Nucleofection에 의해 인간의 THP-1 대 식세포의 고효율 형질

이 절차의 전반적인 목표는 세포 생존율이 높고 세포 활성화가 없는 인간 THP one 대식세포를 안정적으로 transfection하는 것입니다. 이는 먼저 THP 1 monocytes를 48시간 동안 사전 분화하여 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 조산 TP one 대식 세포를 분리하는 것입니다.

세 번째 단계는 lonza의 핵 인자 기술을 사용하여 IRNA 또는 플라스미드 DNA로 세포를 transfection하는 것입니다. 마지막 단계는 세포를 다시 씨를 뿌리고 더 분화하는 것입니다. 궁극적으로 성공적인 유전자 knockdown 또는 과발현은 정량적 realtime PCR, 웨스턴 블롯 백 등을 통해 보여줄 수 있습니다.

lipofection과 같은 다른 transfection 접근법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 높은 세포 생존율과 함께 높은 transfection 효율을 달성할 수 있고 microphage의 기능과 거동을 변화시키지 않는다는 것입니다. 불행히도, 이 기술은 이 프로토콜에 대해 한 번에 더 강력한 transfection을 수행할 수 없기 때문에 high sput 애플리케이션에는 적합하지 않습니다. Transfection 24시간 전에 RPMI 1640에서 10% FCS 및 1% pen strep L glutamine으로 THP one 세포를 배양하여 세포를 분할하고 새로운 배지를 제공합니다.

다음 날. 75제곱센티미터 조직 플라스크에 1,000만 개에서 1,500만 개의 세포를 파종하여 보충된 RPMI 배지에 1%비필수 아미노산, 1%피루브산나트륨, 밀리리터당 10나노그램, PMA 및 50마이크로몰 베타 메르캅토에탄올을 48시간 후에 파종하고 배지를 흡인하고 6ml의 아큐테인으로 교체합니다. 하나는 세포를 분리하기 위해 섭씨 37도까지 가열했습니다.

부화하는 동안 30분 동안 배양하십시오. 세포의 핵 애정 후 관리를 위해 충분한 형질주입 배지 및 배양 배지를 준비합니다. 30분 후 셀이 분리되었는지 확인하고 주위를 둘러보십시오.

일부 세포가 여전히 부착되어 있는 경우 마이크로 피펫으로 플라스크를 부드럽게 펌핑하거나 간단한 교반을 사용하여 세포를 분리합니다. 스크레이퍼를 사용하지 마십시오. 현탁액을 15 밀리리터 튜브로 옮기고 300 Gs 및 실온에서 5 분 동안 원심 분리하고 흡인에 의해 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

1ml의 RPMI에서 중간 농도가 섭씨 37도로 예열되고 세포를 계수하고 즉각적인 transfection을 위해 2-250만 개의 세포를 포함하는 마이크로 폐기물 튜브 부분 표본을 만듭니다. 이 프로토콜의 빠른 실행이 필수적입니다. 세포 치사율의 손실을 피하려면 모든 재료를 미리 준비해야 합니다 첫 번째 원심분리기, 모든 형질 주입 분취액을 250GS에서 10분 동안 그리고 회전하는 동안 실온에서 모든 뉴클레오 이펙터 수의사에게 플라스미드 DNA 반 마이크로그램 또는 SI RNA 1마이크로그램을 로드합니다

이제 세포 부분 표본 중 하나에서 상등액을 흡인합니다. 핵 인자 용액에서 세포를 100마이크로리터로 현탁시킵니다. 세포가 용액에 15분 이상 노출되지 않도록 하십시오.

세포를 Q 수의사에게 옮기고 부드럽게 두드려 섞습니다. 그런 다음 모델 2 B 핵 인자에서 프로그램 Y 0 0 1을 사용하여 세포를 transfection합니다. 일회용 피펫을 사용하여 전기천공된 세포를 반응 바이알로 옮기고 즉시 사전 경고된 transfection 배지 반 밀리리터를 세포에 추가합니다.

이제 세포가 모두 형질주입될 때까지 세포의 각 분취액에 대해 하나씩 이 과정을 계속 반복합니다. nucleo affection을 완료한 후, 세포의 각 transfection을 2.5ml의 따뜻한 transfection 배지가 있는 6웰 플레이트의 well로 옮깁니다. 마이크로 피펫으로 각각을 잘 섞습니다.

로드된 모든 플레이트를 4시간 동안 배양한 후 현미경으로 세포의 상태를 확인합니다. 4시간 후, 필요한 경우 대부분의 세포를 플레이트에 부착해야 합니다. 기껏해야 그렇다.

또 다른 한 시간의 배양은 한 번에 하나의 우물에서 충분한 sahe 작업을 제공 할 것입니다. 부착된 세포에서 형질주입 배지를 흡인하고 동일한 부피의 따뜻한 배양 배지로 교체합니다. 이 단계에서 셀을 분리하지 않도록 주의하십시오.

이제 필요한 만큼 세포를 배양합니다. 필요한 경우, 매 48시간마다 배지를 교체하여 transfection된 DNA 또는 RNA가 최대 효과를 발휘할 때 종료되도록 치료 적용 계획을 세웁니다. effector로 세포를 치료할 때는 PMA와 베타 메르캅토에탄올이 없는 무혈청 배지를 사용하십시오.

혈청 없이 세포가 24시간 이상 배양하지 않도록 주의한다. 프로토콜을 사용하여 transfection하고, IRNA 세포 형태를 가진 THP 1 대식세포를 평가했습니다. 유세포 측정에 따름.

세포의 세포사멸 및 괴사 비율은 형질주입 배양과 대조군 배양 모두에서 낮았습니다. 그러나 신중한 집계 결과 형질주입된 샘플에서 세포사멸과 괴사 모두 약간 더 높았음이 밝혀졌습니다. 이는 형질주입된 THP one 대식세포가 UNT 형질주입된 세포보다 플레이트에서 분리하기가 더 어려웠기 때문일 수 있습니다.

전반적으로, transfection rate는 유세포 분석법으로 분석한 바와 같이 90% 이상이었습니다. 형광 S-I-R-N-A를 사용한 형질 주입 효율도 형광 현미경에 의해 확인되었습니다. 형질주입의 기능성은 IL 10 RB 발현의 유전적 넉다운에 의해 입증되었다.

짧은 간섭 RNA를 사용하여 마스터링되면 transfection이 제대로 수행되면 1-1시간 30분 내에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 배양 배지가 성능에 상당한 영향을 미친다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이는 텍스트 프로토콜에 설명되어 있습니다.