Name: 단일 평면 조명 모듈과 와이드 필드 현미경 용 마이크로 모세관 접근법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-15T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 배우세요 단일 평면 조명 현미경법을 이용하여 3차원 세포 스페로이드의 형태와 약물 흡수를 실시간으로 관찰하는 방법을. 마이크로유체 시스템을 활용한 이 기술은 신경과학 및 세포생물학 연구에 활용됩니다.

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이 프로젝트는 토지 바덴 뷔 르템 베르크에 의해뿐만 아니라 유럽 연합 (EU), 유로 파이스 퐁 자금 엘리제 REGIONALE ENTWICKLUNG 다이했다. 저자는 숙련 된 기술 지원 U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 세포주와 클라우디아 Hintze를 제공​​하기위한 라이너 티그 (ILM 울름를) 감사합니다.

1 셀 회전 타원체 성장하고 배양 <ol><li> 실험 1 : 셀 회전 타원체는 화학 요법 약물과 함께 배양 <ol><li> (6 판에 충분한) 30 ml의 배지에 아가로 오스 0.45 g을 첨가하여 배양액에 1.5 % 아가로 오스를 준비한다. </li><li> 수시로를 교반하면서 단계 1.1.1에서 최소 80 ° C로 가열하여 혼합합니다. </li><li> 96 웰 플레이트의 각 웰에 단계 1.1.2에서 가열 된 혼합물의 50 μl를 작성하고 1 ~ 2 시간 내에 확고히 할 수 있습니다. 사용할 때까지 5 ° C에서 냉장고에 폐쇄 덮여 판을 보관하십시오. </li><li> 제조 된 96 - 웰 10 % 소 태아 혈청 (FCS)이 보충 된 햄 F-12 배지와 둘 베코 변형 이글 배지에 (DMEM)에서 플레이트와 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신의 각 웰에 150 MCF-7 유방암 세포에 대한 종자 . </li><li> 5 % CO 2와 37에서 인큐베이터에서 약 200 ~ 300 μm의 직경에 5-7 일 동안 회전 타원체 성장76, C. </li><li> 5 % CO 2와 37 ° C에서 인큐베이터에서 2 μM과 (배지에서) 8 μM 사이의 농도 범위에서 6 시간 동안 안트라 사이클린 항생제 독소루비신 염산염과 셀 회전 타원체를 품어. </li><li> 문화 매체 또는 얼의 균형 소금 솔루션 (EBSS) 현미경의 이전과 셀 회전 타원체을 씻으십시오. </li></ol></li><li> 실험 2 : 산화 환원 센서를 발현 타원체의 산화 공정 <ol><li> DMEM에서 96 - 웰 플레이트의 영구적 아가 로스 겔 피복 웰 글루타티온 민감한 녹색 형광 산화 환원 센서 Grx1-roGFP2 (절차 단계에 설명 1.1.1-1.1.3)로 형질 400 U251-MG-L106의 아교 모세포종 세포에 대한 종자 배양 배지는 10 % FCS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 하이 그로 마이신 B (/ ㎖ 150 μg)으로 보충. </li><li> 5 % CO 2, 37 ℃에서 인큐베이터에서 약 200 ~ 300 μm의 직경에 5-7 일 동안 회전 타원체를 성장. </li><li> 10 &amp; # 추가181, 100 mM의 스톡 용액을 만들기 위해 990 ㎕의 이중 증류수에 과산화수소 수용액 (purum 펜실바니아, ≥ 30 %)의 (L)은 12 시간 이내에 사용해야한다. </li><li> 바로 실험 전 단계에서 EBSS에서 1.2.3 50 μM을 원액을 희석. </li><li> 산화 환원 센서의 산화 EBSS에 과산화수소 50 μM와 측정 중에 마이크로 유체 시스템을 통한 세포 배양 타원체. </li></ol></li><li> 실험 3 : 개시 및 회전 타원체 내에서 세포 괴사의 표시 <ol><li> 보충 된 DMEM 배지에서 96 - 웰 플레이트의 아가로 오스 겔 피복 종자 웰에 400 세포 (예, U251-MG-L106-Grx1-roGFP2의 아교 모세포종 세포) (절차 단계에서 설명 1.1.1-1.1.3) 10 % FCS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 하이 그로 마이신 B (150 ㎎ / ㎖). </li><li> 5 % CO 2, 37 ℃에서 인큐베이터에서 약 200 ~ 300 μm의 직경에 5-7 일 동안 회전 타원체를 성장. </li><li> 셀을 품어배지에서 1 μM의 농도에서 3 시간 동안 미토콘드리아 전자 수송 억제제 로테와 타원체 세포 괴사를 유도한다. 또한, 괴사 세포에 라벨을 1 ㎖의 배양 배지에서 1 μL의 농도로 3 시간 동안 녹색 세포 독성 염료와 공동 품어. </li><li> 문화 매체 또는 현미경의 이전 EBSS와 셀 회전 타원체을 씻으십시오. </li></ol></li></ol> 2 라이트 시트 조정 주 : 최상의 결과를 달성하기 위해 그것은 광 시트의 빔 허리는 대물 렌즈의 포커스 평면에 있음을 보장해야한다. 빔 허리의 위치는 단지 (- 2.8 단계 2.5 참조), 모세관에 대하여 수직 위치에서 광 시트를 관찰하여 정렬 될 수있다. <ol><li> 도립 현미경을 사용하여 참고 문헌에 설명 된 것처럼, 여기 SPIM 모듈을 탑재. (16), 위치 결정 테이블의베이스 플레이트 (도 1a 참조). </li><li> 1 현미경을 착용0X / 또는 20X 0.3 / 0.5 현미경 대물 렌즈와 현미경의 검출 경로에 적합한 긴 통과 필터 (예를 들어, λ ≥ 515 nm의). </li><li> 현미경의 검출 포트에 통합 카메라를 탑재합니다. </li><li> 우선적으로 470 나노 미터의 여기 파장으로 레이저 또는 레이저 다이오드의 빔 평행 시준을 사용 SPIM 모듈에 적용. </li><li> 빛 시트의 빔 허리의 축 조정을위한 수직 위치로 빛을 시트를 전송 90도에 의해 원통형 렌즈를 돌립니다. </li><li> 샘플 홀더에 형광 염료와 액체를 포함하는 모세관을 놓습니다. </li><li> 현미경의 위치 결정 테이블에 모세관 샘플 홀더를 부착하고이를 중심 광 시트의 빔 허리 초점이되도록 모세관의 위치를​​ 정렬. </li><li> 원통형 렌즈 자체의 축 방향 위치의 변화에​​ 의해 빔 허리를 조정. 광고 후 렌즈를 돌려,justment. </li></ol> 3 셀 회전 타원체의 응용 프로그램 및 현미경 피드 동기화 <ol><li> 600 μm의 × 600 μm의의 내부 단면과 120 μM의 두께와 별도로 또는 직사각형 붕규산 유리 모세관 (16) 내에서 그룹 셀 회전 타원체를 놓습니다. 셀 회전 타원체의 응용 프로그램에 대한 두 가지 기술이 성공적으로 입증했다. <ol><li> 엄지 손가락과 가운데 손가락 똑바로 빈 모세관을 가지고 당신의 집게 손가락 상부 개구를 밀봉. 하부 주위의 액체 셀 타원체 주변 개구 (EBSS 또는 배양 배지)을 준비한다. 상부 개구에서 집게 손가락을 뗍니다. 그 안에있는 셀 회전 타원체와 액체는 모세관 힘에 의해 즉시에 배어됩니다. 모세관의 각각의 수직 위치에서 중력에 의해 채워진 모세관 내에서 회전 타원체의 위치를​​ 조정합니다. </li><li> 또한, 피펫 팅을 통해 모세관에 셀 회전 타원체를 적용합니다. 관리 그쪽을 가지고회전 타원체의 크기만큼 큰 한편이다 피펫의 선단의 개구를, T와, 다른 한편으로는, 더 적은 또는 모세관의 내경의 크기와 동일. </li></ol></li><li> 현미경을위한 특별한 샘플 홀더 그것에 회전 타원체와 모세관을 놓습니다. </li><li> 현미경의 위치 결정 테이블에 모세관 샘플 홀더를 부착하고 중심 집중되도록 셀 타원체의 위치를​​ 정렬. </li><li> 광 시트 및 반사 미러의 위치와 원통형 렌즈를 조정함으로써, 검출 패스의 현미경 대물 렌즈의 초점면 사이의 일치를 설정 (도 1b에 조절 나사를 참조). </li><li> 마이크로 미터 나사를 조정하여 굴절률과 어항 효과를 보상하기위한 대물 렌즈의 개구 수에 따라 (도 1b 참조). NOTE : 다른 굴절률을 샘플의 인덱스 t와 주변 매체그 대물 렌즈의 이동과 초점 평면의 변화 간의 차이와 대물 렌즈 리드. 광 시트는 대물 터릿에 의해 이동되기 때문에, 광 시트 (대물 렌즈의 시프트에 대응)과 초점 평면의 시프트의 시프트 간의 불일치는 레버 아암에 의해 보상된다 (도 1b 참조). 마이크로 미터 나사가 대물 렌즈의 개구 수와 굴절률에 따른 광 시트의 이동을 조절하기 위해 상부 및 하부 핀 사이의 간격을 조정하기 위해 사용된다. </li></ol><img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig1highres.jpg" width="500"> 단일 평면의 조명도 1 (A) 도립 현미경의 위치 결정 테이블의베이스 플레이트에 장착 된 하나의 평면 조명 모듈의 그림, (B) 설치모듈과 현미경 공급 동기화 초점 평면과 조명 평면 사이의 리프팅 불일치 (어항 효과)를 보상한다. ΔZ o를 초점면의 이동과 광 시트 F 대물 렌즈와 ΔZ의 변화를 나타냅니다. 인레이는 회전 타원체 포함하는 모세 혈관의 단면을 보여줍니다. 왼쪽 : 직사각형 모세관 600 μm의 (벽 120 μm의)의 내경. 오른쪽 : 회전에 사용되는 설치 프로그램을 실행합니다. 내부 원형 모세관 (내경 400 μM, 550 μM, 외경)은 외측 직사각형 모세관 내에서 회전된다. 이 모세 혈관 사이에 공간이 침지 액체로 채워진다. 동적 액체 환경에서의 4 측정 NOTE : 이전 프로토콜 셀 타원체 이전 단순한 중력에 의해 모세관 장소에서 배양 한 후 유지되어있는 측정 전에 정적 배양을 위해 사용된다. 상기 fixati은 필요 없다에. 그러나, 동적 배양하고, 따라서 역동적 인 환경이 흡수 반응 속도를 측정하는 것이 바람직하다 매체를 흐르는 측정을 위해, 하나는이 하위 프로토콜을 수행 할 수 있습니다. 4.5-4.9이 시료에 도달하는 공기 방울을 방지하기 위해 중요한 단계. <ol><li> 30 분 내측 유리 표면에 세포 타원체 이후 세포 접착 성을 지원하기위한 FCS와 모세관을 채운다. </li><li> 고갈 된 모세 혈관에 남아있는 FCS 코팅은 적어도 12 시간 동안 건조 보자. </li><li> 단계 3.2에 기재된 바와 같이 코팅 된 FCS 모세관 셀 타원체를 소개한다. </li><li> 회전 타원체의 세포 접착의 원인이 5 % CO 2 및 추가 2-4 시간 동안 37 ° C에서 인큐베이터에있는 모세 혈관을 둡니다. </li><li> 마이크로 유체 시스템의 afflux 부분을 설정 (도 2 참조). (: 0.89 mm 내경) 형광 염료, 약물 또는 에이전트를 포함하는 배양 배지와 함께 호스의 afflux을 채우기 위해 연동 펌프를 사용합니다. </li><li> 도없고기포 트랩 마이크로 유체 시스템의 afflux 부분 CT (도 2 참조). </li><li> 제 afflux 튜브에 기포없이 모세관 클램프하고 드레인 호스에 모세관의 다른 쪽 클램프. </li><li> 튠 원하는 값 (예를 들면, 37의 C)에 수조의 액체 온도. </li><li> 원하는 펌프 속도에 연동 펌프를 조정 (예를 들면, 유량 : 10 μL / 분; 펌프 속도에서 모세관 : 25mm / 분). </li><li> ,받는 사람 (개방 루프 설정)에서 펌핑 된 액체를 수집 소스 (폐쇄 루프 설정)로 다시 공급되거나 연동 펌프 (꽉 닫힌 루프 설치)의 튜브에 직접 공급. </li></ol><img alt="그림이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig2highres.jpg" width="500"> 그림 2 미세 유체 설치 (개방 루프 꽉 폐쇄 루프); 인레이 : SPH의 조명도립 현미경에 연결된 광 시트 기반 형광 현미경을 이용하여 마이크로 모세관 내의 eroid. (5) 데이터 수집 및 분석 <ol><li> 레이저 파워와 화상 획득에 대한 통합 시간을 설정한다. </li><li> 단계 5.1에 정의 된 매개 변수가 빛 선량 값 원시 세포에 대해 50 ~ 100 J / cm 2 또는 형광 단백질 인코딩 플라스미드와 형광 염료와 함께 배양 또는 형질 세포에 대한 10 ~ 20 J / cm 2를 초과하지 않도록주의하십시오 (세부 사항 참조. 12 참조를 위해) 광독성을 피하십시오. </li><li> ΔZ에 Z-스택 증가 = 빛 시트 두께가 약 10 μm의 그대로 3 차원 데이터 분석을 위해 바람직하다 5 ~ 10 μm의를 설정합니다. </li><li> 셀 회전 타원체 내에서 초점면의 변화에​​ 의해 하나의 이미지 또는 z-스택의 측정을 수행합니다. </li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

본 원고는 광 시트 또는 3 차원 전지 시스템에 최적화 된 단일 평면 조명 현미경 (SPIM) 장치, 예를 들면, 다세포 종양 타원체 (MCTS)를 설명한다. 세 가지 예시적인 애플리케이션은 (1) 세포 증식 억제 약물의 흡수 및 (화학 치료 효능에 기여 여전히 평가 될 남아) 분해물과의 부분적인 전환, 유전자 부호화 글루타티온 센서 사용시에 의한 산화 환원 상태의 (2)의 측정을 포함 산화제를 첨가하고, (3) 개시 및 미토콘드리아 호흡 사슬의 억제시 세포 괴사의 라벨. 기존 시스템 (예를 들면은, 사람들은 문헌에보고. 7, 8, 9, 14, 15)와 비교하여이 SPIM 모듈의 주요 장점은이 쉽게 반전 와이드 필드 현미경에 적용 할 수 있도록하고, 시료에 있는지 소량의 O를 필요로 작은 측정 챔버 (마이크로 모세관)F 형광 염료, 약제 또는 약물 따라서 제약 테스트를위한 예 비용을 최소화, 실험의 다양한 종류에...

잘 확립 방법 (공 초점 또는 다중 광자 레이저 스캐닝 현미경 1-4, 구조화 된 조명 현미경 5,6) 광 시트 또는 단일 평면 조명 현미경 (SPIM) 이외에 3D 촬상 7,8의 방법에 유용한 것으로 입증했다 9. 특히 관심 신약 개발 연구 10,11 위해 점점 사용 3 차원 세포 배양, 예를 들면, 다세포 종양 타원체 (MCTS)에의 응용이다. 또한, SPIM 심지어 장기간 노출 또는 반복적 인 측정에 저조도 투여는이 평면이 광에 노출되는 샘플의 각면의 측정하므로, 시료의 생존을 유지하는 데 필요한 특수한 방법이다. 이것은 각각의 초점면의 검출 샘플 전체가 켜져 다른 현미경 기법과 대조적이며, 광 도즈 합까지 다양한 평면의 기록시되도록 시료 (12)를 손상시킬 수있다. </p&gt; 광 시트 현미경 또는 SPIM는 원통형 렌즈의 사용에 의해 또는 (리뷰 참조 참조. 08) 흥미로운 레이저 빔을 스캔하여 어느 관측 경로에 수직 한 방향으로 샘플의 조명에 기초한다. 이것은 종종 특별한 샘플 챔버 13,14 또는 매트릭스를 필요로 예를 들면, 아가 로스 7,15 특별한 고가 현미경으로 구현. 이러한 시스템에 대한 대안으로서 SPIM위한 비교적 단순한 조명 장치가 개발되고 있으며, 종래의 도립 현미경 (16) (도 1 참조)에 적응. 약 100 μM의 필드의 깊이에 걸쳐 6-10 μm의 두께의 광 시트에이 원통형 렌즈 (0.08 : 50mm, 개구 초점 길이)로 8mm의 직경을 확대하고 초점 레이저 빔 이루어져 . 샘플은 현미경 대물 LEN 앞에 배치 600-900 μm의 내경의 직사각형 모세관에있는형광 검출을위한 발. 이러한 주요 기능은 현재 완성 유지하기위한 형광 검출 (동일한 광로에 사용 (축 방향) 샘플 조명광 시트의 동기 조정하고, 대물 렌즈를 회전시키기위한 진보 된 마이크로 모세관 접근법을 사용함으로써 최적화된다 변위의 길이, 따라서 필요한 양과 비용을 최소화 기계적 피드 보정)하고, 형광 염료, 약제 또는 약물의 응용을위한 마이크로 유체 시스템의 적응을 필요로한다.

<table><tbody><tr><td>Microtiter 플레이트</td><td>Orange Scientific</td><td>4430100</td><td>세포 스페로이드 성장</td></tr><tr><td>아가로스용&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3810.1</td><td>세포 스페로이드 성장</td></tr><tr><td>MCF-7 세포주</td><td>CLS Cell Lines Service GmbH</td><td>300273</td><td>세포주</td></tr><tr><td>U251-MG-L106 세포주</td><td>세포주</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>FG0435</td><td>배양 배지</td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F-12</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>FG4815</td><td>배양 배지</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>S0615</td><td>세포 배양 보충제</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>A 2213</td><td>항생제</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>PAA Laboratories&nbsp; &nbsp;</td><td>P02-015</td><td>항생제</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>시그마-알드리치 Inc.</td><td>E3024</td><td>세포 배양 보충제</td></tr><tr><td>독소루비신</td><td>시그마-알드리치 Inc.</td><td>D1515</td><td>형광 염료 (주의 : 급성 독성)</td></tr> <tr><td>녹색 세포 독성 염료</td><td>Promega GmbH</td><td>G8742</td><td>CellTox - 형광 세포 독성 염료</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>R8875</td><td>세포 억제제 (주의 : 급성 독성)</td></tr> <tr><td>과산화수소 (H2O2)</td> <td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>95302</td><td>산화용 시약 (주의: 급성 독성)</td></tr><tr><td>Capillary</td><td>VitroCom&nbsp;</td><td>8260-050</td><td>샘플 준비</td></tr><tr><td>현미경</td><td>Carl Zeiss Jena</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRc CCD 카메라</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>426508-9901-000</td><td>CCD 카메라</td></tr><tr><td>AxioVision 데이터 수집 소프트웨어</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>버전 4.8.2.</td><td></td></tr><tr><td>레이저 다이오드</td><td>Pico Quant GmbH</td><td>LDH-P-C-470</td><td>드라이버와 함께 사용됨 PDL800-B</td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Ismatec Labortechnik</td><td>MS-1 Reglo</td><td>최소 펌프 속도를 1/10 감소시키기 위해 재보정;</td></tr><tr><td>실리콘 튜브</td><td>IDEX 건강 & 사이언스 GmbH</td><td>타이곤 R3607</td><td></td></tr></tbody></table>

단일 평면 조명 모듈과 와이드 필드 현미경 용 마이크로 모세관 접근법

Single Plane Illumination Module and Micro-capillary Approach for a Wide-field Microscope

쉽게 반전 와이드 필드 현미경에 적합한 3 차원 세포 배양에 최적화되어 설명 된 광 시트 또는 단일 평면 조명 현미경 (SPIM) 용 모듈 등 다세포 종양 타원체 (MCTS). SPIM 여기 모듈 모​​양 및 샘플 수직 현미경의 검출 경로 광 시트에 의해 조명되도록 광을 편향시킨다. 시스템은 조명광 시트의 동기 조정뿐만 아니라 형광 검출에 사용되는 대물 렌즈에 의해, 시료 (도 회전시키는 마이크로 모세관 접근 의해 고급 버전에서) 유지하는 직사각형 모세관의 사용을 특징으로한다 형광 염료, 소량의 약제 또는 약물의 응용 프로그램에 대한 마이크로 유체 시스템의 적응에 의해. 이 시스템을 사용하기위한 프로토콜을 제공하고, 몇 가지 기술적 인 세부 사항이보고됩니다. 대표적인 결과는 업 (1)의 측정치를 포함산화제의 첨가시 세포 증식 억제 약물 (독소루비신) 및 분해 생성물과의 부분적인 전환의 유전자 인코딩 글루타티온 센서를 이용하여, (2) 산화 환원 측정을 수행하고, (3) 개시 및 억제시 세포 괴사 라벨링 미토콘드리아 호흡 사슬. 기존 시스템에 비해 본 SPIM 모듈의 차이점 및 이점이 논의된다.

실험 1 : 셀 회전 타원체는 화학 요법 약물과 함께 배양 이전에 배양 MCF-7 세포 회전 타원체 (8 μM 독소루비신 (doxorubicin), 6 시간)의 Z-스택 스캔은 그림 3에 나와있다.이 세포 흡수 및 독소루비신 (17)의 분포와 그 분해 산물 (18, 19)에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 내측 회전 타원체 분야 분해물에 의해 방출 된 녹색 형광이 세포질 막 (19)에 지배되고, 반면 구형의 적색 형광성 독소루비신의 외 세포층에서 주로 핵 지역화된다. <img alt="그림 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig3highres.jpg" width="40...

단일 평면 조명 현미경 용 모듈 (SPIM)이 쉽게 반전 와이드 필드 현미경에 적합한 3 차원 세포 배양을 위해 최적화되어 설명된다. 샘플은 직사각형 모세관 내에 위치되며, 마이크로 유체 시스템 형광 염료로, 약제 또는 약물은 소량으로 적용 할 수있다.

A module for light sheet or single plane illumination microscopy (SPIM) is described which is easily adapted to an inverted wide-field microscope and ...

이 절차의 전반적인 목표는 도립 현미경용 광시트 여기 모듈을 사용하여 단일 평면 조명 현미경 검사를 수행하고 이를 3차원 세포 스페로이드에 적용하는 것입니다. 이는 먼저 피펫을 사용하여 세포 스페로이드를 마이크로타이터 플레이트의 웰에서 두 번째 웰로 옮겨 세척 후 배양함으로써 수행됩니다. 그런 다음 S 스페로이드가 직사각형 모세관에 도입됩니다.두 번째 단계는 광시트 조명 모듈을 도립 현미경 포지셔닝 테이블의 베이스 플레이트에 장착하는 것입니다. 다음으로, 스테로이드를 함유한 모세관을 현미경 검사를 위한 특수 샘플 홀더에 넣습니다. 마지막 단계는 검출 경로에서 광학 시트와 현미경 대물 렌즈의 초점면 간의 일치를 설정하는 것입니다.궁극적으로, 3차원 형광 측정은 세포 스페로이드 내 초점면의 변화에 의해 수행되어 약물의 흡수 또는 S 스페로이드의 구조에 관한 단일 이미지 또는 Zacks의 정보를 얻을 수 있습니다. 기존 광시트 현미경에 비해 이 기술의 주요 장점은 기존 현미경에 적용할 수 있는 모듈로 구성되어 있고 연구에 큰 자유도를 제공하기 때문에 비용 효율적이고 다재다능하다는 것입니다. 이 기술의 의미는 치료 및 진단에 사용되는 약물 및 약제의 연구로 확장되며, 특히 미세 유체 시스템의 적응으로 인해 흐름 조건에서 빠른 프로세스를 조사할 수 있기 때문에 확장됩니다.이제 이 여기 방법은 모든 검출 기술과 결합하여 낮은 광 선량에서 살아있는 세포 스테로이드에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 cipro fish, artila embryos 및 광학 CLE 조직 샘플과 같은 다른 살아있는 시스템에도 적용할 수 있습니다. 시작하려면 50 웰 플레이트의 각 웰에 배양 배지에서 가열된 1.5 에어로를 96 마이크로리터 넣고 1-2시간 동안 응고시킵니다.그런 다음 준비된 96웰 플레이트 총 S의 각 웰에 약 150개의 MCF 7개의 유방암 세포를 5-7일 동안 5-7일 동안 인큐베이터에서 약 200-300마이크로미터의 직경으로 파종합니다. 다음으로, 세포 스테로이드를 안트라사이클린 항생제인 독소루비신 염산염과 함께 배양에서 2마이크로몰과 8마이크로몰 사이의 농도로 6시간 동안 배양합니다. 배지 배양 후 현미경 검사 전에 배양액, 배지 또는 Earl's balance salt 용액으로 세포 OID를 세척합니다.도립 현미경을 사용하여 단일 평면 조명 현미경 또는 SPM 여기 모듈을 포지셔닝 테이블의 베이스 플레이트에 장착합니다. 현미경의 검출 경로에 10배 또는 20배 확대 현미경 대물 렌즈와 적절한 장역 통과 필터를 현미경에 장착합니다. 그런 다음 통합 카메라를 현미경의 감지 포트에 장착합니다.여기 파장이 우선적으로 470나노미터인 레이저 또는 레이저 다이오드의 병렬 대조 빔을 사용하여 스핀 모듈에 적용합니다. 다음으로, 원통형 렌즈를 90도 회전하여 광 시트의 빔 웨이스트를 축 방향으로 조정하기 위해 광 시트를 수직 위치로 이동합니다. 형광 염료가 포함된 액체가 들어 있는 모세관을 샘플 홀더에 놓습니다.모세관이 있는 샘플 홀더를 현미경의 위치 지정 테이블에 부착합니다. 모세관의 위치가 중앙에 오도록 정렬하고 광 시트의 빔 웨이스트에 초점이 맞춰지도록 합니다. cylindrical lens 자체의 축 위치의 변화에 따라 beam waist를 조정합니다.조정 후 렌즈를 되돌립니다. 세포 스테로이드를 내부 단면적이 600 x 600 마이크로미터이고 벽 두께가 120 마이크로미터인 직사각형 규산보 유리 모세관 내에 개별적으로 또는 그룹으로 배치합니다. 이를 위해 엄지와 중지로 빈 모세관을 똑바로 세우고 집게손가락으로 위쪽 구멍을 막습니다.스테로이드가 주입된 위쪽 개구부 액체에서 집게손가락을 둘러싼 세포 회전 타원체에 가까운 아래쪽 개구부를 가져옵니다. 그것은 모세관 힘에 의해 즉시 흡수될 것입니다. 중력에 의해 채워진 모세관 내에서 S 스페로이드의 위치를 조정합니다.또는 피펫팅을 통해 스테로이드를 모세혈관에 도포합니다. 피펫 끝의 개구부가 한편으로는 S 스페로이드 크기에 비해 충분히 크고 다른 한편으로는 모세관의 내경보다 작거나 같은 크기인지 주의하십시오. 그런 다음 S 스페로이드가 포함된 모세관을 현미경 검사의 특수 샘플 홀더에 넣습니다.모세관이 있는 샘플 홀더를 현미경의 위치 지정 테이블에 부착하고 세포 스테로이드가 중앙에 집중되고 초점이 맞춰지도록 세포 스테로이드의 위치를 정렬합니다. 반사 거울과 원통형 렌즈의 위치를 조정하여 검출 경로에서 광 시트와 현미경 대물 렌즈의 초점면 사이의 일치를 설정합니다. 모세혈관을 태아 송아지 혈청 또는 FCS로 30분 동안 채워 나중에 세포 스테로이드가 내부 유리 표면에 세포가 접착되도록 지원합니다.고갈된 모세관에 남아 있는 FCS 코팅을 FCS 코팅된 모세관에 세포 스테로이드를 도입한 후 최소 12시간 동안 건조시킵니다. 이전과 마찬가지로 인큐베이터에 모세관을 추가로 2-4시간 동안 그대로 두어 스테로이드의 세포 접착을 유발합니다. 다음으로, 버블 트랩을 포함한 미세유체 시스템의 flx 부분을 설정합니다.연동 펌프를 사용하여 튜브의 flx를 형광 염료 약물 또는 제제를 포함하는 배양 배지로 채웁니다. 먼저 기포가 없는 모세관을 유출 튜브에 고정한 다음 모세관의 다른 쪽을 배수 튜브에 고정합니다. 수조의 액체 온도를 원하는 값으로 조정하십시오.그런 다음 연동 펌프를 원하는 펌프 속도로 조정합니다. 데이터 수집 및 분석을 위한 개방 루프 설정을 통해 펌핑된 액체를 수용체로 수집합니다. 이미지 획득을 위한 레이저 출력과 통합 시간을 설정합니다.ZS 스택의 증분을 5마이크로미터에서 10마이크로미터 사이의 값으로 설정하며, 이는 3차원 데이터 분석에 적합합니다. 광시트 두께가 약 10마이크로미터이므로 세포 스테로이드 내 초점면의 변화에 의해 단일 이미지 또는 Zacks의 측정을 수행합니다. 이전에 8마이크로몰 독소루비신으로 6시간 동안 배양된 mc 7 세포 스테로이드의 Zack 스캔이 표시됩니다.이 이미지는 독소루비신의 세포 흡수 및 분포와 분해에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 스테로이드 적색 형광 독소루비신의 외부 세포층 내 생성물은 주로 핵에 국한되어 있는 반면, 내부 sphe roid 영역에서는 분해 산물에 의해 제출된 녹색 형광이 세포막에서 우세합니다. 천연 mc seven 인간 유방암 세포 S에서 화학 요법 약물 독소루비신의 흡수는 spm에 의해 선택된 단일 세포층에 대해 묘사됩니다.유동 시스템 내에서 2 개의 마이크로 몰 및 배양 배지를 적용하면 독소루비신과 그 분해 생성물의 적색 및 녹색 형광이 지속적으로 증가하여 유동 시스템 내의 배양 배지에 2 마이크로 몰 독소루비신을 적용하면 독소루비신과 그 분해 생성물의 적색 및 녹색 형광이 지속적으로 증가했습니다. 마스터링이 완료되면 광시트 제거 모듈을 장착한 후 3D 샘플의 형광 이미지를 기록할 때까지 몇 분 밖에 걸리지 않습니다. 유동 조건을 측정할 때 샘플이 모세관의 내부 표면에 부착되도록 하고 기포가 샘플에 도달하여 모세관에서 분리될 수 있는 것을 방지하는 것이 가장 중요합니다.이 비디오를 시청한 후에는 다양한 현미경에 적용할 수 있는 다용도 모듈을 사용하여 광시트 조명 현미경 검사에 대해 잘 이해하게 될 것입니다.

single-plane-illumination-module-micro-capillary-approach-for-wide

Research

연구

JoVE Journal

Engineering

공학

그들의 모국어 microenvironment에서 진화 많은 생물 학적 및 임상 상황에서는 그것은 세포 프로세스를 연구에 유리합니다. 여기 우리는 세포 배양, 동물 실험 및 임상 환자 연구에 실시간 영상을 제공할 수있는 저비 용의 광섬유 현미경의 조립 및 사용에 대해 설명합니다.

고해상도 광섬유 Microendoscopy에 대한 현장에서 세포 이미징

lensless 온칩 형광 현미경 플랫폼 시연입니다 예의 울트라 와이드 뷰 필드 이상의 이미지를 형광 물체 수, 디코딩 알고리즘을 기반으로 압축 샘플링을 사용하여 &lt;4μm 해상도&gt; 0.6-8 cm2. 이러한 작고 넓은 분야 형광 온 칩 영상 양상은 높은 처리량 cytometry, 희귀 세포 연구와 microarray 분석을 위해 도움이 될 수 있습니다.

칩에 Lensless 형광 현미경

사용자 정의, 실시간 공촛점 스캐닝 이미징 시스템의 전체 구조는 설명합니다. 쉽게 동영상 속도 현미경 및 microendoscopy 사용할 수있는이 시스템은, 비용의 일부로 표준 상용 공촛점 시스템을 사용하여 액세스할 수 없습니다 이미징 형상 및 응용 프로그램의 배열을 허용합니다.

비디오 - 속도 검색 공촛점 현미경과 Microendoscopy

Lensfree 광학 tomography은 &lt;1 μm의의 공간적 해상도를 제공하는 입체 현미경 기법이다 × &lt;1 μm의 × 15~1백밀리미터의 큰 이미지 볼륨여 각각 X, Y 및 Z 크기에서 &lt;3...

멀티 앵글 조명 및 픽셀 슈퍼 해상도를 채용 Lensfree 온칩 단층 현미경

성체 마우스의 림프절에서 120 ㎛의 깊이까지의 향상된 콘트라스트와 높은 해상도의 intravital 촬상 공간적 다중 초점 이광자 현미경의 여기 패턴을 변조함으로써 달성된다. 100 μm의 깊이에서 우리는 따라서 산란 및 회절 한계를 우회, 487 ㎚의 해상도 (측면) 및 551 nm의 (축 방향)을 측정 하였다.

어린 싹 센터의 높은 해결의 intravital 스트라이프 - 조명 현미경

단백질 기능화 평면 유리 지지 지질 이중층의 준비, 내 단백질 이동성 측정 및 단백질 밀도 측정이 여기에 나와 있습니다. 노이즈를 줄인 내부 전반사(Total Internal Reflection) 현미경을 구축하기 위한 로드맵이 요약되어 있으며, 이를 통해 높은 시공간 해상도로 단일 이중층 상주 형광 색소를 시각화할 수 있습니다.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

최근 우리 라이브 셀에 기본 속눈썹 안쪽 translocating 다양 한 단백질에 대 한 전송 경로의 3 차원 (3D) 공간 위치 매핑. 여기 실험 설정, 생물 학적 샘플의 과정 및 접근을 새로 이미징 3D 슈퍼 해상도 형광에 대 한 데이터 분석에 적용이 종이 세부 기본 속눈썹 살고 있습니다.

라이브 주 Cilium에서 고속 슈퍼 해상도 속도 현미경의 응용

여기에 우리가 현재 기존의 피 형광 이미징, 단일 분자 검출 기반 슈퍼 해상도 이미징, 및 다중 색상 단일 분자 검출 병합, 통합된 현미경 시스템 구축의 실용적인 가이드 포함 단일 분자 형광 공명 에너지 비용 효율적인 방법으로 하나의 설정으로 이미지를 전송 합니다.

실시 한 형광 현미경으로 여러 영상 모드

상세한 지시는 타일 (HIST) 현미경 및 단일 분자 이미징에 대 한 용법을 휩 쓸 높은 경사를 구축 하는 방법에 설명 되어 있습니다.

높은 경사 구축 가이드 확장 된 시야의 단일 분자 이미징 타일 현미경을 휩 쓸

칩 기반 의 초고해상도 광학 현미경 검사법은 형광 현미경 검사법에 대한 새로운 접근법이며 비용 효율성과 처리량에 이점을 제공합니다. 여기에서, 칩 준비 및 화상 진찰을 위한 프로토콜은 TIRF 현미경 검사법 및 현지화 기지를 둔 초고해상도 현미경 검사법을 위해 도시됩니다.

포토닉 칩을 사용한 고처리량 총 내부 반사 형광 및 직접 적층 광학 재건 현미경

배우세요 단일 평면 조명 현미경법을 이용하여 3차원 세포 스페로이드의 형태와 약물 흡수를 실시간으로 관찰하는 방법을. 마이크로유체 시스템을 활용한 이 기술은 신경과학 및 세포생물학 연구에 활용됩니다.

단일 평면 조명 모듈과 와이드 필드 현미경 용 마이크로 모세관 접근법

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