 남서부에 걸쳐 발견 매우 vagile 및 잡식성 곤충이다. 이 곤충은 Xylella fastidiosa (X를 fastidiosa)의 주된 벡터, 포도 나무의 피어스 병 (PD)의 인과 에이전트 목부 제한 박테리아입니다. 피어스 병은 경제적 피해이고; 따라서 H. vitripennis 병원체 관리 전략의 대상이되고있다. Homalodisca의 coagulata 바이러스-01 (HoCV-01)로 확인 dicistrovirus는 H.의 사망률 증가와 관련이있다 vitripennis 인구. 숙주 세포는 01-HoCV 복제에 필요하기 때문에, 세포 배양 물은 생물 농약과 물류 생산 경제적 가치가 타겟팅 복제 일정한 환경을 제공한다. 이 연구, H. 대규모 전파 시스템 조직 배양을 통해 vitripennis 세포가 개발 한 P바이러스 복제 메커니즘을 roviding. HoCV-01는 몸 전체의 곤충에서 추출하여 배양 된 H. 접종에 사용 된 다양한 수준에서 vitripennis 세포. 배지는 168 시간, RNA 추출 QRT-PCR 분석을위한 매 24 시간을 제거 하였다. 세포는 트리 판 블루로 염색하고 광학 현미경을 이용하여 세포의 생존 성을 정량화하는 계수 하였다. 항목의 바이러스 입자는 전체 세포 배양 붕괴가 발생하기 전에 것으로 결정된 시점이었다 감염 후 96 시간, 최대 추출 하였다. 세포는 형광 염색을 실시하고 F-액틴 및 첨부 핵 무결성에 바이러스 활성을 조사하기 위해 공 초점 현미경을 사용하여 보여졌다. 이 연구의 결론은 있다는 것이다 H. vitripennis 세포 배양 생물 농약의 생산을 허용하기에 적합한 수준으로 HoCV-01의 대량 생산을 위해 사용 가능하다.

세포 부착과 성장은 차 문화와 계속 통로에서, 크고 작은 문화 플라스크에 통과 48 시간 내 보였다. 섬유 아세포의 성장과 발전은이 시간 내에 관찰되었다. 새로 시드 플라스크 48 시간 전에 교란되었을 때,이, 세포 부착에 보이는 감소했다 때로는 느린 성장 문화와 전혀 첨부 파일 또는 성장을 선도. 세포는 전달의 1 주일 이내에 약 80 %의 합류했고, 10~14일 (그림 1)에서 단일 층을 형성했다. 이 연구의 개시에서 재배 된 차 문화는 어떤 형태 저하 또는 전체 세포 생존 능력의 감소없이 30 + 세포 통로를 살아 남았다. 세포 부착과 성장은 판에 플라스크에서 통과 48 시간 내 보였다. 그것은 더 작은 성장 표면 그대로 단층 형성은, 더 짧은 시간주기에서 약 5-6일을 달성 하였다. 감염된 문화가 촬영t 100X는 광학 현미경 하에서 감소 셀 모양의 무결성의 흔적을 보여 주었다. 48 시간 게시물 감염에서 큰 구멍이 세포의 표면에 존재 할...

여기에서 우리는 시험 관내에서 Homalodisca vitripennis 세포와 HoCV-1을 전파하는 프로토콜을 제시한다. 중간 HoCV - 한 긍정적 인 문화에서 제거하고 RNA는 168 시간 동안 매 24 시간을 추출 하였다. 세포 생존은 트리 판 블루 염색에 의해 정량 하였다. 전체 바이러스 입자는 감염 후를 추출 하였다. 추출 된 RNA는 QRT-PCR에 의해 정량 하였다.

의 전파<em&gt; Homalodisca의 coagulata 바이러스-01</em&gt;를 통해<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; 세포 배양

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

다음 실험의 전반적인 목적은 Homalodisca coagulata virus one(HOCV-one)이 Homalodisca vitripennis 세포 배양물을 통해 복제될 수 있는지 확인하고, 이후의 하위 공정을 위해 이를 추출할 수 있는지 결정하는 것입니다. 이는 H. vitripennis를 성공적으로 배양하여 정제된 HOCV-one을 도입해 복제를 유도함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 바이러스가 포함된 배지와 세포를 배양물에서 제거한 후, 바이러스 및 RNA 추출 과정을 거치게 됩니다.다음으로, 감염된 배양물에서 추출한 RNA를 PCR에 subjected하여 세포 내에 바이러스 RNA가 존재하는지 확인합니다. 그 결과, 감염 전후의 생세포 수 측정 및 qRT-PCR 분석을 통해 HOCV one이 in vivo에서 복제될 수 있음이 나타났습니다.감염된 살아있는 곤충을 사육하는 것과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 더욱 경제적이며 최소한의 시설과 장비로 쉽게 관리할 수 있다는 점입니다. 이 방법을 사용하면 생물학적 방제 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 특정 곤충 종에 특이적인 곤충 바이러스나 바이러스를 이용해 대규모로 해충을 방제할 수 있을까요?이 방법은 특정 곤충의 관리에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, HOCV와 동일한 과의 바이러스를 이용한 붉은불개미 관리와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하기 전에, 수정된 WH-two 꿀벌 배지인 H2G plus leaf hopper 배지를 사용하여 25 square centimeter 조직 배양 플라스크에서 배양액을 배양하고 유지하십시오. 바이러스 양성 H. vitripennis의 전신을 0.02% DETCA가 포함된 인산염 완충액에서 큰 조직 덩어리가 더 이상 남지 않을 때까지 약 10초 간격으로 볼텍싱하여 균질화하십시오. 4 °C에서 16시간 동안 22,000 g로 초고속 원심분리를 수행하여 바이러스를 추출하십시오.상층액을 버린 후, 펠렛을 수집하고 0.4% sodium deoxycholic acid와 4% polyethylene glycol hexa-desal ether가 포함된 10 millimolar 인산염 완충액 5 mL로 용해합니다. 펠렛을 충분히 섞기 위해 튜브 벽면에서 펠렛을 떼어내고 필요한 경우 분쇄합니다. 300 g에서 15분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 다음, 용액을 0.45 µm 필터에 통과시켜 여과액을 큰 수집 튜브에 모읍니다.필요 시 DETCA가 포함되지 않은 10 millimolar 인산염 완충액을 소량 사용하여 여과액을 분자량 컷오프 3.5 kilodaltons의 투석 막으로 옮깁니다. 투석 막을 4 °C의 2중 증류수가 채워진 큰 비커에 넣습니다. 막 내에 흰색 침전물이 형성될 때까지 5~6시간 동안 매시간 물을 교체합니다. 이 시점에서 48 Well 배양 플레이트에 세포를 접종합니다.세포 성장률이 80%confluent에 도달하면, 각 행의 세포에 단계 희석한 바이러스를 접종합니다. 그 다음, 부피 대조군으로서 각 웰에 2중 증류수 10 µL를 첨가합니다. 실험군 세포 수와 비교할 기준 세포 농도를 설정하기 위해, 배양액의 어떤 웰에도 바이러스를 처음 접종하기 전, 각 행의 첫 번째 웰에 있는 세포를 해리시킵니다. 그 후 세포 수를 측정합니다.다음으로, 각 24시간 시점에서 이미징한 컬럼에서 모든 배지를 제거하고 RNA 추출 및 바이러스 정량을 위해 -20°C에 보관합니다. 앞서 설명한 프로토콜에 따라 배양 세포에서 바이러스를 추출한 후, 제조사의 프로토콜에 따라 액체 샘플용 구아니디늄 티오시아네이트 페놀 클로로포름 추출법을 사용하여 각 1주일 바이러스 시험 기간 동안 수집한 배지 샘플에서 RNA를 추출합니다. RT-PCR의 경우, H. vitripennis 전신에서 분리한 바이러스 분리물을 사용하여 HOCV RT-PCR 프라이머-1 프라이머 쌍으로 일반적인 PCR을 수행함으로써 바이러스 표준물질을 설정합니다.그 후, 정제된 시료를 57 ng/µL에서 57 ag/µL까지 10배 단계 희석 시리즈로 수행합니다. 저발현 전사체를 신뢰성 있게 정량할 수 있는 qRT-PCR 키트를 사용하여 qRT-PCR로 희석 시리즈의 검출 한계를 결정합니다.앞서 설명한 대로 실험 샘플에서 RNA를 추출한 후, 분광광도법을 사용하여 정량합니다. 다음으로, 낮은 카피 수를 감지할 수 있는 원스텝 qRT-PCR 키트를 사용하여 모든 샘플에 대해 25 µL 반응 부피로 qRT-PCR을 2회 반복 수행하며, 방법은 다음과 같습니다. 각 반응 혼합물이 1x 마스터 믹스 12.5 µL, 0.3 µM 정방향 프라이머 1.0 µL, 0.3 µM 역방향 프라이머 1.0 µL, 역전사 효소 0.25 µL 및 표준화 값에 따른 가변 양의 템플릿을 포함하도록 마스터 믹스를 제조합니다. 그 후 RNase-free water를 사용하여 총 반응 부피를 25 µL로 맞춥니다. 각 PCR 런마다 5 × 10⁻¹⁰, 10, 5 × 10⁻⁸, 5 × 10⁻⁶, 5 × 10⁻⁴, 5 × 10⁻² 카피의 5가지 표준 농도를 포함시킵니다. 각 런의 시작 단계에서 초기 획득 시 발생하는 노이즈를 줄이기 위해, 각 런의 임계값(threshold)을 형광 값 10 × 10⁻².⁵ 바로 아래로 설정합니다.유리 커버슬립이 포함된 12웰 플레이트에서 Homalodisca vitripennis 세포를 배양한 후, 단층(monolayer)이 형성되면 추출된 바이러스를 사용하여 4일 동안 24시간마다 한 열씩 접종합니다. 접종이 완료되면 4 °C에서 차가운 4% paraformaldehyde로 30분 동안 세포를 고정합니다. 그런 다음 세포에 1X PBS 500 µL를 첨가하고, 저속 로커(rocker)를 사용하여 상온에서 10분 동안 세척합니다. 세포를 세 번 세척한 후, 0.1% TritonX-100 500 µL를 첨가하여 10분 동안 세포를 투과화합니다.세포를 1X PBS로 세척한 후, 5% bovine serum albumin 용액 500 microliters를 첨가하여 상온에서 세포를 블로킹합니다. 2시간 후, 세포에서 용액을 제거합니다. 그다지 각 웰에 희석된 rhodamine-red 접합 Phalloidin 스톡 용액 250 microliters를 첨가하여 f-actin을 염색합니다. 염료의 탈색을 방지하기 위해 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고, 4°C에서 하룻밤 동안 세포를 배양합니다. 배양 후, rhodamine 용액을 제거하고 5% BSA가 포함된 1X PBS에 희석한 DAPI 250 microliters를 첨가하여 세포 핵을 염색합니다. 상온에서 1시간 동안 세포를 배양한 후, 앞서 설명한 것과 같이 1X PBS로 세 번 세척합니다.마지막으로, 웰에서 커버슬립을 조심스럽게 꺼내어 Antifade 시약이 포함된 마운팅 용액을 사용하여 현미경 슬라이드에 마운팅합니다.소형 및 대형 배양 플라스크에서 계대 배양 후 48시간 이내에 세포 부착 및 섬유아세포 발달이 관찰되었습니다. 새로 분주한 플라스크에 충격이 가해졌을 때, 세포 부착력이 감소하여 배양 성장 속도가 느려졌으며 때로는 부착이나 성장이 전혀 일어나지 않았습니다.세포는 일주일 이내에 약 80% 정도 밀집(confluent)되었으며, 10~14일 이내에 단일층을 형성했습니다. 감염된 배양물은 세포 형태의 무결성이 저하되는 징후를 보였으며, 감염 후 48시간째에 세포 표면에 커다란 구멍처럼 보이는 것들이 관찰되었습니다. 희석하지 않은 HOCV-one에 감염된 후 약 72~96시간이 지나자 세포가 수축하고 배양 표면에서 떨어져 나갔습니다. 시간에 따른 바이러스 농도별 생존 세포 수의 차이를 나타내기 위해 평균 생존 세포 수를 도식화했습니다. 바이러스 처리 농도가 높은 그룹에서는 배양 상태가 훨씬 더 뚜렷하게 악화되었으며, 특히 48~72시간 사이에 생존 세포 수가 급격히 감소했습니다. 반면, 바이러스 처리 농도가 낮은 그룹은 서서히 감소하다가 약 144시간경에 급감했습니다. Kaplan Meyer 곡선으로 분석한 결과, 고농도 바이러스를 접종한 세포의 생존 확률이 더 낮게 나타났으며, 이는 평균 생존 세포 수 분석 결과와 일치했습니다. 통계적으로 유의미하지는 않았으나, 데이터에 따르면 바이러스에 노출된 세포가 시간이 지남에 따라 낮은 생존율을 보일 가능성이 88% 더 높음을 시사합니다. HOCV-one에 노출된 세포에서 나타난 핵의 감소와 f-actin의 변형된 모습은 배양물에 중대한 영향이 있음을 나타냅니다.1:10의 더 높은 바이러스 부하에 노출된 건강한 세포들은 더 큰 스트레스를 나타냈습니다. 이 절차를 수행할 때, 일부 단계는 시간과 온도에 민감하므로 프로토콜의 각 단계를 적시에 완료하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후에는 ELISA와 같은 다른 방법을 사용하여, 예를 들어 다양한 양의 바이러스를 세포 배양물에 접종한 후 배양물 내에 얼마만큼의 바이러스가 존재하는가와 같은 주요 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 곤충 세포주를 사용하여 RNA 바이러스를 복제하고, 해당 바이러스를 추출한 뒤 qRT-PCR을 통해 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에서 우리는 floxed Rac1 allele를 갖고 기본 마우스 배아 섬유아 세포를 감염시킬 Cre 호텔 recombinase 유전자를 갖고 아데노 바이러스를 사용합니다.

교양 차 마우스 배아 섬유아 세포의 신호 분자의 아데노 바이러스 - 매개 유전자 제거

우리는 처리 방법을 설명하고 화면의 필드 수집 베로 세포 배양 분석에 의해 바이러스의 다양성을 위해 모기. 이 기술을 채용함으로써, 우리는 코네티컷에서 수집한 모기 4 taxonomic 가정에서 9 가지 바이러스를 감지했습니다.

베로 세포 배양 분석하여 필드 수집 모기에서 감염성 바이러스의 검출

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Production and Collection of Pseudovirus Particles Using Mammalian Cell Culture

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the propagation and harvesting of oncolytic herpes simplex virus in mammalian cell cultures, highlighting viral entry, replication, and the recovery of virus-loaded cells. It further shows methods for preserving infected cells for downstream processing.

Propagation and Harvesting of Oncolytic Herpes Simplex Virus in Mammalian Cells

Source: Huang, D., et al. Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the step-by-step procedure for the in vitro isolation of mosquito-associated viruses from mosquito homogenates using fibroblast-like mammalian cells.

Isolation of Mosquito-Associated Virus from Mosquito Homogenate

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