해마의 Organotypic 조각의 쌍으로 전체 셀 녹음

다음 실험의 전반적인 목표는 뇌의 최소 시냅스 회로에서 전기 생리학을 기록할 수 있는 것입니다. 이것은 플라스틱 배양 삽입물에서 자란 쥐 해마의 유기형 슬라이스 배양으로 만든 녹음에서 달성됩니다. 이 조각은 정교하지만 적절한 시냅스 연결을 만들어 배양 성장 기간 후에 쉽게 기록할 수 있습니다.

이 조각에 녹음을 하면 두 개의 뉴런 사이에 만들어진 최소 시냅스 회로의 시냅스 활동을 분리할 수 있으므로 뉴런 회로의 가장 기본적인 특성을 연구할 수 있습니다. 이 방법은 해마에서 시냅스 미세 회로의 기능을 조사하는 데 사용할 수 있지만 인접한 뉴런이 시냅스로 연결된 뇌의 모든 영역에 사용할 수 있습니다. 기록 및 해부 방법의 시각적 시연은 많은 단계가 뇌 랜드마크와 뉴런의 정확한 식별에 의존하기 때문에 매우 중요하며, 두 단계 모두 슬라이스를 만들기 전에 모든 용액과 배양 플레이트를 준비합니다.

조각을 모으기 위한 각 큰 접시에는 7개의 작은 접시가 들어 있으며, 각 접시에는 조립하는 동안 배지와 배양 인서트가 있습니다. 공기가 갇히지 않도록 인서트를 매체에 비스듬히 설정합니다. 이 플레이트를 인큐베이터에 보관하고, 구조적 랜드마크를 사용하여 뇌를 탐색하여 손상 없이 P 7 설치류 뇌의 각 절반에서 해마를 조심스럽게 제거합니다.

먼저 정중선을 따라 뇌를 나눕니다. 그런 다음 가는 주걱을 사용하여 피질과 중뇌를 분리한다. 뇌를 벗겨내면 해마가 드러납니다.

다음으로, 주걱 끝으로 fornix를 자르고 FIA와 해마 아래에서 주걱을 작업합니다. 이제 뇌에서 해마를 굴려 붙여서 붙어있는 조직에서 잘라낸다. 해마를 부드럽게 퍼서 얼음처럼 차가운 해부 매체에 넣습니다.

두 번째 해마 채취를 진행합니다. 두 개의 하마 캄피를 자르는 것을 진행하십시오. 촉촉한 두 가지 두께가 늘어선 헬리콥터 블록의 무대에 놓습니다.

둘째, 여과지입니다. 그런 다음 슬라이스를 들어 올리지 않고 연속적인 400미크론 가로 슬라이스를 만듭니다. 그 결과는 얇게 썬 빵 한 덩어리와 같습니다.

일관된 두께와 부드러운 취급이 핵심입니다. 이제 4번 아티스트의 붓인 부드러운 흰색 세이블을 사용하여 얇게 자른 해마 아래로 브러시를 부드럽게 굴려 무대 밖으로 들어 올립니다. 두 하마 캄피가 옮겨지면 접시를 덮고 세게 휘젓습니다.

방향을 자주 바꾸십시오. 목표는 조각을 분리하는 것입니다. 이제 해부 현미경으로 슬라이스를 검사하고 손상되었거나 원하는 것보다 작은 슬라이스를 버리십시오.

또한 세포층이 명확하게 보이지 않는 절편은 손상의 표시이므로 버리십시오. 분리되지 않은 조각은 가장자리를 뒤집어 뒤몽 집게로 찌르면 강제로 분리할 수 있습니다. 먼저 피펫을 미디엄으로 채웁니다.

그런 다음 조각을 입구 근처에 유지하면서 부드럽게 빨아냅니다. 가벼운 압력을 사용합니다. 팁에 물방울을 형성하고 조각이 물방울에 가라앉을 때까지 기다립니다.

그런 다음 물방울을 조직 배양 표면에 접촉합니다. 삽입하다. 슬라이스가 인서트에 명확하게 놓이면 피펫을 빼냅니다. 액적이 너무 크지 않으면 세 조각이 하나의 멤브레인에 맞습니다. 삽입하다.

모든 슬라이스가 옮겨지면 목초지 피펫을 사용하여 각 슬라이스 주위의 배지를 부드럽게 흡입합니다. 도금된 인서트에 대한 유체 제거를 수행합니다. 먼저 슬라이스가 가라앉을 수 있는 충분한 시간을 허용합니다.

이제 각 작은 접시를 덮고 큰 접시를 덮고 어셈블리를 배양하십시오. 자른 다음 날 조각을 먹이십시오. 그런 다음 자른 후 3일째에 다시 먹이십시오.

섭씨 34도의 인큐베이터로 옮기고 두 번째 수유 후 5%CO2를 공급한 다음 일주일에 두 번 배양물을 공급합니다. 유기형 슬라이스는 절단 후 1주에서 2주 사이에 기록할 준비가 됩니다. 레코딩 리그에서 배양 인서트의 바닥을 완전히 자르고 메스로 슬라이스 주위를 완전히 잘라 개별 슬라이스를 제거합니다.

dumont 집게로 자른 플라스틱 원을 제거하고 전기생리학 장비의 기록 챔버에 넣습니다. 집게를 사용하여 슬라이스를 기록 챔버로 이동합니다. 이제, 스테이지를 유지하면서 여전히 초점을 맞추고 10 배 및 40 배 배율로 슬라이스 표면을 스캔하여 CA 3 개의 세포체 층을 찾습니다.

표적 세포가 확인되면 기록 챔버에서 대물렌즈와 A CSF 사이의 유체 반월판을 깨뜨리지 않고 대물렌즈를 최대한 들어 올립니다. 그런 다음 대물렌즈 아래에 전체 세포 기록 전극을 놓고 전극이 표적 뉴런과 접촉할 때까지 전극의 끝을 찾기 위해 초점을 맞춥니다. 전극에 이물질이 없도록 전극 내부 용액에 양압을 유지하십시오.

이제 전극이 슬라이스 표면 근처에 올 때까지 전극과 대물렌즈를 함께 내립니다. 그런 다음 전극을 조직 안으로 더 낮추고 표적 뉴런 측면으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 이제 양압을 제거하고 내부 용액을 부드럽게 흡입하여 뉴런의 멤브레인에 기가 옴 밀봉을 만듭니다.

밀봉이 이루어지면 흡입 펄스로 전극 아래의 멤브레인을 방해하거나 하나의 전체 셀 기록으로 증폭기의 커패시턴스를 과도하게 보상합니다. 대물렌즈를 다시 올리고 두 번째 전극을 설정하여 첫 번째 녹음을 방해할 수 있는 움직임을 최소화합니다. 두 번째 전극의 양압을 낮게 유지하십시오.

합리적으로 낮은 유량은 2-3개의 뉴런 거리에서 움직임을 유도합니다. 두 번째 전체 세포 기록이 확립되면 시냅스 전달은 1시간에서 4시간 동안 안정적이어야 합니다. 시냅스 연결성은 시냅스 이전 뉴런을 자극하여 활동 전위를 발화시킨 다음 5밀리초 이내에 시냅스 후 뉴런에서 모노 시냅스 EPC를 보는 것으로 분명합니다.

테스트된 ca three cell의 약 1/3은 활성 연결에 의해 다른 CA three cell에 synaptically 결합된 monos였습니다. AMPA 수용체 매개 전류의 진폭은 하나의 쌍 기록 내에서 시도마다 달랐고 다른 활성 연결에서 달랐습니다. EPC는 10피코암페어 미만 또는 800피코암페어보다 클 수 있습니다.

실패율은 표준 유도 방법을 사용하여 크게 변했습니다. LTP와 LTD는 모두 ca 3에서 ca 3 시냅스에서 안정적으로 유도될 수 있으며, 두 가지 형태의 가소성은 2시간 이상 유지됩니다. polys 시냅스 억제 사건을 기록하는 전체 기간은 CA 3개의 파라메탈 뉴런 쌍 사이에서 자주 관찰되었습니다.

그러나 이러한 사건 사이의 긴 잠복기로 인해 신경 시냅스 전류를 크게 방해하지 않았기 때문에 약리학적으로 차단되지는 않았습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 유기형 해마 절편을 만드는 방법과 이를 사용하여 시냅스로 연결된 뉴런 쌍에서 이중 전체 세포 기록을 만드는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.