인간 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 다공성 뼈 매트릭스에 자신의 재배

중간엽 줄기세포(MSC)는 용해성 인자 또는 특정 생체 물질로 자극될 때 조골세포 계통으로 분화 가능성이 있습니다. 이 연구는 소 뼈 기질 Nukbone(NKB)을 골격으로 사용하는 인간 양막(AM-hMSC)에서 MSC를 전달하기 위한 새로운 옵션을 제시합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 다공성 뼈 기질에서 인간 중간엽 줄기 세포를 배양하는 것입니다. 이는 먼저 인간 양막 또는 AM hcs에서 중간엽 줄기세포를 분리함으로써 달성됩니다. 다음으로, 다공성 뼈 기질 디스크는 세포가 성장할 수 있도록 영양분의 올바른 분포를 선호하도록 준비됩니다.

그런 다음 AM hcs를 다공성 뼈 기질 디스크에서 배양합니다. 마지막으로, 식민지 형성 단위를 계산하고 형태를 지정합니다. 세포 증식 및 세포 부착을 모두 분석합니다.

궁극적으로 세포 형태, 집락 형성 단위의 수, 세포 증식 및 세포 부착은 각각 활성 염료를 사용한 광학 현미경 염색 및 주사 전자 현미경을 통해 분석됩니다. 이 기술의 의미는 뼈 손상 치료로 확장되는데, 중간엽 줄기세포를 자연 뼈를 모방한 거대 다공성 생체 물질에 전달할 수 있기 때문입니다. 인간 양막에서 중간엽 줄기세포를 분리하려면 한 손으로 탯줄을 잡고 다른 손으로 반투명 시트처럼 보이는 양막을 분리합니다.

샘플에 choon이 있는 경우 수동으로 해부하여 양막 조직에서 분리합니다. PBS 5ml를 사용하여 샘플을 세 번 세척하여 잔여 혈액을 제거하고 간단한 집게를 사용하여 메스로 혈전을 제거합니다. 양막을 작게 절개하여 약 0.5제곱센티미터의 파편을 생성합니다.

멤브레인을 소화하려면 50ml 원추형 튜브에 조각을 넣고 0.125% 트립신 0.5 millimolar EDTA 용액 5ml를 추가합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 30분 동안 배양한 후 200Gs와 섭씨 25도에서 5분 동안 회전합니다. 그런 다음 상등액을 버리십시오.

다음으로, 15ml의 콜라겐 분해 효소 유형 2 용액을 넣고 섭씨 37도에서 2 시간 동안 배양하고 al의 용암 프로토콜에 따라 가끔 흔들어 먹습니다. 분해 직후 15 ml의 PBS와 원심 분리기를 200G 및 25 °C에서 10 분 동안 첨가합니다. 상층액을 버리고 PBS를 사용하여 세포 펠릿을 세척한 후 15분 동안 다시 회전시킵니다.

상등액을 버린 후 펠릿에 H-G-D-M-E-M 10ml를 넣고 부드럽게 흔들어 재현탁합니다. 중간엽 줄기세포를 확장하기 위해. 배양 플라스크에 2ml의 세포 현탁액을 시딩하고 2ml의 H HG DMEM 배양을 추가합니다.

그리고 5-7일 후에 배양 배지를 변경하여 비접착 세포를 제거합니다. 그런 다음 추가로 7-10일 동안 3일마다 세포가 90% 융합될 때까지 배양 배지를 변경합니다. EDTA에 0.125%트립신을 첨가하고 5분 동안 배양한 후 세포 현탁액을 흡인하고 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

세포를 회전시키고 상층액을 버린 후 HG DMEM을 사용하여 세포 펠릿 배양을 재현탁합니다. 2 75 평방 센티미터 플라스크의 세포는 90 % 합류점에서 배양을 유지합니다. 아홉 번째 통로 또는 하위 배양까지 화와 반복 도금을 반복합니다.

그런 다음 유세포 분석 또는 다른 연구를 위해 세포를 복구합니다. 다공성 뼈 매트릭스 디스크를 준비합니다. 먼저 각 NKB 디스크에 FBS가 없는 HG DMEM 3ml를 첨가하고 다음 날 FAA etal에 따라 가습된 분위기에서 밤새 배양합니다.

각 디스크를 50ml 원뿔형 튜브에 넣고 200GS에서 5분 동안 회전하여 과도한 배양 배지를 제거한 다음 24웰 배양 플레이트로 옮깁니다. 500마이크로리터의 H-G-D-M-E-M을 추가하고 영양소와 세포의 올바른 분포를 위해 디스크에 기포가 없는지 확인합니다. 섭씨 25도에서 30분 동안 3개의 하위 배양에서 천천히 그리고 지속적으로 배양합니다.

사전 결혼 된 생체 재료 디스크의 표면에 세포 현탁액을 파종하고 배양 후 30 분 동안 배양하고 1.5 밀리리터의 전쟁 전 H-G-D-M-E-M을 조심스럽게 첨가하고 세포 증식 분석을 수행하기 위해 3 일 동안 배양을 유지하고 제조업체의 지침에 따라 세포 디스크 샘플에 150 마이크로 리터의 필수 착색제 AB를 첨가합니다. 600나노미터의 기준 파장으로 570나노미터에서 흡광도를 즉시 측정합니다. 7일 동안 세포를 배양하고 24시간마다 흡광도를 측정합니다.

H-G-D-M-E-M에서 100mm 조직 배양 디스크당 100개의 세포를 배양하여 집락 형성 단위를 측정하고 14일 동안 배양합니다. PBS를 사용하여 배양액을 세척하고 메탄올에 0.5% 크리스탈 바이올을 사용하여 실온에서 5-10분 동안 세포를 염색합니다. 이러한 유세포 분석 히스토그램에서 볼 수 있듯이 현미경을 사용하여 세포를 계수하기 전에 PBS를 사용하여 플레이트를 두 번 세척합니다.

양막에서 분리된 세포 집단은 표면 중간엽 마커 CD 90, CD 73 및 CD 1 0 5에 강하게 반응하고 조혈 마커 CD 34 및 CD 45에 음적으로 반응하여 AM HSC가 실제로 중간엽임을 나타냅니다. 이 스캐닝 현미경 사진에서 볼 수 있듯이, 생체 물질의 표면은 첫째 날에 구형 세포로 덮여 있었고 AMC는 7일째 되는 날에 소 매트릭스 표면에 부착된 것으로 보입니다. 더 높은 배율에서 podal 과정을 채우는 것을 통해 세포는 서로 접촉을 형성합니다.

이 그래프는 소 행렬의 상대 흡광도 단위가 약간 감소한 것을 보여줍니다. 배양 하루 후, 골격의 존재는 세포 증식의 증가를 유도하며, 줄기 세포를 분석하기 위해 콜로니 형성 단위 분석을 사용하여 소 매트릭스가 없을 때 수행된 배양과 비교하여 통계적으로 유의합니다. 이 그래프는 이 비디오에서 보여준 것처럼 분리되고 다양한 밀도로 도금된 AM HSC가 배양에서 14일 동안 개별 콜로니를 형성하는 능력을 보존했음을 보여줍니다.

이 비디오를 시청한 후에는 중간엽 줄기세포와 거대다공성 생체 재료에 전달하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.