세 가지 차원 콜라겐 매트릭스 내에서 세포의 이동 분석

이 절차의 전반적인 목표는 3차원 환경 내에서 세포의 이동 행동을 분석하는 것입니다. 먼저, 관심 세포를 3차원 콜라겐 격자에 삽입합니다. 그런 다음 타임 랩스 비디오 현미경으로 세포의 움직임을 기록하고 컴퓨터 지원 세포 추적으로 이동 매개 변수를 설명하고 스프레드 시트 소프트웨어 응용 프로그램을 사용하여 세포 추적 데이터를 분석합니다.

궁극적으로 이 방법은 암과 관련하여 암세포 또는 백혈구, 림프구 및 줄기세포와 같은 정상 세포의 이동을 조절하는 요인과 신호 전달 경로를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서 세포 이동, 조절 인자 및 관련 신호 전달 경로에 대한 지식은 종양 세포 이동 및 전이성 확산을 저해하는 새로운 치료 전략을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 마이그레이션 챔버의 경우 용융 된 파라핀 왁스, 바셀린 믹스의 두 층을 유리 슬라이드의 중간에 빠르게 솔질하고 덮개를 추가하고 파라핀 왁스, 바셀린 믹스의 두 층으로 미끄러지고 밀봉합니다.

그런 다음 마이그레이션 챔버를 1.5ml 반응 튜브에 랙의 수직 위치에 놓습니다. 콜라겐 현탁액을 위해 20마이크로리터의 세포 현탁액을 추가합니다. 50 μl의 10 XMEM과 27 μl의 7.5 % 중탄산 나트륨 용액을 철저히 혼합합니다.

그런 다음 375마이크로리터의 액체 콜라겐 현탁액을 넣고 pH 7.5를 나타내는 밝은 자주색이 되도록 완전히 혼합합니다. 이제 세포 현탁액의 50 마이크로 리터에 최종 콜라겐 현탁액 100 마이크로 리터를 추가하고 콜라겐 섬유의 개시를 주의하면서 철저히 혼합합니다. 중합. pH 7.5에서 혼합물을 마이그레이션 챔버로 옮깁니다.

이동 챔버를 부드럽게 두드려 이동 사슬 챔버 바닥에 콜라겐 현탁 세포 혼합물을 균등하게 분배합니다. 마이그레이션 챔버를 랙에 똑바로 세우고 30분 동안 배양합니다. 중합된 콜라겐 격자가 약간 탁하지만 여전히 연한 자주색인 경우 이동 챔버를 적절한 매체로 채우고 마이그레이션 챔버를 파라핀 왁스로 밀봉합니다.

바셀린 믹스. 마이그레이션 챔버에서 10배 배율을 사용하여 현미경 스테이지 히터를 섭씨 37도로 조정합니다. 시야각에서 약 50개 이상의 셀에 초점을 맞춥니다.

멀티 카메라 비디오 감시 소프트웨어 애플리케이션을 사용하여 타임 랩스 모드에서 세포 이동을 기록합니다. 셀 마이그레이션 동영상을 적절한 파일 형식으로 저장합니다. 세포 이동 동영상 파일을 세포 유형 및 실험 조건과 같은 지원 정보가 포함된 데이터베이스에 연결합니다.

다음으로, 편향되지 않은 분석을 위해 적절한 세포 추적 소프트웨어 응용 프로그램을 사용하여 세포 이동 동영상을 분석합니다. 세포가 총 이동 활성인지 여부에 대한 지식 없이 분석할 세포를 무작위로 선택하고, 일반적인 세포 이동 실험에서 세포당 약 60개의 XY 좌표를 결정합니다. 세포 분열의 경우, 추적에서 따를 딸 세포 하나를 무작위로 선택합니다.

스프레드시트 프로그램과 같은 적절한 소프트웨어 응용 프로그램을 사용하여 세포 추적 데이터를 분석하여 세포가 이동한 총 거리를 계산합니다. 숫자 픽셀 값의 합에 미크론으로 변환하기 위한 수정 계수를 곱합니다. 25미크론 임계값 미만으로 마이그레이션된 셀을 움직이지 않는 셀로 정의하고 숫자 값을 쉼표로 바꿉니다.

다음으로, 추적된 세포 집단 중 두 시점 사이를 이동한 세포의 백분율로 운동 활동을 계산합니다. 또한 활성 이동 시간을 관찰 기간의 기간과 관련하여 셀이 이동한 총 시간의 백분율로 계산합니다. 그런 다음 man Whitney U 검정을 사용하여 통계적 유의성을 계산하고 세포 이동 데이터를 표시합니다.

일반적인 셀 추적 데이터 파일은 각 열이 하나의 추적된 셀을 나타내는 테이블과 비슷합니다. 행에는 셀 이동에 대한 위치 정보가 포함되어 있습니다. 시간이 지남에 따라 세포의 기관차 거동은 분석된 세포 집단의 평균 운동 활동과 활발한 운동 시간으로 특성화될 수 있습니다.

이 예는 4개의 독립적인 실험에서 120개 세포의 이동 활동을 보여줍니다. 각 다이아몬드는 셀이 두 개 이상의 시점 사이에서 이동했음을 나타냅니다. 회색 선은 움직이는 세포와 움직이지 않는 세포를 구별합니다.

기관차 활동의 매개변수는 XY 다이어그램 또는 상자 그림으로 표시할 수 있습니다. 분석된 세포 집단의 역학을 시각화하기 위해 히스토그램은 동일한 세포의 활성 시간을 효과적으로 보여줍니다. MDA HER2 및 M-D-A-N-E-O 유방암 세포주의 이동 행동에 대한 이 분석은 두 세포주가 유사한 자발적 운동 활동을 보였음을 나타냅니다.

파라미터 시간 활성은 M-D-A-N-O 유방암 세포에 비해 자발적으로 움직이는 M-D-A-H-E-R 세포의 수가 약간 더 많은 것으로 나타났습니다. EGF 1밀리리터당 100나노그램으로 자극하면 움직이는 세포의 수와 활발한 운동 시간으로 측정된 MDA HER2의 이동 활성이 크게 증가했습니다. 흥미롭게도, M-D-A-N-E-O 세포는 EGF 자극에 반응하여 이동하였고, 포스포리파제 c 감마 1 억제제 uc 3 1 22를 사용한 시간 이동 활성 패턴 처리는 M-D-E-E-R 2 및 MDAN 모두의 자연 및 EGF 유도 이동을 모두 감소시켰습니다.

EEO 세포. 시간 활성 매개 변수를 분석한 결과, U 7 3 1 2 2의 2 마이크로 몰로 MDAN EEO 세포를 처리하면 운동 활성이 현저히 감소했으며, 이는 주로 움직이지 않는 세포의 양 증가에 기인합니다. 일단 숙달되면 림프구와 백혈구를 3차원 콜라겐으로 이동시키면 약 2시간 내에 글자와 정신을 기록할 수 있으며 하룻밤 동안 종양 세포를 기록할 수 있습니다.