단일 평면 조명 모듈과 와이드 필드 현미경 용 마이크로 모세관 접근법

이 절차의 전반적인 목표는 도립 현미경용 광시트 여기 모듈을 사용하여 단일 평면 조명 현미경 검사를 수행하고 이를 3차원 세포 스페로이드에 적용하는 것입니다. 이는 먼저 피펫을 사용하여 세포 스페로이드를 마이크로타이터 플레이트의 웰에서 두 번째 웰로 옮겨 세척 후 배양함으로써 수행됩니다. 그런 다음 S 스페로이드가 직사각형 모세관에 도입됩니다.

두 번째 단계는 광시트 조명 모듈을 도립 현미경 포지셔닝 테이블의 베이스 플레이트에 장착하는 것입니다. 다음으로, 스테로이드를 함유한 모세관을 현미경 검사를 위한 특수 샘플 홀더에 넣습니다. 마지막 단계는 검출 경로에서 광학 시트와 현미경 대물 렌즈의 초점면 간의 일치를 설정하는 것입니다.

궁극적으로, 3차원 형광 측정은 세포 스페로이드 내 초점면의 변화에 의해 수행되어 약물의 흡수 또는 S 스페로이드의 구조에 관한 단일 이미지 또는 Zacks의 정보를 얻을 수 있습니다. 기존 광시트 현미경에 비해 이 기술의 주요 장점은 기존 현미경에 적용할 수 있는 모듈로 구성되어 있고 연구에 큰 자유도를 제공하기 때문에 비용 효율적이고 다재다능하다는 것입니다. 이 기술의 의미는 치료 및 진단에 사용되는 약물 및 약제의 연구로 확장되며, 특히 미세 유체 시스템의 적응으로 인해 흐름 조건에서 빠른 프로세스를 조사할 수 있기 때문에 확장됩니다.

이제 이 여기 방법은 모든 검출 기술과 결합하여 낮은 광 선량에서 살아있는 세포 스테로이드에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 cipro fish, artila embryos 및 광학 CLE 조직 샘플과 같은 다른 살아있는 시스템에도 적용할 수 있습니다. 시작하려면 50 웰 플레이트의 각 웰에 배양 배지에서 가열된 1.5 에어로를 96 마이크로리터 넣고 1-2시간 동안 응고시킵니다.

그런 다음 준비된 96웰 플레이트 총 S의 각 웰에 약 150개의 MCF 7개의 유방암 세포를 5-7일 동안 5-7일 동안 인큐베이터에서 약 200-300마이크로미터의 직경으로 파종합니다. 다음으로, 세포 스테로이드를 안트라사이클린 항생제인 독소루비신 염산염과 함께 배양에서 2마이크로몰과 8마이크로몰 사이의 농도로 6시간 동안 배양합니다. 배지 배양 후 현미경 검사 전에 배양액, 배지 또는 Earl's balance salt 용액으로 세포 OID를 세척합니다.

도립 현미경을 사용하여 단일 평면 조명 현미경 또는 SPM 여기 모듈을 포지셔닝 테이블의 베이스 플레이트에 장착합니다. 현미경의 검출 경로에 10배 또는 20배 확대 현미경 대물 렌즈와 적절한 장역 통과 필터를 현미경에 장착합니다. 그런 다음 통합 카메라를 현미경의 감지 포트에 장착합니다.

여기 파장이 우선적으로 470나노미터인 레이저 또는 레이저 다이오드의 병렬 대조 빔을 사용하여 스핀 모듈에 적용합니다. 다음으로, 원통형 렌즈를 90도 회전하여 광 시트의 빔 웨이스트를 축 방향으로 조정하기 위해 광 시트를 수직 위치로 이동합니다. 형광 염료가 포함된 액체가 들어 있는 모세관을 샘플 홀더에 놓습니다.

모세관이 있는 샘플 홀더를 현미경의 위치 지정 테이블에 부착합니다. 모세관의 위치가 중앙에 오도록 정렬하고 광 시트의 빔 웨이스트에 초점이 맞춰지도록 합니다. cylindrical lens 자체의 축 위치의 변화에 따라 beam waist를 조정합니다.

조정 후 렌즈를 되돌립니다. 세포 스테로이드를 내부 단면적이 600 x 600 마이크로미터이고 벽 두께가 120 마이크로미터인 직사각형 규산보 유리 모세관 내에 개별적으로 또는 그룹으로 배치합니다. 이를 위해 엄지와 중지로 빈 모세관을 똑바로 세우고 집게손가락으로 위쪽 구멍을 막습니다.

스테로이드가 주입된 위쪽 개구부 액체에서 집게손가락을 둘러싼 세포 회전 타원체에 가까운 아래쪽 개구부를 가져옵니다. 그것은 모세관 힘에 의해 즉시 흡수될 것입니다. 중력에 의해 채워진 모세관 내에서 S 스페로이드의 위치를 조정합니다.

또는 피펫팅을 통해 스테로이드를 모세혈관에 도포합니다. 피펫 끝의 개구부가 한편으로는 S 스페로이드 크기에 비해 충분히 크고 다른 한편으로는 모세관의 내경보다 작거나 같은 크기인지 주의하십시오. 그런 다음 S 스페로이드가 포함된 모세관을 현미경 검사의 특수 샘플 홀더에 넣습니다.

모세관이 있는 샘플 홀더를 현미경의 위치 지정 테이블에 부착하고 세포 스테로이드가 중앙에 집중되고 초점이 맞춰지도록 세포 스테로이드의 위치를 정렬합니다. 반사 거울과 원통형 렌즈의 위치를 조정하여 검출 경로에서 광 시트와 현미경 대물 렌즈의 초점면 사이의 일치를 설정합니다. 모세혈관을 태아 송아지 혈청 또는 FCS로 30분 동안 채워 나중에 세포 스테로이드가 내부 유리 표면에 세포가 접착되도록 지원합니다.

고갈된 모세관에 남아 있는 FCS 코팅을 FCS 코팅된 모세관에 세포 스테로이드를 도입한 후 최소 12시간 동안 건조시킵니다. 이전과 마찬가지로 인큐베이터에 모세관을 추가로 2-4시간 동안 그대로 두어 스테로이드의 세포 접착을 유발합니다. 다음으로, 버블 트랩을 포함한 미세유체 시스템의 flx 부분을 설정합니다.

연동 펌프를 사용하여 튜브의 flx를 형광 염료 약물 또는 제제를 포함하는 배양 배지로 채웁니다. 먼저 기포가 없는 모세관을 유출 튜브에 고정한 다음 모세관의 다른 쪽을 배수 튜브에 고정합니다. 수조의 액체 온도를 원하는 값으로 조정하십시오.

그런 다음 연동 펌프를 원하는 펌프 속도로 조정합니다. 데이터 수집 및 분석을 위한 개방 루프 설정을 통해 펌핑된 액체를 수용체로 수집합니다. 이미지 획득을 위한 레이저 출력과 통합 시간을 설정합니다.

ZS 스택의 증분을 5마이크로미터에서 10마이크로미터 사이의 값으로 설정하며, 이는 3차원 데이터 분석에 적합합니다. 광시트 두께가 약 10마이크로미터이므로 세포 스테로이드 내 초점면의 변화에 의해 단일 이미지 또는 Zacks의 측정을 수행합니다. 이전에 8마이크로몰 독소루비신으로 6시간 동안 배양된 mc 7 세포 스테로이드의 Zack 스캔이 표시됩니다.

이 이미지는 독소루비신의 세포 흡수 및 분포와 분해에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 스테로이드 적색 형광 독소루비신의 외부 세포층 내 생성물은 주로 핵에 국한되어 있는 반면, 내부 sphe roid 영역에서는 분해 산물에 의해 제출된 녹색 형광이 세포막에서 우세합니다. 천연 mc seven 인간 유방암 세포 S에서 화학 요법 약물 독소루비신의 흡수는 spm에 의해 선택된 단일 세포층에 대해 묘사됩니다.

유동 시스템 내에서 2 개의 마이크로 몰 및 배양 배지를 적용하면 독소루비신과 그 분해 생성물의 적색 및 녹색 형광이 지속적으로 증가하여 유동 시스템 내의 배양 배지에 2 마이크로 몰 독소루비신을 적용하면 독소루비신과 그 분해 생성물의 적색 및 녹색 형광이 지속적으로 증가했습니다. 마스터링이 완료되면 광시트 제거 모듈을 장착한 후 3D 샘플의 형광 이미지를 기록할 때까지 몇 분 밖에 걸리지 않습니다. 유동 조건을 측정할 때 샘플이 모세관의 내부 표면에 부착되도록 하고 기포가 샘플에 도달하여 모세관에서 분리될 수 있는 것을 방지하는 것이 가장 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 다양한 현미경에 적용할 수 있는 다용도 모듈을 사용하여 광시트 조명 현미경 검사에 대해 잘 이해하게 될 것입니다.