Name: 상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 10 s
Description: 배우세요 라이브 세포막에서 지질과 단백질의 확산 법칙을 측정하는 방법을 상용 현미경으로 구현합니다. TIRF 현미경과 가우시안 피팅을 활용한 이 기술은 막 역학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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이 작업은 NIH-P41 P41-RRO3155 및 NIH P50-GM076516(EG에 보조금) 및 Fondazione Monte dei Paschi di Siena(FB에 보조금)에 의해 부분적으로 지원됩니다.

1 시스템 교정 <ol><li> 포인트 확산 함수 (PSF) 교정 <ol><li> 증류수 90 μL에 30 nm의 형광 비드 용액 (약 5 μM) 10 μl를 희석 한 후 20 분 동안 초음파 처리 용액. 사각형 (1cm X 1cm) 아가 로스 겔 (3 %)과 예금 겔의 상단에있는 용액 10 μL의 조각을 잘라. 2cm 페트리 접시의 바닥 유리에 젤의 조각을 뒤집고 유리에 드롭을 짠다. </li><li> 이번 인수 설정을 켭니다 홀더에 샘플을 넣고, 카메라 노출과 EMgain을 설정 (100 밀리 초 및 1000 시스템에 따라 좋은 매개 변수이지만 최적화) 카메라가 식을 때까지 기다립니다. </li><li> 100 밀리 초, 1000에 카메라 EMgain, 획득 모드로 설정 카메라 노출 설정 저장 전송, 100 반복 및 자동 프레임입니다. </li><li> 겔의 테두리에 접안과 투과광 포커스를 사용하고, 겔의 중심부에 대물 이동 및 초점을 조절 STA레이저 정렬 절차 RT (LAS AF에 &#39;TIRF 설정&#39;을 선택하고 자동 정렬 절차를 따르십시오). </li><li> , 참고로 (즉, 일반적으로 구슬 집계를 나타냅니다) 밝은 자리에 초점을 정확하게, 고립 된 하나의 관광 명소와 시야를 찾아 100 프레임을 획득하고 여러 단일 지점을 얻기 위해 단계 5-6 번 반복합니다. </li><li> 데이터 처리 프로그램으로 취득한 일련 오기 및 시간 (도 1a)을 스택 평균 단일 절연 비드를 선택한다. 입자의 응집을 방지하기 위해 최소의 속성을 선택합니다주의하십시오. </li><li> (매트랩 재료의 ICS-matlab에 도구에서) 명령 &quot;gaussfit&quot;을 사용하여 가우시안 함수를 선택한 강도 분포 (단일 구슬 프로파일의 예를 그림 1B에 제시되어있다)를 장착한다. 얻어진 잔류 물을 검사하여 적합도를 확인 (해당 잔차 장착 가우시안 프로파일의 예 난을 제시N 그림 1B). </li></ol></li><li> 카메라 보정 <ol><li> 카메라를 켜고 카메라가 식을 때까지 기다리십시오. 카메라 설정 획득 설정 (즉, 사용 된 카메라 우리는 0.5 밀리 초, 1000에 카메라 EMgain, 자른 모드, 32 X 128, 10000 반복에 대한 투자 수익 (ROI) 크기로 획득 모드로 노출을 설정)와 카메라 배경의 획득을 시작 신호. </li><li> 임포트 데이터 처리 프로그램에 프레임 시리즈를 인수. 계산하고 카메라 배경 칩의 선택 지역에서 약 평평한 지 확인하기 위해 각 픽셀의 평균 강도를 검사합니다. 카메라 배경 일반적 경계선 바이어스되기 때문에 자른 모드에서, 각각의 프레임에 대한 제 (ROI의 크기에 따라 3 내지 10) 최후의 수평 라인을 제거한다. </li><li> 값의 히스토그램 만들기 (매트랩 명령 &#39;HIST&#39;를 사용) 스택 획득 된 영상에서 (또한 디지털 레벨, DL 정의) 및 로그를 플롯주파수 결과의 (매트랩 semilogy 명령을 사용하여). 카메라 배경 DL 분포의 예는 그림 2에 제시되어있다. 참고 : 카메라가 잘 작동하면, 플롯은 지수 붕괴 (로그 스케일에서 음의 기울기를 가진 라인으로 다음 제로 광자에 관련된 값의 분포를 나타내는 약 가우스 피크 (로그 스케일에서 포물선 프로파일)을 표시합니다 ) 한 광자 (그림 2)에 관련된 값의 분포를 나타냅니다. 지수 부분의 감쇠 상수가 각각의 단일 광자에 카메라에 의해 할당 된 DL의 추정을 나타내고, 특히, 중앙 및 가우스 함수의 분산은 각각 카메라와 오프셋 에러를 나타낸다. 매트랩 자료를 지원하는 스크립트의 섹션 &quot;CalibrateCamera&quot;를 사용합니다. </li><li> 선택된 모든 카메라 EMGain 및 이득에 대한 작업을 반복합니다. </li></ol></li></ol> 2 레이블셀 준비 <ol><li> (1,2 - dioleoyl- -glycero SN-3-phosphoethanolamine), 지질 혼입 36 필요한 리포좀을 제조 DOPE 별도로 1 mg의 용해, DOTAP (1,2-dioleoyl-3-트리메틸 프로판) 1 ㎎, 클로로포름 1 ㎖에 ATTO488 PPE-1 밀리그램. 24 시간 동안 진공에서 함께 0.5 도프의 수용액, DOTAP 용액 0.5 ml의 PPE-ATTO488 솔루션의 25 μL 및 건조를 섞는다. 40 ° C에서 15 분 동안 15 분, 초음파 처리에 대한 HEPES 버퍼 20 mm의 0.5 ml의, 소용돌이를 추가합니다. </li><li> 셀을 준비 PBS로 합류 CHO-K1 (중국 햄스터 난소)의 P100 접시를 세 번 씻어 5 분 동안 인큐베이터에 트립신 및 저장 1 ㎖를 추가합니다. 10 % FBS 보충 된 DMEM / F12 배지 9 ml에 첨가 분리 된 세포를 일시 중단하고 동일한 배지 800 μl를 함유하는 페트리 접시에 세포 용액 150 μl를 시드. </li><li> 37 ° C에서 24 시간 동안 인큐베이터에 보관 5 % CO 2. 지질 혼입 들어, 셀 (500)을 가진 매체를 대체무 혈청 배지 ㎕의; 30 분 후, 리포좀 용액 2 μl를 추가; 와 PSB 15 분 세척 한 후 영상에 대한 새로운 DMEM / F12 매체를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 형질의 경우, 형질 세포 이미징 전에 인큐베이터에서 TFR-GFP 플라스미드 및 저장 24 시간을 사용하여 리포 펙 타민 프로토콜 (제조사 지침)에 따라. </li></ol> 3 데이터 수집 <ol><li> 설치 준비 <ol><li> 현미경을 온도 조절하기 위해, 실험 전 24 시간은 인큐베이터를 켭니다. </li><li> 가장 빠른 달성 획득 시간을 적용하기 위해, 자른 센서 모드에서 작업 (소개 참조) 셀 (카메라 2)를 선택 이미징 (카메라 1)와 두 번째 카메라에 대한 첫 번째 카메라를 사용합니다. 설치 구성의 방식은 보충 그림 S1 표시됩니다. 그런 다음, 현미경에있는 두 개의 카메라 회전을 맞추고 카메라가 식을 때까지 기다려야합니다. </li><li> 두 카메라 투과광 이미징을위한 매개 변수를 설정합니다 (예 : </em&gt;, 노출 시간, 게인 EM 1) 및 명 시야 모드에서 현미경을 넣어 20 밀리. </li><li> 만 (여기에 32 × 32 픽셀의 ROI) 세포 이미징에 사용되는 투자 수익 (ROI)에 빛을 허용하는 슬릿을 밀어 부드럽게 홀더에 샘플을 넣고 접안 렌즈를 사용하여 초점 카메라 하나에 빛을 보내고. </li><li> 선택한 영역에 셀을 이동하고 카메라 2에 빛을 보내, 다음 참조를하기 위해 카메라 2를 제어하는​​ 소프트웨어의 ROI를 그립니다. </li></ol></li><li> 이미지 (그림 3A) <ol><li> 우선, 사용자의 설정의 방법에 따라 TIRF 레이저 정렬. 우리의 설정에서 &#39;TIRF 설정&#39;을 선택하고 자동 정렬 절차를 시작합니다. 레이저가 정렬되면 (약 70 °) 침투 깊이의 70 나노 미터를 설정합니다. </li><li> 모두 카메라 1과 카메라 2에 100에 EMGain 70 밀리 초와 노출 시간을 설정하고, 다음, 카메라 (1)를 사용하여 셀을 선택한 후, 카메라 (2)에 광을 전송하고 정확하게 세포막 초점. 캘리포니아에 최소 노출을 설정메라 ​​2, 1000 EMGain, 자른 센서 모드, 열 다섯 반복 설정하고 자동 저장 파일 (유연한 이미지 전송 시스템, 쉽게 관리 할 수있는 형식)을 맞는있다. </li><li> 이미지 시리즈를 기록하는 인수를 시작합니다. 게인하고, 새로운 세포를 획득하기 전에 온도 안정화를 허용 8-10 세포를 얻기 위해 마지막 두 단계를 반복 자른 모드를 해제합니다. </li></ol></li></ol> 영상에서 평균 제곱 변위의 4 계산 (I MSD) NOTE : 다음 프로토콜 직접 미가공 데이터에 적용될 수있다. 동시에, 전체 프로토콜은 매트랩과 SimFCS 모두 시뮬레이션 데이터 수집에 유효하다. 해당 자습서에 대한 링크는 &#39;재료&#39;섹션에서 찾을 수 있습니다. <ol><li> matlab에 의해 계산 <ol><li> ImportImageSeries 스크립트를 사용하여 matlab에 획득 한 시리즈를 가져옵니다. 공동 사용 시간에 각 이미지의 평균 강도를 계산mmand 제 2 차원을 의미하고, 생성 된 벡터를보고 플롯을 사용합니다. </li><li> 광표백의 10 % 이상이 존재하는 경우, 일련의 폐기 또는 이들의 첫 번째 부분을 제거한다. 이 낮 으면 (37) 전에 도시 된 바와 같이, 각각의 이미지를 평균 세기를 감산함으로써 상관 함수에 대한 효과를 해결하기위한 시도. </li><li> 셋째 차원 평균을 이용하여 각 화소의 평균 강도를 계산하고 화상 생성 참조. 참고 : 특별한주의를 인공적인 상관 관계를 방지하기 위해 필요합니다. 사실, 이전에 유사한 기술 (38), 셀 경계뿐만 아니라 포커스 소체에서와 같이 강한 상관을 도입 할 수있다. 평균 이미지의 검사 셀 테두리 또는 초점 소포에서 밝혀, 그렇지 않으면 인수를 폐기 관련된 지역을 제외하려고합니다. 이 부동 구조체의 효과를 해결하기위한 각 화소 (39)로부터 평균 순간 세기를 뺀다. </li><li> t를 계산기능 CalculateSTICScorrfunc을 사용하여 그는 시공간의 상관 관계 (G (ξ, χ, τ)). G는 (ξ, χ, 0)으로 인해 낮은 조명 정권의 샷 잡음에 상관 관계가 G를 지배하고 있기 때문에 (0,0,0)를 제거; 인해 검출기에 상관 측정 허리를 증가시킴으로써 τ = 0 G (ξ, χ, τ)을 변형 할 수 노출 시간 동안 G (± 1,0,0), 및 입자 운동을 지배한다 (이 효과는 τ 사라진다 &gt; 0) 34. </li><li> 다음 지지물에 &quot;LogBinStack&quot;기능을 사용하여 소음을 줄이기 위해 대수 시간 빈을 사용하여 평균 G (ξ, χ, τ&gt; 0) (ξ, χ, τ) 기능을 이용하여 &quot;gaussfit&quot;의 결과 G 맞추기 소재의 ICS-매트랩 툴 I MSD (결과 배열의 두 번째 열)를 복구한다. </li><li> 시간의 함수로서 얻어진 허리 σ (τ) 2 (I MSD)를 그린다. 데이터가 너무 시끄러운 경우 acqu의 수를 증가하려고IRED 프레임 함께 레이저 파워, 평균보다 G (ξ, χ, τ)을 증가시킨다. </li></ol></li><li> SimFCS에 의해 계산 <ol><li> ImageJ에이 BioFormat 가져 오기 플러그인을 이용하여 획득 된 파일을 열고 티파니 순서로 인수 시리즈를 저장합니다. </li><li> 열기 SimFCS 선택 RICS 도구 및 파일&gt; 가져 오기 여러 개의 이미지 (보충 그림 S2). </li><li> 맞는 창 (보충 그림 S3)을 맞추기를 선택 올바른 인수 매개 변수를 삽입하고 닫습니다. </li><li> 디스플레이&gt; 평균 강도&gt; CH1을 선택하고 photobleaching에의 존재 (보충 그림 S4)를 확인합니다. </li><li> 광표백의 10 % 이상이 본 폐기보기 시리즈 또는 가능하면 다시로드 시리즈의 첫 번째 부분을 제거하는 이미지 시퀀스 인 경우. </li><li> 그것을 표백하는 10 %보다 낮은 도구를 선택하는 경우&gt; 내가 MSD&gt; 매개 변수 설정, 왼쪽에 ROI 패널에 설정 &#39;사용은 이동 평균&#39;확인상대 시간 확산 특성 시간보다 높다고 이동 평균 지불 주목 프레임의 엄버 (1 μM 2 초에서 움직이는 입자 -1 10 초의 시간이 좋은 이동 평균) </li><li> 도구&gt; iMSD&gt; 아이 MSD (보충 그림 S5) 및 착용감을 계산하고 메모 패드에서 내가 MSD를 내보낼 (보충 그림 S6). </li></ol></li></ol> 내가 MSD의 확산 법칙 (5) 계산 <ol><li> 절편 (σ 0 2)를 추정하는 최초의 몇 가지 포인트를 장착 (5 점 정도면 충분하지만 더 많은 포인트가 선형 동작을 보여 주면 장착 할 수 있습니다) 및 이전에 측정 된 PSF이와이 값을 비교합니다. 그들은 비교할 경우, 격리 된 형광 물질의 역학을 따라야되고있다. 반면, σ 0 2 &gt;&gt; PSF이 시도는을 보장하기 위해 빠르게 취득하는 경우숨겨진 역학 ​​34 존재한다. </li><li> 겉보기 확산 계수 (D 응용 프로그램)와 식 (3)과 (4) (소개를 참조)를 사용하여 평균 변위 (R)을 계산합니다. </li><li> FCS 12 (그림 3D)를 기반으로 현장의 변화로 측정되는 것과 비슷한 확산 법을 얻기 R의 함수로 플롯 D 응용 프로그램. </li></ol>

<ol><li>Engelman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membranes+are+more+mosaic+than+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Membranes are more mosaic than fluid.</a> Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).</li>
<li>Vereb, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((yet+structured%3A+The+cell+membrane+three+decades+after+the+Singer-Nicolson+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">yet structured: The cell membrane three decades after the Singer-Nicolson model.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (14), 8053-8058 (1073).</li>
<li>Ishihara, A., Hou, Y., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Thy-1+antigen+exhibits+rapid+lateral+diffusion+in+the+plasma+membrane+of+rodent+lymphoid+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Thy-1 antigen exhibits rapid lateral diffusion in the plasma membrane of rodent lymphoid cells and fibroblasts.</a> 84 (5), 1290-1293 (1987).</li>
<li>Axelrod, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+motion+of+fluorescently+labeled+acetylcholine+receptors+in+membranes+of+developing+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73 (12), 4594-4598 (1976).</li>
<li>Jacobson, K., Derzko, Z., Wu, E. S., Hou, Y., Poste, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+lateral+mobility+of+cell+surface+components+in+single%2C+living+cells+by+fluorescence+recovery+after+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Supramol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Measurement of the lateral mobility of cell surface components in single, living cells by fluorescence recovery after photobleaching.</a> J. Supramol. Struct. 5 (4), 10-1002 (1976).</li>
<li>Kusumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradigm+shift+of+the+plasma+membrane+concept+from+the+two-dimensional+continuum+fluid+to+the+partitioned+fluid%3A+high-speed+single-molecule+tracking+of+membrane+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 34, 351-378 (2005).</li>
<li>Kusumi, A., Ike, H., Nakada, C., Murase, K., Fujiwara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+tracking+of+membrane+molecules%3A+plasma+membrane+compartmentalization+and+dynamic+assembly+of+raft-philic+signaling+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule tracking of membrane molecules: plasma membrane compartmentalization and dynamic assembly of raft-philic signaling molecules.</a> Semin. Immunol. 17 (1), 3-21 (2005).</li>
<li>Schwille, P., Korlach, J., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+with+single-molecule+sensitivity+on+cell+and+model+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes.</a> Cytometry. 36, 176-182 (1999).</li>
<li>Gielen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+sphingomyelin+and+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+in+the+membrane+of+OLN-93+oligodendroglial+cells+studied+by+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22C.+R.+Biol%22%5BJournal%5D)">Diffusion of sphingomyelin and myelin oligodendrocyte glycoprotein in the membrane of OLN-93 oligodendroglial cells studied by fluorescence correlation spectroscopy.</a> C. R. Biol. 328 (12), 1057-1064 (2005).</li>
<li>Weiss, M., Hashimoto, H., Nilsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalous+protein+diffusion+in+living+cells+as+seen+by+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Anomalous protein diffusion in living cells as seen by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophys. J. 84, 4043-4052 (2003).</li>
<li>Wawrezinieck, L., Rigneault, H., Marguet, D., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+diffusion+laws+to+probe+the+submicron+cell+membrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy diffusion laws to probe the submicron cell membrane organization.</a> Biophys. J. 89 (6), 4029-4042 (2005).</li>
<li>Lenne, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+molecular+confinement+in+the+plasma+membrane+by+microdomains+and+the+cytoskeleton+meshwork%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic molecular confinement in the plasma membrane by microdomains and the cytoskeleton meshwork.</a> EMBO J. 25 (14), 3245-3256 (2006).</li>
<li>Ries, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+slow+membrane+dynamics+with+continuous+wave+scanning+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Studying slow membrane dynamics with continuous wave scanning fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophys. J. 91 (5), 1915-1924 (2006).</li>
<li>Ruan, Q., Cheng, M. A., Levi, M., Gratton, E., Mantulin, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial-temporal+studies+of+membrane+dynamics%3A+scanning+fluorescence+correlation+spectroscopy+%28SFCS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Spatial-temporal studies of membrane dynamics: scanning fluorescence correlation spectroscopy (SFCS).</a> Biophys. J. 87 (2), 1260-1267 (2004).</li>
<li>Berland, K. M., So, P. T., Chen, Y., Mantulin, W. W., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+two-photon+fluctuation+correlation+spectroscopy%3A+particle+counting+measurements+for+detection+of+molecular+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Scanning two-photon fluctuation correlation spectroscopy: particle counting measurements for detection of molecular aggregation.</a> Biophys. J. 71, 410-420 (1996).</li>
<li>Heinemann, F., Betaneli, V., Thomas, F. A., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+lipid+diffusion+by+fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+a+critical+treatise%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Quantifying lipid diffusion by fluorescence correlation spectroscopy: a critical treatise.</a> Langmuir. 28 (37), 13395-13404 (2012).</li>
<li>Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+directed+molecular+motion+in+the+nuclear+pore+complex+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (25), 9863-9868 (2012).</li>
<li>Sanchez, S. A., Tricerri, M. A., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laurdan+generalized+polarization+fluctuations+measures+membrane+packing+micro-heterogeneity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Laurdan generalized polarization fluctuations measures membrane packing micro-heterogeneity in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (19), 7314-7319 (2012).</li>
<li>Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+of+intact+nuclear+pore+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy of intact nuclear pore complexes.</a> Biophys. J. 101 (4), 27-29 (2012).</li>
<li>Di Rienzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+LOX-1+receptor+interplay+with+nanotopography%3A+mechanotransduction+and+atherosclerosis+onset%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Unveiling LOX-1 receptor interplay with nanotopography: mechanotransduction and atherosclerosis onset.</a> Sci. Rep. 3, 10-1038 (2013).</li>
<li>Unruh, J. R., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+concentration+and+brightness+from+fluorescence+fluctuation+data+with+an+electron+multiplied+CCD+camera%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera.</a> Biophys. J. 95 (11), 5385-5398 (2008).</li>
<li>Kannan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+multiplying+charge-coupled+device+camera+based+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Electron multiplying charge-coupled device camera based fluorescence correlation spectroscopy.</a> Anal. Chem. 78 (10), 3444-3451 (2006).</li>
<li>Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((three-dimensional+super-resolution+imaging+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">three-dimensional super-resolution imaging of live cells.</a> Nat. Methods. 8 (6), 499-508 (2011).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5 (2), 155-157 (2008).</li>
<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-field+optical+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Far-field optical nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li>
<li>Klar, T. A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+resolution+in+far-field+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 24 (14), 954-956 (1999).</li>
<li>Eggeling, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+the+nanoscale+dynamics+of+membrane+lipids+in+a+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell.</a> Nature. 457 (7233), 1159-1162 (2009).</li>
<li>Hedde, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+emission+depletion-based+raster+image+correlation+spectroscopy+reveals+biomolecular+dynamics+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Stimulated emission depletion-based raster image correlation spectroscopy reveals biomolecular dynamics in live cells.</a> Nat. Commun. 4, Forthcoming.</li>
<li>Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+image+correlation+spectroscopy+%28STICS%29+theory%2C+verification%2C+and+application+to+protein+velocity+mapping+in+living+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells.</a> Biophys. J. 88 (5), 3601-3614 (2005).</li>
<li>Brown, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+integrin-actin+linkage+using+high-resolution+protein+velocity+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping.</a> J. Cell Sci. 119, 5204-5214 (2006).</li>
<li>Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+spatiotemporal+correlation+spectroscopy+to+determine+protein+lateral+diffusion+laws+in+live+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Fast spatiotemporal correlation spectroscopy to determine protein lateral diffusion laws in live cell membranes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (30), 12307-12312 (2013).</li>
<li>Mueller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+nanoscopy+reveals+molecular+details+of+cholesterol-+and+cytoskeleton-modulated+lipid+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">STED nanoscopy reveals molecular details of cholesterol- and cytoskeleton-modulated lipid interactions in living cells.</a> Biophys. J. 101 (7), 1651-1660 (2011).</li>
<li>Kleusch, C., Hersch, N., Hoffmann, B., Merkel, R., Csiszar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+lipids%3A+functional+parts+of+fusogenic+liposomes+and+tools+for+cell+membrane+labeling+and+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Fluorescent lipids: functional parts of fusogenic liposomes and tools for cell membrane labeling and visualization.</a> Molecules. 17 (1), 1055-1073 (2012).</li>
<li>Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+membrane+dynamics+with+line-scan+FCS%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS.</a> Biophys. J. 96 (5), 1999-2008 (2009).</li>
<li>Kolin, D. L., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+image+correlation+spectroscopy%3A+measuring+number+densities%2C+aggregation+states%2C+and+dynamics+of+fluorescently+labeled+macromolecules+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells.</a> Cell Biochem. Biophys. 49 (3), 141-164 (2007).</li>
<li>Digman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+fast+dynamics+in+solutions+and+cells+with+a+laser+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope.</a> Biophys. J. 89 (2), 1317-1327 (2005).</li>
<li>Ritchie, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+non-Brownian+diffusion+in+the+cell+membrane+in+single+molecule+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Detection of non-Brownian diffusion in the cell membrane in single molecule tracking.</a> Biophys. J. 88 (3), 2266-2277 (2005).</li>
<li>Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal-plane+fluorescence+optical+sectioning%3A+three-dimensional+imaging+of+macroscopic+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens.</a> J. Microsc. 170, 229-236 (1993).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene,, Wittbrodt, F., J,, Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Wohland, T., Shi, X., Sankaran, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+plane+illumination+fluorescence+correlation+spectroscopy+%28SPIM-FCS%29+probes+inhomogeneous+three-dimensional+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Single plane illumination fluorescence correlation spectroscopy (SPIM-FCS) probes inhomogeneous three-dimensional environments.</a> Opt. Express. 18 (10), 10627-10641 (2010).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

단일 입자 추적 (SPT)은 분자 역학을 연구하는 가장 일반적인 전략 중 하나를 의미하며, 입자의 궤적을 측정의 큰 장점을 갖는다. 차례로 이것은 복잡한 시스템에도 몇몇 표지 입자의 거동을 프로빙한다. 그러나, 일반적 SPT 프로브와 매우 밝은 라벨 저밀도 필요 이러한 이점을 달성한다. 생산 시스템으로, 라벨 및 삽입의 복잡한 절차가 필요하다이 경우 : 특히, 높은 시간 해상도 (마이크로 초 범위) 무기 프로브는 일반적으로 요구된다 (예를 들면, 양자 도트 나 금속 나노 입자)를 얻을 수있다. SPT에 비해 본 발명의 방법은 몇 가지 중요한 장점을 보여줍니다. 첫째,이 방법은 형광 단백질과 접합하여 사용할 수있다. 따라서 SPT에 비해,보다 높은 시간 해상도가 광자의 하부 양 덕분 (동일한 라벨) 달성 34 필수. 보다 상세하게는,이 속성은 시간 레졸을 밀어 수 있습니다10 아래의 ution - 3 초는 encodable 형광 단백질을 사용하는 경우,이 척도는 막 성분의 ...

가수 Nicolson 의해 일본어 "유체 모자이크"모델부터 출발 세포 원형질막의 영상이 지속적으로 세포 골격과 지질 1,2 도메인의 새로운 역할을 포함하기 위해 지난 수십 년 동안 업데이트되었습니다. 첫번째 관찰은 막 단백질의 상당 부분이 3-5 움직입니다 (FRAP) 발표를 photobleaching에 후 형광 복구에 의해 얻어졌다. 이러한 선구적인 연구는 매우 유익하지만, FRAP의 설정의 상대적으로 가난한 공간 (마이크론)의 해상도와 시간 (초)으로 고통. 또한, 앙상블 평균 측정되는, FRAP는 단일 분자의 행동에 관한 정보를주는 없다. 이러한 맥락에서, 특히 가능성 (시 확산 처리 한 분자의 연구를 허용) 매우 밝은 태그와 단일 분자 라벨을 매우 성공적이었다. 특히, 밀어등 마이크로 척도, 쿠스미 크게 막 ​​생리 6 액틴 기반 막 골격의 역할 인식에 기여 지질과 단백질 역학의 알 수없는 기능에 알. 얻은 액세스 단일 입자 추적 (SPT) 방식의 시간 해상도 , 7. 이러한 결과는 지질 단백질 및 액틴이 확산 기반 골격에 의해 조절되는 '피켓 울타리'모델을, 소위 생성. 그러나 여러 실험적인 문제 SPT에 의해 제공되는 정보의 양에 큰 권한을 부여하기 위해 해결되어야한다. 특히, 라벨 절차는 일반적으로 시스템에 표시된 종의 생산, 정제 및 도입 등 여러 단계로 구성되어있다. 또한, 라벨은 큰, 양자점 또는 금속 나노 입자와 같이 자주 서브 - 밀리 세컨드 타임 스케일 많은 경우에 회피 될 수없는 라벨 표적 분자의 가교에 도달해야한다. 마지막으로, 많은 궤적통계 학적 기준에 맞게 기록 될 필요와 병용 라벨의 저밀도는 추적을 허용하도록 요구된다. SPT에 비해 이러한 단점을 많이 극복 형광 상관 분광학 (FCS)는, 분자 역학을 연구하는 매우 유망한 접근 방식을 나타냅니다. 사실, FCS는 일시적으로 형질 세포에 형광 단백질 태그 분자의 역학을 연구 할 수 있도록, 희미하고 조밀 한 레이블 또한 잘 작동합니다. 또한, 제한된 시간에 높은 통계에 도달한다. 마지막으로, 라벨의 "높은"밀도에도 불구하고 FCS는 단일 분자 정보를 제공합니다. 덕분에 모든 속성, FCS는 매우 간단 접근 방식을 나타냅니다 광범위 모델 막에서 라이브 세포 8-10에서 모두 지질과 단백질 역학을 연구하기 위해 적용되었습니다. 많은 다른 접근법은 분자 확산의 상세를 공개하는 FCS의 능력을 증가시키기 위해 제안되었다. 예를 들면, SH이었다자신의 다른 크기의 관찰 영역에 FCS를 수행하여 하나의 분자 운동 (11, 12)의 "FCS 확산 법"계몽 숨겨진 기능을 정의 할 수 있습니다. 크기가 변화되는 외에, 초점 영역도 13 중복 된 고속 카메라 (21, 22)와 선 (14-20) 또는 복합 따라 공간에서 움직였다. 이 '시공간'의 상관 관계에 접근하여, 여러 가지 막 구성 요소의 관련 생물학적 매개 변수를 정량적 모델 막 실제 생물들, 막 공간 조직에 따라서 항복 통찰력을 모두 설명했다. 그러나, 모든 FRAP 및 FCS 애플리케이션에서 설명한 바와 초점 영역의 크기를 극복 할 수없는 공간 해상도의 한계를 나타낸다. 몇몇 초 - 해상도 이미징 방법은 최근이 제한을 우회하기 위해 개발되어왔다. 일부는 같은 확률 광 재건 현미경 (STORM)로, 현지화 정밀도를 기반으로 &lt;SUP&gt; 23,24, photoactivation 현지화 현미경 (PALM) (25), 형광 PALM (FPALM) (26), 및 단일 입자 추적 PALM (sptPALM) 27 : 각 샷에 필요한 광자의 비교적 큰 양 그러나의 시간 해상도를 제한 적어도 몇 밀리 초에 이러한 방법, 따라서 생체 내에서의 적용을 방해. 대조적으로, 슈퍼 해상도 이미징을위한 유망한 대안은 공간적 자극 방출 고갈 방법 (STED 또는 가역 포화 광학 형광 전환 (RESOLFT)) (28, 29)과 형광 방출을 조절함으로써 열렸다. 이러한 접근 방식은 빠른 스캐닝 현미경 및 탐지 시스템을 사용하는 가능성 관찰 볼륨 성형 아니라 아래 회절 한계를 결합한다. 형광 변동 분석과 함께, STED 현미경 직접 지질 및 P의 나노 시공간 역학을 조사 할 수라이브 세포막 (30, 31)에서 roteins. STED 기반 현미경 같은 물리량이 생균에 형광 표지 된 막 단백질 및 / 또는 지질의 역학 연구에 적합한 개질 시공간적 화상 상관 분광법 (STICS 32,33)의 방법에 의해 얻을 수있다 및 상용 현미경으로. 여기에 제시된 실험 프로토콜은 몇 가지 단계로 구성되어있다. 첫 번째는 막에 관심 영역의 고속 이미징을 필요로한다. 그 후, 화상의 생성 스택 평균 시공간 상관 함수를 계산하는데 사용된다. 상관 함수의 시리즈를 끼워 맞춤으로써, 분자 '확산 법칙은'명백한 확산 계수 (D 앱)의 형태로 영상에서 직접 획득 될 수있다 - - 평균 변위 플롯 대. 이 플롯은 매우 분자에 의해 탐구 환경에 따라 직접 실제 확산 모드를 인식 허용관심 지질 / 단백질. 이전 34와 같이 더 상세하게, 상기 취득 된 이미지 시리즈의 시공간적 자동 상관 함수가 매우 수집 된 이미지 시리즈에서 이동 분자 역학에 의존한다 (같은 추론이 라인 획득에 적용될 수 있음을주의하세요 공간에서 하나의 차원은) 생각입니다. 특히, 상관 함수를로 정의한다 : <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq1.jpg" width="230"> (1) 여기서 <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/xyt.jpg" width="50"> 위치 (x)에서 측정 한 형광 강도를 나타내고, Y 및 시간 t에서, <img fo:content-width=".08in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="8"> 및 <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10"> 나타내고 X의 거리각각 y 방향, <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10"> 타임 래그를 나타내고, <img fo:content-width=".2in" src="/files/ftp_upload/51994/brackets.jpg" width="20"> 평균을 나타냅니다. 이 함수는 다음과 같이 표현 될 수있다 : <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq2.jpg" width="230"> (2) 'N'은 관찰 영역에서 분자의 평균 수를 나타내고, <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/circlex.jpg" width="10"> 공간에서의 컨볼 루션 연산을 나타내고, <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ex.jpg" width="50"> 쓸모있는 허리의 자기 상관을 나타냅니다. 후자 인해 광 기록 / 셋업 단일 광자 에미 터가 공간 내에 확산되는 방법의 측정으로 해석 될 수있다 (소위 점 분포 함수, PSF, 유전자잘) 가우스 함수에 의해 근사 집회. 마지막으로, <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ext.jpg" width="50"> 거리 입자를 찾을 확률을 나타낸다 <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="10"> 및 <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10"> 시간 지연 후에 <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10"> . 우리는 입자가 모든 방향으로 임의로 이동 순 플럭스가 존재하지되는 확산 역학을 고려하면,이 기능들은 일반적 차이가 움직이는 입자의 평균 제곱 변위 (MSD)로 식별 될 수 가우시안 함수로 근사 . 따라서, 상관 함수의 허리는 (로도 지칭 <img fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/51994/2t.jpg" width="30"> ), 입자 근골격계의 합 수단 허리로 정의 될 수 있고, 가우시안 피트에 의해 측정 될 수있다각 시간 지연에 대한 상관 함수의 팅. 측정 전 MSD는 움직이는 분자의 겉보기 확산을 계산하는데 사용될 수있다 <img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/dappt.jpg" width="40"> 및 평균 변위 <img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/rt.jpg" width="40"> 로 : <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq3.jpg" width="170"> (3) <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq4.jpg" width="170"> (4) 다음 섹션을 통해 독자를 안내 할 수 실험 구성에 대한 몇 가지 고려 사항. 선택적 상업용 TIR 형광을 이용하여, 우리는 전체 내부 반사 (TIR)​​ 조명을 사용하는 살아있는 세포의 기저막에 형광체를 여기하기 위해 (TIRF) 현미경 (상세는 재료 부분에서 찾아 볼 수있다). 또한, 순서 번째 수집전자 형광 우리 고배율 대물 사용하며 (칩 16 μM의 화소의 물리적 크기) EMCCD 카메라 (100X NA 1.47, 높은 개구는 TIRF 조명 필요함). 100nm의 픽셀 크기에 도달하기 위해 우리는 1.6 부가 배율 렌즈를 적용. 후술하는 바와 같이, 1 밀리 초 이하의 시간 해상도는 100 나노 미터 이하로 적절히 빠른 막 지질의 역학을 설명하는 데 필요한 것. 이 시간 해상도에 도달하기 위해 우리는 카메라 (512 X 512)의 온 - 칩보다 작은이자 (ROI)의 영역을 선택해야한다. 이러한 방식으로, 카메라는 시간 해상도를 증가 선의 감소 된 수를 판독 할 것이다. 그러나,이 판독 정권 프레임 시간은 카메라 판독 칩에 노출 전하를 이동하는 데 필요한 512 X 512 픽셀 EMCCD 대 밀리 위해 통상 시간에 의해 제한 될 것이다. 이 한계를 이길하려면 새로운 기술은 와트, ROI 라인 만 대신 전체 프레임을 이동 할 수 있습니다(우리 EMCCD에서 자른 센서 모드라고 함)에 노출 칩 사이즈의 실질적인 감소 효과 제 i. 이 구성에 적용하려면, ROI 외부의 칩은 광로에 장착 슬릿 커플 적용되어야한다. 시간 해상도 다운 10-4 초로 설정이 덕분에 달성 될 수있다. '토론'섹션에 설명 된대로이 방법이 여러 가지 실험 설정과 결합 될 수 있다는 점 유의하시기 바랍니다. 방법은 데모 GFP- ATTO488 표지 모두 1 - 팔미 토일 -2 - 하이드 록시 -3 -glycero SN-phosphoethanolamine (ATTO488-PPE) 및 트랜스페린 수용체 GFP 표지 된 변형을 (사용함으로써, 생균에 제공 될 TFR). 이전에보고 된 바와 같이 30,35 ATTO488-PPE의 경우이 접근법은 성공적 주로 자유 확산을 나타내는 평균 변위의 함수로서 거의 일정한 D 애플리케이션을 복구 할 수있다. 대조적으로, TFR-GFP는 감소 D를 도시 <su>6 건의 평균 변위의 함수로서 B&gt; 애플리케이션. 또한, 후자의 경우에는 로컬 확산 상수 및 막 평면에 많은 미크론 이상의 평균 협착 영역을 정량화 할 수있다. </su>

<table><tbody><tr><td>iXon Ultra 897</td><td>Andor</td><td>DU-897U-CS0</td><td></td></tr><tr><td>Solis</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>ATTO 488 라벨 PPE</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 488-151</td><td></td></tr><tr><td>DOPE</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td></td><td></td>850725</tr><tr><td>DOTAP</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>890890</td><td></td></tr><tr><td>100x 페니실린-스트렙토마이신-글루타민</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>21331</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-106&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>SimFCS 3.0</td><td>Globals 소프트웨어는</td><td></td><td>여기에서 다운로드할 수 있습니다: http://www.lfd.uci.edu/globals/</td></tr> <tr><td>DMI6000 with TIRF modulus</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Lipofectamine</td><td></td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWork</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>C-terminal GFP tagged Tranferrin Receptor</td><td>OriGene</td><td>RG200980</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5306</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Sigma Aldrich</td><td>528730</td><td></td></tr><tr><td>라텍스 비드, 형광 황록색, 30nm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5155</td><td></td></tr><tr><td>SONICA 초음파 세척기</td><td>SOLTEC</td><td>ETH S3</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Willco</td><td>GWSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td></td><td></td>용 Bio-Format 임포터 <td>http://www.openmicroscopy.org/site/support/bio-formats5/users/matlab/</td></tr> <tr><td>ICS-MatLab 도구</td><td></td><td></td><td><a href="https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip">https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip</a></td></tr><tr><td>Simulation by Matlab 튜토리얼</td><td></td><td></td><td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/icsmatlab/ICSTutorial.html</td></tr><tr><td>Simulation by SimFCS 튜토리얼</td><td></td><td></td><td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/ppt-pdf/RICS%20Simulations.ppt</td></tr></tbody></table>

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

그것은 공간적 분포 및 지질과 단백질과 같은 막 성분의 움직임이 많은 세포 기능의 조절에 중요​​한 요인이라는 것을 분명하게 증가했다. 그러나, 빠른 역학과 관련된 작은 구조로, 매우 높은 시공간 해상도는 분자의 실제 동작을 잡을 필요합니다. 여기에서 우리는 높은 시공간 해상도의 살아있는 세포에 형광 표지 된 플라즈마 막 단백질과 지질의 역학을 공부 실험 프로토콜을 제시한다. 특히,이 방법은 각각의 분자를 추적 할 필요가 없지만, 그 막의 소정 영역에있는 모든 분자를 사용하는 인구의 동작을 계산한다. 시작점은 막에 소정 영역의 고속 촬상이다. 이후, 완전한 시공간적 자기 상관 함수는 예를 들어, 각각 2, 3, N 번 반복 시간 지연을 증가에서 획득 된 영상의 상관 관계를 계산한다. 이는 폭을 입증 할 수있다확산으로 인한 입자 운동의 함수로서 시간 지연을 증가에서 공간적 자기 상관 함수 증가 피크. 따라서, 자기 상관 함수의 일련의 피팅하는 것은 실제의 단백질이 여기에 평균 겉보기 변위 대 확산의 형태로 표시, 영상 (iMSD)에서 제곱 평균 변위를 추출 할 수있다. 이 나노 미터 정밀도로 단일 분자의 평균 역학의 양적보기를 얻을 수 있습니다. 표지 된 트랜스페린 수용체 (TFR) 및 ATTO488의 GFP 표지 된 변형을 사용하여 1 - 팔미 토일 -2 - 하이드 록시 SN -glycero-3-phosphoethanolamine (PPE)가 켜져 단백질 및 지질 확산 시공간 규제를 준수 할 수있다 마이크로 - 투 - 밀리 초의 시간 범위에서 μm의 막 크기의 영역.

프로토콜 단계 1.1에 기재된 바와 같이 수단 허리를 보정하기 위해, 단일 형광 나노 비드의 이미지를 측정 할 수있다. 이 구슬의 전형적인 형광 이미지를 그림 1에 제시되어있다. 2 차원 가우스 함수에 의해 강도 분포의 피팅 다시 좋은 잔차를 제공하고 270 nm에서 악기의 허리를 측정 할 수 있습니다. 이 값은 레일리 방정식에 의해 추정 된 예상되는 회절 한계와 잘 일치한다. 이 교정은 입자 동역학 측정을 위해 필요한 것은 아니지만 그것 겉보기 입자 크기를 측정하기 위해 필요하다. 카메라의 배경 전형적인 주파수 분포는 약 180 DL에서의 피크는 더 광자 카메라 응답에 기인한다.도 2에 제시하고, 아날로그 디지털 (AD) 변환기의 기여를 나타낸다. 이 기여는 오프셋 추정 가우스 분포 및 분산 같이 근사화 될 수있다신호 기록에 의해 도입. 200 DL 위의 디지털 레벨 분포 지수 (로그 스케일에서 선형)가되어 단일 ...

원형질막 단백질과 지질의 공간 분포와 시간 역학은 생물학에서 뜨거운 주제입니다. 여기서 이 문제는 개념적으로 동일한 단일 입자 추적의 물리량을 제공하지만 작은 분자 레이블과 표준 현미경 설정을 사용하는 시공간 이미지 변동 분석을 통해 해결됩니다.

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

이 절차의 전반적인 목표는 이를 수행하기 위해 살아있는 세포막에서 지질과 단백질의 확산 법칙을 측정하는 것입니다. 먼저, 현미경의 점 확산 기능은 나노 형광 비드를 이미징하여 보정됩니다. 다음으로, 형광 표지된 관심 분자를 포함한 리포좀 기반 벡터를 준비하고 transfection 또는 직접 통합에 의해 살아있는 세포에 도입합니다.살아있는 세포 원형질막의 빠른 이미징은 전반사 형광 현미경 검사로 수행됩니다. 마지막으로, 상관 함수가 계산되고 분자 확산 법칙이 가우스 피팅에 의해 추출됩니다. 결과 데이터입니다.조사 중인 지질 또는 단백질의 운동 모드를 식별합니다. 광표백 접근 방식 또는 고전적인 단일 점 형광 상관 분광법 후 기존 형광 회수에 비해 이 기술의 주요 장점은 분자 확산 법칙을 측정할 수 있다는 것입니다. 우리는 시스템에 대한 우선 지식을 알고 있습니다.또한 기존의 단일 입자 추적 방법론과 반대입니다. 여기서 mular displacement는 입자 궤적을 추출할 필요 없이 측정됩니다. 결과적으로, 이 금속은 예를 들어 유전적으로 암호화된 형광 단백질과 같이 상대적으로 간주되고 밀도가 높은 분자와 함께 쉽게 사용할 수 있습니다.전반적으로, 이 방법은 단백질 또는 지질 운동이 원형질막 구조 및 기능 조직을 어떻게 조절하는지와 같은 세포 분자 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 이러한 질문에 대한 답변은 모든 사람이 사용할 수 있게 되며, 상용 현미경을 사용하여 전체 절차의 시연은 zo에 의해 수행됩니다. 연구실의 박사 과정 학생. 이미징 시스템의 포인트 스프레드 기능을 보정하여 이 프로토콜을 시작합니다. 먼저 500마이크로리터 원심분리기 튜브에 이전에 첨가한 90마이크로리터의 증류수에 10마이크로리터의 형광 비드 용액을 희석합니다.메스를 사용하여 사우나 케이터링 욕조에서 용액을 20분 동안 초음파 처리한 다음 3%AGA 로즈 젤 1cm 정사각형 조각을 잘라 페트리 접시에 담습니다. 10마이크로리터의 희석된 형광 비드 용액을 겔 상단에 증착합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 2cm 유리 페트리 접시에 젤 조각을 뒤집습니다.다시 말하지만, 집게를 사용합니다. 젤 조각을 아래로 눌러 방울을 분산시킵니다. 다음으로, 시판되는 전반사 형광 현미경으로 구성된 획득 설정을 켭니다.인큐베이터와 빠른 E-M-C-C-D 카메라가 장착되어 있으며, 응용 프로그램 제품군, 고급 형광 소프트웨어 및 또는 Solis 이미지 획득 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터에 연결됩니다. 샘플을 현미경 스테이지의 홀더에 놓고 I 피스와 투과광을 사용합니다. 젤의 테두리에 초점을 맞춥니다.그런 다음 젤을 대물렌즈 중앙에 놓고 초점을 조정하여 Leica 애플리케이션 제품군에서 레이저 정렬 절차를 시작하고 고급 형광 소프트웨어는 자동 정렬을 선택하고 자동 정렬 절차를 따릅니다. 및/또는 Solis 수집 소프트웨어에서 레이저를 정렬한 후 설정 버튼을 클릭합니다. 창이 열립니다.카메라 노출을 100밀리초로, EM 게인을 1000으로, 반복을 100으로 설정하고, 프레임 전송 확인란을 선택합니다. 그런 다음 자동 저장 창을 클릭하고 실험 이름을 삽입합니다. 고립된 단일 스폿이 있는 시야를 찾습니다.일반적으로 비드 응집체를 나타내는 밝은 점에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 100개의 프레임을 획득합니다. 이 단계를 5-6회 반복하여 여러 단일 점의 이미지를 획득합니다.수집된 시리즈를 MATLAB과 같은 데이터 처리 프로그램으로 가져와서 스택의 시간 평균을 구합니다. 그런 다음 측정된 평균 강도 이미지를 표시합니다. 밝고 작은 형광 반점을 확대/축소하고 중심을 반점의 가장 밝은 픽셀로 대략적으로 식별합니다.마지막으로, 입자 주위에 그리려는 관심 영역의 크기를 선택하며, 일반적으로 그 옆에 1미크론을 선택하여 가우스 함수로 선택한 강도 분포를 맞춥니다. gause fit 명령을 선택합니다. 얻은 잔차를 검사하여 피팅의 양호성을 확인합니다.마지막으로 함께 제공된 문서에 설명된 대로 카메라를 보정합니다. 시스템이 보정되면 이미지 획득을 위해 세포에 레이블을 지정할 차례입니다. 클로로포름 1ml가 들어 있는 별도의 마이크로 원심분리기 튜브에 DOPE 1mg, D-O-T-A-P 1mg 및 PPE ADO 4 88 1mg을 각각 용해하여 지질 통합에 필요한 리포좀 준비를 시작합니다.다음으로, 각각 0.5밀리리터의 DOPE 및 D-O-T-A-P 용액을 25마이크로리터의 PPE ATO 4 88 용액과 결합합니다. 튜브를 원심 증발기에 넣고 280gs에서 스핀을 시작합니다. 진공 펌프를 시작하고 24시간 동안 회전시키십시오.다음 날, 0.5ml의 20 millimolar heis 버퍼를 튜브에 넣고 15분 동안 와류로 가열합니다. 그런 다음 튜브를 음파 케이터링 수조에 넣고 섭씨 40도에서 15분 동안 초음파 처리합니다. 세포를 준비하기 위해 P100 접시의 P, 합류, 중국, 햄스터 난소 또는 CHOK 1 세포를 10ml의 PBS로 3회 세척합니다.그런 다음 트립신 1ml를 넣고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소를 5분 동안 배양합니다. 배양 후, FBS 10%가 보충된 D-M-E-M-F 12 9ml를 첨가하여 이 세포 함유 용액 150마이크로리터를 현탁시킵니다. 22mm 유리 바닥 페트리 접시에 동일한 매체의 800 마이크로 리터가 들어 있습니다.섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 세포를 배양합니다. 지질 결합을 위해 세포 배지를 500마이크로리터의 무혈청 배지로 교체하고 30분 동안 배양합니다. 배양 후 2마이크로리터의 리포좀 용액을 넣고 15분 더 배양합니다.그런 다음 PBS로 세포를 세척하고 새로운 DM EMF 12를 추가합니다. 실험 최소 12시간 전에 이미징하기 전에 현미경 인큐베이터를 켜서 현미경 스테이지와 광학 구성 요소를 실험 온도까지 올리십시오. 이 절차에서 가장 어려운 단계는 획득하는 것입니다.성공을 보장하려면 시스템의 모든 수집 매개변수를 최적화해야 합니다. 연구 중. 실험 당일에는 현미경을 켜고 카메라가 작동 온도에 도달할 때까지 기다립니다.실험을 수행하기 위해 두 대의 카메라를 사용합니다. 카메라 1은 이미징에 사용되고 카메라 2는 셀을 선택하는 데 사용됩니다. 이 구성을 사용하면 소프트웨어에서 가장 빠른 획득 시간을 얻을 수 있습니다.투과광 이미징을 위한 매개변수를 설정합니다. 20밀리초 입력 노출 시간의 경우 두 카메라의 EM 게인으로 1을 입력합니다. 그런 다음 소프트웨어에서 대비 모드 창을 열고 왼쪽을 선택합니다.BF를 클릭하여 명시야 옵션을 선택합니다. 샘플을 홀더에 넣는 동안 viewview접안렌즈를 통해 샘플. 샘플에 초점을 맞춥니다.그런 다음 수동으로 빛을 카메라 1로 보내고 슬릿을 부드럽게 밀어 이미지화할 ROI만 조명되도록 합니다. 그런 다음 셀을 선택한 영역으로 이동하고 소프트웨어를 사용하여 카메라 2로 조명을 보냅니다. 그런 다음 소프트웨어에서 ROI를 그려 참조를 생성합니다.먼저 소프트웨어로 레이저를 정렬하려면 자동 정렬을 선택합니다. 그런 다음 자동 정렬 절차를 시작하려면 시준기 사용을 선택합니다. 그런 다음 상단의 인큐베이터를 열고 레이저 빔을 시준합니다.레이저가 소프트웨어 창의 왼쪽 하단 모서리에 정렬되면 70 버튼을 클릭하여 침투 깊이를 70나노미터로 설정합니다. 이것은 Leica 응용 제품군에서 약 70도의 바닥 유리에 있는 레이저의 입사각에 해당합니다. 고급 형광 소프트웨어 노출 시간 텍스트 상자.EM 게인 텍스트 상자에 70밀리초를 입력합니다. 카메라 2에서 동일한 작업을 수행하려면 1000을 입력합니다. 설정 창을 열고 해당 텍스트 상자에 동일한 숫자를 입력합니다.그런 다음 라이브 버튼을 클릭합니다. 형광은 카메라 1로 전송되고 샘플의 이미지가 화면에 나타납니다. 형광 세포가 관심 참조 영역에 도달할 때까지 샘플을 이동합니다.그런 다음 현미경 본체 전면에 있는 버튼을 눌러 빛을 카메라 2로 보내고 Z 위치 휠을 정확하게 움직여 및 또는 단독 소프트웨어의 세포막에 초점을 맞춥니다. 설정 창을 열고 1000 EM 게인 크롭 센서 모드 10에서 달성 가능한 최소 노출 시간을 5회 반복으로 설정하고 자동 저장 옵션을 설정하여 이미지 시리즈 획득을 시작합니다. 소프트웨어의 카메라 아이콘을 클릭하고 획득이 완료될 때까지 기다립니다.그런 다음 설정 창을 열고 EM 게인을 비활성화하고 자르기 모드 옵션에서 확인 표시를 제거합니다. 획득하는 동안 카메라의 온도는 일반적으로 약 2-3도 증가합니다. 따라서 새 셀에서 이미지를 획득하기 전에 최적의 작동 온도에 도달할 때까지 기다리십시오.다시 말하지만, 이미징이 완료되면 함께 제공되는 문서의 지침에 따라 이미징의 평균 제곱 변위를 계산하여 관심 분자의 형광 표지된 변형체를 얻습니다. CHOK one 세포는 ADO 4 88 PPE로 표지되거나 수용체 또는 T-F-R-G-F-P의 전달로 transfection되고 이 비디오에 설명된 대로 TIRF로 이미지화되었습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, ADO 4 88 PPE에 대해 측정된 확산 법칙은 평평하며, 이전에 T-F-R-G-F-P를 사용한 형질 주입 후 유도 방출 공핍 형광, 상관 분광법 또는 stead FCS 측정에 의해 나타난 바와 같이 대부분 자유 확산을 나타내며, T-F-R-G-F-P에 대해 측정된 확산 법칙은 처음에는 평평하며 평균 겉보기 확산 계수가 초당 약 0.7미크론 제곱인 평균 분자 변위의 100나노미터 미만으로 유지됩니다.그 다음에는 겉보기 확산도가 초당 0.2미크론 제곱까지 급격히 감소합니다. 일반적으로 회절 제한 FCS로 측정되는 값입니다. 이 마지막 예에 의해 보이는 것과 같이, 현재 접근 방식은 GFP와 같은 상대적으로 희미하고 조밀한 라벨을 사용하더라도 수십 나노미터의 해상도로 평균 분자 변위를 쉽게 측정할 수 있다는 점에 유의하는 것이 흥미롭습니다.더욱이, 겉보기 확산 계수가 감소하기 시작하는 공간 규모는 이전 추정치와 마찬가지로 막 골격에 의한 단백질 부분 감금의 특징적인 크기를 약 120나노미터로 설정합니다. 일단 마스터하면 데이터 분석 및 수집 절차를 몇 분 안에 완료할 수 있습니다. 우리는 이 기술이 세포 및 분자 생물학 분야의 연구자들이 생명 샘플에서 단백질 및 지질 확산의 시공간 조절을 쉽고 정량적으로 탐구할 수 있는 길을 열 것이라고 믿습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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여기에서는 후속 다중 파라미터 라이브 셀 현미경을 수행하기 위한 다양한 다세포 스페로이드 형성 방법을 설명합니다. 형광 평생 이미징 현미경(FLIM), 세포 자가형광, 염색 염료 및 나노 입자를 사용하여 살아있는 3차원(3D) 암 및 줄기 세포 유래 스페로이드에서 세포 대사, 저산소증 및 세포 사멸을 분석하는 접근 방식을 시연합니다.

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상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

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