Name: 빠른 세균의 식별 및 항생제 감수성 테스트를위한 혈액 문화 펠렛의 제조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: 배우세요 양성 혈액 배양액에서 세균 펠렛을 제조하는 방법을. 원심분리와 염화암모늄 처리를 통해 적혈구를 용해하고 세균을 농축하여 MALDI-TOF 및 항생제 감수성 테스트를 신속하게 수행할 수 있습니다.

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우리는 실험실에서 기술을 구현하는 그들의 도움을 로잔의 대학 병원 센터의 세균학 연구소의 기술자 감사합니다.

이 프로토콜 개발 도구 루틴으로서 구현되기 전에 본원의 연구 개발 프로세스 및 윤리 규칙에 따라 확인되었다. 염화 암모늄 적혈구 - 용균 절차에 의한 혈액 문화 세균 펠렛의 1 준비 <ol><li> 이후 원심 분리에 대한 긍정적 인 혈액 배양의 준비. <ol><li> 혈액 배양 뚜껑을 소독. 병의 뚜껑에 70 % 에탄올을 추가하고 구울 수 있습니다. 참고 : 층류 후드에서이 단계를 수행하지 마십시오. </li><li> 층류 후드에 병을 이동합니다. 20 G 주사기와 혈액 배양 5 ㎖를 수집합니다. </li><li> 멸균 물 (H 2 O)의 45 ML을 포함하는 50 ㎖의 원심 분리 관에 혈액 배양의 5 ML을 추가하고 샘플을 섞는다. </li></ol></li><li> 용해 원심 분리하여 혈액 배양 세균 펠렛의 제조. <ol><li> RT에서 10 분 동안 1,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 레모실험실 진공 펌프 (주로 H 2 O 및 혈액 세포를 포함) 상등액을했습니다. </li><li> 용액 (0.15 M NH4Cl 등, 1 ㎜ KHCO 3) 용균 수제 암모늄 클로라이드 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 긁어 튜브 텍싱하여 펠릿을 분해하고 실온에서 10 분 동안 140 XG에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 주로 적혈구 파편이 포함 된 상층 액을 버린다. <ol><li> 펠릿 출혈성 남아 있다면, 상기 잔류 적혈구 세포를 용해하고, 펠릿을 세척 및 멸균 증류수 H 2 0 2 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 실온에서 10 분 동안 140 XG에서 샘플을 원심 분리기 상층 액을 버린다. </li></ol></li><li> H 2 O의 200 μL에 펠렛을 재현 탁 </li></ol></li><li> 다양한 선택과 비 선택 한천 미디어에 혈액 문화의 하위 문화. <ol><li> 20 G 주사기와 혈액 배양 1 ㎖를 수집합니다. </li><li> 혈액 배양 INT 1 방울을 접종혈액 한천, 초콜릿 한천, McConkey의 한천 Schaedler 한천에 네 사분면 오. </li><li> 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 혈액 한천와 초콜릿 한천 플레이트를 품어, 정상적인 분위기에서 McConkey 한천 및 혐기성 상태에서 Schaedler 한천 플레이트. </li><li> 다른 매체에 세균의 성장을 따르십시오. </li><li> 세균의 순도를 확인합니다. </li></ol></li></ol> MALDI-TOF MS에 의해 2 식별 <ol><li> 혈액 펠릿에서 직접 확인. <ol><li> 전송 한 MALDI 대상 접시에 혈액 펠릿의 μL와 42 ° C 가열 플랫폼에서 말리면. </li><li> 1 ㎕의 70 % 포름산으로 샘플을 오버레이와 42 ° C 가열 플랫폼에서 말리면. </li><li> MALDI 매트릭스의 1 ㎕의 시료를 오버레이 및 42 ° C 가열 플랫폼에서 말리면 (α-시아 노 - 사 - 히드 록 아세토 니트릴 - 2.5 % 트리 플루오로 아세트산 50 %에서 산의 포화 용액). </li><li> MAL에 진행제조 업체에 의해 기술 된 바와 같이 MALDI-TOF MS 시스템과 DI-TOF MS 분석. </li><li> 식별 점수 (점수 &lt;2 인스턴스) 종 레벨에서 유효하지 않은 경우, 피 펠릿 시료 단백질 추출을 수행한다. </li></ol></li><li> 혈액 배양 펠릿에서 단백질을 추출 후 확인. <ol><li> RT에서 2 분 동안 13,000 XG에 70 % 에탄올 1 ml의 원심 분리와 펠렛의 20 μl를 섞는다. </li><li> 뜨는을 취소하고 70 % 포름산 25 ㎕의 펠릿 100 % 아세토 니트릴의 25 μl를 추가합니다. 소용돌이 적극적으로 펠릿을 재현 탁합니다. 소용돌이로 교반하기 전에 피펫 팁을 나누어서 힘든 알약을 재현 탁. </li><li> 실온에서 2 분 동안 13,000 XG에 원심 분리기. 전송 한 MALDI 대상 접시에 뜨는 ㎕의 (추출 된 단백질을 포함한다) 및 42 ° C 가열 플랫폼에서 말리면. 2.1.2에 설명 된대로 진행합니다. </li></ol></li></ol> 3 세균성 지문을 확인해자동화 된 미생물 시스템과 가스화 및 항생제 감수성 검사 <ol><li> 자동화 된 미생물 시스템과 박테리아 식별 및 AST에 대한 세균 현탁액의 준비. <ol><li> 자동화 된 미생물 시스템과 호환 멸균 0.45 % NaCl 용액 3 ㎖를 함유하는 플라스틱 관을 준비한다. </li><li> 0.6-0.8의 맥팔랜드 탁도에 대응 세균 현탁액을 얻기 위해 0.45 % NaCl 용액으로 혈액 배양 펠렛의 충분한 볼륨. 농도계 기계를 사용하여 탁도를 측정한다. 참고 : 혈액 배양 세균 펠릿의 부피는 0.6-0.8의 맥팔랜드 탁도를 달성하기 위해 50 ~ 200 μL에 따라 다릅니다. </li></ol></li><li> 제조자에 의해 설명 된대로 식별 자동화 그람 양성 (GP) 또는 그람 음성 (GN) 카드 및 그람 양성 구균 및 그람 음성 세균의 항균 감수성 테스트에 대한 자동화 된 AST 카드를 접종한다. 참고 : IdentificatioMALDI-TOF MS 식별 점수 값이&gt;이 경우 N GP 또는 GN 카드 적용되지 않습니다. 혈액 한천 (GP와 GN)와 MacConkey 한천 (GN) 접시에 세균 현탁액을 계대 배양하여 세균 현탁액의 순도를 확인합니다. </li></ol> 디스크 확산 분석하여 4 항생제 감수성 검사 디스크 확산 분석은 항균제 감수성 시험 (EUCAST, 버전 3.0 년 4 월 2013 www.eucast.org)에 관한 유럽위원회에 의해 설명된다. <ol><li> 세균 현탁액을 준비 디스크 확산 분석에 의한 항균제 감수성 시험을 수행 할 수 있습니다. <ol><li> 멸균 된 0.9 % NaCl 용액 3 ㎖를 함유 유리 튜브를 준비한다. </li><li> 0.5 맥팔랜드 탁도에 대응 세균 현탁액을 얻기 위해 0.9 % NaCl 용액에 혈액 배양 펠렛의 충분한 볼륨. 농도계 기계를 사용하여 탁도를 측정한다. 참고 : 혈액 배양의 부피세균 펠릿은 0.6-0.8의 맥팔랜드 탁도를 달성하기 위해 50 ~ 200 μL에 따라 다릅니다. </li><li> 세균 현탁액을 소용돌이. </li></ol></li><li> 뮬러 - 힌튼 한천 (MH) 또는 뮬러 - 힌튼 한천 - 까다로운 생물 한천 (MHF) 위에 세균 현탁액의 예방 접종은 (MH 5 % defibrinated 말의 혈액과 20 밀리그램 / β-니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드의 L 보충). <ol><li> 세균 현탁액 멸균 면봉을 찍어 부드럽게 유리 튜브의 내부 벽에 면봉을 돌려 초과 액체를 제거합니다. </li><li> 세 방향 보라고하거나 자동화 플레이트 회 전자를 사용하여 MH / MHF 한천 플레이트의 전체 표면 상에 고르게 세균 현탁액을 확산. </li></ol></li><li> 접종 한천 접시에 항균 디스크의 응용 프로그램입니다. <ol><li> 수동 건조 접종 아가 플레이트의 표면 또는 감수성 디스크 디스펜서를 사용하여 밀접하게 디스크를 적용한다. </li><li> 해당 템피에서 접시를 품어rature 및 항균제 감수성 시험 EUCAST 디스크 확산법에 설명 된대로 분위기 (버전 3.0 년 4 월 2013 www.eucast.org). </li></ol></li></ol> (5) 자동 MRSA의 검출에 대한 진단 검사를 PCR 기반 <ol><li> 마이크로 피펫을 사용하여 20 초 동안 PCR 기반의 진단 테스트 키트와 소용돌이를 자동화 MRSA와 함께 제공되는 샘플 시약 병으로 혈액 배양 펠릿의 50 μl를 전송합니다. </li><li> 1 ML의 마이크로 피펫을 사용하여, 카트리지의 시험편 포트에 샘플을 조제. 자동화 된 PCR 시스템에 카트리지를 삽입하고 제조자에 의해 설명 된대로 분석을 시작합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

종래 양성 혈액 배양 진단 방법에 비해, 염화 암모늄 용해 원심 분리 방법을 이용하여 세균 펠렛의 빠른 획득은 24 시간 및 48 시간에 24 의한 AST를보고 할 때 (도 1 및 16에 의해 식별을보고하는 시간을 단축 3). 적절한 항생제 치료의 도입은 빠른 혈류 감염으로 고통받는 환자의 결과를 향상시키기 위해 중요한 것이다. 따라서, 약 8-16 시간에서 얻은 빠른 AST 다음에 1 시간 내 감염원의 조기 발견은 패혈증 환자의 임상 관리에 큰 영향을 나타냅니다. 그람 염색의 급속한보고는 이미 항생제 치료에있어 환자의 이환율과 사망률의 6,7의 감소와 함께 큰 영향과 관련되어있다. 혈액 배양 박테리아 펠릿 그람 염색법은 감도를 증가시키기 위해 수행 될 수있는 경우 BL의 그람 염색법짐 우드 배양액은 부정적이거나 약한 양성 (그림 4)입니다. 그러나, 기본 혈액 배양...

입원 환자의 혈류 감염 및 패혈증은 질병률과 사망률의 중요한 원인이다. 따라서, 감염 혈액과 관련된 사망률은 입원 환자의 37 %로 약 14 %에서 관찰되며, 중환자 실 환자의 1 ~ 35 %로 증가 할 수 있습니다. 감염원의 신속한 식별 최적 항균 치료를 안내와 항균 치료 4,5의 성공적인 결과를 증가시키는 중추적이다. 양성 혈액 배양에서 그람 얼룩의 신속한 분석은 이미 항균 요법 6,7하지만 감염원의 정확한 식별 적응에 큰 영향을 갖는 환자에게 가장 적합한 항생제 치료를 제공해야한다. 예를 들어, 다른 항생제 치료법은 장내 및 그람 염색으로 구별하기 어려운 구균 균혈증 다음으로 구현되어야한다. 마찬가지로, 종의 식별 레프엘은 8-락탐을 β하기 위해 증가 된 저항성을 염색체의 AmpC 유전자를 코딩하는 그람 음성 장내 세균을 검출하는 데 필요합니다. 긍정적 인 혈액 배양으로, 기존의 진단 방법은 생화학 검사, 다른 선택 배지에 성장과 자동화 된 미생물 식별 시스템을 포함한 다양한 방법으로 추가 배양 전에 식별 몇 시간을 필요로 다른 한천 접시에 감염원을 배양하는 것입니다. 종래의 진단 방법의 결과 시간은 약 1-3일이다. 미생물의 신속한 식별을위한 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 비행 시간 형 질량 분석 (MALDI-TOF) 기술의 출현은 신속 양성 혈액으로부터 직접 또한 아가 플레이트상에서 성장한 콜로니로부터 미생물하지만을 식별하는 새로운 도구를 제공했다 문화 (그림 1) 9-12. 목혈액 배양에서 감염원을 확인하기 MALDI-TOF의 전자의 사용은 크게 몇 분 대신 전통적인 방법에 의해 요구되는 시간과 일에 결과 시간을 단축하고있다. Croxatto 외. (13)에 의해 논의 된 바와 같이, MALDI-TOF 식별 효율은 미생물의 순도 및 양을 포함하여 다른 매개 변수에 의존한다. 이 두 기준은 쉽게 한천 플레이트에 성장 이산 식민지에서 얻은하지만, MALDI-TOF 식별을 방해 할 수있는 여러 세포와 단백질 구성 요소를 포함하는 혈액 배양 등 복잡한 시료에서 세균 농축 및 정제를위한 사전 분석 치료를해야합니다. 혈액 배양에서 다양한 미생물 &#39;분리 방법이 세균 추출 9,14, 혈청 분리 방법 10 사포닌 또는 다른 중성 세제 방법을 포함하여 다수의 연구에서 사용 된, 용해 원심 분리 방법 12 </s까지&gt; 등 sepsityper 키트 상업적으로 솔루션을 제공합니다. 우리의 세균학 진단 ​​실험실은 MALDI-TOF에 의한 박테리아와 효모의 빠른 식별 및 자동 식별 시스템 (그림 2) 15를 허용 염화 암모늄 적혈구 - 용해를 기반으로 간단한 혈액 배양 세균 펠렛 제제를 개발했다. 이 혈액 문화 펠릿 준비 또한 그람 염색 등의 직접 다운 스트림 애플리케이션을위한 샘플을 제공, 같은 메티 실린 내성 Staphyloccocus 구균의 신속한 검출 (MRSA)에 대한 POCT-PCR들과 함께 항생제 감수성 검사와 같은 자동화 된 PCR 기반의 진단 테스트 자동화 된 AST 시스템 및 / 또는 한천 플레이트에 디스크 확산 분석 (그림 3)에 의해. Prod&#39;hom 등에 의해 설명 된 바와 같이이 작품에서, 우리는 혈액 배양 세균 펠렛의 제조를위한 여러 단계를 설명합니다. 15 (그림 4). 우리는 또한 탈 것서기관 혈액 배양 펠릿에서 수행 할 수있는 주요 응용 프로그램의 세 가지에 대한 프로토콜 : 자동 장내 세균에 대한 시스템 16 및 포도상 구균 및 자동 PCR-와 MALDI-TOF 15, 식별 (ID) 및 항생제 감수성 검사 (AST)에 의해 확인 MRSA (17)의 검출에 기초하여 진단 테스트.

<table><tbody><tr><td>20 G 바늘</td><td>Terumo, Leuven, Belgium</td><td>NN-2038R</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon tube</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>352070</td><td>50 ml 원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>Ammonium chlorure</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>101145</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydrogen carbonate</td><td>Fluka, St. Louis, MO, USA&nbsp;</td><td>60340</td><td></td></tr><tr><td>포름산</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA&nbsp;</td><td>F0507</td><td>가연성, 부식성</td></tr><tr><td>&#945;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td><td>Fluka, St. Louis, MO, USA&nbsp;</td><td>70990</td><td>급성 독성</td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>시그마-알드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국&nbsp;</td><td>271004</td><td>가연성, 급성 독성</td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA&nbsp;</td><td>T6508</td><td>부식성, 급성 독성</td></tr><tr><td>Vitek 2 60 instrument</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, France</td><td>27202</td><td>자동 미생물 시스템 기기</td></tr><tr><td>Vitek 2 그램 양성 (GP) 카드</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, France</td><td>21342</td><td>자동 GP&nbsp; 신분증</td></tr><tr><td>Vitek 2 AST-P580 카드</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, France</td><td>22233</td><td>자동 미생물 AST 시스템</td></tr><tr><td>Vitek 2 그람 음성(GN) 카드</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, France</td><td>21341</td><td>자동 GN&nbsp; 신분증</td></tr><tr><td>Vitek 2 AST-N242 카드</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, France</td><td>413391</td><td>자동화 미생물 AST 시스템</td></tr><tr><td>Xpert MRSA</td><td>Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA</td><td>&nbsp; GXMRSA-100N-10</td><td>핵산 증폭 기술 MRSA</td></tr><tr><td>GeneXpert IV 기기</td><td>Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA</td><td>GXIV-4-D</td><td>핵산 증폭 기술 기기</td></tr><tr><td>Microflex LT MALDI-TOF MS 기기</td><td>Bruker Daltonics, 브레멘, 독일</td><td>BDAL microflex LT/SH</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 타겟 스틸 BC</td><td>Bruker Daltonics, 브레멘, 독일</td><td>280799</td><td>MALDI 타겟 플레이트</td></tr><tr><td>농도계 Densicheck 기기</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, France</td><td>27208</td><td></td></tr><tr><td>MALDI Sepsityper kit 50</td><td>Bruker Daltonics, 브레멘, 독일</td><td>8270170</td><td></td></tr><tr><td>Mac Conkey 한천</td><td>Biolife, Milano, Italy</td><td>4016702</td><td></td></tr><tr><td>Mueller-Hinton 한</td><td>천 옥소이드, 햄프셔, 잉글랜드</td><td>CM0337</td><td>Mueller-Hinton 한천(MH)&nbsp;</td></tr><tr><td>MHF 한천</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, France</td><td>43901</td><td>Mueller-Hinton 한천-까다로운 유기체 한천 (MHF)</td></tr><tr><td>BD 콜롬비아 III 한천</td><td>BD, 프랭클린 레이크, 뉴저지, 미국</td><td>254071</td><td>혈액 한천</td></tr><tr><td>BD 초콜릿 한천</td><td>BD, 프랭클린 레이크, 뉴저지, 미국</td><td>254089</td><td>초콜릿 한천</td></tr><tr><td>BD schaedler 한천</td><td>BD, 프랭클린 레이크, 뉴저지, 미국</td><td>254084</td><td>Schaedler 한천</td></tr></tbody></table>

빠른 세균의 식별 및 항생제 감수성 테스트를위한 혈액 문화 펠렛의 제조

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

혈류 감염 및 패혈증은 질병률과 사망률의 중요한 원인이다. 균혈증 고통받는 환자의 성공적인 결과는 최적의 항생제 치료를 안내 할 수있는 감염원의 빠른 식별에 따라 달라집니다. 긍정적 인 혈액 배양에서 그람 얼룩의 분석은 신속하게 실시 이미 크게 항생제 처방에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나, 감염원의 정확한 식별은 여전히​​ 최적의 치료 대상을 설정할 필요가있다. 여기서 이러한 디스크 확산 분석에 의한 MALDI-TOF MS, 항생제 감수성 검사 (AST)에 의해 식별 또는 자동화 AST 시스템과 같은 여러 가지 에센셜 하류 애플리케이션 용 시료로 사용 될 수있는 양성 혈액 배양에서 간단하고 빠른 박테리아 펠렛 제제를 제시 그리고 자동으로 진단 검사를 PCR 기반. 혈액 배양 박테리아 펠릿에 직접 적용이 다른 식별 및 AST 시스템의 성능은 매우 SI이며성능 밀라 (milar)는 일반적으로 한천 플레이트에 성장 고립 식민지에서 얻을. 종래의 방법에 비해 박테리아 펠릿 신속한 취득이 크게 식별 및 AST 모두를보고하는 시간을 감소시킨다. 따라서, 다음과 같은 혈액 배양 양성, MALDI-TOF에 의한 식별은 8 내에서 각각 18 시간, 자동화 된 AST 시스템 또는 디스크 확산 분석에 의해 AST의 결과 반면 미만 1 시간 이내에보고 할 수 있습니다. 마찬가지로 신속한 PCR 기반 분석의 결과는 임상의에게 균혈증 리포트 다음, 2 시간 미만을 통신 할 수있다. 함께, 이러한 결과는 혈액 배양 박테리아 펠릿 신속한 준비 식별 및 AST 턴어라운드 시간에 따라서 혈류 감염으로 고통받는 환자의 성공적인 결과에 상당한 영향을 미치고 있음을 보여준다.

Prod'hom 외. (15)에 의해 수행 된 연구에서, 78 명의 환자에서 122 양성 혈액 배양의 염화 암모늄의 용해를 원심 분리에 의해 얻어진 박테리아 펠릿은 MALDI-TOF MS로 분석 하였다. 122 긍정적 인 혈액 배양 중, 95 (77.9 %)이 올바르게 속 수준에서 종 수준과 하나 (0.8 %)에서 확인되었다. 나머지 26 (21.3 %), 혈액 배양 펠릿은 MALDI-TOF에 의한 신뢰성있는 식별을주지 않았다. 그 중, 21은 13 연쇄상 구균 및 5 응고 효소 음성 포도 구균을 포함한 그람 양성 세균이었다. 중요한 것은, 13 알 수없는 연쇄 구균 중 10 종종 어려운를 Lyse 캡슐을 소유하고 S. 종에서 거의 구별되는 폐렴 구균했다 MALDI-TOF MS 사용 mitis 그룹입니다. 다섯 그람 음성 박테리아는 네이 어려운를 Lyse이 폐렴 간균 및이 Haemop 포함 종의 박테리아를 캡슐화...

양성 혈액 배양에서 빠른 박테리아 펠렛 제제는 MALDI-TOF에 의해 식별, 그람 염색, 항생제 감수성 시험 및 PCR-기반 테스트와 같은 애플리케이션을위한 샘플로서 이용 될 수있다. 결과는 급속 혈류 감염으로 고통받는 환자의 결과를 개선하기 위해 임상에 통신 될 수있다.

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 응용 분야의 샘플로 사용할 수 있는 양성 혈액 배양에서 박테리아 펠릿을 준비하는 것입니다. 이는 먼저 원심분리 후 양성 혈액 배양액을 멸균수와 혼합하여 수행됩니다. 펠릿은 염화암모늄에 재현탁되어 두 번째 원심분리 후 적혈구를 이가 됩니다.펠릿은 물에 재현탁됩니다. 마지막 단계는 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화, 비행 시간, 그램 염색, 항생제 감수성 테스트 및/또는 PCR 기반 테스트에 의한 박테리아 식별을 위해 얻어진 펠릿을 사용하는 것입니다. 궁극적으로 획득한 결과는 혈류 감염으로 고통받는 환자의 결과를 개선하기 위해 임상의에게 신속하게 전달될 수 있습니다.양성 혈액 배양의 박테리아 하위배양과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 박테리아 식별을 약 6시간에서 24시간으로 줄이고 항생제 내성 결과를 얻는 시간을 약 24시간 단축한다는 것입니다. 이 방법은 항생제 치료를 신속하게 조정하고 혈류 감염으로 고통받는 환자의 결과를 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 OV와 같은 일상적인 식별 방법 및 기존의 항균 지속 가능성 테스트 접근 방식에 적용할 수 있지만 VUL 인자 및 ESBL 및 CARBAPENEMASE 활성과 같은 내성 메커니즘의 화를 목표로 하는 새로운 기술에도 적용할 수 있습니다.다운스트림 응용 프로그램을 위한 충분한 미생물 물질을 얻기 위해서는 박테리아 PAL 제제가 중요하기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요하며, 절차를 시연하는 것은 모두 제 실험실의 실험실 기술자인 Christian Durel, Maria Cortesi, Maria ti 및 Kim Giza가 후속 원심분리를 위한 양성 혈액 배양을 준비하기 위한 것입니다. 병 뚜껑에 70% 에탄올을 첨가하고 태워 혈액 배양 캡을 살균합니다. 그런 다음 병을 층류 후드로 옮깁니다.20게이지 바늘 주사기로 5ml의 혈액 배양액을 수집합니다. 다음으로, 45ml의 멸균수가 들어 있는 50ml 원심분리 튜브에 5ml의 혈액 배양액을 추가하고 샘플을 혼합합니다. 1000Gs에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다.실온에서 실험실 진공 펌프로 상층액을 제거합니다. 그런 다음 펠릿을 1 밀리리터의 수제 염화 암모늄에 재현탁시킵니다. 용해 용액.140gs에서 10분 동안 샘플을 원심 주입하기 전에 긁어내고 와류로 펠릿을 분해합니다.원심분리 후 실온에서 주로 적혈구 파편을 포함하는 상등액을 버립니다. 펠릿이 출혈성 Resus로 남아 있는 경우, 잔류 적혈구를 더 형성하기 위해 2밀리리터의 멸균 및 증류수에 펠릿을 현탁시키고 이전과 같이 샘플을 원심분리한 후 펠릿을 세척하고 상등액을 버리고 펠릿을 200마이크로리터의 물에 재현탁시키고 혈액 펠릿에서 직접 식별하기 위해 튜브를 소용돌이칩니다. 먼저 1마이크로리터의 펠릿을 MALDI 타겟 플레이트로 옮기고 섭씨 42도의 가열 플랫폼에서 건조시킵니다.샘플에 1 마이크로 리터의 70 % 포름산을 오버레이하고 가열 플랫폼에서 건조시킵니다. 다음으로, 샘플에 Maldi Matrixx 1 마이크로 리터를 바르고 다시 가열 플랫폼에서 건조시킵니다. 제조업체에서 설명한 대로 MALDI TOF MS 시스템을 사용하여 MALDI TOF MS 분석을 진행합니다.식별 점수가 종 수준에서 유효하지 않은 경우, 먼저 20마이크로리터의 펠릿과 1밀리리터의 70% 에탄올을 혼합하여 혈액 펠릿 샘플의 단백질 추출을 수행합니다. 다음 13, 실내 온도에 2 분 동안 000 Gs에 표본을 원심 분리하고, 상등액을 버리고 펠릿 와류에 70%formic 산의 25 microliters 및 100%aceto 니트릴의 25 마이크로리터를 13, 2 분 동안 000 Gs에 원심분리에 후에 펠릿을 resuspend하기 위하여 격렬하게 추가하십시오. 실온에서 1마이크로리터의 상등액을 MALDI 타겟 플레이트로 옮기고 섭씨 42도의 가열 플랫폼에서 건조시킵니다.박테리아 식별 및 항생제 감수성 검사 또는 ST를 먼저 수행하려면 자동 미생물 시스템과 호환되는 멸균 0.45% 염화나트륨 용액 3ml가 들어 있는 플라스틱 튜브를 준비합니다. 충분한 부피의 혈액 배양 펠렛을 용액에 추가하고 와류를 일으켜 농도계 기계를 사용하여 측정한 바와 같이 0.6 내지 0.8의 McFarland 탁도에 해당하는 박테리아 현탁액을 얻습니다. 다음으로, 식별을 위해 자동화된 그람 양성 또는 그람 음성 카드를 접종합니다.또한 제조업체가 설명한 대로 그람 양성 구균 및 그람 음성 박테리아의 항균 감수성 테스트를 위해 자동화된 ST 카드를 접종합니다. 디스크 확산 분석에 의한 항균 감수성 검사를 수행합니다. 먼저 3ml의 멸균 0.9% 염화나트륨 용액이 들어 있는 유리관을 준비합니다.그런 다음 농도계 기계로 측정한 McFarland 탁도 0.5에 해당하는 박테리아 현탁액을 얻기 위해 충분한 부피의 혈액 배양 펠릿을 용액에 추가합니다. 박테리아 현탁액을 소용돌이치게 하여 박테리아 현탁액을 접종합니다. 먼저 멸균 면봉을 박테리아 현탁액에 담그고 유리관 내벽에 있는 면봉을 돌려 과도한 체액을 부드럽게 제거합니다.그런 다음 박테리아 현탁액을 Mueller의 전체 표면에 고르게 펴 바릅니다. Hint and auger 또는 Mueller hint and auger는 세 방향으로 면봉으로 닦거나 접종된 오거 플레이트에 항균 디스크를 적용하기 위해 자동화된 플레이트 회전기를 사용하여 까다로운 유기체에 대해 오거합니다. 먼저, 건조된 접종된 오거 플레이트의 표면에 디스크를 수동으로 또는 감수성 디스크 디스펜서를 사용하여 밀접하게 적용합니다.그런 다음 항균제 감수성 테스트에 관한 유럽 위원회의 항균 감수성 테스트 디스크 확산 방법에 설명된 대로 적절한 온도와 분위기에서 플레이트를 배양하여 자동화된 PCR 기반 진단 테스트를 수행합니다. 먼저, 마이크로 피펫을 사용하여 50마이크로리터의 혈액 배양 펠릿을 MSA 자동 PCR 기반 진단 테스트 키트와 함께 제공된 샘플 시약 바이알로 옮깁니다. 그런 다음 1ml 마이크로 피펫을 사용하여 바이알을 20초 동안 볼링합니다.샘플을 카트리지의 검체 포트로 분배합니다. 카트리지를 자동 PCR 시스템에 삽입하고 로잔 실험실의 제조업체에서 설명한 대로 분석을 시작합니다. 결과는 실험실 인터페이스 시스템 또는 LIS와 함께 사용되는 자동 PCR 시스템의 연결성 덕분에 직접 검증되고 임상의에게 전송됩니다.결과가 유효하지 않은 경우, 박테리아 펠릿을 10배 희석한 후 분석을 반복하는 것이 좋습니다. 이것은 종종 PCR 억제제 때문이기 때문에, 염화암모늄 용혈은 염화암모늄이 없는 음성 대조군에 비해 적혈구 파편이 거의 없는 매우 높은 품질의 혈액 배양 펠릿을 생성했습니다. Escher Coli, Coagulase, 음성 포도상구균 capita 및 연쇄상 구균 디스크 AE의 양성 혈액 배양액의 그람 염색을 혈액 배양 준비 전후에 수행했습니다.이 접근법을 사용하여 펠릿의 박테리아 펠릿 제조는 미생물을 약 100 - 1000배 농축할 수 있습니다. 전반적으로, 혈액 배양 펠릿에서 시작하여 수행할 수 있는 몇 가지 다운스트림 응용 분야가 있으며, 모두 분리된 집락에서 수행된 분석에 비해 민감도와 특이도가 감소하지 않고 결과를 얻기까지의 시간을 단축하는 이점이 있습니다. 일단 숙달된 페이트는, 제대로 수행된다면 약 30분 안에 준비를 완료할 수 있습니다.혈액 배양 작업은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 장갑 및 라이나 플로우 후드 아래에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

현장 하이브리드화 분석에서 형광 펩타이드 핵산 (PNA 물고기)를 사용하여 긍정적인 혈액 배양에서 Enterococcus faecalis와 다른 Enterococcus 종의 직접 확인을위한 신속한 프로토콜.

의 식별을위한 1.5 시간 절차 Enterococcus</em직접 혈액 배양에서> 종

세균성 병원체 진단을위한 간단 하루 워크플로우 방식의 디자인은 혈류 감염의 급속한 인식을 가능하게합니다. 여덟 임상적으로 관련성이 높은 세균성 대상과 항생제 저항 프로파일을 포함하는 더 적절한 치료로 이어질 수있는 당일에 임상 초기 통찰력을 제공합니다.

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Google은 최근은 간단 세균 검출을위한 형광 분석 "을 믹스 앤 읽기"를 설정하는 데 적용할 수있는 형광 DNAzyme 프로브를 생성하기위한 새로운 접근 방식을보고했습니다. 이러한 특별한 유전자 프로브는이를 형광 신호 생성에 세균 검출을 번역 특정 세균에 의해 생산되는 원유 세포외 혼합물 (CEM)의 앞에서 발색단 - 수정의 DNA-RNA 키메라 기판의 절단을 catalyze. 이 보고서에서 우리는 "RFD-EC1"표시된 특정 DNAzyme 프로브는 모델 박테리아의 탐지를 위해 고용되는 핵심 실험 절차를...

형광 DNAzymes을 사용하여 박테리아의 탐지

출처: Koeth, LM, et. al., 호기성 성장 박테리아의 달바반신 체외 감수성 테스트에 대한 참조 국물 미세 희석 방법. J. Vis. 경험. (2015).이 비디오는 그람 양성균에 대한 리포글리코펩타이드 항생제의 최소 억제 농도(MIC)를 결정하기 위한 국물 미세 희석 방법을 보여줍니다. 박테리아 콜로니 분리, 희석, 다양한 항생제 농도의 마이크로플레이트 웰 접종, 배양 순도 및 세포 수 검증을 다룹니다. 이 비디오는 또한 항생제 결합이 세포벽 합성을 방해하여 용해를 유발하는 방법과 눈에 보이는 성장 억제를 기반으로 MIC를 식별하는 방법을 설명합니다.

그람 양성균의 항생제 감수성 시험을 위한 국물 미세 희석 방법

단기 (MALDI-TOF) 질량 분석 (MS) 직접 혈액 배양액 행의 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 시간 애플리케이션은 박테리아의 식별을 촉진. 제출 방법은 직접 혈액 배양액에서 그람 음성 박테리아의 식별을위한 신속하고 신뢰할 수있는 방법입니다.

MALDI-TOF 질량 분석기를 사용하여 혈액 배양액에서 그람 음성 박테리아의 빠른 확인

항균 시너지 테스트 조합에 사용 되는 두 개 이상의 항생제의 효과 평가 하는 데 사용 하 고는 일반적으로 두 가지 방법 중 하나에 의해 수행: 바둑판 배열 또는 시간 죽 일 분석 결과. 여기, 우리는 자동화 된, 잉크젯 프린터 기반 바둑판 배열 시너지 기술 및 고전적인 시간 죽이기 시너지 연구 제시.

잉크젯 프린터 기반으로 테스트 자동화 된 바둑판 배열 및 수동 시간 죽 일 방법 항균 시너지

형광 태그 항생제는 항균 저항의 다중 양상을 공부하기 위하여 이용될 수 있는 강력한 공구입니다. 이 문서는 형광 태그 항생제의 제조 및 박테리아에서 항생제 저항을 공부 하는 그들의 응용 프로그램을 설명 합니다. 프로브는 분광광도법, 유세포 분석 및 현미경 검사법에 의한 세균 저항(예: 유출)의 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

형광 항생제 프로브를 사용한 세균 저항성 시각화

이 프로토콜은D2O대사의 단일 세포 자극 라만 산란 이미징에 의해 2.5시간 이내에 신속한 항균 감수성 테스트(AST) 분석을 제공합니다. 이 방법은 소변 또는 전혈 환경의 박테리아에 적용되며, 이는 클리닉에서 신속한 단일 세포 표현형 AST를 변형시킵니다.

단일 박테리아에 혼입된 중수소의 자극된 라만 산란 이미징에 의한 신속한 항균 감수성 테스트

여기에서는 물에서 항생제 내성 박테리아의 분리 및 식별과 항생제 내성 유전자(ARG)의 분자 특성 분석을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 배양 기반 및 비배양 기반(메타게놈 분석) 기술을 사용하면 인도 뭄바이의 담수에 존재하는 다양한 ARG의 총 박테리아 다양성과 총 풀에 대한 완전한 정보를 얻을 수 있습니다.

수인성 항생제 내성 박테리아의 분리 및 동정과 항생제 내성 유전자의 분자 특성 분석

EUCAST는 자동 혈액 배양을 위한 직접 항균제 감수성 검사(AST) 프로토콜을 개발했습니다. 그러나 질량 분석 기반 미생물 식별에 대한 의존성은 자동화된 미생물 식별 시스템에서 직접 접종 준비 프로토콜을 사용하여 제거할 수 있습니다. 이 접근 방식은 검체 채취 후 24시간 이내에 AST 보고서를 제공할 수 있습니다.

질량 분석법 없이 EUCAST RAST 방법을 용이하게 하기 위해 자동 미생물 식별 시스템을 사용한 직접 미생물 식별

배우세요 양성 혈액 배양액에서 세균 펠렛을 제조하는 방법을. 원심분리와 염화암모늄 처리를 통해 적혈구를 용해하고 세균을 농축하여 MALDI-TOF 및 항생제 감수성 테스트를 신속하게 수행할 수 있습니다.

빠른 세균의 식별 및 항생제 감수성 테스트를위한 혈액 문화 펠렛의 제조

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