Name: 에 상처 응답에 대한 피부 상처에 대한 방법 및 분석 실험 C. 엘레 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 학습하세요 C. elegans 피부 상처 치유 방법으로 미세주사침 및 레이저 조사를 이용한 상처 유도와 칼슘 신호, 액틴 고리 형성을 관찰하는 실험 기법을. 이 방법은 상피 세포의 손상 감지와 반응 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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예쁜꼬마선충에 대한 바늘 상처 방법은 Nathalie Pujol과 Jonathan Ewbank에 의해 처음 개발되었습니다. 원고에 대한 의견을 주신 Nathalie Pujol에게 감사드립니다. 예쁜꼬마선충 표피 상처 치료에 대한 우리 실험실의 연구는 NIH의 A.D.C. 보조금으로 지원됩니다(R01 GM054657).

다음 프로토콜은 C.에 대한 자세한 절차를 설명 엘레 피부 상처와 상처 응답을 분석합니다. 1. 바늘 상처 3,4 <ol><li> 표준 NGM (선충 성장 매체) E.와 함께 접시에 건강한 unstarved 웜 성장 20 ° C 배양기에서 유지 음식으로 대장균 OP50 박테리아,. 참고 : NGM 한천 플레이트와 C의 일상 재배하는 방법 엘레 www.wormbook.org (6)에서 확인할 수있다. </li><li> 20 ° CO / N에서 부상과 문화 전에 갓 시드 플레이트 일일 25 L4 무대 웜을 선택합니다. </li><li> 부상하기 전에 바늘 풀러를 사용하여 모세 혈관에서 바늘을 빼냅니다. 상처에 사용되는 바늘의 C. 마이크로 인젝션에 사용되는 것과 동일하다 엘레. </li><li> 모든 벌레 젊은 성인 단계에 있는지 확인합니다. 약 30 분 동안 얼음에 벌레의 접시를 놓습니다. 냉각 동물 바늘 상처를 용이 부진 할됩니다. <li> 해부 실체 현미경으로 얼음에서 한천 플레이트를 제거합니다. 웜 픽을 사용하여 한천 플레이트의 중심에 25 벌레를 이동합니다. </li><li> 더 쉽게 바늘을 잡고 100 μL 피펫 팁에 바늘을 놓습니다. 생식선을 피하고, 바늘 웜 본체의 전방 또는 후방 부 천공. 일반적으로, 후방 및 전방 인두 생식선 사이 또는 후방 생식소와 항문 사이에 감겨 시도. 재사용 바늘 여러 번, 깨지까지. 주 : 동물에 ~ 5 ~ 10 μm의 침투, 상처가 표피와 피부에 구멍을 간략하게, 부드러운 거시기 있는지 확인. 바늘 ANIM를 입력해야합니다피부 알 대략 직각. 상처는 내부 장기에 손상이 없는지, 또는 신체의 즉각적인 파열의 원인이 안됩니다. 세포질 상처 후 몇 초 스며 나오는 모습을 소량 관찰; 휴대 내용이 장시간에 걸쳐 누출 그러나 동물들은 살아남지 못할 것이다. 최적 영상화, 횡 표피 syncytium (hyp7) 또는 측면 솔기 상처. 참고 :이 절차는 유리 바늘의 사용을 포함한다. </li><li> 웜은 20 ° C에서 다음 실온에서 문화를 복구 할 수 있습니다. 아래에 설명 된 분석의 수에 의하여 바늘 상처의 성공을 판사. 야생형 동물의 95 % 이상은 바늘이 젊은 성인 단계에서 부상 후 24 시간 생존. 유충 세 이상 성인에서 부상의 효과는 아직 광범위하게 분석되지 않았습니다. </li></ol> 2. 레이저 상처 3 보다 정확한 상처를 수행 할 펨토초 레이저 조사 (800 나노 미터)를 사용합니다. <ol><li> 한천 페이지 준비용융 2 % 한천 7 유리 슬라이드에 광고. C. 패드의 라이브 영상을 위해 사용 한천 패드 비슷 확인 엘레. </li><li> 웜 선택과 아가로 오스 패드에 10 젊은 성인 웜을 전송, 12 mM의 levamisole을 용액 2 μL 드롭을 추가합니다. 동물과 커버 슬립와 액체를 커버. 벌레가 마비 1-2 분을 기다립니다. </li><li> 회전 디스크 공 초점 현미경 상으로 유리 슬라이드를 놓습니다. 벌레를 찾아 100X의 목적으로 측면 전방 또는 후방 세포 융합 표피 (NA 1.4-1.46)에 초점을 무대로 이동합니다. </li><li> 140 메가 와트 펨토초 레이저의 파워를 설정 (목적 전에 측정). 80 MHz의 반복율로 펨토초 레이저를 사용한다. 참고 : (20 밀리로 구분) 200 밀리 초 각의 두 펄스가 우리 손에 상처 충분합니다. </li><li> 표피 세포의 꼭대기의 표면에 초점 표피 상처. 세포질 (버블)의 현지 중단, 또는 로컬 표백 O를 관찰사용 된 형광 마커 바. 참고 : 펨토초 레이저를 사용하는 경우 적절한 레이저 안전 절차를 따르십시오. 이러한 두 광자 현미경에서와 펨토초 레이저를 사용하여 라인 또는 포인트 스캔 레이저 상처에 대한 충분한 전력을 제공해야한다. 참고 : 우리는 다른 레이저를 사용하여 직접 경험을하지 않지만, 원칙 상처에 (C. 세포 절제 엘레 간스에서 사용) 기존의 UV 레이저를 사용하여 수 있어야한다. 선택적으로, 표피 (N. 푸욜, 개인 통신) 상처는 디스크 공 초점을 회전에 (FRAP) 모듈을 광표백 후 형광 복구를 사용합니다. </li></ol> 상처에 표피 칼슘 응답 3. 시각화 <ol><li> 유전자 변형 C.를 사용하여 성인 상피 세포 특이 적 프로모터 COL-19 (그림 1A의 제어하에, 표피 (예 : GCaMP 시리즈의 것과 같은) 칼슘 센서를 표현 엘레 균주, 유전자는에 나열되어 있습니다 <stroNG&gt; 표 1). 형질 전환 유전자 발현 수준에 대한 내부 통제 등 tdTomato로 적색 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 유전자를 사용합니다. 참고 : 우리는 표피 tdTomato 형광이 상대적으로 안정적으로 유전자 발현을위한 내부 통제로 tdTomato를 사용하고 GCaMP 영상을 방해하지 않습니다. </li><li> 표피에 트리거 칼슘 상승 부상 바늘과 레이저 모두. 니들 상처 용이 스피닝 디스크 촛점을 수행 할 수 없습니다 그러나, 레이저 상처는 칼슘 응답 (도 1)의 정량 분석을하는 것이 바람직하다. </li><li> 100X의 목적으로 회전 디스크 공 초점 (NA 1.4-1.46) 및 적절한 필터 세트를 사용하여 다차원 획득 모드 (간격 시간 114 밀리 초 여기 레이저 노출 2 초)의 시간 경과 이미지를 획득 (GFP 필터는 GCaMP3에 대해 작동합니다). 참고 : 칼슘 RESP를 검사하는 데 약 2 시간 동안 시간 경과 이미지마다 30 초를 취득긴 시간의 과정을 통해 부상에 온세. </li><li> 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 백그라운드에서 표피 세포 세포질 다섯 중심 다섯 관심있는 (ROI)의 열 동등한 영역에서 평균 GCaMP 형광을 측정한다. </li><li> 그때 부상 전에 배경 5의 ROI 평균을 감산 표피에서의 ROI에서 5 형광의 평균을 기준선 형광 (F 0)을 얻었다. 기준선 [(F T는 -F 0) / F 0]에 대한 변화의 비율 ΔF 형광의 변화를 표현한다. </li></ol> 부상 후 F - 굴지 역학 4. 시각화 <ol><li> 주 : 바늘 상처에 응답하여, 서서히 상처 주위 폐쇄 상처 부위에서 액틴 링을 관찰한다. 이 프로토콜 부 분석법 액틴 링 직경을 측정함으로써 폐쇄 권취. </li><li> 이러한 융합 초파리 moesin 액틴 결합 도메인으로 F - 굴지 마커를 표현하는 유전자 변형 벌레를 생성GFP, 예컨대 (트랜스 juIs352) COL-19 (도 2a)로 표피 특이 적 프로모터의 제어하에 발현. 참고 : 우리는 Lifeact 또는 F-tractin (게시되지 않은 결과)로 도메인 마커 바인딩 다른 액틴을 사용하여 유사한 결과를 얻었다. </li><li> P COL-19- GFP-moesin 유전자 변형 웜에 상처 바늘을 수행합니다. 바늘 상처 후 ~ 5 분으로 상처 부위 주변 GFP-moesin의 반지를 관찰합니다. 액틴 링 직경이 작아지고 결국 야생형 동물 (그림 2A)에 부상 2 ~ 3 시간 게시물을 닫습니다. </li><li> 유리 슬라이드에 2 % 한천 패드를 준비하고 12 mM의 2 μL의 levamisole 용액에 패드 (10) 상에 웜을 전송. 기존의 공 초점 현미경을 사용하여 부상 후 이미지 GFP-moesin 반지 1 시간. 참고 : 사용 공 초점 현미경은 1 시간 부상 후 액틴 링의 Z-스택 (13 X 0.5 μm의)을 취득합니다. </li><li> 부상 후 액틴 링의 직경을 측정한다. 표피 G를 정량하는 방법FP-moesin 먼저 Z 스택의 최대 강도 투사을 다음 4 라인 스캔을 그릴 GFP-moesin 링을 통해 (서로 45 °에서). 링 직경은 4 개의 라인 스캔 (그림 2B)의 피크 거리에 평균 피크로 정의된다. 이미 닫은 반지를 들어, 직경은 0 μm의로 정의된다. 참고 :이 야생형에 상처 봉합 과정을 통해 약 절반 방법이기 때문에 F - 굴지 링 편리 부상 1 시간 게시물을 측정한다. F 액틴 링은 또한 상처 폐쇄 시간 코스를 유도하도록 여러 시점에서 측정 될 수있다. 상처 폐쇄의 시간 경과 영화의 levamisole 고정화 웜을 사용하여 디스크 공 초점 현미경을 회전 얻을 수있다. </li></ol> 표피 항균 펩타이드의 5 분석 유도 참고 : 상처도 C에서 선천성 면역 반응을 유발 엘레 피부. 항균 펩타이드 (AMPS)를 코딩하는 유전자의 전사 산업사입니다표피 uced. NLP-29 (신경 펩타이드와 같은 단백질) AMP 강력 4 명이 부상에 의해 유도된다. 표피 상처 후 AMP 발현을 조절하는 방법을 개별 AMP 사체 레벨을 검출하는 트랜스 제닉 리포터 또는 실시간 PCR을 사용하여 분석한다. <ol><li> 4 명이 부상에 대한 선천성 면역 반응에 대한 유전자 변형 기자 분석. </li><li> 내부 통제로 P의 NLP-29- GFP 및 P COL-12을 DsRed를 포함하는 유전자 변형 기자 frIs7을 표현 성인 동물 (프로토콜 1과) 바늘 상처를 수행합니다. GFP 긴 패스 필터에 어두운 빨간색이나 주황색 unwounded 성인 동물을 관찰한다. 참고 : 상처 야생 형 웜 P의 NLP-29 -GFP 발현을 유도하지만 GFP 긴 패스 조명 아래 오렌지, 노란색 또는 녹색을 표시 벌레 결과, P의 COL-12 -dsRed에 영향을 미치지 않습니다. 이러한 PMK-1 또는 p38 MAPK 경로에서의 유전자의 기능의 상실 nsy-1 차단 NLP-29 -GFP4 명이 부상 후 유도. P의 NLP-29- GFP는 유충 단계에서 높은 수준으로 발현된다 </li><li> 젊은 성인 동물 AMP 유도 분석을 수행합니다. unwounded 제어 동물 GFP의 낮은 수준을 가지고 있는지 확인하십시오. 주 : P-29- NLP GFP 발현은 또한 삼투 스트레스 (8)에 의해 유도되고, 다른 환경 스트레스에 민감 할 수있다. </li><li> 상처 후 6 시간은 GFP 긴 패스 필터와 범위를 해부 형광을 이용하여 P의 NLP-29 -GFP 유도 (그림 3) 9이 웜의 수를 점수. 참고 : 1 시간 후 상처의 P NLP-29- GFP가 눈에 띄게 유도에서, 다음 6 시간 후 - 상처에 대한 피크에 도달하고하면 24 시간 후 상처까지 상승 남아. 시각 득점 4,9에 의해 발현을 정량화. 대안 적으로, 형광 활성화 웜 소터 4를 사용 발현 수준을 정량화. 웜 분류기를 들어, 적어도 50 동물 부상 될 필요가있다. </li><li> ...로서 실시간 PCR 분석AMP 개별 유전자의 전 사체 수준을 ntitating. 여러 유전자 ​​분석 성적 수준 : NLP-29, NLP-30, CNC-1 및 CNC-5. </li><li> 야생형 또는 돌연변이 웜에 상처 바늘을 수행합니다 (프로토콜 1 참조) </li><li> 원하는 시간에 50 명이 부상 웜 및 50 unwounded 웜 (예 : 3, 6, 24 시간) 후 상처를 수집합니다. </li><li> RNA는 제조업체의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 압축을 풉니 다. </li><li> 상업 역전사 효소 키트를 사용하여 총 20 μl의 cDNA의를 얻기 위해 역전사를 수행합니다. </li><li> RT-PCR의 경우, 녹색 형광 및 수퍼 믹스와 0.2 μM 프라이머와 조합하여 각 샘플 0.2 μL의 cDNA (1/40)을 사용한다. RNA의 질을 비교하기 위해 기준으로서 AMA-1 또는 SNB-1 RT-PCR을 사용한다; 내부 통제 (AMA-1 또는 SNB-1)로 정규화하여 AMP 상대적 발현 량을 비교, 또는 규범에 의해 (부상 웜 / unwounded 웜에 AMP 유도) 배 유도 후 상처를 비교내부 통제를 지향 모델. 참고 : CNC-1과 CNC-5는 누구의 전사 10 명이 부상에 의해 활성화되는 가족 항균 펩티드를 caenacin 있습니다. 전형적으로, 바늘 상처가 발현을 유도 (CNC-1 ~ 500 배) 4 시간 10 시간 걸쳐. 출판 작업에 사용되는 프라이머는 표 2에 나열되어 있습니다. </li></ol> 6. 분석 생존 후 부상 <ol><li> 참고 : 칼슘 의존 상처 수리 경로 및 선천성 면역 반응 경로 : 상처는 표피에 적어도 두 개의 독립적 인 신호 전달 경로를 활성화합니다. 두 경로 멸균 상처의 전체 생존을 위해 필요합니다. 돌연변이 또는 RNAi의 치료는 상처 치유에 영향을 미치는 여부를 테스트하기 위해, 24 ~ 48 시간 포스트 상처에서 생존을 측정한다. 선택적으로, 장에 -4,9- 부상의 효과를 결정하기 위해 종래의 수명 세이를 사용한다. </li><li> (젊은 성인 (L4 + 24 시간) 웜에 50 벌레 부상 바늘을 수행, 반복 세비위의 프로토콜 한 다음 RAL 회). 컨트롤과 같은 unwounded 웜의 동등한 수를 유지한다. </li><li> 생존에게 (새로운 한천 판 매 24 시간에 전송 부상 웜) 매 24 시간을 확인합니다. 이러한 GTL-2 또는 사격-1, 정규화 unwounded 제어 동물로 상처 수리에 결함이 돌연변이 체에서 부상 후 50 %의 생존율 ~ 24 시간을 관찰한다. 죽음은 웜의 선택에 의해 접촉하는 전위의 응답의 부족으로 정의된다. </li></ol>

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저자는 경쟁 이해관계를 인식하지 못합니다.

바늘과 레이저 상처 여기 제시된 방법은 손상을 복구하는 표피 상피의 능력을 평가하기위한 보완적인 접근법을 제공한다. 바늘 상처가 표피, 표피 및 내부 가능성 기저막을 방해하는 반면 레이저 상처는 표피에 국한 될 수 비교적 지역화 및 (레이저 구성에 따라)이다. 바늘 상처보다 정확하게 병원균이나 자연 환경에서 기계적 손상에 의해 입은 상처과 유사 할 수 있습니다. 일반적으로, 바늘 상처는 동물의 생존과 호환되는 정확한 상처를 달성하기 위해 더 많은 연습이 필요합니다. 바늘과 레이저 상처 디스플레이 많은 유사점에 대한 세포 반응. 그러나 그것은 액틴 고리 형성이 재현 펨토초 레이저 상처 후에 관찰되지 않는다는 것을 알아야한다. 또한 바늘 기여 웜에 손​​해 내부 조직 : 바늘 구멍의 한계는 정확한 상처되지 않는 것입니다생존 기간은 조사되지 않음. 이 프로토콜의 수정 가능한 사항은보다 정확한 물리적 상처를 수행하기 위해 미세 유체 기반의 미세 주사 시스템 (11)과</su...

피부 상처 치유 메카니즘은 기초 생물학이 관심있는 인간의 건강에 관련된. 척추 동물 및 포유 동물에서 상처 치유가 코디 응답 여러 조직 및 1 시그널링의 복잡한 시리즈를 포함한다. 많은 간단한 유전자 모델 생물은 피부 상처 (2)를 치유 할 수있다. 이는 피부 상처 복구 유전자 취급 용이 모델을 분석하는 것이 흥미 롭다. 우리와 다른 피부 상처에 대한 새로운 모델이 3,4 치유로 예쁜 꼬마 선충을 사용하기 시작했다. 이 프로토콜의 목적은 C.을 사용하는 연구자의 ​​광범위한 세트를 활성화하는 것 도구로 elegans의 표피 상처 치유의 분자 및 세포 메커니즘을 조사합니다. C. 엘레 피부 (피하도라고도 함) 및 표피 세포 외 5 표피를 포함한다. 성인 표피가 가장 큰 k를 syncytium 인 multinucleate syncytia의 소수로부터 형성된다nown으로 hyp7. 표피는 선 단면에 표피를 분비 단순한 상피이다. 피부는 적극적으로 피부를 관통 병원균에 대한 방어 및 작은 상처 (4)를 복구 할 수 있습니다. C.의 상처 수리 엘레 피부 모두 야생형 동물 바늘, 또는 레이저 조사에 의한 로컬 피부 손상에 의한 작은 천공 상처 견딜 수 생존 거의 견고하다. C. 엘레 피부 상처는 표피 선천성 면역 반응, 상처 폐쇄 및 흉터 형성 (4)를 포함하여 응답의 제품군을 트리거합니다. 성인 표피 포스트 - 유사 분열하고, 상처 치유 표피 증식 또는 세포 이동과 반대로 지방 세포 반응을 포함한다. 우리는 피부에 상처가 막 TRPM 채널 GTL-2 및 내부 칼슘 저장 (3)을 필요로하는, 칼슘 2 + 표피에 큰 지속적인 증가를 유발 보여 주었다. 표피 칼슘 신호에서 F - 굴지 고리의 형성과 폐쇄 WO 필요싶게 사이트. 상처를 입는 또한 NLP-29 암페어의 전사를 활성화 선천성 면역 반응을 유도한다. 앰프의 상처에 의한 전사는 TIR-1 표피 4 자율적으로 행동 / PMK-1 P38의 MAP 키나제 캐스케이드에 따라 달라집니다. 중 칼슘 신호 전달 경로 또는 선천성 면역 반응의 결함은 낮은 생존 후 상처로 이어질 것입니다. C.의 비교적 간단한 구조 elegans의 표피, 생체 내 이미징을위한 유전의 취급 용이성 및 장점은 상처 수리의 여러 측면을 연구하기 위해 그것에게 우수한 시스템을 확인합니다. 바늘 상처 및 레이저 상처 : 여기에서 우리는 상처의 두 가지 일반적인 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 바늘 상처는 (바늘 풀러 제외)에는 전문 장비가 필요하지 않으며, 경험 하루에 벌레 수백 수행 할 수 있습니다. 바늘 상처는 한천 플레이트에 성장 동물에서 수행됩니다. 대조적으로, 레이저는 상처에 대해 수행된다 anesthetized 동물 커버 슬립 아래 패드 한천에 장착하고, 손상 세포 반응의 라이브 영상에 적합합니다.

<table><tbody><tr><td>아가로스</td><td>덴빌 사이언티픽</td><td>CA3510-8</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 페트리 플레이트</td><td>Tritech Research</td><td>T3308</td><td>60 mm</td></tr><tr><td>레바미솔</td><td>시그마</td><td>L9756</td><td>12 mM</td></tr><tr><td>보로실리케이트 유리 캐필러리</td><td>월드 정밀 기기</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>니들 풀러</td><td>셔터 기기&nbsp;</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>웜 픽 (백금 와이어)</td> <td>Tritech Research</td><td>PT-9010</td><td></td></tr><tr><td>M9 솔루션</td><td>집에서 만든</td><td></td><td>3g KH2PO4, 6g Na2HPO4, 5g NaCl, 1ml 1M MgSO4, H2O에서 1리터. 고압증기멸균으로 살균</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>50마리의 웜에 500ml 사용</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green</td><td>Bio-Rad</td><td>1708882</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>PCR 기계</td><td>Bio-Rad</td><td>C1000/CFX96</td><td></td></tr><tr><td>96-well PCR 튜브</td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9601</td><td></td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>분자 소자</td><td>변형</td><td></td></tr></tbody></table>

에 상처 응답에 대한 피부 상처에 대한 방법 및 분석 실험 c. 엘레

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

C. elegans의 표피와 표피는 부상으로 인한 국부적 손상을 복구 할 수있는 간단하면서도 정교한 피부 층을 형성한다. 이 모델에 상처 응답 및 수리의 연구는 세포 골격과 조직 손상에 대한 게놈의 답변에 대한 우리의 이해를 조명했다. 두 개의 가장 일반적으로 사용되는 방법을 권취하기 C. 엘레 성인 피부는 미세 주사 바늘 및 지역의 레이저 조사와 거시기 있습니다. 로컬 부상 바늘은 표피, 표피 및 관련 세포 외 매트릭스를 방해하고, 또한 내부 조직에 손상을 줄 수 있습니다. 더 현지화 된 손상에 레이저 조사 결과. 상처는 상승 표피 칼슘 (초 분) 형성과 상처 사이트 (1-2 시간), 항균 펩타이드 유전자의 높은 전사에서 액틴 함유 링의 폐쇄를 포함하여 쉽게 분석 응답의 연속 (2-24 트리거 시간), 흉터 형성. 본질적으로 모든 야생형 성인 동물 여기서 상처 생존상처 수리 또는 다른 응답에 결함이있는 돌연변이로 생존을 감소 보여줍니다. 자세한 바늘과 레이저 상처에 대한 프로토콜 및 정량 상처 응답 및 복구 프로세스 (칼슘 역학, 굴지 역학, 항균 펩타이드 유도, 생존)의 시각화에 대한 분석은되게됩니다.

이러한 GCaMPs 같은 칼슘 센서 (그림 1)과 시각으로 레이저 또는 바늘 상처는 표피 칼슘 수준의 신속하고 지속적인 상승을 트리거합니다. 칼슘 상승 초 이내에 발생하고 수십 분에 대한 높은 남아있다. 재현성 부상 바늘 상처 사이트 (그림 2)에서 F - 굴지 고리의 형성을 초래; 이러한 분 이내에 나타나며, 부상 후 점차 가까이 1-2 이상의 시간. 액틴 링이 적게보다 정확한 레이저 상처 후에 형성된다. 두 바늘과 레이저 상처는 전사 기자 (그림 3)로 검출 표피 항균 펩타이드 등 NLP-29 등 (AMPS)의 발현을 유도한다. AMP 유도는 부상 후 2-4 시간 내에 알 수있다 약 24 시간 지속됩니다. 야생형의 바늘 상처가 크게 (부상 후 24 시간 측정) 생존 또는 수명에 영향을 미치지 않습니다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="always"...

성체 예쁜꼬마선충 피부는 상처 봉합, 흉터 형성 및 선천성 면역을 포함한 상피 상처 반응을 연구하기 위한 다루기 쉬운 모델입니다.

에 상처 응답에 대한 피부 상처에 대한 방법 및 분석 실험 C. 엘레

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

다음 실험의 전반적인 목표는 상처를 입었을 때 우아함을 느끼는 데 사용되는 방법을 보여주고, 상처에 대한 표피 반응을 시각화하는 것입니다. 이것은 미세 주사 바늘의 찌르기로 인한 작은 구멍으로 표피에 상처를 입혀 달성할 수 있습니다. 두 번째 상처 입히기 방법은 레이저 방사선 조사를 사용하는 것입니다.이는 현미경 검사를 위해 장착된 동물에서 수행할 수 있으며 상처 반응을 즉시 이미징할 수 있습니다. 그 결과, 상처는 표피 칼슘의 급격한 상승을 유발하고, 이어서 상처 부위 주위에 액틴 고리가 축적되어 몇 시간 내에 닫히는 상처가 바늘을 치유할 수 있음을 보여줍니다. 그리고 여기에 표시된 레이저 상처 방법은 현재 선충 C Elgan에서 가장 널리 사용되는 피부 상처 방법입니다.이러한 방법은 피부 세포가 손상을 감지하고 반응하는 방법과 같은 상처 신장 분야의 핵심 질문을 해결하는 데 사용됩니다. 어린 성인 벌레가 들어있는 접시를 얼음 위에 약 30 분 동안 놓아 동물의 속도를 늦춥니다. 이 오싹하게 유도된 토르포는 정확한 바늘 상처에 중요합니다.웜은 일반적으로 너무 빨리 움직여서 실체 현미경으로 상처를 입힐 수 없으므로 웜을 보고 곡괭이를 사용하여 모두 플레이트의 중앙으로 이동합니다. 그런 다음 100 마이크로 리터 피펫 팁으로 마이크로 주입에 사용되는 것과 같은 당긴 바늘을 잡습니다. 바늘 홀더로서 바늘 끝을 생식선을 피하고 생식선을 피하고 후방 pH 인두와 내부 생식선 사이 또는 후방 생식선과 직장 사이로 가져갑니다.그런 다음 큐티클에 대략 직각을 추가합니다. 약 5-10미크론을 벌레 안으로 침투하는 짧고 부드럽게 찌르십시오. 이러한 바늘 상처는 장과 같은 내부 장기를 손상시킬 수도 있습니다.잠시 기다렸다가 상처에서 세포 내용물이 새어 나오는 것을 관찰하십시오. 몇 초의 누출은 괜찮지만 그 이상은 상처가 치명적일 것임을 암시합니다. 상처 반응을 영상화하는 것은 상처가 외측 표피 세포융합 또는 외측 이음새에 만들어진 경우 가장 쉬울 것입니다.바늘에 찔릴 때는 크게 찌르는 것보다 작은 구멍을 뚫는 것이 중요합니다. 사다리는 지렁이를 빠르게 죽일 수 있기 때문에 상처 반응을 유도하는 데 필요한 최소한의 손상을 재현 가능하게 유발하는 연습이 필요합니다: 각 동물이 부러지거나 더러워질 때까지 동일한 바늘을 사용하여 상처를 입힙니다. 경험에 비추어 볼 때, 5분 안에 접시에 있는 25마리의 동물을 모두 다치게 하는 것은 매우 실현 가능합니다.이 프로토콜은 회전 디스크 초점 현미경 라인에 부착된 펨토 세그먼트 레이저를 사용하거나 두 개의 사진 현미경과 같은 펨토 펨토초 리터를 사용하는 포인트 스캔을 사용합니다. 그것도 충분해야 합니다. 오거 패드에 10명의 청년을 모으는 것으로 시작하십시오.12 밀리 몰 라일 용액의 2 마이크로 리터 방울로 마비시킵니다. 그런 다음 커버 슬립으로 덮고 마비될 때까지 몇 분 동안 기다립니다. 동물을 완전히 마비시키는 것이 중요합니다.12 밀리 이상은 반응에만 영향을 미치지 않습니다. 그러나, 고정화의 다른 방법도 사용될 수 있다. 펨토초 레이저 출력이 대물렌즈 전에 측정된 대로 140밀리와트로 설정되어 있고 레이저 반복률이 80메가헤르츠인지 확인합니다.이제 표피 세포의 정점 표면에 초점을 맞추고 표적 웜의 측면, 전방 또는 후방 세포융합 표피에 높은 개구수를 가진 100 x 대물렌즈를 사용하여 회전 디스크 컨포칼 현미경 아래에서 웜을 찾습니다. 20밀리초로 분리된 두 개의 200밀리초 펄스에 레이저를 비춥니다. 이것은 표피에 상처를 입히기에 충분해야 합니다.잠시 기다렸다가 거품으로 나타나는 세포질의 국소적 파괴를 관찰하십시오. 형광 마커가 있는 경우 국부적인 표백을 관찰할 수 있습니다. 이 프로토콜은 G Camp three와 같은 표피에서 칼슘 센서를 발현하고 TD 토마토와 같은 적색 형광 단백질을 전이유전자 발현 수준에 대한 내부 대조군으로 발현하는 C elegance를 사용합니다.두 가지 상처 방법 모두 회전 디스크 컨포칼 현미경으로 이를 이미지화하기 위해 칼슘 상승을 트리거하지만, 상처가 2초의 간격 시간과 114밀리초의 여기 및 레이저 노출로 타임 랩스 이미지를 획득한 후 레이저 상처를 사용해야 합니다. 레이저 상처에 사용되는 것과 동일한 배율이 30초 이상마다 2시간 동안 이미지를 촬영할 수 있는 것과 같이 장시간에 적합합니다. 텍스트 프로토콜은 분석 루틴을 제안합니다.이 프로토콜은 바늘 상처 배양 후 call 19와 같은 표피 특이적 프로모터의 제어 하에 F actin marker GFP mosin을 발현하는 웜을 사용합니다. 부상당한 벌레는 섭씨 20도의 인큐베이터에서 한 시간 동안 부상당한 벌레를 관찰한 다음 Zacks를 액틴 링의 이미지 형성으로 데려가 바늘 상처 직후 액틴 역학을 조사하고 부상당한 동물을 슬라이드의 오거 패드로 옮기고 레일로 마취합니다. 그런 다음 기존의 컨포칼 현미경을 사용하여 동물을 이미지화합니다.1-2시간 동안 0.5마이크로미터 간격으로 Zacks를 획득하여 액틴 고리를 측정하고 고리 직경을 정량화합니다. 먼저 Z 스택의 최대 강도 투영을 만들고 GFP MOI와 링에 대해 서로 45도에서 4개의 라인 스캔을 그립니다. 그런 다음 고리의 직경을 닫힌 고리에 대한 4개의 스캔의 평균 피크 토프 거리로 계산합니다.직경은 0 O 레이저 또는 바늘 상처로 정의되며, 칼슘 센서 G 캠프에 의해 시각화된 바와 같이 표피 칼슘 수치의 빠르고 지속적인 상승을 유발합니다. 전방체의 표피의 측면은 표피핵인 X와 N으로 표시된 레이저 상처를 보여줍니다. 칼슘 상승은 상처 부위에서 빠르게 퍼져 나갑니다: 한 상처 부위에서 2040 및 60미크론의 칼슘 수치를 정량화하면 이러한 초기 칼슘 반응 역학을 설명하는 데 도움이 됩니다.칼슘 상승은 수십 분 동안 유지되고 바늘 상처는 안정적으로 유지됩니다. 그 결과 2시간 이내에 상처 부위에서 점차적으로 닫히는 f 액틴 고리가 형성됩니다. 이는 동물에서 P call 19 GFP MOI를 사용하여 시각화되었습니다.이 링은 정밀한 레이저 상처에 의해 생성되는 경우가 적습니다. 액톤 링의 직경은 4개의 라인 스캔을 사용하여 정량화되었습니다. 라인 스캔의 정량화는 액틴 고리가 상처에서 다양한 거리에서 어떻게 다른 강도를 갖는지 보여줍니다. 사이트.이러한 상처 치유 방법의 개발을 통해 연구자들은 선천성 면역 반응 및 상처 봉합을 포함한 상처 복구의 여러 측면에 대한 모델로 바다의 우아함을 활용할 수 있게 되었습니다. 펨토 세그먼트 레이저는 위험하다는 것을 잊지 마십시오. Femto 세그먼트 레이저로 작업하는 모든 사람은 레이저 안전 교육을 이수해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 벌레 표피에 매우 정밀한 부상을 입히는 데 사용되는 레이저 상처 방법을 소개합니다. 샘플 프로토콜은 상처 반응 및 복구에 대한 연구에서 가져온 것입니다.

표피 레이저 상처: 예쁜꼬마선충의 복구 과정을 조사하기 위한 국소 손상 유도

아주 늦은 단계 Drosophila의 배아의 배아 표피 빠른 찔린 상처의 응답 분석을위한 생체 시스템을 제공하고, 포유 동물 모델로 번역 상처 치료에 대한 연구를 진행하기 위하여 유전자 조작 물질 또는 화학 물질 미세 주입 치료와 결합 될 수있다.

미세 주입 상처 분석 및<em&gt; 생체 내</em&gt; 표피의 현지화는 응답 기자의 상처<em&gt; 초파리</em&gt; 태아.

프로토콜은 C에서 산소 결핍 / 기아를 사용하는 설명 허혈 / 재관류를 모델로 엘레. 기능적 결과는 사망률 증가, GFP - 라벨의 연결 과정에서 볼 수 이상 및 신경 세포의 기능을 필요로 장애 행동 반응 (가) 있습니다.

허혈 / 재관류에 대한 산소 결핍 - 기아 모델<em&gt; C. 엘레</em

Mechanobiology 연구에 대 한 새로운 도구 어떻게 기계적 스트레스를 이해 하는 데 필요한 생화학 경로 활성화 하 고 elicits 생물학 응답. 여기, 우리 세포 응답의 고해상도 이미지를 수 있도록 미세 트랩으로 움직이지 동물의 선택적 기계적 자극에 대 한 새로운 방법을 전시.

기계적 자극 및 높은 해상도 C. 선 충 의 이미징에 대 한 마이크로 장치를 사용 하 여

이 원고 방법 절 개 같은 병 변 배양된 상피 세포 monolayers에 편리 하 게 모델 치료 생체 외에서이미징 confocal 의해 상처 또는 레이저 스캔 현미경, 고는 높은 품질을 제공할 수 있습니다. 공부 셀 동작 및 마이그레이션에 관련 된 메커니즘에 대 한 양적 및 질적 데이터입니다.

현미경 기반 방법을 생체 외에서 상처 치유 중 상피 세포 이동의 평가 대 한

우리는 비-침략 적 vivo에서 이미징 프로토콜을 간소 하 고 비용 효율적인, L-012, chemiluminescent luminol 아날로그, 시각화 하 고 계량 상처 excisional 마우스 모델에서 생성 된 반응성 산소 종 (선생님)을 활용 하 여 설명 합니다.

Vivo에서 영상에는 Murine 반응성 산소 종의 상처 모델

여기서, 우리는 1차 섬유아세포를 이용한 시험관내 스크래치 분석및 마우스에서 의 피부 상처 치유 분석실험을 위한 프로토콜을 제시한다. 두 방법 모두 시험관 내 및 생체 내 상처 치유를 평가하는 간단한 방법입니다.

스크래치 마이그레이션 분석 및 등갈 피부 접기 챔버 에서 생체 외 및 상처 치유의 생체 내 분석

여기서, 2개의 뮤린 상처 치유 모델이 기술되고, 하나는 세포 및 사이토카인 상처 치유 반응을 평가하기 위해 고안되고 다른 하나는 상처 폐쇄의 속도를 정량화하도록 설계된다. 이 방법은 가난한 상처 치유의 각종 양상에 의하여 기계장치를 결정하기 위하여 당뇨병과 같은 복잡한 질병 모형으로 이용될 수 있습니다.

등지성 폴리비닐 알코올 스폰지 이식 및 절제 꼬리 피부 상처 모델을 사용하여 급성 상처 치유의 평가.

상처 유발 다중계화는 세포가 세포 손실을 보상하기 위해 분할하는 대신 크기로 성장하는 보존된 조직 수리 전략입니다. 여기에 상피 상처 수리에서 ploidy 및 유전 적 조절을 측정하는 모델로 과일 비행을 사용하는 방법에 대한 자세한 프로토콜입니다.

상처로 인한 다중계를 연구하는 드로소필라 모델

여기서는 전형염색 접근법과 결합된 전 생체 내 인간의 피부를 사용하여 상처 수리를 평가하기 위한 최적화된 기술을 시연합니다. 이 방법론은 잠재적인 상처 치료의 평가를 위한 전임상 플랫폼을 제공합니다.

인간 Ex 생체 내 상처 모델 및 피부 수리를 정확하게 평가하기 위한 전산 염색 접근법

본 논문은 생체 내에서 고해상도로 상처 치유를 위해 살아있는 Clytia hemisphaerica medusa의 상피에 상처를 만드는 방법을 설명 한다. 또한, 상처 치유 동안 상피 세포 및 세포 외 기질의 신호 전달 과정을 교란시키기 위해 염료 및 약물을 도입하는 기술이 제시됩니다.

Cnidarian 모델 유기체 Clytia hemisphaerica를 사용한 생체 내 상피 상처 치유 특성화

학습하세요 C. elegans 피부 상처 치유 방법으로 미세주사침 및 레이저 조사를 이용한 상처 유도와 칼슘 신호, 액틴 고리 형성을 관찰하는 실험 기법을. 이 방법은 상피 세포의 손상 감지와 반응 메커니즘 연구에 활용됩니다.

에 상처 응답에 대한 피부 상처에 대한 방법 및 분석 실험 C. 엘레

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