아시아 타이거 모기에 Photoperiodic 휴면의 RNA-서열 분석을위한 실험 및 생물 정보학 프로토콜, Aedes albopictus

다음 실험의 전반적인 목표는 사진 주기적 일시정지 반응의 전사 구성 요소를 식별하는 것입니다. 비모델 모기 80년대 엘보우 픽투스(mosquito eighties elbow pictus)에서, 이것은 먼저 다른 주기적인 사진 처리를 통해 분열된 난자와 비분열성 난자의 생물학적으로 복제된 샘플을 생산함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 고처리량 RNA 염기서열분석을 위해 각 복제물에서 RNA를 추출합니다.

그런 다음 RNA 염기서열을 계산적으로 처리하여 콩그로 조립하고 주석을 달게 됩니다. 궁극적으로, diapause 유도 대 non diapause 유도 광 기간에 대한 반응으로 유전자 발현의 변이는 Reeds MAP에서 RNA 어셈블리로 추론 할 수 있습니다. 마이크로레이 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 게놈 염기서열 또는 마이크로어레이와 같은 이전 유전 자원이 diapause 조건에 대한 반응으로 유전자 발현의 전체 추정치를 얻을 필요가 없다는 것입니다.

이 방법은 DPO의 전사 기반이 무엇인지 또는 비모델 유기체의 기타 주요 생태학적 적응과 같은 생태 유전체학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 충분한 양의 diapause 및 non DPO 난자를 얻기 어려울 수 있고 다운스트림 생물정보학 분석이 어려울 수 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 우리는 고처리량 DNA 염기서열분석 기술이 점점 더 저렴해지고 절차를 시작하기 전에 비모델 유기체에서 전체 게놈 발현 프로파일을 얻기 위한 다루기 쉬운 방법을 제공한다는 것을 알게 되었을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었습니다.

최적의 일시정지 표현과 약 80%의 상대 습도를 위해 섭씨 21도에서 프로그래밍 가능한 조명이 있는 두 개의 사진 기간 캐비닛을 설정하고, 한 캐비닛은 16 8개의 밝은 어두운 주기로 비일시정지를 유도하는 사진 기간을 위한 캐비닛을 설정하고, 다른 하나는 두 캐비닛이 사진 기간 사이의 일주기 시간을 동기화하기 위해 조명을 동시에 켠 상태에서 8개의 16 밝은 어두운 주기를 유도합니다. 다음으로, 500ml의 탈이온수에 적절한 수의 계란을 담그고 1ml의 분쇄 개 사료와 소금물 새우 식품 슬러리를 추가합니다. 용기를 메쉬로 덮고 메쉬 주위에 고무 밴드를 두어 제자리에 고정합니다.

그런 다음 약 24 시간 동안 16 8 light dark long day 사진 기간 캐비닛에서 알을 품습니다. 다음날, 그룹당 약 30마리의 부화한 유충을 90ml의 탈이온수로 채워진 10 x 10 x 2cm 페트리 접시 개인에게 옮깁니다. 48-72시간마다 유충을 깨끗한 접시에 옮겨 옮길 때마다 신선한 식품 슬러리를 먹입니다.

약 6일 후, 각 사진 기간 치료를 위해 3-4개의 성체 케이지 바닥에 젖은 여과지를 깔고 여과지에 충분한 탈이온수를 적셔 고인 물을 피하면서 케이지의 국소 습도를 높입니다. 사진 기간, 복제 번호, 케이지 시작 날짜 및 케이지 측면에 있는 영구 마커와 함께 실험과 관련된 기타 정보를 기록하십시오. 그런 다음 격일로 10일 동안 푸이를 물 25밀리리터당 50푸이 이하의 깨끗한 물이 담긴 작은 컵에 옮겨 실험에 적합한 성체 케이지에 넣고 케이지의 상단 메쉬에 유기 건포도를 놓아 출현한 성인에게 설탕을 제공합니다. 첫 번째 혈액 식사 후 4-5일 후에 난자 위치를 자극하기 위해, 질감이 있는 표백되지 않은 종이 타월을 깐 짙은 색의 50ml 컵에 탈이온수를 반쯤 채우고 각 케이지에 한 컵씩 넣어 계란을 수집하고 보관합니다.

각 케이지의 계란 종이를 새 종이로 교체하고 최근에 제거한 종이를 페트리 접시에 넣고 계란 보관에 대한 혼란스러운 영향을 피하기 위해 8개의 16 라이트 다크 쇼트 데이 포토 기간 캐비닛에 보관합니다. 채취 후 약 48시간 후, 난자를 야외에서 건조시켜 축 늘어지고 만졌을 때 약간 축축하되 너무 젖어서 종이가 물로 인해 검어지거나 부화를 자극할 정도로 젖지 않도록 합니다. 일시정지 현상을 측정하려면 각 달걀 종이에 달걀 수를 기록하십시오.

그런 다음 개별 종이를 약 80ml의 탈이온수와 함께 90ml의 페트리 접시에 완전히 담그십시오. 부화를 촉진하기 위해 약 0.25ml의 식품 슬러리를 첨가한 다음 24시간 후에 페트리 접시를 검은색 표면으로 옮깁니다. 이제 한쪽에 광원을 배치하면 유충이 빛에서 멀어지므로 별 유충에서 먼저 개체를 명확하게 계산할 수 있습니다.

개체를 다시 세는 것을 방지하기 위해 계산 후 피펫을 사용하여 각 유충을 제거하십시오. 그런 다음 달걀 종이를 새 페트리 접시에 넣고 빨갛게 말립니다. 일주일 후 부화한 두 번째 알을 세고 난 후, 부화하지 않은 나머지 알과 함께 난자를 새로운 90ml 페트리 접시에 넣고 약 80ml의 새 표백 용액이 종이가 표백 용액에 완전히 잠기도록 주의합니다.

종이를 흄 후드 아래에 하룻밤 동안 두었다가 다음 날 광학 현미경을 사용하여 부화하지 않은 알의 수를 계산합니다. 난자가 배아가 되면 눈은 등쪽에서 서로 마주보는 두 개의 작은 검은색 점으로 나타나는 회백색을 나타냅니다. 먼저 RNA 오염 제거 용액으로 벤치를 조심스럽게 세척하여 잔류 뉴클레아제를 제거하고 RNA 분해를 방지합니다.

다음으로, 낙타 털 브러시를 사용하여 발달 중인 배아가 포함된 최소 400개의 모기 알을 빗질합니다. 유리 그라인더에 대한 관심 지점. 흄 후드에 1ml의 트리올을 넣고 완전히 분쇄될 때까지 계란을 갈아서 트리올에서 RNA 추출을 수행한 다음 제조업체의 지침에 따라 이소프로판올 침전을 수행합니다.

이제 제조업체의 지침에 따라 섭씨 37도에서 30분 동안 50마이크로리터의 반응에서 RNA 최대 10마이크로그램당 최대 1마이크로리터의 Dns를 사용하십시오. 다음으로, 실온에서 5분 동안 5마이크로리터의 부유 DNA 불활화 시약에 반응을 배양합니다. 잠복기 동안 현탁액을 세 번 부드럽게 소용돌이칩니다.

그런 다음 RNA 추출물을 10, 000 번 G에서 1.5 분 동안 원심분리하고 Eloqua, 상등액을 포함하는 RNA는 시퀀싱을 위한 새로운 튜브에 넣습니다. 마지막으로, read, preparation, assembly 및 annotation에서 differential expression analysis에 이르기까지 생성된 차세대 염기서열분석 데이터를 처리하는 방법에 대한 자세한 내용은 함께 제공되는 텍스트를 참조하십시오. 이 첫 번째 그림에서, 두 개의 대표적인 RNA 샘플의 형광 측정법은 약 2000개의 뉴클레오티드에서 두 개의 띠를 보여줍니다.

곤충 28 s 리보솜 RNA는 수소 결합으로 함께 유지되는 두 개의 폴리뉴클레오티드 사슬로 구성되어 있으며, 이는 짧은 가열 또는 수소 결합을 끊는 물질에 의해 쉽게 파괴됩니다. 그 결과 두 가지 구성 요소는 두 번째 RNA 샘플에서 18s 리보솜 RNA와 거의 동일한 크기이며 이 대표적인 실험에서 높은 수준의 분해가 관찰될 수 있습니다. 알보픽투스(albopictus) 모기의 대표 그룹에 대한 사진 주기적 치료는 짧은 낮 사육 모기에서 높은 일시정지 발생과 긴 낮 사육 모기에서 낮은 일시정지 발생을 초래했습니다.

예를 들어, 반복실험 간에 약간의 차이가 있었지만, 짧은 2일차 그룹은 다른 복제물보다 더 낮은 휴면 횟수를 보였습니다. 디지털 방식으로 정규화된 읽기의 Trinity 어셈블리는 평균 conig 길이가 1020 3.1이고 최대 Conti 길이가 20, 892인 76, 377 contigs를 생성했습니다. Conti 길이의 분포는 더 짧은 contigs쪽으로 크게 편향되어 있습니다.

이것은 Denovo 전사체 조립의 전형입니다. 이 마지막 그래프에서, 난자 위치 후 11일과 21일에 휴지 유도 조건에서 사육된 배아의 유사한 워크플로우에서 차등 발현 분석을 통해 이 두 기간 사이에 3,128개의 차등적으로 발현된 유전자가 드러납니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행된다면 조직 생성 신성한 정보학 분석으로부터 6개월에서 8개월 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 다음 단계로 이동하기 전에 각 단계의 성공 여부를 확인해야 한다는 점을 기억해야 합니다. 예를 들어, RNA 무결성을 테스트하기 전에 실험 조건에서 DPA 및 비분뇨 난자가 생성되었는지 확인합니다. 이 절차를 따릅니다. 정량적 R-T-P-C-R 또는 비교 유전체학 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 조직 또는 발달, 관심 유전자의 특정 발현 및/또는 분자 진화 과정에 관한 추가 질문에 답할 수 있습니다.

트리올로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑, 실험실 가운 및 흄 후드 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.