상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

이 절차의 전반적인 목표는 이를 수행하기 위해 살아있는 세포막에서 지질과 단백질의 확산 법칙을 측정하는 것입니다. 먼저, 현미경의 점 확산 기능은 나노 형광 비드를 이미징하여 보정됩니다. 다음으로, 형광 표지된 관심 분자를 포함한 리포좀 기반 벡터를 준비하고 transfection 또는 직접 통합에 의해 살아있는 세포에 도입합니다.

살아있는 세포 원형질막의 빠른 이미징은 전반사 형광 현미경 검사로 수행됩니다. 마지막으로, 상관 함수가 계산되고 분자 확산 법칙이 가우스 피팅에 의해 추출됩니다. 결과 데이터입니다.

조사 중인 지질 또는 단백질의 운동 모드를 식별합니다. 광표백 접근 방식 또는 고전적인 단일 점 형광 상관 분광법 후 기존 형광 회수에 비해 이 기술의 주요 장점은 분자 확산 법칙을 측정할 수 있다는 것입니다. 우리는 시스템에 대한 우선 지식을 알고 있습니다.

또한 기존의 단일 입자 추적 방법론과 반대입니다. 여기서 mular displacement는 입자 궤적을 추출할 필요 없이 측정됩니다. 결과적으로, 이 금속은 예를 들어 유전적으로 암호화된 형광 단백질과 같이 상대적으로 간주되고 밀도가 높은 분자와 함께 쉽게 사용할 수 있습니다.

전반적으로, 이 방법은 단백질 또는 지질 운동이 원형질막 구조 및 기능 조직을 어떻게 조절하는지와 같은 세포 분자 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 이러한 질문에 대한 답변은 모든 사람이 사용할 수 있게 되며, 상용 현미경을 사용하여 전체 절차의 시연은 zo에 의해 수행됩니다. 연구실의 박사 과정 학생. 이미징 시스템의 포인트 스프레드 기능을 보정하여 이 프로토콜을 시작합니다. 먼저 500마이크로리터 원심분리기 튜브에 이전에 첨가한 90마이크로리터의 증류수에 10마이크로리터의 형광 비드 용액을 희석합니다.

메스를 사용하여 사우나 케이터링 욕조에서 용액을 20분 동안 초음파 처리한 다음 3%AGA 로즈 젤 1cm 정사각형 조각을 잘라 페트리 접시에 담습니다. 10마이크로리터의 희석된 형광 비드 용액을 겔 상단에 증착합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 2cm 유리 페트리 접시에 젤 조각을 뒤집습니다.

다시 말하지만, 집게를 사용합니다. 젤 조각을 아래로 눌러 방울을 분산시킵니다. 다음으로, 시판되는 전반사 형광 현미경으로 구성된 획득 설정을 켭니다.

인큐베이터와 빠른 E-M-C-C-D 카메라가 장착되어 있으며, 응용 프로그램 제품군, 고급 형광 소프트웨어 및 또는 Solis 이미지 획득 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터에 연결됩니다. 샘플을 현미경 스테이지의 홀더에 놓고 I 피스와 투과광을 사용합니다. 젤의 테두리에 초점을 맞춥니다.

그런 다음 젤을 대물렌즈 중앙에 놓고 초점을 조정하여 Leica 애플리케이션 제품군에서 레이저 정렬 절차를 시작하고 고급 형광 소프트웨어는 자동 정렬을 선택하고 자동 정렬 절차를 따릅니다. 및/또는 Solis 수집 소프트웨어에서 레이저를 정렬한 후 설정 버튼을 클릭합니다. 창이 열립니다.

카메라 노출을 100밀리초로, EM 게인을 1000으로, 반복을 100으로 설정하고, 프레임 전송 확인란을 선택합니다. 그런 다음 자동 저장 창을 클릭하고 실험 이름을 삽입합니다. 고립된 단일 스폿이 있는 시야를 찾습니다.

일반적으로 비드 응집체를 나타내는 밝은 점에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 100개의 프레임을 획득합니다. 이 단계를 5-6회 반복하여 여러 단일 점의 이미지를 획득합니다.

수집된 시리즈를 MATLAB과 같은 데이터 처리 프로그램으로 가져와서 스택의 시간 평균을 구합니다. 그런 다음 측정된 평균 강도 이미지를 표시합니다. 밝고 작은 형광 반점을 확대/축소하고 중심을 반점의 가장 밝은 픽셀로 대략적으로 식별합니다.

마지막으로, 입자 주위에 그리려는 관심 영역의 크기를 선택하며, 일반적으로 그 옆에 1미크론을 선택하여 가우스 함수로 선택한 강도 분포를 맞춥니다. gause fit 명령을 선택합니다. 얻은 잔차를 검사하여 피팅의 양호성을 확인합니다.

마지막으로 함께 제공된 문서에 설명된 대로 카메라를 보정합니다. 시스템이 보정되면 이미지 획득을 위해 세포에 레이블을 지정할 차례입니다. 클로로포름 1ml가 들어 있는 별도의 마이크로 원심분리기 튜브에 DOPE 1mg, D-O-T-A-P 1mg 및 PPE ADO 4 88 1mg을 각각 용해하여 지질 통합에 필요한 리포좀 준비를 시작합니다.

다음으로, 각각 0.5밀리리터의 DOPE 및 D-O-T-A-P 용액을 25마이크로리터의 PPE ATO 4 88 용액과 결합합니다. 튜브를 원심 증발기에 넣고 280gs에서 스핀을 시작합니다. 진공 펌프를 시작하고 24시간 동안 회전시키십시오.

다음 날, 0.5ml의 20 millimolar heis 버퍼를 튜브에 넣고 15분 동안 와류로 가열합니다. 그런 다음 튜브를 음파 케이터링 수조에 넣고 섭씨 40도에서 15분 동안 초음파 처리합니다. 세포를 준비하기 위해 P100 접시의 P, 합류, 중국, 햄스터 난소 또는 CHOK 1 세포를 10ml의 PBS로 3회 세척합니다.

그런 다음 트립신 1ml를 넣고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소를 5분 동안 배양합니다. 배양 후, FBS 10%가 보충된 D-M-E-M-F 12 9ml를 첨가하여 이 세포 함유 용액 150마이크로리터를 현탁시킵니다. 22mm 유리 바닥 페트리 접시에 동일한 매체의 800 마이크로 리터가 들어 있습니다.

섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 세포를 배양합니다. 지질 결합을 위해 세포 배지를 500마이크로리터의 무혈청 배지로 교체하고 30분 동안 배양합니다. 배양 후 2마이크로리터의 리포좀 용액을 넣고 15분 더 배양합니다.

그런 다음 PBS로 세포를 세척하고 새로운 DM EMF 12를 추가합니다. 실험 최소 12시간 전에 이미징하기 전에 현미경 인큐베이터를 켜서 현미경 스테이지와 광학 구성 요소를 실험 온도까지 올리십시오. 이 절차에서 가장 어려운 단계는 획득하는 것입니다.

성공을 보장하려면 시스템의 모든 수집 매개변수를 최적화해야 합니다. 연구 중. 실험 당일에는 현미경을 켜고 카메라가 작동 온도에 도달할 때까지 기다립니다.

실험을 수행하기 위해 두 대의 카메라를 사용합니다. 카메라 1은 이미징에 사용되고 카메라 2는 셀을 선택하는 데 사용됩니다. 이 구성을 사용하면 소프트웨어에서 가장 빠른 획득 시간을 얻을 수 있습니다.

투과광 이미징을 위한 매개변수를 설정합니다. 20밀리초 입력 노출 시간의 경우 두 카메라의 EM 게인으로 1을 입력합니다. 그런 다음 소프트웨어에서 대비 모드 창을 열고 왼쪽을 선택합니다.

BF를 클릭하여 명시야 옵션을 선택합니다. 샘플을 홀더에 넣는 동안 viewview접안렌즈를 통해 샘플. 샘플에 초점을 맞춥니다.

그런 다음 수동으로 빛을 카메라 1로 보내고 슬릿을 부드럽게 밀어 이미지화할 ROI만 조명되도록 합니다. 그런 다음 셀을 선택한 영역으로 이동하고 소프트웨어를 사용하여 카메라 2로 조명을 보냅니다. 그런 다음 소프트웨어에서 ROI를 그려 참조를 생성합니다.

먼저 소프트웨어로 레이저를 정렬하려면 자동 정렬을 선택합니다. 그런 다음 자동 정렬 절차를 시작하려면 시준기 사용을 선택합니다. 그런 다음 상단의 인큐베이터를 열고 레이저 빔을 시준합니다.

레이저가 소프트웨어 창의 왼쪽 하단 모서리에 정렬되면 70 버튼을 클릭하여 침투 깊이를 70나노미터로 설정합니다. 이것은 Leica 응용 제품군에서 약 70도의 바닥 유리에 있는 레이저의 입사각에 해당합니다. 고급 형광 소프트웨어 노출 시간 텍스트 상자.

EM 게인 텍스트 상자에 70밀리초를 입력합니다. 카메라 2에서 동일한 작업을 수행하려면 1000을 입력합니다. 설정 창을 열고 해당 텍스트 상자에 동일한 숫자를 입력합니다.

그런 다음 라이브 버튼을 클릭합니다. 형광은 카메라 1로 전송되고 샘플의 이미지가 화면에 나타납니다. 형광 세포가 관심 참조 영역에 도달할 때까지 샘플을 이동합니다.

그런 다음 현미경 본체 전면에 있는 버튼을 눌러 빛을 카메라 2로 보내고 Z 위치 휠을 정확하게 움직여 및 또는 단독 소프트웨어의 세포막에 초점을 맞춥니다. 설정 창을 열고 1000 EM 게인 크롭 센서 모드 10에서 달성 가능한 최소 노출 시간을 5회 반복으로 설정하고 자동 저장 옵션을 설정하여 이미지 시리즈 획득을 시작합니다. 소프트웨어의 카메라 아이콘을 클릭하고 획득이 완료될 때까지 기다립니다.

그런 다음 설정 창을 열고 EM 게인을 비활성화하고 자르기 모드 옵션에서 확인 표시를 제거합니다. 획득하는 동안 카메라의 온도는 일반적으로 약 2-3도 증가합니다. 따라서 새 셀에서 이미지를 획득하기 전에 최적의 작동 온도에 도달할 때까지 기다리십시오.

다시 말하지만, 이미징이 완료되면 함께 제공되는 문서의 지침에 따라 이미징의 평균 제곱 변위를 계산하여 관심 분자의 형광 표지된 변형체를 얻습니다. CHOK one 세포는 ADO 4 88 PPE로 표지되거나 수용체 또는 T-F-R-G-F-P의 전달로 transfection되고 이 비디오에 설명된 대로 TIRF로 이미지화되었습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, ADO 4 88 PPE에 대해 측정된 확산 법칙은 평평하며, 이전에 T-F-R-G-F-P를 사용한 형질 주입 후 유도 방출 공핍 형광, 상관 분광법 또는 stead FCS 측정에 의해 나타난 바와 같이 대부분 자유 확산을 나타내며, T-F-R-G-F-P에 대해 측정된 확산 법칙은 처음에는 평평하며 평균 겉보기 확산 계수가 초당 약 0.7미크론 제곱인 평균 분자 변위의 100나노미터 미만으로 유지됩니다.

그 다음에는 겉보기 확산도가 초당 0.2미크론 제곱까지 급격히 감소합니다. 일반적으로 회절 제한 FCS로 측정되는 값입니다. 이 마지막 예에 의해 보이는 것과 같이, 현재 접근 방식은 GFP와 같은 상대적으로 희미하고 조밀한 라벨을 사용하더라도 수십 나노미터의 해상도로 평균 분자 변위를 쉽게 측정할 수 있다는 점에 유의하는 것이 흥미롭습니다.

더욱이, 겉보기 확산 계수가 감소하기 시작하는 공간 규모는 이전 추정치와 마찬가지로 막 골격에 의한 단백질 부분 감금의 특징적인 크기를 약 120나노미터로 설정합니다. 일단 마스터하면 데이터 분석 및 수집 절차를 몇 분 안에 완료할 수 있습니다. 우리는 이 기술이 세포 및 분자 생물학 분야의 연구자들이 생명 샘플에서 단백질 및 지질 확산의 시공간 조절을 쉽고 정량적으로 탐구할 수 있는 길을 열 것이라고 믿습니다.