Name: 아시아 타이거 모기에 Photoperiodic 휴면의 RNA-서열 분석을위한 실험 및 생물 정보학 프로토콜, Aedes albopictus (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: 학습하세요 Aedes albopictus 모기의 광주기 휴면 반응에서 유전자 발현 변화를 RNA-Seq와 생물정보학 분석으로 식별하는 방법을. 비모델 생물의 적응 특성 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 5R21AI081041-02와 조지타운 대학교의 지원을 받았습니다.

두 A. 1. 유생 양육 albopictus 그룹은 성인기 <ol><li> 두 최적의 휴면 식 (16)에 대해 21 ° C에서 프로그램 조명 광주 캐비닛과 약 80 %의 상대 습도를 설정합니다. <ol><li> 16L를위한 프로그램 하나 캐비닛 : 8D 등 : 어두운주기 (비 휴면는 LD의 광주를 유도). 8L의 두 번째 캐비닛을 설정합니다 16D 빛 : 어두운주기 (유도 휴면) 13. </li><li> 모두 캐비닛에 동시에 프로그램 &#39;에 조명&#39;photoperiods 사이의 일주기 시간을 동기화합니다. </li></ol></li><li> 실험을 수행하는 데 필요한 계란의 금액을 계산한다. 케이지 당 300 ~ 500 달걀을 목표로하고 있습니다. 세 적어도 휴면 케이지를 복제하고 세 비 휴면 케이지가 RNA 생성에 필요한 복제합니다. 이 실험 당 1,800-3,000 계란을시켜 대략 합계. <ol><li> 약에 탈 H 2 O의 500 ml에 계란 논문을 잠수하여 해치 계란 </li><li> 추가 &lt;EM&gt; 캘리포니아. 지상 개 음식과 소금물 새우로 구성된 1 ml의 음식 슬러리는 이전에 24 설명했다. 메쉬 컨테이너를 커버하고, 고무 밴드와 장소에 메쉬를 유지합니다. </li><li> 약 24 시간 동안 LD의 광주 캐비닛에 넣습니다. </li></ol></li><li> 전송 부화 유충에 10 × 10 × 2cm 페트리 약 90 ml로 채워진 요리 탈 H 2 O <ol><li> 접시 당 약 30 유충을 유지한다. 예를 들어, 매주 월요일, 수요일, 금요일 (MWF) (24) 요리마다 48 ~ 72 시간을 청소하는 유충을 전송합니다. </li><li> 이전으로 탈 이온수에 지상 개 음식과 소금물 새우의 모든 MWF를 구성 피드 약 1 ml의 음식 슬러리 (24)을 설명했다. </li></ol></li><li> 각 케이지는 생물 복제를 포함하는 각각의 광주 처리를 위해 3-4 성인 케이지를 설정합니다. <ol><li> 9.5 L 버킷의 반대편에서 한 10 별 14cm의 구멍을 잘라, 그리고 15cm 직경이 다른 구멍. 공동메쉬와 첫 VER. 정형 스타킹의 약 다리 길이를 절단하고, 다른 구멍의 주위에 내측 일단 접착제. </li><li> 스타킹 오프 매듭 차단의 발 끝을 잘라 - 케이지의 내부에 대한 액세스가 필요한 경우에만 열립니다. 케이지 덮개를 들어, 만 림을 떠나, 내부를 모두 잘라, 메쉬 (24) 내부 플라스틱을 대체합니다. </li><li> 케이지의 측면에 영구 마커 실험에 관련된 번호, 케이지 시작 날짜 및 기타 정보를 복제, 광주를합니다. </li></ol></li><li> 젖은 종이 필터와 성인 케이지의 하단 라인. 종이 필터 (24)에 산란을 자극 할 수있는, 새장 현지 습도를 증가하지만, 고인 물을 피하기 위해 충분히 탈 H 2 O와 여과지를 적 십니다. 필요한 경우, 건조 매일 다시 젖은 여과지를 확인합니다. </li><li> 적어도 100 명의 여성을 포함, RNA 라이브러리에 대한 충분한 계란을 생산 / 9.5 L의 캘리포니아GE, 케이지 당 500 개 이상의 모기와. </li><li> 더 이상 50 번데기 (25) 당 ML의 H 2 O의 밀도로 깨끗한 H 2 O의 작은 컵에 번데기의 MWF과 장소를 수집 성인 케이지에 번데기 컵을 전송합니다. 각각의 광주 캐비닛에 넣어 케이지 - A. albopictus의 번데기는 15 감광 있습니다. </li><li> 죽은 번데기의 축적 대량 사망을 일으킬 수 있기 때문에, 컵에서 H 2 O는 맑고 깨끗한 있는지 매일 확인하고 죽은 번데기를 제거합니다. 모든 번데기가 등장 O 컵 후 H 2를 제거합니다. </li><li> 등장 성인 설탕을 제공하는 케이지의 상단 메쉬 유기농 건포도를 놓습니다. 건포도를 모니터링하고, 금형 축적을 방지하기 위해 모든 3~5일을 변경합니다. </li></ol> 성인 2. 유지 보수 상대와 계란 생산을 허용하는 <ol><li> (섹션에 ì을 습윤 여과지로 케이지 바닥을 안감으로 높은 습도 (약. 80 %)에서 케이지를 유지하고, 전술 한 바와 같이, 비 곰팡이가 핀 건포도에 대한 액세스를 제공기능 1.5 및 1.9). </li></ol> 3. 혈액 공급 <ol><li> 산란은 거의 100 % 휴면 계란 14 시작하기 전에 여성은 적어도 8 모호 짧은 일에 노출되었는지 확인하기 위해 우화 후 2-6일 사이의 혈액 공급 여성을 준비합니다. </li><li> Hemotek 막 먹이 시스템을 준비합니다. 전원 공급 장치에 공급 장치를 연결합니다. 조정 나사를 사용하여 37 ° C에 각 부의 온도를 조절합니다. 교정시 급지 유닛의 온도를 측정하기 위해 전자 온도계 및 프로브를 사용한다. </li><li> 식사 저수지를 준비합니다. 식사 저수지의 구멍을 통해 콜라겐 공급 막의 광장 스트레칭과 O 링으로 고정합니다. 조심스럽게 주름을 제거하기 위해 모서리를 당겨; 가위로 초과 막 트림. 참고 : 콜라겐 멤브레인은 모든 모기 종에 대해 잘 작동하지 않을 수 있습니다, 그리고 작업하는 경우 최적의 멤브레인을 찾기 위해 여러 종류를 시도 할 필요가있다A. 종 이외 albopictus. 파라 필름은 쿨 렉스 pipiens 잘 작동합니다. <ol><li> 혈액을 사용하기 전에 최소한 1 시간 동안 실온에서 동결, 해동 저장되어있는 경우. </li><li> 멤브레인이 아래를 향하도록 용기를 잡고, 지원되지 않는 및 충전 포트는 최대 직면하고있다. 항응고제로서 시트르산 나트륨을 갖는 닭에서 전혈 약 3 ml로 저장조를 채우기 위해 전송 피펫 또는 주사기를 사용한다. 플라스틱 플러그와 충전 포트를 밀봉합니다. </li></ol></li><li> 공급 장치 하단의 열 전달 접시에 스터드에 나사를 조이기에 의해 공급에 준비 저수지를 연결합니다. 모기는 케이지의 메쉬를 통해 공급할 수 있도록 공급 전환과 케이지의 위, 아래로 막면에 놓습니다. 공급을 최대화하기 위해 약 45 분 동안 케이지의 공급을 유지합니다. </li></ol> 4. 산란을 자극 <ol><li> 4 ~ 5 일 컬러 어두운 각 케이지를 장착, 혈액 식사를 게시 50 ㎖의 C표백 종자 발아 용지 (계란 용지) 또는 질감 비 표백 된 종이 타월로 줄 지어 탈 이온수 9 반쯤 채우까지. 250 개 이상의 모기가 케이지에있는 경우, 두 컵을 사용합니다. 참고 : 작은 케이지 또는 단일 여성 병의 경우, 산란 컨테이너에서 &quot;건초 주입은&quot;인해 미생물 식물 (25)의 냄새에 산란을 증가시킬 수있다. </li></ol> 5. 수집 및 저장 계란 <ol><li> 계란 생산은 일반적으로 다음 주에 걸쳐 진정 후 오일 혈액 공급 후 약 봉우리, 그리고 있기 때문에 혈액 공급 4 ~ 5 일 이내에 달걀 수집을 개시합니다. </li><li> 실험의 필요성에 달걀 수집 주파수를 다양합니다. 일반 목적을 위해, MWF 일정에 계란 서류를 수집합니다. 각 케이지에서 계란 서류를 제거하고 새 용지로 교체합니다. 계란 저장의 혼란 효과를 방지하기 위해 SD의 광주 캐비닛의 배양 접시와 저장소에 최근에 제거 서류를 놓습니다. </li><li> 계란 논문을 다시 허용<html> 계란 건조에 저항 (26)을 증가 장막 표피 형성을 허용하는 후 산란 2 일간 젖은 주. </li><li> 약 48 시간 게시물 수집, 야외에서 건조 계란. 이 논문은 H 2 O에서 어두운 또는 계란의 부화 자극하는 너무 젖은 다리를 저는 터치에 물기가 약간 있지만되도록 용지를 건조. 참고 : 6.5 &quot;× 4&quot;종이 건조하는 데 약 3.5 시간이 걸릴 수 있습니다. 이 계란 건조로 (27)가 발생합니다으로, 끝나지 건조 계란 논문에주의해야합니다. </li><li> LD와 SD 두 photoperiods에서 예약 추가 계란 휴면 발생률을 평가하고 (휴면 측정 제 6 장 참조) photoperiodic 효과를 해석합니다. </li><li> 장기 저장을 위해 21 ° C에서 계란 논문을 유지하고 페트리 접시에 약 80 % 습도. 배아 발달는 21 ° C에서 4~5일 사용되기 때문에 지역의 습도를 유지하기 위해 물을 플라스크와 유리 섬유 복합 재질의 저장 용기에서 배양 접시를 유지합니다. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 6. 휴면 부각 측정 <ol><li> 추가 예약 배아 휴면 응답을 정량화하기 7-20일 나이 (산란, 4 장을 자극 참조)를 사용합니다. </li><li> 각 계란 종이에있는 계란의 수를 기록한다. </li><li> 완전히 약 80 ml의 탈 H 2 O와 함께 90 ml의 배양 접시에서 개별 계란 논문을 잠수하여 부화 달걀을 자극 약 0.25 ml의 음식 슬러리를 추가합니다. </li><li> 24 시간 후에 부화 첫번째 령 유충의 수를 집계. 애벌레를 시각화하고 접시의 한면에 광원을 배치하는 검은 색 표면에 페트리 접시를 놓습니다. 유충은 각각의 애벌레의 명확한 집계를 허용, 광원으로부터 멀리 이동합니다. 개별 유충을 열거 방지하기 위해 계산하는 동안 피펫 개별 유충을 제거합니다. </li><li> 새로운 배양 접시 및 재 건조에 넣어 달걀 논문입니다. 다시 해치 계란은 다시 1 ~ 일주일 후 위의 방법을 사용하여 부화 달걀을 집계. </li><li> 나머지 U와 장소 달걀 논문<html> 약 80 ml의 표백 액 28 ml의 90 새로운 배양 접시에 달걀을 N-화. 계란 논문이 완전히 표백 용액에 침수되어 있는지 확인하고 표백제 냄새를 방지하기 위해 흄 후드하에 밤새 둡니다. 주 : 표백 용액을 39 ° C에서 1 주간 ~ 저장 될 수 있지만, 그렇지 않은 신선한 이루어져야한다. </li><li> 융모막을 취소하고 발육, 취소 부화 달걀의 시각화를 허용 할 표백 광학 현미경을 이용하여 계란을 검사합니다. 난자가 발육 경우, 계란 등의 측면에서 서로 반대 두 개의 작은 검은 점으로 나타나는 눈 오프 화이트 색상이있을 것이다. 해칭되지 않은, 유정란 13의 수를 집계. </li><li> 없음 = %의 휴면 다음 식에 휴면 발생률을 결정합니다. 인간 백신 않은 부화 달걀 / (NO. 부화 달걀 + NO. 인간 백신 않은 부화 계란) (100) (13) X. </li></ol> 계란 / pharate 애벌레 7. RNA 추출 &quot;ontent&gt; 참고 : 층류 후드에서 사용 트리 졸. <ol><li> 낙타 털 브러시를 사용하여 유리 분쇄기에 달걀 논문에서 별개의 개발 시점에서 개발 배아 또는 pharate 유충을 포함하는 브러시 모기 계란. 완전히 분쇄 될 때까지 트리 졸에서 계란 (조직의 50 ~ 100 mg의 당 1 ml)에 갈기. 충분한 RNA를 생성하는 라이브러리 당 적어도 400 알을 사용합니다. <ol><li> 또한, 액체 질소에 동결 계란을 스냅 트리 졸 분쇄하기 전에 한 달까지를위한 마이크로 원심 튜브에서 -80 ° C에 저장됩니다. </li></ol></li><li> 트리 졸에 RNA 추출을 수행은 제조업체의 지시에 따라 이소프로판올 침전 하였다. </li><li> RNA 저하를 방지하기 위해 잔류 클레아 제를 제거하는 RNase 오염 제거 용액 또는 다른 에이전트와 벤치를 처리합니다. <ol><li> DNase의와 추출 된 RNA를 취급합니다. 제조업체의 지시에 따라, 37 ° C에서 30 분 동안의 DNase와 RNA 샘플을 배양한다. 1 #을 사용하여181; 50 μL 반응에서 RNA의 최대 10 μg의에 대한 리터의 DNase. 하나의 반응으로 RNA의 10 μg의가있는 경우의 DNase의 양을 늘립니다. </li><li> 5 μL 현탁 DNase의 불활 화 시약을 첨가하여 DNase의 불활. 잠복기 (부드러운 와동) 중 세 번을 혼합, 실온에서 5 분 품어. </li><li> 1.5 분 동안 10,000 XG에 원심 분리기. 후속 단계에 대한 신선한 튜브로 처리 된 RNA 샘플을 포함하는 상층 액을 전송합니다. </li></ol></li><li> 형광 측정에 의해 총 RNA 샘플의 품질을 평가. 이 작업에 대한 적절한 장비와 전문 시설로 샘플을 보낼 수 있습니다. 시설은 칩에 주입 형광 색소로 가시화 샘플 RNA 종의 크기를 결정하기 위해 온 - 칩 전기 영동을 수행한다. 결과는 electropherogram로 반환됩니다. <ol><li> 프리젠 O를 보면 알 수있는 바와 같이, 존재 또는 분해 생성물의 유무에 의해 총 RNA 샘플들의 무결성을 결정결과 electropherogram (그림 1B)의 18S와 5S 리보솜 RNA의 피크 사이의 F 봉우리. </li></ol></li></ol> 8. RNA 시퀀싱 <ol><li> 표준 프로토콜 다음 농축 쌍 엔드 mRNA의 라이브러리와 mRNA의 염기 서열의 건설을위한 상업 시퀀싱 센터에 충분히 높은 품질 (그림 1A)과 양 (라이브러리 당 보통&gt; 3 μg의)와 함께 총 RNA 샘플을 보낼 수 있습니다. </li><li> 둘 이상의 레인 하나를 시퀀싱 실험에 사용되는 경우, 시퀀스 동안 레인 기술 중 변동을 고려하여 시퀀싱 개의 레인으로 개인 라이브러리를 분할. </li></ol> 9. lllumina 읽기 청소 참고 : 그림 2는이 프로토콜의 생물 정보학 부분을 요약 한 것입니다. 이 프로토콜의 생물 정보학 섹션에 사용 된 모든 프로그램과 자료의 전체 목록은 표 1을 참조하십시오.에또한, 보조 파일 (1)는 다음과 같은 생물 정보학 프로토콜의 각 단계의 명령 줄 예제가 들어 있습니다. <ol><li> NCBI UniVec 코어 데이터베이스에 95 % 이상의 신원을 식별하기 위해 일치 ssaha2 29 (표 1)을 사용하여 (표 1), A. albopictus rRNA 유전자 서열 (GenBank 등록 번호의 L22060.1), 시퀀싱 어댑터 (보충 파일 1에서 제공하는 상세한 명령 줄 예제). 제공되는 Perl 스크립트 (보충 파일 2)를 적용하여, 예를 들어 펄을 사용하여 일치 또는 유사한 스크립트 도구와 읽기 쌍을 제거합니다. </li><li> 나머지 청소 SolexaQA 패키지 (30)와 읽기 (표 1, 보충 파일 1) : DynamicTrim.pl의 기본 설정을 사용하여 20 미만의 phred 점수 동등한 영역을 트림. <ol><li> 제거는 앞으로 모두 LengthSort.pl와보다 짧은 25 BP를 읽고 역을 동시에 읽습니다. FastQC (표 1 fastq 세정 파일의 품질을 평가 </st룽&gt;) - 특히, 당 염기 서열의 품질과 당 서열 품질 평가 점수가 20 위에 있는지 확인합니다. </li></ol></li></ol> 10. 디지털 정규화 <ol><li> K-메르 크기 20, 20의 범위 차단하고, X를 사용 (특히 normalize-by-median.py, (보충 파일 1 표 1) 크메르 도구 (31)를 사용하여 읽어 청소에 디지털 정상화 한 라운드를 수행 = 1E10). </li><li> 높은 RAM을 가진 기계를 사용할 수 (GB를 수백) 인 경우 또는, 삼위 일체의 normalize_by_kmer_coverage.pl 스크립트 (표 1)를 사용합니다. </li></ol> 11. 드 노보 사체 조립 <ol><li> 어셈블리의 크기에 따라, RAM의 최대 256 기가 24 CPU가있는 컴퓨터 또는 컴퓨터 클러스터에 대한 액세스 권한을 획득 할 수 있습니다. </li><li> 콘티로 설정 디지털 표준화 된 읽기를 조립; 삼위 일체 (32) (보충 파일 1 표 1)를 사용합니다. 줄이기 위해메모리 사용, --min_kmer_cov 2를 사용합니다. </li></ol> 12. 조립 평가 <ol><li> 삼위 일체 인접 출력에 Assemblathon2 프로젝트 (33)로부터 assemblathon_stats.pl를 실행합니다. (; 기업 파일 1 표 1)이 스크립트는 비계의 개수, N50, 어셈블리 조성물 등과 같은 조립 품질 평가에 관련된 기본적인 계산을 수행한다. </li></ol> 조립 사체 13. 주석 <ol><li> 기준 집합에 대해 단백질의 조립체 BLASTX (표 1)을 수행; 모기, 초파리,과 아노 펠 레스 gambiae, (Culex pipiens), 큘 및 Aedes aegypti 적합한 참조이다. 특히, BLASTX (보충 파일 1) 다음에 폭발에 대한 기준 단백질 FASTA 파일을 포맷합니다. </li></ol> (14)지도 RSEM (34)를 사용하여 총회에 읽습니다 (표 1) <ol><li> &#39;성적 증명서 - 투 - 유전자지도&#39;파일을 생성하는에첫 번째 열은 참조 유전자 ID 및 두 번째 열에 인접 ID를 포함합니다. 스프레드 편집기에서 BLASTX 출력으로부터 제 1 및 제 2 열을 교환하고,이 .txt 파일에 이러한 열 물품. 유닉스 형식으로 결과 .txt 파일에 줄 바꿈을 변환 할 LINEBREAK 프로그램을 사용하십시오. </li><li> RSEM 패키지 (보조 파일 1)에서 제공하는 rsem-준비 참조 스크립트를 사용하여 사체의 FASTA 파일에서 참조 데이터 집합을 만듭니다. </li><li> RSEM 패키지 (보조 파일 1)에 구비 rsem 계산할 표현식 명령을 이용하여 각각의 라이브러리에 대해 개별적 식 값을 계산한다. 읽을 때, 읽기 세척 단계 (단계 9.2)으로 인한 fastq 쌍 파일을 사용합니다. <ol><li> 생체로부터 RNA 복제가 시퀀싱 개의 레인으로 분리 된 경우, 하나의 파일을 생성하는 연산 식 모두 fastq 파일을 포함한다. </li></ol></li><li> 쉽게 다른 페이지에서 처리 행렬에 각 도서관에서 발현 결과를 변환RSEM 패키지 (보조 파일 1)에 설치된 설치 스크립트 rsem - 생성 - 매트릭스 데이터를 사용 rograms. </li></ol> 15. 차등 발현 분석 <ol><li> R 및 에저 (표 1)를 설치합니다. </li><li> 단계 14.3 (보충 파일 1)에서 RSEM 결과를로드 할 수 read.delim를 사용합니다. 필요한 경우, 가장 가까운 정수로 반올림 카운트. 참고 : EDGER 가이드는 중요성을 감지 충분히 높은 발현과 유전자 데이터 집합을 제한하는 것이 좋습니다. </li><li> EDGER에 대한 데이터 서식을 지정하려면로드 된 데이터 파일 (보충 파일 1)에서 DGEList 객체를 생성합니다. 이어서, TMM 정규화 (보조 파일 1)를 사용하여 데이터를 정상화. 데이터 (보충 파일 1)의 공통 및 tagwise 분산을 추정합니다. </li><li> Benjamini - 호흐 베르크로 발현 된 유전자를 확인하고 p- 값 &lt;0.05 (보충 파일 1) 수정. 풍부한 대 로그 배 변화 (보충 파일 1)의 분포를 그린다. </li></ol>

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이 프로토콜은 A의 유도 휴면를 photoperiodically로 인해 발현 된 유전자를 발견하는 방법을 제시한다 albopictus. photoperiodic 휴면 응답에 초점을 사람들을 위해 특히 - 프로토콜은 고유 초보 사용자가 액세스 할 수있는 분자 생리학 프로그램의 모든 실험적인 측면을 만들기 위해 모기 양육과 생물 정보학 기술을 결합한다는 점에서 중요하다. 양육 실수를 파악하는 것이 필요 - - 기존의 방법은, 우리의 지식, 양육 프로토콜의 많은 세부 사항을 제공하지 않으며 하류 성공적인 생물 정보학 분석을 가능하게 할 것이다 양육 단계에서 실험 설계에 대한 통찰력을 제공 할 수. 여기에 제시된 방법은 A.에 최적화 된 albopictus, 특히 일반적으로 다음 한 실험실 세대로부터 6 주가 걸릴 양육 방법. 그러나, 미래의 응용 프로그램에서이 방법은 겸손으로 적용 할 수 있습니다photoperiodic 휴면 (23)을 나타내는 다른...

NGS(Next-Generation Sequencing) 기술의 급속한 발전은 다양한 비모델 유기체 1-3에서 유전적으로 복잡한 생태학적 적응의 분자적 토대를 조사할 수 있는 흥미로운 기회를 제공하고 있습니다. 이 접근 방식은 농업 해충 및 질병 매개체와 같은 실질적인 우려 유기체뿐만 아니라 특히 흥미롭거나 잘 설명된 생태학 또는 진화 역사를 가진 유기체에 대한 개체군 및 기능 유전체학 연구의 기초를 구축하기 때문에 매우 강력합니다. 따라서 NGS 기술은 생태학 분야의 급속한 발전으로 이어지고 있으며 급격한 현대 기후 변화4에 대한 생물학적 반응의 기계론적 기반 이해4, 침입종의 확산5 및 숙주-병원체 상호 작용6,7과 같은 문제를 해결할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
생태학 및 진화 생물학의 기본 및 응용 질문을 해결하기 위한 NGS 기술의 놀라운 잠재력은 부분적으로 이러한 접근 방식이 대부분의 연구 실험실에서 실현 가능한 적당한 비용으로 모든 유기체에 적용될 수 있다는 사실에 기인합니다. 또한 이러한 접근 방식은 마이크로어레이 칩이나 완전한 게놈 염기서열과 같은 선험적 유전 자원이 필요하지 않고 게놈 전체 정보를 제공합니다. 그럼에도 불구하고 NGS 실험의 생산성을 극대화하려면 RNA 샘플링의 발달 시기 및 조직 특이성과 같은 문제를 포함하여 실험 설계를 신중하게 고려해야 합니다. 또한 이러한 실험에서 생성된 방대한 양의 데이터(종종 최대 수억 개의 DNA 염기서열 판독)를 분석하는 데 필요한 기술적 능력은 특히 어려운 과제였으며 NGS 접근 방식의 광범위한 구현을 제한했습니다.
 의학적으로 중요한 침습성 모기인 Aedes albopictus의 일시정지(diapause)의 전사 염기에 대한 최근의 RNA-Seq 연구는 비모델 유기체8–10에서 복잡한 생태학적 적응의 분자적 기초를 연구하는 데 NGS 기술을 성공적으로 적용하기 위해 사용할 수 있는 몇 가지 실험 프로토콜의 유용한 예를 제공합니다. A. albopictus는 아시아가 원산지이지만 최근에는 북미, 남미, 유럽 및 아프리카에 침입한 매우 침입적인 종입니다11,12. 많은 온대 곤충과 마찬가지로 A. albopictus의 온대 개체군은 광주기적 휴면기라고 하는 일종의 휴면기에 들어가 겨울을 통해 생존합니다. A. albopictus에서 번데기와 성인 암컷을 짧은(가을) 낮 길이에 노출시키면 발생학적 발달이 완료되는 일시정지 알이 생성되지만 알의 융모막 내부에 있는 pharate 유충은 발달 정지에 들어가 알이 부화 자극에 불응하게 만듭니다15-17. diapause 난자는 건조에 더 강하고, 5,18 non-diapause 난자보다 더 많은 총 지질을 함유하고 있다19. 따라서 A. albopictus의 광주기적 일시경은 온대 환경에서 겨울의 혹독한 조건에서 살아남는 데 필수적인 모계가 조절하는 적응 표현형 가소성입니다. 광범위한 곤충20,21에서 광주기적 일시정지의 잘 알려진 생태학적 중요성에도 불구하고, 이 중요한 적응의 분자 기초는 어떤 곤충에서도 잘 특성화되지 않았습니다22. 파레이트 유충 단계에서 배아 휴지기를 겪는 A. albopictus와 같은 유기체의 경우, 어미가 받은 광주기 신호가 어떻게 자손에게 전달되고 배아 발달 과정을 통해 지속되어 파레이트 유충 단계에서 정지를 일으키는지 이해하는 것은 특히 설득력 있는 과제로 남아 있습니다.
이 프로토콜은 A. albopictus에서 광주기적 일시정지의 전사 성분을 밝히기 위해 수행되는 NGS 실험(전사체 염기서열분석)을 위한 모기 사육, 실험 설계 및 생물정보학 분석을 설명합니다. 이 프로토콜은 A. albopictus의 일시정지에 대한 추가 연구에 사용할 수 있고, 알 일시정지를 겪는 다른 에딘 모기와 같이 밀접하게 관련된 다른 종의 일시정지를 조사하는 데 적용할 수 있으며,23 또한 모든 곤충에서 복잡한 적응의 전사 염기를 연구하기 위해 NGS 접근법을 사용하는 것과 더 일반적으로 관련이 있습니다.

<table><tbody><tr><td>인큐베이터 - 모델 818</td><td>Thermo-Scientific</td><td>3751</td><td>120 V</td></tr><tr><td>제어 환경실</td><td>Thermax Scientific</td><td>N/A</td><td>Thermax Scientific Products의 맞춤형 사양에 따라 제작된 워크인 제어 환경실. 인큐베이터에 대한 더 큰 대안. http://thermmax.com/</td></tr> <tr><td>Cool 형광등 전구</td><td>Philips</td><td>392183</td><td>4 W</td></tr><tr><td>페트리 접시 100 mm x 20 mm</td><td>Fisher</td><td>08-772-E</td><td></td></tr><tr><td>여과지 20.5 cm</td><td>Fisher</td><td>09-803-6J</td><td></td></tr><tr><td>9.5 L 양동이</td><td>Plastican</td><td>Bway 제품</td><td>http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117</td></tr><tr><td>유틸리티 패브릭 모기장 화이트</td><td>조앤</td><td>10173292</td><td>http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html</td></tr><tr><td>정형 외과 스타킹</td><td>Albahealth</td><td>23650-040</td><td>제품 번호 081420</td></tr><tr><td>유기농 건포도</td><td>Newman 's Own</td><td>UPC: 884284040255</td><td></td></tr><tr><td>산란 컵 (갈색)</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-007-52</td><td>이 제품은 실제로 우리가 상단을 본 호박색 125ml 병입니다.</td></tr><tr><td>재활용 종이 타월</td><td>7세대</td><td>30BPT120</td><td></td></tr><tr><td>모듈식 메이트 스퀘어 타파웨어 세트</td><td>터파웨어</td><td></td><td>http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items</td></tr><tr><td>유리 그라인더</td><td>Corning Incorporated</td><td>7727-2</td><td>이 Tenbroeck 티슈 그라인더는 계란을 깨고 RNA를 TRI 시약으로 방출합니다.</td></tr><tr><td>TRI 시약</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9424</td><td>조직 50-100mg당 1ml TRI 시약을 도포합니다. 주의 &#8212; 이 시약은 독성이 있습니다.</td></tr><tr><td>TURBO DNA-free</td><td>Ambion/Life Technologies</td><td>AM1907</td><td>이 키트는 페놀/클로로포름 세척에 이어 기존의 DNase 처리보다 수율이 높으며 사용이 더 간단합니다.</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion/Life Technologies</td><td>AM9782</td><td>벤치 표면 및 RNA 샘플과 접촉할 수 있는 모든 장비에 자유롭게 도포합니다. 이 용액은 경알칼리성/부식성이며 자극을 유발할 수 있으며 삼키면 유해합니다.</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td>하나의 칩에 최대 12개의 RNA 시료를 배치할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Hemotek 멤브레인 피더</td><td>Hemotek&nbsp;</td><td>5W1</td><td>이 시스템은 동시에 사용할 수 있는 5개의 급전 스테이션을 제공합니다. PS5 전원 장치 및 전원 코드 포함; 5 FUI 피더 + 식사 저장통 및 O-링; 플라스틱 플러그, Hemotek 콜라겐 공급 멤브레인; 온도 설정 도구; 및 플러그 추출 도구. 회사의 우편 주소는 Hemotek Ltd입니다. 유닛 5 유니온 코트; 앨런 램스바텀 웨이; 그레이트 하우드; 영국 랭커셔; BB6 7FD; 전화: +44 1254 889 307.</td></tr><tr><td>디지털 온도계 및 프로브</td><td>Hemotek&nbsp;</td><td>MT3KFU</td><td>MicroT3 온도계 및 KFU 프로브. 이것은 각 FUI 공급 장치의 온도를 설정하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Sodium Citrate</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>33130-1</td>이 함유된 비멸균 닭 전혈 <td>500ml의 혈액은 -80 &#176에서 20ml 분수액에 냉동 보관되었습니다; C는 최대 1 년. 사용하기 전에 최소 1시간 동안 실온에서 혈액을 해동하십시오.</td></tr></tbody></table>

아시아 타이거 모기에 photoperiodic 휴면의 rna-서열 분석을위한 실험 및 생물 정보학 프로토콜, aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

광주기적 일시중지는 개인이 일련의 생리적 변화, 특히 발달 정지 및 신진대사 감소를 통해 혹독한 계절 환경에서 벗어날 수 있도록 하는 중요한 적응입니다. RNA-Seq를 통한 글로벌 유전자 발현 프로파일링은 광주기적 일시정지의 전사 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 아시아 호랑이 모기(Aedes albopictus)는 사육이 용이하고 쉽게 유도되는 휴지기 및 이용 가능한 게놈 자원으로 인해 휴직의 전사 염기를 연구하는 데 뛰어난 유기체입니다. 이 원고는 A. albopictus에서 diapause-induced transcriptional differences를 확인하기 위한 일반적인 실험 워크플로우를 제시합니다. 사육 기술, 휴기정지 및 비휴기 발달을 유도하는 데 필요한 조건, 개체군의 휴지기 비율을 추정하는 방법, 모기에 대한 RNA 추출 및 무결성 평가가 문서화되어 있습니다. Illumina 염기서열분석기의 RNA-Seq 데이터를 처리하는 워크플로우는 차등적으로 발현된 유전자 목록에서 마무리됩니다. 대표적인 결과는 이 프로토콜이 광주기적 차이로 인해 A. albopictus의 전사 수준에서 차등적으로 조절되는 유전자를 효과적으로 식별하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. 약간의 조정으로 이 워크플로우는 다른 모기의 일시정지 또는 기타 중요한 생활사 특성의 전사 기반을 연구하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다.

두 대표 RNA 샘플의 형광 측정 (그림 1A, B) NT 약 2,000 개의 밴드를 보여 주었다. 곤충, 28S 리보솜 RNA 쉽게 간단한 가열 또는 수소 결합을 방해 35 에이전트 파쇄되어 수소 결합에 의해 함께 유지 개의 폴리 뉴클레오티드 사슬로 구성된다. 생성 된 두 성분은 약 18S 리보솜 RNA와 같은 크기이다. 두 번째 RNA 샘플은 저하 높은 수준의 (그림 1B)를 보여 주었다. A.의 대표 그룹의 Photoperiodic 치료 반복 실험 중 몇 가지 변화 (표 2)이 있었지만 albopictus 모기, 긴 하루 양육 모기 짧은 - 일 - 양육 모기 높은 휴면 발생률, 낮은 휴면 부각 결과. 예를 들어, SD2 나머지 복제물보다 낮은 (80 %) 휴면 발생률 (- 97.67 % 87.18 %)을 나타내...

RNA-Seq 분석은 비모델 유기체에서 적응 형질의 분자 토대를 식별하는 데 점점 더 중요해지고 있습니다. 여기에서는 모기 사육에서 RNA 염기서열 분석 및 RNA-Seq 데이터의 생물정보학 분석에 이르기까지 diapause와 non-diapause Aedes albopictus 모기 사이에 차등적으로 발현된 유전자를 식별하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

아시아 타이거 모기에 Photoperiodic 휴면의 RNA-서열 분석을위한 실험 및 생물 정보학 프로토콜, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

다음 실험의 전반적인 목표는 사진 주기적 일시정지 반응의 전사 구성 요소를 식별하는 것입니다. 비모델 모기 80년대 엘보우 픽투스(mosquito eighties elbow pictus)에서, 이것은 먼저 다른 주기적인 사진 처리를 통해 분열된 난자와 비분열성 난자의 생물학적으로 복제된 샘플을 생산함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 고처리량 RNA 염기서열분석을 위해 각 복제물에서 RNA를 추출합니다.그런 다음 RNA 염기서열을 계산적으로 처리하여 콩그로 조립하고 주석을 달게 됩니다. 궁극적으로, diapause 유도 대 non diapause 유도 광 기간에 대한 반응으로 유전자 발현의 변이는 Reeds MAP에서 RNA 어셈블리로 추론 할 수 있습니다. 마이크로레이 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 게놈 염기서열 또는 마이크로어레이와 같은 이전 유전 자원이 diapause 조건에 대한 반응으로 유전자 발현의 전체 추정치를 얻을 필요가 없다는 것입니다.이 방법은 DPO의 전사 기반이 무엇인지 또는 비모델 유기체의 기타 주요 생태학적 적응과 같은 생태 유전체학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 충분한 양의 diapause 및 non DPO 난자를 얻기 어려울 수 있고 다운스트림 생물정보학 분석이 어려울 수 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 우리는 고처리량 DNA 염기서열분석 기술이 점점 더 저렴해지고 절차를 시작하기 전에 비모델 유기체에서 전체 게놈 발현 프로파일을 얻기 위한 다루기 쉬운 방법을 제공한다는 것을 알게 되었을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었습니다.최적의 일시정지 표현과 약 80%의 상대 습도를 위해 섭씨 21도에서 프로그래밍 가능한 조명이 있는 두 개의 사진 기간 캐비닛을 설정하고, 한 캐비닛은 16 8개의 밝은 어두운 주기로 비일시정지를 유도하는 사진 기간을 위한 캐비닛을 설정하고, 다른 하나는 두 캐비닛이 사진 기간 사이의 일주기 시간을 동기화하기 위해 조명을 동시에 켠 상태에서 8개의 16 밝은 어두운 주기를 유도합니다. 다음으로, 500ml의 탈이온수에 적절한 수의 계란을 담그고 1ml의 분쇄 개 사료와 소금물 새우 식품 슬러리를 추가합니다. 용기를 메쉬로 덮고 메쉬 주위에 고무 밴드를 두어 제자리에 고정합니다.그런 다음 약 24 시간 동안 16 8 light dark long day 사진 기간 캐비닛에서 알을 품습니다. 다음날, 그룹당 약 30마리의 부화한 유충을 90ml의 탈이온수로 채워진 10 x 10 x 2cm 페트리 접시 개인에게 옮깁니다. 48-72시간마다 유충을 깨끗한 접시에 옮겨 옮길 때마다 신선한 식품 슬러리를 먹입니다.약 6일 후, 각 사진 기간 치료를 위해 3-4개의 성체 케이지 바닥에 젖은 여과지를 깔고 여과지에 충분한 탈이온수를 적셔 고인 물을 피하면서 케이지의 국소 습도를 높입니다. 사진 기간, 복제 번호, 케이지 시작 날짜 및 케이지 측면에 있는 영구 마커와 함께 실험과 관련된 기타 정보를 기록하십시오. 그런 다음 격일로 10일 동안 푸이를 물 25밀리리터당 50푸이 이하의 깨끗한 물이 담긴 작은 컵에 옮겨 실험에 적합한 성체 케이지에 넣고 케이지의 상단 메쉬에 유기 건포도를 놓아 출현한 성인에게 설탕을 제공합니다. 첫 번째 혈액 식사 후 4-5일 후에 난자 위치를 자극하기 위해, 질감이 있는 표백되지 않은 종이 타월을 깐 짙은 색의 50ml 컵에 탈이온수를 반쯤 채우고 각 케이지에 한 컵씩 넣어 계란을 수집하고 보관합니다.각 케이지의 계란 종이를 새 종이로 교체하고 최근에 제거한 종이를 페트리 접시에 넣고 계란 보관에 대한 혼란스러운 영향을 피하기 위해 8개의 16 라이트 다크 쇼트 데이 포토 기간 캐비닛에 보관합니다. 채취 후 약 48시간 후, 난자를 야외에서 건조시켜 축 늘어지고 만졌을 때 약간 축축하되 너무 젖어서 종이가 물로 인해 검어지거나 부화를 자극할 정도로 젖지 않도록 합니다. 일시정지 현상을 측정하려면 각 달걀 종이에 달걀 수를 기록하십시오.그런 다음 개별 종이를 약 80ml의 탈이온수와 함께 90ml의 페트리 접시에 완전히 담그십시오. 부화를 촉진하기 위해 약 0.25ml의 식품 슬러리를 첨가한 다음 24시간 후에 페트리 접시를 검은색 표면으로 옮깁니다. 이제 한쪽에 광원을 배치하면 유충이 빛에서 멀어지므로 별 유충에서 먼저 개체를 명확하게 계산할 수 있습니다.개체를 다시 세는 것을 방지하기 위해 계산 후 피펫을 사용하여 각 유충을 제거하십시오. 그런 다음 달걀 종이를 새 페트리 접시에 넣고 빨갛게 말립니다. 일주일 후 부화한 두 번째 알을 세고 난 후, 부화하지 않은 나머지 알과 함께 난자를 새로운 90ml 페트리 접시에 넣고 약 80ml의 새 표백 용액이 종이가 표백 용액에 완전히 잠기도록 주의합니다.종이를 흄 후드 아래에 하룻밤 동안 두었다가 다음 날 광학 현미경을 사용하여 부화하지 않은 알의 수를 계산합니다. 난자가 배아가 되면 눈은 등쪽에서 서로 마주보는 두 개의 작은 검은색 점으로 나타나는 회백색을 나타냅니다. 먼저 RNA 오염 제거 용액으로 벤치를 조심스럽게 세척하여 잔류 뉴클레아제를 제거하고 RNA 분해를 방지합니다.다음으로, 낙타 털 브러시를 사용하여 발달 중인 배아가 포함된 최소 400개의 모기 알을 빗질합니다. 유리 그라인더에 대한 관심 지점. 흄 후드에 1ml의 트리올을 넣고 완전히 분쇄될 때까지 계란을 갈아서 트리올에서 RNA 추출을 수행한 다음 제조업체의 지침에 따라 이소프로판올 침전을 수행합니다.이제 제조업체의 지침에 따라 섭씨 37도에서 30분 동안 50마이크로리터의 반응에서 RNA 최대 10마이크로그램당 최대 1마이크로리터의 Dns를 사용하십시오. 다음으로, 실온에서 5분 동안 5마이크로리터의 부유 DNA 불활화 시약에 반응을 배양합니다. 잠복기 동안 현탁액을 세 번 부드럽게 소용돌이칩니다.그런 다음 RNA 추출물을 10, 000 번 G에서 1.5 분 동안 원심분리하고 Eloqua, 상등액을 포함하는 RNA는 시퀀싱을 위한 새로운 튜브에 넣습니다. 마지막으로, read, preparation, assembly 및 annotation에서 differential expression analysis에 이르기까지 생성된 차세대 염기서열분석 데이터를 처리하는 방법에 대한 자세한 내용은 함께 제공되는 텍스트를 참조하십시오. 이 첫 번째 그림에서, 두 개의 대표적인 RNA 샘플의 형광 측정법은 약 2000개의 뉴클레오티드에서 두 개의 띠를 보여줍니다.곤충 28 s 리보솜 RNA는 수소 결합으로 함께 유지되는 두 개의 폴리뉴클레오티드 사슬로 구성되어 있으며, 이는 짧은 가열 또는 수소 결합을 끊는 물질에 의해 쉽게 파괴됩니다. 그 결과 두 가지 구성 요소는 두 번째 RNA 샘플에서 18s 리보솜 RNA와 거의 동일한 크기이며 이 대표적인 실험에서 높은 수준의 분해가 관찰될 수 있습니다. 알보픽투스(albopictus) 모기의 대표 그룹에 대한 사진 주기적 치료는 짧은 낮 사육 모기에서 높은 일시정지 발생과 긴 낮 사육 모기에서 낮은 일시정지 발생을 초래했습니다.예를 들어, 반복실험 간에 약간의 차이가 있었지만, 짧은 2일차 그룹은 다른 복제물보다 더 낮은 휴면 횟수를 보였습니다. 디지털 방식으로 정규화된 읽기의 Trinity 어셈블리는 평균 conig 길이가 1020 3.1이고 최대 Conti 길이가 20, 892인 76, 377 contigs를 생성했습니다. Conti 길이의 분포는 더 짧은 contigs쪽으로 크게 편향되어 있습니다.이것은 Denovo 전사체 조립의 전형입니다. 이 마지막 그래프에서, 난자 위치 후 11일과 21일에 휴지 유도 조건에서 사육된 배아의 유사한 워크플로우에서 차등 발현 분석을 통해 이 두 기간 사이에 3,128개의 차등적으로 발현된 유전자가 드러납니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행된다면 조직 생성 신성한 정보학 분석으로부터 6개월에서 8개월 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 다음 단계로 이동하기 전에 각 단계의 성공 여부를 확인해야 한다는 점을 기억해야 합니다. 예를 들어, RNA 무결성을 테스트하기 전에 실험 조건에서 DPA 및 비분뇨 난자가 생성되었는지 확인합니다. 이 절차를 따릅니다. 정량적 R-T-P-C-R 또는 비교 유전체학 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 조직 또는 발달, 관심 유전자의 특정 발현 및/또는 분자 진화 과정에 관한 추가 질문에 답할 수 있습니다.트리올로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑, 실험실 가운 및 흄 후드 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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