Name: 해마의 Organotypic 조각의 쌍으로 전체 셀 녹음 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 학습하세요 해마 organotypic 조각에서 쌍으로 전체 셀 패치 클램프 기법을 사용하여 시냅스 연결 뉴런의 전기생리학적 활동을 기록하는 방법입니다. 이 기법은 최소 시냅스 회로의 기능을 연구하는 데 활용됩니다.

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유익한 토론을 해주신 Montgomery와 Madison 연구실 구성원들에게 감사드립니다. 우리는 이 연구에서 NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC 및 NIH로부터 자금을 지원받았음을 인정합니다.

동물 윤리 정책 : 이 논문에서 설명하는 프로토콜은 오클랜드와 스탠포드 대학의 대학에 의해 설립 된 동물 보호 지침을 따르십시오. P7 쥐 새끼는 빠른 잘린 안락사되었다. 해마 해부는 즉시 아래에 설명 된대로 수행됩니다. 1의 Organotypic 해마 슬라이스 문화 <ol><li> 준비 <ol><li> (뇌를 해부에만 사용) 해부 매체를 준비합니다. , 5 ㎖의 HEPES 완충 용액, 2 ㎖의 1 M 트리스 주식 솔루션 (산도 7.2) (0.85 % NaCl을 각각 10,000 대) 200 ㎖의 최소 필수 중간, 2 ml의 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션을 결합하고, 필터는 0.22 μm의 필터 소독 . 얼음처럼 차가운 해부 매체에서 해마 절제술을 수행하십시오. </li><li> 해부 매체를 쿨. 약 1 시간 전에 액체가 매우 추운 때까지 절개를 시작하기에 냉동실에서 해부 미디어를 넣습니다. 큰 얼음 CR을 허용하지 마십시오ystals을 형성한다. 필요한 때까지 얼음에 보관하십시오. </li><li> (해마의 해부를 제외한 모든 사용) 문화 매체를 준비합니다. / L-글루타민, 2 ml의 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션 와트, 행크의 염 / w 100 ㎖의 최소 필수 중간, (1 배 농도, 액체) 겸용 (0.85 % 액체, 각각 10,000 대, 염화나트륨), 2.5 ml의 HEPES 한 M 버퍼 솔루션, 50 ML 행크의 균형 소금 솔루션, 50 ㎖의 말 세럼 (정의, 열 불 활성화) 및 필터는 0.22 μm의 필터 소독. </li><li> 문화 요리를 준비합니다. 35mm 배양 접시 당 배양액 1 ㎖를 배치하고, 각 요리에 막 삽입을 추가합니다. 한 150mm 페트리 접시에 이러한 요리의 일곱까지 착용 할 것 ( &#39;판&#39;이라고 함). 요리 배양 배지는 적절한 온도와 pH가 달성되도록 절개가 시작되기 전에 적어도 한 시간 동안 CO 2 배양기에서 접시를 놓습니다. </li></ol></li><li> 출생 후 7 일에서 쥐 새끼들까지 잔치에서 해마의 해부 (P7) <ol><li> 절차 전에 자외선 아래의 모든 해부 도구를 사전 소독. </li><li> 급속한 잘린 후 접시에 냉장 한 매체 중에 뇌와 장소를 제거하고 해부 용 가습 필터 종이 조각을 제거. 해마를 노출, 무딘 부드러운 플라스틱으로 코팅 된 미니 주걱을 사용하여 멀리 중뇌에서 피질을 애무 해줘. 원개를 절단 한 다음 조심스럽게 (그림 1A)를 밖으로 플립 해마 아래에 주걱을 작동합니다. 노트 : 슬라이스 배양 P10까지 동물을 사용하여 제조 될 수있다. </li><li> 멀리 뇌의 나머지 부분에서 분리 된 해마를 낸다. 적신 부드러운 붓을 사용하여 냉장 해부 매체를 포함하는 새로운 접시에 해마로 이동 (예를 들어, 흰색 검은 담비 # 4). </li><li> 이러한 스폰지, meninge 형상 조직이 어려운 해마를 분리 할 수 있도록 같이, 박리시 맥락총의 해마의 하부 (즉, 평탄한면) 청소나중에 서로 조각. 참고 : 그들이 부드럽게 떨어져 조롱 할 수없는 경우 대신이 조직을 둡니다. </li><li> 해마를 손상시키지 않고 가능한 한 빨리 전체 절개를 수행한다. 참고 :주의 해부 한 실험 조건이 냉각 될 때, 빠른 일보다 더 중요하다. 동시에 세 쥐의 해마를 썬다. 도금 조각이 인큐베이터에 갈 때 슬라이스 건강이에 한 시작부터 총 시간 등의 영향을받지 않습니다 30 분을 받고있다. </li></ol></li><li> 슬라이스 <ol><li> 가로 수동 조직 슬라이서를 사용하여 400 μm의 크로스 섹션으로 해마를 썬다. 슬라이싱이 수행 된 방법은 조직에 과도하게 손상되지 않고 (암몬의 혼이 쉽게 조직에 보존 할 볼 수 있습니다 즉) 쉽게 볼 수 층류 아키텍처와 일치하는 두께의 조각을 생산 너무 오래 같이 중요하지 않습니다. </li><li> 조직의 무대에서 해마를 거짓말2 여과지 트리플 두께의 위에 초퍼. 해마는 (오히려이 시점에서 슬라이스 빵 덩어리처럼, 그림 1B 모든 인하되었습니다 때까지 전체 해마가 헬기의 무대에 남아 즉) 개별적으로 모든 조각을 제거하지 않고 완전히 분리된다. </li><li> 각 해마 옆에 누워 부드러운 붓 (2 흰색 검은 담비 #)를 사용하여 해부 매체로 해마를 전송합니다. 부드럽게 해마와 기본 필터 종이 사이의 접착력을 깰 측면에 각 해마를 밀어 넣습니다. 무대에서 내려 데리러 각 해마 아래 브러시를 굴립니다. 냉장 해부 매체의 동일한 35mm 페트리 접시에 모든 해마를 놓습니다. 수동으로 시계 방향과 반 시계 방향으로 운동을 교대로 요리를 교반하여 개별 조각으로 해마를 분리합니다. </li><li> 해부 현미경 슬라이스를 검사하고 명확하게 보이는 셀을 소유하지 않는 작은 손상, 또는 어떤되는 모든 폐기몸 층. 참고 : 종종 모든 조각이 성공적으로이 방법으로 자신의 형제 분리되어 있지 경우가 될 것입니다. 이 경우, 그들은 가장자리에 돌려서 미세 핀셋의 선단 그들을 괴롭히는 의해 분리 될 수있다. &quot;좋은&quot;슬라이스가 다음 차단 및 화재 연마 파스퇴르 피펫 (그림 1C-E)를 사용하여 냉장 해부 매체를 포함하는 또 다른 깨끗한 페트리 접시로 전송됩니다. </li></ol></li><li> 저장 <ol><li> 멤브레인 필터 인서트에 개별 조각을 놓습니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 차단 및 화재, 더 큰 구멍을 줄 개별적으로 문화 삽입에 조각을 전송하는 연마. 참고 : 절단 및 화재 연마 피펫이 중요한 때 생성 된 구멍의 크기입니다. 너무 작은 조각은 쉽게 막에 대한 피펫을 떠나지 않을 것입니다. 너무나 큰 과잉 유체는 슬라이스와 함께 공막의 표면 상에 배치된다. 최적 내경은 전형적으로는 약 절반이다 DIAM피펫의 배럴의 eter. 절단 할 때에는,이 직경은 피펫의 테이퍼에 적절한 장소에서 절단함으로써 선택 될 수있다. </li><li> 슬라이스 전송 <ol><li> 첫째 매체와 피펫을 입력 한 다음 작은 흡입 힘을 가진 한 조각을 빨아. 이 피펫의 개통 근처에 슬라이스를 유지하고 슬라이스를 배치 할 삽입에 너무 많은 매체 추방을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 작은 매달려 방울을 형성하는 전구에 약간의 힘을 주어 슬라이스가 물방울에 정착 한 다음 막에 그 방울을 터치 멤브레인에 슬라이스 &quot;가을&quot;을 할 수 있습니다. 일반적으로 3 조각은 각각의 막 삽입에 배치됩니다. NOTE : 유체 액적가 너무 큰 경우, 세 조각에서 물방울 막 표면에 병합하는 경향이 있고, 슬라이스 따라서 모든 더 어렵게 이후 전기 생리 녹화 그들을 분리 할 수​​있게, 멤브레인의 중앙에 수집된다. </li></ol></li><li> 유체 Remov알 <ol><li> 슬라이스에 침지 또는 해부 매체의 수영장으로 둘러싸여되지 않도록, 그 판의 모든 조각 (삽입 당 3 조각 = 플레이트 당 21 조각)의 배양 용기 삽입의 상단에서 초과 매체를 대기음. </li><li> 이 포경 함께 수행하지만, 화재 연마 파스퇴르 피펫. 슬라이스가 정착 피펫 팅 전에 분 동안 막에 부착 할 수 있습니다. 최대 피펫으로 슬라이스를 흡입하지 않도록주의하십시오. 슬라이스가 정착하기에 충분한 시간을 허용하기 위해, 제 도금 인서트 유체 제거를 수행한다. </li></ol></li><li> 슬라이스 저장 <ol><li> 37 ° C에서 5.0 % CO 2 인큐베이터에 보관 슬라이스 문화. 그림 1E의 문화의 최종 배열을 관찰한다. 개별 조각은 밑바닥 공막가 배양 용기 삽입시 휴식,이 인서트는 매체의 소량 충전 페트리 접시 안에 맞는; 이것에 의해, 슬라이스 나에 몰입되지 않습니다dium는 있지만 배양 플레이트 인서트의 하단 멤브레인을 통해 액세스 할 수 있습니다. </li><li> 임의로, 배양 접시를 삽입하거나 제거하여 슬라이스를 포함하는 인서트 막의 단면을 잘라내어 수도 연구 중 슬라이스를 제거한다. </li></ol></li></ol></li><li> 유지 보수 <ol><li> 문화를 한 후 일 배양 접시에서 매체를 교환한다. 전송하기 전에 적어도 한 시간 동안 배양기에서 평형화 신선한 배지 1 ㎖를 함유하는 새로운 배양 접시에 배양 플레이트 인서트를 전송합니다. </li><li> 문화를 한 후 셋째 날에 동일한 방식으로 다시 매체를 변경합니다. 셋째 날, 34 ° C로 설정 인큐베이터에 문화를 전송합니다. 두 번 각 주 (모든 3-4일을) 매체를 변경합니다. </li><li> 건강한 문화를 식별합니다. 한 쌍의 전체 세포 레코딩을위한 건강한 문화를 선택합니다. 참고 : 건강한 문화가 잘 정의 된 가장자리와 명확하게 정의 된 피라미드 세포 층이있다. 문화 재치시간의 어두운 (가능성이 괴사) 지역 현재 또는 병합 된 테두리가있는 액포 외관은 거부됩니다. 이러한 기준 채택, 슬라이스 문화의 일반적으로 3 분의 2는 충분히 기록 건강. </li><li> 시간의 매우 작은 창 내에서 이러한 문화를 활용합니다. 신경 세포가 서서히 시간을 악화 약간 간질 동작을 표시하기 시작 이후 2 주 이상 배양 사용되지 조직을 수행합니다. 신경 세포의 생존의 정확한 상한은 알려져 있지 않습니다하지만 문화 피라미드 세포에게 늦게 16 개 주 기능에서 기록 할 수있다. </li></ol></li></ol> 2 쌍으로 전체 셀 녹음 <ol><li> ACSF 및 세포 내 솔루션 <ol><li> 120 글루 콘산 칼륨, 40 HEPES, 5 MgCl2를, 2 NaATP, 0.3 NaGTP (; 290 mOsm 삼투압 KOH으로 pH 7.2) (단위 : mm) 혼합하여 시냅스 전극 솔루션을 준비합니다. 같은 전극 용액이 시냅스 후 뉴런, 세슘 글루코 네이트에 사용되는 동안 (120 mM의) 일반적으로 주요 시냅스 전극에 소금 플러스 5 밀리미터 QX314로 사용됩니다. 참고 :이 시냅스 NMDAR - 중재 전류 8-10,13를 기록하는 양의 전위에서 안정 전압 클램핑을 할 수 있습니다. 또한 기가 옴 밀봉이되기 전에 시냅스 기록 전극에서 흐르는 내부 솔루션에 의해 시냅스 전 신경 세포의 칼륨에 의한 hyperexcitability을 방지 할 수 있습니다. </li><li> (mm 단위) 구성 시냅스 전극 액 120 세슘 글루코 네이트, 40 HEPES, 5를 MgCl 2, 5 QX314,이 NaATP하고, (; 290 mOsm 삼투압 CsOH를하여 pH 7.2) 0.3 NaGTP를 준비합니다. 5 ~ 10 MΩ 저항에 유리 미세 전극을 당겨 여과 내부 솔루션을 입력합니다. </li><li> 인공 뇌척수액 (ACSF) 119 염화나트륨, 2.4의 KCl (mm 단위) 구성을 준비 황산 1.3, 2.4 염화칼슘이, 하나 나 2 HPO 4, 26.2 탄산 수소 나트륨, 95 % O 2, 5로 포화 된 11 포도당, 산도 7.4, %의 CO 2. 주 : R을 AMPAR 매개하는 경우esponses는 NMDAR EPSCs의 검사를 위해 차단해야하는 ACSF에 10 μM C​​NQX 또는 NBQX을 포함한다. </li></ol></li><li> 페어 전체 셀 녹음을 구합니다 <ol><li> 이 개별 뉴런 사이의 시냅스 전달을 조사하기 위해, 시냅스 신경 세포로 하나의 신경 세포를 지정하고 활동 전위를 유도하고 시냅스 전달을 시작하기 위해 현재의 클램프를 누르고 있습니다. </li><li> 시냅스 후 뉴런과 같은 뉴런 제를 지정하고, 연구자에 의해 요구되는 정보에 따라 전류 또는 전압 클램프에 고정. 전압 클램프에서 시냅스 후 뉴런을 잡고 MV 6-16 30에서 조사 -65 MV에서 조사 AMPAR - 매개 EPSCs과 NMDAR - 중재 EPSCs와 글루타메이트 전류의 자세한 검사를 받기 </li><li> 페어링 기록을 설정합니다. 페어링 녹화를 설정하기 위해, 시냅스 전 세포 기록 반드시 여러 순차 시냅스 후 뉴런있게 제 얻어지는 접속 하는 시냅스 하나까지 획득 될D가 얻어진다. 시냅스 가소성 실험을 수행하는 경우, LTP 8,19 필요한 세포질 인자의 유실을 방지하기 전 세포 기록을 얻는 10 분 이내에 시작되어야 시냅스 후 뉴런에서 LTP의 유도로 제 시냅스 전 신경 세포를 얻는 것이 특히 중요하다. </li><li> 운동에 의한 세포의 손실을 피하십시오. 페어링 전 세포 기록을 행하는 주요 과제는 진동과 제 2 기록을 얻는 반면 제 전 세포 기록 움직임 - 유도 방해를 회피한다. <ol><li> 제 전 세포 기록을 구하여 설정된 기록이 모니터 (도 2a)에 표시되는 영역의 가장자리에 위치되도록 한 다음 X-축에서 10 내지 200 μm의 현미경 렌즈를 이동. </li><li> ACSF 여전히 렌즈와의 접촉을 유지하는 보장 ~ 5-10밀리미터을 현미경의 렌즈를 올립니다. 제 2 전극을 마운트하고 (유체 메 니스 커스 (meniscus)에 그림 2B 안내 </strong&gt;). </li><li> 이 렌즈를 통해 빛의 경로 바로 아래에 여전히 크게 기존의 기록 전극 위에까지 xy 평면에 전극을 이동합니다. 전극은 현미경으로 볼 일단 팁이 떨어져 제 1 전극으로부터 멀리 모니터의 가장자리에 확인. </li><li> 양 전극이 같은 초점면에 때까지 현미경의 초점을 순서대로 제 2 전극을 아래로 이동합니다. 그것은 제 전 세포 기록을 중단하도록 정압의 레벨이 너무 강해 팁 막힘을 방지하기에 충분히 강하지 만없는 것이 중요하다. 이것은 먼저 슬라이스 들어가면 전극으로부터 2-3에서 운동 신경원을 유도 정압으로 변환. </li><li> 첫번째 시냅스 기록 (그림 2C)와 비슷한 초점면에서 시냅스 파트너를 찾습니다. 녹화는 일반적으로 첫 번째 연구의 0-200mm 신경 세포에서 CA3 피라미드 뉴런 초 전 세포 사이의 녹음을 쌍의 취득ecording (그림 2C, D). 주 : 신경 쌍 사이 시냅스 전달 최대 3-4 시간의 시간 기간에 걸쳐 안정 이러한 표준 전체 셀에 기록하는 기술을 사용하는 경우. </li></ol></li></ol></li><li> 시냅스 일단 성공적 시냅스 연결 피라미드 세포 쌍 취득시 (도 3a를, B), 시냅스 전달과 가소성의 특성을 조사한다. <ol><li> LTP 유도. <ol><li> 1 분 0 MV (그림 3C) 7-9,12-14에 -10 시냅스 탈분극과 시냅스 활동 전위 (1 ~ 200Hz)를 페어링하여 LTP를 유도한다. 브레이크에서 시냅스 후 뉴런의 10 분 이내에 페어링을 시작합니다. 참고 : LTP는 시냅스 활동 전위로, 1 분 동안 1 Hz에서 시냅스와 시냅스 활동 전위를 페어링하여 현재 클램프에서 열린 두 신경 세포로 유도 할 수는 시냅스 전 신경 세포의 팔에 전류를 주입 다음 10 밀리 초를 유도 </s&gt;입니다. </li></ol></li><li> 또한 5 ~ 10 분 (그림 3C) 9 -55 MV에 시냅스 후 뉴런의 약간의 탈분극과 함께 1 Hz에서 저주파 자극 (LFS)에 의해 LTD를 유도한다. </li></ol></li></ol>

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여기에서 우리는 해마의 Organotypic 슬라이스 문화에 성공적으로 짝을 전체 셀 녹음을 확립하기위한 요구 사항을 설명했다. 짝 녹음은 급성 슬라이스와 해리 문화 시스템 (26, 27)를 포함하여 여러 준비, 수행 ​​될 수있다. 초점은 여기에서 시냅스 가소성 (즉 LTP와 LTD)의 이상 형태의 유도에 왔지만, 짧게는의 Organotypic, 급성 슬라이스에서 해당 쌍 전 세포 녹음을 강조하는 것이 중요하다 세포 제제는 계량 적 크기로 중요한 통찰력을 제공 한 해리 -TERM 가소성, 연접 기능뿐만 아니라 LTP 2,4,8,26,27 및 LTD. 슬라이스의 Organotypic 시스템의 주요 장점은 뉴런 간의 연결이 증가된다. 급성 슬라이스 준비 시냅스 연결로 인해 슬라이스 준비하는 동안 축삭 연결의 절단으로 낮다. 우리의 경험에 의하면, 시냅스의 접속 하에서 녹음을 쌍급성 조각에서 개발 CA3 뉴런을 얻을 쌍 녹음 만 ~ 5 %에...

글루타메이트 수용체는 중추 신경계의 시냅스에서 흥분성 시냅스 전달의 대부분을 중재. 시냅스 후 막의 척추 헤드에서 번역 이온 성 글루타메이트 수용체의 두 가지 서브 타입은 N-메틸-D-아스파 테이트 (NMDA)과 α-아미노 -3 - 히드 록시-5 proprionic-4-메틸 아이 산 (AMPA) 수용체이다. 막 전위를 휴식에서 AMPA 수용체는 시냅스 전달하는 동안 시냅스 전류의 대부분을 수행한다. 해마에서, NMDA 수용체가 시냅스 막에서 AMPA 수용체의 수의 변화를 유발에 중요한 역할을한다 : &quot;일치 검출기&quot;로 작용함으로써 하나는 시냅스 강도 하나의 변경을 시작하는, NMDA 수용체는 시냅스 메커니즘에 참여 즉 세포 내 수준에서 학습과 기억을 뒷받침하는 것으로 생각된다. 시냅스 송신기 릴리스에 평행 시냅스 신경 세포의 탈분극에 응답하여, 칼슘 NMDA 통해 입사수용체가 AMPA 수용체의 삽입 또는 제거 2를 시작합니다. 이러한 수용체는 시냅스 역학 소성을 이루는 시냅스 강도의 감소가 장기 우울증 4 (LTD) 동안 시냅스 강도의 증가는 장기 증강 2,3 (LTP)이다. NMDA 수용체는 그것의 제어를 유도하는 것으로 생각되는 반면 따라서 AMPA 수용체 이동은 시냅스 가소성 발현 책임 생각된다. 시냅스 전송 및 소성의 기초가되는 정확한 메커니즘을 결정하는 것은 이상적으로 시냅스의 작은 인구, 하나의 시냅스를 공부해야합니다. 일부 시냅스는 매우 인해 시냅스 연결의 작은 확산 특성이 매우 어렵습니다 대부분의 시냅스 집단이 수준, 예를 들어, 다섯 개최의 꽃받침,에서 연구에 적합하는 동안. 두 주요한 기술은 전기 생리학 단일 시냅스 연결을 검사하기 위해 개발되었다 : 제 최소 자극이며, 어디 있나한 시냅스 섬유 추정된다 전자는 세포 외 자극. 두 번째 기술은 시냅스 연결 뉴런에서 두 개의 동시 전체 셀 녹음이 수행 기록을, 짝. 최소한의 자극의 주요 장점은 동시에 시냅스 후 뉴런에서 촬영하면서 축삭 기관으로 세포 외 자극 전극의 배치를 포함하는, 수행하도록 신속하고 비교적 간단하다는 것이다. 이 기술을 이용하여 주요 관심사는 단일 셀의 신뢰성 자극 거의 시험 후 시험을 보장 할 수 있다는 것이다. 지난 15 년 동안 우리는 정기적으로이 시냅스 연결 피라미드 뉴런 6-17에서 전체 셀 녹음을 쌍으로 사용하고 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단지 하나의 시냅스 전 뉴런이 일관되고 신뢰성있게 자극한다는 것이다. 또한 전기 생리 학적 특성뿐만 아니라, 시냅스 전 뉴런 6,18 &lt;약리학 조작뿐만 아니라 허용/ SUP&gt;. 그러나, 뉴런 사이의 시냅스 연결의 확률은 19 구에 접속 쌍 어렵게 낮다. 의 Organotypic 뇌 슬라이스 배양의 사용은 시냅스 연결 등이 장애물이 시험 관내에서 다시 설정할 수 있고, 더구나 그 결과 연결이 자연 네이티브 뇌 조직 (20)과 유사하다 우회. 또한,의 Organotypic 문화에 가소성 메커니즘을 가능하게 LTP, LTD 7-10,12-15,21 페어링 된 펄스 촉진 (PPF)과 우울증 (PPD) 6,22,23을 포함한 단기 시냅스 가소성을 추가로 표현 뉴런 쌍으로 연구 될 수있다. 여기에서 우리는 성공적으로 시험 관내 시스템에서 한 쌍의 기록을 달성에 관련된 자세한 방법을 설명합니다. 이 정보는 용이 급성 뇌 조각 및 다른 영역을 포함하는 다른 실험 시스템에 적용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>최소 필수 중간</td><td></td><td></td><td>안정적인 전동 마이크로 매니퓰레이터&nbsp;</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액&nbsp;</td><td></td><td></td><td>얕은 조직 목욕</td></tr><tr><td>HEPES 완충 용액</td><td></td><td></td><td>DIC 카메라</td></tr><tr><td>1M 트리스 순정 용액</td><td></td><td></td><td>증폭기</td></tr><tr><td>행크 ' s Balanced Salt Solution</td><td></td><td></td><td>컴퓨터</td></tr><tr><td>말 세럼&nbsp;</td><td></td><td></td><td>방진 테이블</td></tr><tr><td>플라스틱 코팅 미니어처 주걱</td><td></td><td></td><td>직립 현미경</td></tr><tr><td>소프트 페인트 브러시</td><td></td><td></td><td>데이터 수집 및 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>수동 조직 다지기</td><td></td><td></td><td>전극 풀러</td></tr><tr><td>#2 여과지</td><td></td><td></td><td>패러데이 케이지</td></tr><tr><td>#5 집게</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>멤브레인 인서트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 후드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>클래스 II 후드</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

해마의 organotypic 조각의 쌍으로 전체 셀 녹음

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

쌍 기록은 시냅스로 연결된 두 개의 뉴런의 동시 전체 세포 패치 클램프 기록을 포함하며, 개별 뉴런 사이의 시냅스 연결에 대한 직접적인 전기생리학적 특성화뿐만 아니라 시냅스전 또는 시냅스후 뉴런의 약리학적 조작을 가능하게 합니다. 유기형 해마 절편 배양에서 수행되면 두 개의 뉴런이 시냅스로 연결될 확률이 크게 증가합니다. 이 제제는 세포 유형을 쉽게 식별할 수 있게 해주며, 뉴런은 천연 뇌 조직에서와 유사한 시냅스 기능의 형태와 특성을 유지합니다. 쌍을 이룬 전체 세포 기록의 주요 장점은 세포 외 축삭 자극을 사용하는 다른 조잡한 기술로는 불가능한 시냅스 전달 및 가소성의 특성에 대해 매우 정확한 정보를 제공할 수 있다는 것입니다. 쌍을 이룬 전체 세포 기록은 종종 수행하기에 너무 어려운 것으로 인식됩니다. 이 기술에는 어려운 측면이 있지만, 특정 하드웨어 및 방법론적 기준을 따르는 경우 전체 세포 패치 클램핑에 대한 교육을 받은 사람이라면 누구나 쌍을 이루는 녹음을 수행할 수 있습니다. 시냅스로 연결된 쌍을 이룬 기록을 달성할 확률은 건강한 유기형 절편과 안정적인 미세 조작을 통해 크게 증가하여 시냅스 전후 전체 세포 기록을 독립적으로 달성할 수 있습니다. CA3-CA3 피라미드 세포 쌍은 유기형 절편 해마 제제에 가장 널리 사용되지만, 이 기술은 CA3-CA1 쌍에서도 성공적이었으며 동일한 절편 제제에서 시냅스적으로 연결된 모든 뉴런에 적용할 수 있습니다. 이 원고에서는 전기생리학을 위한 모든 실험실에서 이 기술을 확립하기 위한 자세한 방법론과 요구 사항을 제공합니다.

시냅스 연결이 기록 전극을 통해 탈분극 전류 펄스 (20 밀리 초에 대한 일반적으로 20 ~ 50 씩) 전달하여 활동 전위를 발생하는 시냅스 전 신경 세포를 자극하여 분명하다. 시냅스 현재 추적은 시냅스 활동 전위 (그림 3A)의 피크 후 짧은 (&lt;5 밀리 초)과 일치하는 대기 시간에 유발 monosynaptic EPSC의 존재를 검사합니다. 시냅스 연결 쌍 수득되기 전에 대부분의 실험에서 여러 시냅스 후 뉴런 시험된다. 전반적으로, 연접 CA3 세포 ~ 1 / 3의 활성은 시냅스 연결 monosynaptically (도 3a)에 의해 시냅스 CA3 셀에 결합되고, CA3 뉴런의 약 20 %는 모두 유성 6,8 시냅스 연결에 의해 연결된다. 기준선 AMPA 수용체 매개되는 전류의 진폭은 독립적 인 파​​이 사이도 페어링 내에 기록 재판 재판에서 변수이고,빨간색 레코딩 (그림 3...

쌍 기록은 시냅스로 연결된 두 개의 뉴런에서 동시에 전체 세포 패치 클램프 기록으로, 개별 뉴런 사이의 시냅스에 대한 정확한 전기생리학적 및 약리학적 특성화를 가능하게 합니다. 여기에서는 전기생리학을 위한 모든 실험실에서 유기형 해마 절편 배양에서 이 기술을 확립하기 위한 자세한 방법론과 요구 사항에 대해 설명합니다.

해마의 Organotypic 조각의 쌍으로 전체 셀 녹음

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

다음 실험의 전반적인 목표는 뇌의 최소 시냅스 회로에서 전기 생리학을 기록할 수 있는 것입니다. 이것은 플라스틱 배양 삽입물에서 자란 쥐 해마의 유기형 슬라이스 배양으로 만든 녹음에서 달성됩니다. 이 조각은 정교하지만 적절한 시냅스 연결을 만들어 배양 성장 기간 후에 쉽게 기록할 수 있습니다.이 조각에 녹음을 하면 두 개의 뉴런 사이에 만들어진 최소 시냅스 회로의 시냅스 활동을 분리할 수 있으므로 뉴런 회로의 가장 기본적인 특성을 연구할 수 있습니다. 이 방법은 해마에서 시냅스 미세 회로의 기능을 조사하는 데 사용할 수 있지만 인접한 뉴런이 시냅스로 연결된 뇌의 모든 영역에 사용할 수 있습니다. 기록 및 해부 방법의 시각적 시연은 많은 단계가 뇌 랜드마크와 뉴런의 정확한 식별에 의존하기 때문에 매우 중요하며, 두 단계 모두 슬라이스를 만들기 전에 모든 용액과 배양 플레이트를 준비합니다.조각을 모으기 위한 각 큰 접시에는 7개의 작은 접시가 들어 있으며, 각 접시에는 조립하는 동안 배지와 배양 인서트가 있습니다. 공기가 갇히지 않도록 인서트를 매체에 비스듬히 설정합니다. 이 플레이트를 인큐베이터에 보관하고, 구조적 랜드마크를 사용하여 뇌를 탐색하여 손상 없이 P 7 설치류 뇌의 각 절반에서 해마를 조심스럽게 제거합니다.먼저 정중선을 따라 뇌를 나눕니다. 그런 다음 가는 주걱을 사용하여 피질과 중뇌를 분리한다. 뇌를 벗겨내면 해마가 드러납니다.다음으로, 주걱 끝으로 fornix를 자르고 FIA와 해마 아래에서 주걱을 작업합니다. 이제 뇌에서 해마를 굴려 붙여서 붙어있는 조직에서 잘라낸다. 해마를 부드럽게 퍼서 얼음처럼 차가운 해부 매체에 넣습니다.두 번째 해마 채취를 진행합니다. 두 개의 하마 캄피를 자르는 것을 진행하십시오. 촉촉한 두 가지 두께가 늘어선 헬리콥터 블록의 무대에 놓습니다.둘째, 여과지입니다. 그런 다음 슬라이스를 들어 올리지 않고 연속적인 400미크론 가로 슬라이스를 만듭니다. 그 결과는 얇게 썬 빵 한 덩어리와 같습니다.일관된 두께와 부드러운 취급이 핵심입니다. 이제 4번 아티스트의 붓인 부드러운 흰색 세이블을 사용하여 얇게 자른 해마 아래로 브러시를 부드럽게 굴려 무대 밖으로 들어 올립니다. 두 하마 캄피가 옮겨지면 접시를 덮고 세게 휘젓습니다.방향을 자주 바꾸십시오. 목표는 조각을 분리하는 것입니다. 이제 해부 현미경으로 슬라이스를 검사하고 손상되었거나 원하는 것보다 작은 슬라이스를 버리십시

paired-whole-cell-recordings-in-organotypic-hippocampal-slices

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이것은 피라미드 뉴런에서 전기 레코딩을 만드는 목적 organotypic 문화 neocortical 슬라이스 준비를 준비하고 유지하는 프로토콜입니다.

네크로 텍스의 Organotypic 슬라이스 준비에서 전체 셀 녹음

우리는 GABA 활성화된 단일 채널 전류 (GABAA 채널, GABAA 수용체)와 그들이 뉴런의 시냅스 생성과 토닉 전류를 측정하는 패치 - 클램프 기법을 사용합니다. 채널의 활성화는 건강과 질병에의 연결을 흥분을...

랫 뇌 조각의 GABA 활성화된 단일 채널 및 토닉 해류

절연 hippocampi에서 급성 뇌 조각뿐만 아니라 astrocytes와의 뉴런의 동시 electrophysiological 레코딩의...

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

이 비디오는 형질주입된 쥐 해마 뇌 절편에서 시냅스 상호 작용 및 신경 반응을 연구하는 프로토콜을 보여줍니다. 여기에는 활동 전위를 트리거하기 위해 장거리 감각 뉴런을 조명하고 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 기록된 뉴런에서 결과로 발생하는 흥분성 시냅스 후 전위를 기록하는 것이 포함됩니다.

Photostimulation and Whole-Cell Patch Clamp Recordings of Neurons in Mouse Hippocampal Slices

이 비디오는 시냅스 활동을 기록하기 위해 침수실에서 뇌 절편을 설정하는 절차를 보여줍니다. 이 과정에는 렌즈 종이에 슬라이스를 고정하고, 신경 세포의 생존력을 보장하기 위해 인공 뇌척수액(aCSF)의 지속적인 흐름을 유지하고, 관심 있는 특정 뇌 영역과 관련된 자극 및 기록 전극을 정확하게 배치하는 것이 포함됩니다. 이 설정을 통해 기준선 시냅스 활동과 전기 자극의 영향을 정밀하게 모니터링할 수 있습니다.

Recording Neuronal Field Excitatory Postsynaptic Potentials in Acute Hippocampal Slices(급성 해마 절편에서 신경 필드 흥분성 시냅스 후 전위)

우리는 수생 호랑이 도롱뇽 (에서 얇은 망막 조각의 준비를...

양서류 망막 슬라이스 준비 광수와 2 차 신경 세포에서 동시에 전체 세포 녹음

대뇌 피질의 네트워크는 억제의 interneurons의 작지만 다양한 설정에 의해 제어된다. 의 interneurons의 기능 조사 그러므로 표적으로 기록하고 엄격한 확인이 필요합니다. 세포 내 라벨, 사후 형태 학적 및 면역 조직 화학적 분석 신경 세포의 단일 또는 시냅스 결합 쌍에서 전체 셀 녹음을 포함하는 통합 접근 방식은 여기에 설명한다.

Morphologically- 및 Neurochemically 확인 된 해마의 interneurons에서 전체 세포 패치 클램프 녹음

이 프로토콜은 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행하기위한 기본 절차 단계를 설명합니다. 이 기술은 신경 세포의 전기적 동작의 연구를 허용하고, 뇌 조각에서 수행하는 경우, 여전히 상대적으로 잘 보존 된 뇌 회로에 통합되어 신경 세포에서 다양한 신경 기능의 평가를 할 수 있습니다.

뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음

이 프로토콜은 자발적인 날카로운 파도 잔물결 활동을 나타내는 마우스에서 수평 해마 내톨리날 피질 (HEC) 슬라이스의 준비를 설명합니다. 슬라이스는 단순화 된 인터페이스 보유 챔버에서 배양되고 기록은 조직의 산소화와 네트워크 수준의 활동의 자발적출현을 촉진하기 위해 빠르게 흐르는 인공 뇌척수액과 침수 된 조건에서 수행됩니다.

급성 마우스 뇌 슬라이스 자발적인 해 마 네트워크 활동을 조사

우리는 마우스의 등간 중간 해마에서 급성 슬라이스를 준비하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 기록의 품질과 기록 된 뉴런의 형태학적 특징의 보존 측면에서 관상 슬라이스와이 트랜스 버사제 준비를 비교합니다.

성인 마우스의 덴테이트 자이루스에서 전신 기록 및 신경 재건을위한 등산 해마에서 급성 슬라이스의 준비

학습하세요 해마 organotypic 조각에서 쌍으로 전체 셀 패치 클램프 기법을 사용하여 시냅스 연결 뉴런의 전기생리학적 활동을 기록하는 방법입니다. 이 기법은 최소 시냅스 회로의 기능을 연구하는 데 활용됩니다.

해마의 Organotypic 조각의 쌍으로 전체 셀 녹음

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