Name: 인간 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 다공성 뼈 매트릭스에 자신의 재배 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 배우세요 인간 중간엽 줄기세포를 양막에서 분리하여 다공성 소뼈 매트릭스에서 배양하는 방법을. 이 기술은 뼈 손상 치료를 위한 세포 전달 및 재생의학 연구에 활용됩니다.

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우리는 장학금과 Consejo 나시 오날 드 Ciencia y를 TECNOLOGIA (CONACYT No.49887), Facultad 드 Medicina - UNAM DGAPA IN201510과 DGAPA IN216213에서 제공하는 재정 지원을 인정; 생체 물질에 대한 도움말 연구소의 나시 오날 드 Perinatología의 살바도르 코레아; Nukbone을 기부하고 Biocriss, SA 드 C. V. 또한 잉에 감사드립니다. IIM, UNAM의 헥터 마르티네즈 및 기술 지원을 CINVESTAV의 M EN C 파비 곤잘레스.

이 연구는 연구와 관련된 인간의 윤리적 행위에 관한 헬싱키 세계 의학 협회의 선언에 따라 수행하고 Facultad 드 Medicina, UNAM (프로젝트 번호 101-2012)의 연구 윤리위원회에 의해 승인되었다. 인간 중간 엽 줄기 세포의 1. 분리 <ol><li> 시약의 조제 <ol><li> 1 % 항생제 항진균제 용액과 인산 완충 식염수 (PBS) 및 보충을 준비합니다. </li><li> 둘 베코 변형 이글 배지, 고 글루코스 (DMEM-HG)을 준비하고, 0.2 ㎛의 필터로 여과하여 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 항생제 - 항진균제 solution.Sterilize이 배양 배지를 추가한다. </li><li> FBS 또는 항생제 항진균제 솔루션없이 HG-DMEM 100 U / ㎖에서 콜라게나 제 II 솔루션을 준비합니다. </li><li> , 분리에 필요한 고압 증기 멸균에 의한되는 다음 수술 도구를 소독 : 표준 가위를의 간단한 해부 포셉, 미세 포인트와 이빨 집게와 메스 핸들 (# 4). </li></ol></li><li> 양막의 중간 엽 줄기 세포의 분리 <ol><li> 한 손으로 탯줄을 잡고 다른 손으로, 약 5cm (2)의 조각을 얻기 위해, 반투명 시트처럼 보이는 양막 (AM)를 분리. 융모막 부는 시료에 있으면 융모막 부는 양막보다 두꺼운로서, 수동에 의해, 기본 해부 융모막 분리. </li><li> PBS 5 ml의 세 가지 세척과 잔여 혈액을 제거하고 간단한 집게와 혈전을 제거합니다. 약 0.5 cm 2의 조각을 생성하기 위해 메스 오전에 작은 상처를 확인합니다. </li></ol></li><li> 양막의 효소 소화 <ol><li> 0.125 % 트립신 5 ㎖ / 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 50 ㎖ 원뿔형 튜브에서 30 분 동안 37 ℃에서 0.5 mM의 EDTA 용액으로 AM 부화. (250) 원심 분리기XG, 5 분 동안 25 ° C 한 다음 상층 액을 버리고 트립신 용액을 제거. </li><li> 가끔이 레이 바 등에 따른 진탕하면서 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 2 시간 동안 콜라게나 제 유형 II를 15ml의 용액을 첨가하고, 배양한다. (9) </li><li> 즉시 II 콜라겐과 소화 후 250 XG에 15 ml의 PBS 및 원심 분리기를 추가하고 10 분 동안 25 ° C. </li><li> 뜨는을 취소하고 250 XG에 PBS 용액과 원심 분리기 15 ㎖를 15 분 동안 25 ° C와 세포 펠렛을 씻는다. 상층 액을 제거한다. </li><li> 부드럽게 흔들어 HG-DMEM 10 ㎖의 세포 펠렛을 재현 탁. </li></ol></li><li> 중간 엽 줄기 세포의 확장 <ol><li> 이 종자 배양 플라스크에서 세포 현탁액 (1 × 104 세포 / ㎠) ml의 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 세포를 DMEM-HG 2 ㎖를 추가 배양한다. 5-7 후 배양 배지를 변화시킴으로써 비 - 부착 세포를 제거일. </li><li> 이 시간 후에, 90 %의 세포를 얻기 위해 합류 추가 7~10일위한 배지를 3 일마다 변경. </li><li> 균체를 회수하고, 0.125 % 트립신 / EDTA 용액 (트립신 처리)와 함께 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 5 분 동안이를 부화. </li><li> 즉시 트립신 후, 5 분 250 XG에 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 피펫 및 전송에 세포를 수집합니다. </li><li> 상층 액을 버리고 HG-DMEM 10ml에 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 문화 전지 두 75cm 2 배양 플라스크에 서스펜션 (각 플라스크에 5 ml)에 용해시키고, 90 %의 합류까지 문화를 유지한다. </li><li> 반복 1.4.3 단계를 반복합니다. 1.4.6에, 9 통로 또는 하위 문화까지. </li><li> 유동 세포 계측법 또는 다른 연구 1.4.5하는 단계 1.4.3에서와 같이 트립신 처리하여 세포를 복구 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 다공성 뼈 매트릭스 디스크 2. 준비 (NKB) <ol><li> NKB 디스크를 젖은(직경 12mm, 두께 2mm). 각각의 디스크와 밤새 인큐베이션 Fassina 외 3에있어서, 37 ℃에서 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서없이 FBS DMEM-HG의 ㎖, 5 </li><li> 습윤 처리 한 후, 여분의 배지를 제거하는 5 분 동안 250 XG에 50 ML 원뿔 튜브와 스핀에 디스크를 넣고. 24 웰 세포 배양 플레이트에 디스크를 놓습니다. <ol><li> HG-DMEM의 500 μl를 추가하고 25 ° C에서 30 분 동안 배양한다. 기포가 영양소와 세포의 정확한 분포를 선호하는 NKB 디스크에 존재하지 않는 것을 확인합니다. </li><li> 기포 디스크에 발견되면, 흔들어 배양 배지 300 μl를 추가하고, 37 ℃에서 5 % CO 2의 가습 분위기에서 15 분 동안 배양한다. 이 시간이 지나면 잘 세포 배양의 벽을 통해 빠는 배지 300 μl를 제거하고 기포가 형성 없음을 확인합니다. </li></ol></li><li> 간단한 집게를 사용하여 새 24 웰 플레이트에 디스크를 넣습니다. </li></ol><ol><li> 전 습윤 생체 디스크의 표면 상에, 세 계대 배양에서 (HG-DMEM 100 ㎕에서 5 × 105 AM-중배엽 줄기) 세포 현탁액 시드 및 37 ℃, 5 % CO 2의 가습 분위기에서 30 분 동안 인큐베이션 ° C. 모든 세포가 지지체의 지형과 상호 작용할 수 있도록 생체 물질의 상면에 천천히 연속적이 단계를 수행한다. 주 :이 절차는 표 1에 나타낸 바이오 물질에 부착 된 세포의 60 %를 달성한다. </li><li> 37 ° C에서 5 % CO 2의 가습 분위기에서 3 일 동안 문화를 37 ° C에서 HG-DMEM의 1.5 ML을 추가하고 유지한다. 피 용 배지의 첨가에 난류를 생성하지 않는 배양 접시 접시 바닥에 세포의 성막. 이것은 초기 시간입니다. </li></ol> 흐름 Cytom 4. 세포 표면 마커 특성 분석etry <ol><li> 매트릭스 디스크에 파종 전에 9 번째 계대 배양에서 세포를 분리합니다. 0.25 % 트립신 / 1 mM의 EDTA를 사용하여 얼음처럼 차가운 2 % 포름 알데히드에서 30 분간를 수정. 고정 후, 0.05 % PBS로 한 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 얼음에 3 분 동안 20 % 인간의 면역 글로불린과 함께 세포를 배양하여 비특이적 결합을 차단 및 피코 에리 트린 (를 PerCP)와 0.1 × 10 6 세포 씩 품어은 CD73, FITC 접합 된 단클론 항체 CD90, CD34에 대한 PE - 복합 단클론 항체에 대한 단클론 항체를 π 공역 어둠 속에서 25 ° C에서 1 시간 동안, FITC 접합 된 단클론 항체 CD45 및 PE 접합 된 단클론 항체 CD105. 이소 매치 FITC 접합 된 단클론 항체는, PE - 복합 단클론 항체 andPerCP 접합 된 단클론 항체는 음성 대조군을 될 것입니다. </li><li> 데이터 수집 및 분석을위한 소프트웨어를 사용하여 표면 마커의 발현 수준을 계산한다. </li></ol> 주사 전자 현미경 5. 세포 접착 검출 <ol><li> PBS로 두 번 문화 3 일에있는 셀 디스크 샘플을 씻어및 0.1 M 나-cacodylate 완충액 (pH 7.2) solutionin 4 % (v / v)의 글루 타르 알데히드와 fixthe 샘플. </li><li> 이전 리베라-N 등에 의해보고 된 바와 같이., 현미경 관찰을 위해 열을 준비하고 샘플을 15 kV로의 전위와 500X 및 2000X의 배율에서 주사 전자 현미경을 이용하여 관찰한다. </li></ol> 6. 세포 증식 분석 <ol><li> 배지 1.5 ㎖에 함유 세포 디스크 샘플에 37 ℃에서 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 세포를 제조업 자의 지침에 필수적 착색제 (AB)에 따른 150 μL를 추가 배양한다. </li><li> 즉시 AB (0 시간)에 첨가하고 세포 배양 7 일에 도달 될 때까지 각각 24 시간 후, 600 nm의 기준 파장 570 nm에서 흡광도를 측정한다. </li></ol> 7. 콜로니 형성 단위 (CFU) (11) <ol><li> 문화 100 100mm 조직 배양 diskin HG-DMEM 당 세포와 14 품다37 ℃에서 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 일. </li><li> 실온에서 5 ~ 10 분 동안 메탄올 0.5 % 크리스탈 바이올렛 PBS와 문화와 얼룩을 세척 할 것. </li><li> 두 번 PBS로 접시를 씻고 혈구를 사용하여 눈에 보이는 식민지를 계산합니다. </li></ol>

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

양막 (도 1)로부터 수득 된 줄기 세포는 섬유 아세포와 같은 형태, 중간 엽 세포와 유사한 (도 2) 중간 엽 줄기 세포 주로 보여주고 있었다. 또한, 유동 세포 계측법 분석은 이러한 세포는 조혈 계통 마커 (CD34, CD45) (그림 3)에 대한 중간 엽 세포 마커 (CD73, CD90, 및 CD105) 양성 및 음성 인 것으로 나타났습니다. 또한,이 연구에서 고립 된 AM-중배엽 줄기 세포는 CFUs (그림 6)를 형성하는 능력을 제시한다. 마찬가지로,이 양식에 고립 된 중간 엽 줄기 세포는 (그림 5) osteoinductor의 생체 재료 (그림 4)에 연결하고, 발판에 증식 할 수있는 능력을 유지했다. 이러한 이유로,이 연구에서 사용 된 거대 다공성 뼈 생체 재료에 AM-중배엽 줄기 세포의 배양 방법은 손상된 뼈 조직 내의 세포를 삽입 한 differe을 유도 할 수있는 기회를 나타낸다조골 세포 혈통에 ntiation. 이 배양 시스템은 NKB는 osteoconductive andosteoinductive 재료 (8) 때문에 조골 세포 및 조골 세포의 표현형 분화 과정을 유지하기 위해 골아 인덕터의 첨가를 필요로하지 않는다. 인간 태반 등 폐 조직의 사용은 빈번 침습적 방법 또는 낮은 셀 수율 관련된 다른 소스와 비교하여, 중간 엽 줄기 세포로 분화하는 잠재력을 가진 줄기 세포 집단에 액세스하기 위해 간단하고 윤리적 대안을 나타낸다. 셀이 상부 표면 물질 상에 마이크로 질량 시딩 때문에 제안 배양법 생체 시스템으로 외삽 될 수 있으며, 세포에 정착하고 적절한 배양 시간 후에 전체 바이오 물질의 표면에 부착. 이 기술을 구현할 때 또한, 정교한 시약, 장비 및 절차로도 기존의 방법과는 달리, 마이크로 질량 cultureas을 아르 필요하지 않습니다재료에 세포 나누어지는 느리고 꾸준한 침착은 세포가 우선적으로 판의 바닥에 바이오 물질과 상호 작용하지 않도록합니다. 이것은 그들이 표면 또는 세공 내에 있으면 이들이 관계없이 재료에 통합 될 때 세포가 배양 배지에서 필요한 영양분을 가질 것을 보장로서 또 다른 중요한 점은, 세포를 배양하기 전에, 먼저 습윤 물질의 사용이다. 이 유도 및 골아 분화를 유지하기 위해 외부 요인의 첨가를 피할 수 있기 때문에 최종적으로, 골 유도 생체 물질의 사용은이 프로세스에 중요하다. 기술의 한계가 소 행렬의 전위에 기초하여 골 유도된다는 것이다; 그러나, 제안 된 배양 시스템은 20 ~ 200㎛의 기공 분포 어떠한 다공질 재료에 외삽 될 수있다. 따라서, 본 연구에 제시된 절차는 다양한 재료 t에서 중간 엽 줄기 세포를 배양하기위한 다른 방법은모자는 특히 뼈 재생을 위해, 조직 공학을 위해 사용된다.

거기 쌍 및 조직에서 ororgan 병변 무기력하고, 경우에 치명적인 때문에 의학 목적의 것으로 이루어진다 tissuesis 하나의 재생. 맥락에서, 건강 노동자들과 연구자들은 지속적으로 새로운 치료 alternativesto가 손상 조직의이 쌍 - 재생 과정을 촉진 제공하는 기술, 방법 및 도구를 찾고있다. 이 세포 계보, 조직 재생 과정을 연구하는 이상적인 모델을 나타내고 있기 때문에, 생의학는 외배엽, 중배엽 및 내배엽으로 분화 할 가능성이 높기 때문에에, 중간 엽 줄기 세포 (MSC들), 특히 성체 줄기 세포에 대한 연구에 초점을 맞추었다 세포 계통은 다소 MSC들과 현실을 치료하기 위해, 중간 엽 줄기 세포의 thetherapeutic 전위 특성은 숙주 조직에서 중간 엽 줄기 세포의 원하는 동작을 보장 생체 재료 및 셀룰러 비계를 이용하여 새로운 세포 배양 기술의 구현을 수반한다. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 골 재생에서 중간 엽 줄기 세포와 배양 구현 극복하는 주요 과제는 일반적으로 사용 된 마이크로 미터부터 밀리미터까지의 기공 adistribution 가진 다공성 구조를 제공 선택된 생체 물질에 세포 접착 성을 확보하는 것이다 그러나 자주 세포의 복잡한 동작을 변경 시약, 장비 및 절차를 요구한다. 이러한 절차는하지만 인간이나 생체 분석에 복잡한 오픈 시스템에서 외삽 및 구현, 시험 관내 추정에 적합하다. 다공성 뼈 물질과 같은 임의의 지형에 세포 부착을 보장 초점 기술들이 배양 웰의 바닥에 재료의 접착에 의해 연구 및 콜라겐 아가 로스 중합체를 이용되어왔다. 이러한 방법의 경우, 표면 상에 시딩 된 셀 기공 및 상부면 상에 보유 하였다. 그러나, 이러한 양태는 생체 내에서 확보 할 수없는생체를 둘러싸 체액 다공성 지지체의 원하는 위치에서 셀을 드래그 할 수있는 시스템은 복잡한 장비가 필요하지만, 시험관 내 어 세이 (5)에 조골 세포 마커의 발현을 촉진 초음파 자극의 사용이다. 연속 배양의 사용은 배양 배지 내 영양분의 균질 분포를 보장 생물 반응기를 필요로; 이에 기술과 설비의 벽에 부착 매체에서 사용되는 유량 배지 교체시 그러나, 배양 된 세포의 상당한 비율이 손실된다. 이러한 문제는 이러한 유형의 배양 세포 (7)의 충분한 수를 얻기위한 시간이 필요하다 세포 질량을 증가시킨다. 따라서, 본 연구에서 제시된 방법은 세포가 상면 물질 상에 마이크로 질량 시딩 때문에 생체 시스템으로 외삽되어야 기법을 나타내고, 이후 appropri배양 시간을 먹었다, 초기 세포 질량의 60 %가 부착된다. NKB는 osteoconductive 및 골 유도 골격 8 방법이기 때문에 또한,이 기술은 골아 인덕터 (예를 들면, 덱사메타손, 아스코르브 산, 베타 - 글리세로 포스페이트) 또는 조골 세포 분화 및 골 세포 표현형의 유지를 유도하는 초음파 자극의 첨가를 필요로하지 않는다 손상된 뼈 조직에 세포를 삽입하고 조골 세포 계보로 분화를 유도하기 위해이 작업 representsapossibility에서 제시 거대 다공성 뼈 생체 재료에 인간 양막 (AM-중배엽 줄기 세포)에서 중간 엽 줄기 세포의 배양.

<table><tbody><tr><td>멸균 인산염 완충 식염수</td><td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 10010023</td><td></td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES 10378016</td><td></td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td><td></td> 26140111 <td>세포 배양</td></tr><tr>고포도당 <td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td><td>의 DMEM(Modified Eagle's Medium)</td> GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES <td>11965118</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 II</td><td>형 GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES</td><td></td> 17101015 <td>세포 배양</td></tr><tr><td>3 mM 염화칼슘</td><td>SIGMA_ALDRICH</td><td>C5670</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>트립신 / 0.5 mM EDTA 용액</td><td>GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES</td><td></td> R001100 <td>세포 배양</td></tr><tr><td>Trypan Blue 용액</td><td>GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES</td><td></td> 15250061 <td>세포 배양</td></tr><tr><td>phycoerythrin (PerCP) - 활용 CD73</td><td>BD Pharmigen</td><td>562245</td><td>cytomery</td></tr><tr><td>FITC- CD90,</td> <td>BD Pharmigen</td><td>562245</td><td>cytomery</td></tr><tr><td>PE-CD34</td><td>BD Pharmigen</td><td>562245</td><td>cytomery</td></tr><tr><td>FITC-CD45</td><td>BD Pharmigen</td><td>562245</td><td>cytomery</td></tr><tr><td>PE-CD105</td><td>BD Pharmigen</td><td>562245</td><td>cytomery</td></tr><tr><td>BD FACSCalibur 유세포 분석기</td><td>BD Pharmigen</td><td>BD FACS칼리버</td><td>사이토머리</td></tr><tr><td>알라마Blue (AB)</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td>DAL1025</td><td>증식 세포 분석</td></tr><tr><td>SUNRISE-reader</td><td>TECAN, 독일</td><td>일출</td><td>증식 세포 분석</td></tr></tbody></table>

인간 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 다공성 뼈 매트릭스에 자신의 재배

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

중간엽 줄기세포(MSC)는 용해성 인자 또는 특정 생체 물질로 자극될 때 조골세포 계통으로 분화 가능성이 있습니다. 이 연구는 소뼈 기질 Nukbone(NKB)을 골격으로 사용하는 인간 양막(AM-hMSC)에서 MSC를 전달하기 위한 새로운 옵션을 제시합니다. 따라서 복구 및 조직 재생 과정에서 MSC의 적용은 주로 이러한 세포를 숙주 조직에 배치하는 기술의 효율적인 구현에 달려 있습니다. 이러한 이유로 생체 재료 및 세포 골격의 설계는 최근 몇 년 동안 중요성을 얻었는데, 그 이유는 선택한 골격의 지형적 특성이 손상된 조직의 미세 환경에서 원하는 세포 계통으로의 접착, 증식 및 분화를 보장해야 하기 때문입니다. 인간 양막(AM-hMSCs)에서 MSC를 전달하기 위한 이 옵션은 소 뼈 매트릭스를 세포 골격으로 사용하며 세포가 소 뼈 매트릭스 Nukbone(NKB)의 지형적 특성, 즉 세포 분리 과정 후 표면에 퍼지고 거대 다공성 덮개 및 생체 물질의 깊이를 집락화하는 데 반응하기 때문에 효율적인 배양 기술입니다. 소 매트릭스에서 MSC를 분리하고 배양하는 절차를 제시합니다.

인간 중간 엽 줄기 세포 격리 박리 (blunt dissection) (도 1)를 사용하여 융모막으로부터 AM의 기계적 분리 한 후, 접착 세포 집단은 콜라게나 제 및 트립신 II 절단에 의해 수득 하였다. 건강한 도너 어머니로부터 획득 된 광학 현미경 사진 (도 2A) 및 주사 전자 현미경 사진 (도 2B)이 연구에서 사용 된 국지적 태반 3에 도시 한 바와 같이 일째 섬유 아세포와 같은 세포 형태 presenta 배양 접시에 부착 된 선택된 세포 집단이 분리를 게시 withprevious는 동의를 알렸다. 유동 세포 계측법에 의해 특성화 오전로부터 얻은 세포 인구 (3.46 ± 79 %) 표면 중간 엽 마커 CD90 + (6.85 ± 93.5 %)과 CD73 +와 CD105 +에 강하게 반응했다 및 CD34-와 CD45 등 조혈 마커에 부정적인 반응을 보였다. 따라서,이 작품에 사용 된 AM-중배엽 줄기 세포는 이전에 레이 바 등. (그림 3)에 의해보고 accordancewith 정보, 중간 엽했다. 또한,이 결과는 중간 엽 줄기 세포에 대한 세포 치료에 대한 국제 협회 (ISCT)에 의해 확립 된 면역 표현형 특성과 일치한다. 뼈 매트릭스에 세포 부착 주사 현미경 사진에 NKB 축성 후 AM-칠일 중배엽 줄기 세포의 행동을 나타낸다. 생체 재료의 표면은 구형 세포 (첫날), 그리고 분명히 일곱 번째 날에 소 매트릭스 표면에 부착 된 일부 확산 세포로 덮여 있었다. 높은 배율에서 확산 세포 filipodial 프로세스 (FL) (그림 4)를 통해 밀착 것으로 나타났다. 뼈 매트릭스에 세포 증식 AB 분석의 결과는 상대 흡광도의 작은 감소 하였다 U 니트 소 행렬 조건 (+ 골 기질)의 (RAU) 인큐베이션 일일 후 다음 일째, 지지체의 존재 소과의 부재 하에서 수행 배양과 비교하여 통계적으로 유의 한 세포 증식의 증가를 유도 매트릭스 (-bone 매트릭스) (그림 5). 콜로니 형성 단위 CFU는 줄기 세포의 분석 전통적이다. 이 연구에서 고립 된 AM-중배엽 줄기 세포는 배양 14 일째 이산 식민지를 형성하기 위해 능력을 유지. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig1highres.jpg"> 그림 1 : 양막의 분리. (A) 탯줄 (UC)은 양막이 얻어지는 영역을 식별하기 위해 한 손으로 유지된다. (B)는 양막 (AM)은 혈액 신경 밀도없이 반투명 필름을 닮았다. 항상 "&gt; :"유지 - together.within 페이지를 = FO "ve_content <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig2highres.jpg"> 그림 2 :. 인간 양막에서 줄기 세포의 형태 학적 특성 후 격리 삼일에서 AM-hMSC 문화 광학 현미경을 이용하여 관찰하고 섬유 아세포와 같은 형태를 보였다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig3highres.jpg"> 그림 3 :. 특성 유동 세포 계측법은 인간 양막에서 세포가 중간 엽 마커 (CD73, CD90, CD105) 양성 있었기 때문에 오른쪽으로 히스토그램의 변위에 의해 도시 된 바와 같이, 대부분 중간 엽 세포했고, (조혈 마커에 대한 부정적인 CD34 및 CD45), 왼쪽의 히스토그램에 의해 확인 된 바와 같이 변위. PE와 FITC 형광 색소 isotypesfor 컨트롤에서 관찰하는 동안 항원, 빨간색 막대 그래프에 표시됩니다검은. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig4highres.jpg"> 도 4 :.. 소 뼈 매트릭스에 바이오 물질의 기공에 세포의 부착을 보여주는 SEM 이미지의 시리즈 세포 부착 (A)는 구면 상태 (CS)에 바이오 물질에 부착 여러 셀 NKB 기공의 파노라마 비전 생체 물질의 표면 상에 (CF) 평탄화, 소 행렬에 배양 세 하루 누락이 (락)으로 나타내는 뼈 감사 할 수있다. 표면에 적응시키는 과정에서 전지 (B)의 증폭 filipodial 예측을 통해 재료 소 매트릭스에 부착 평평 두 세포 사이 (C)의 상호 작용 (C1, 셀 (1)과 C2 셀 2).. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51999/51999fig4large.jpg" target="_blank">V하려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 더 큰 버전을 서평. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig5highres.jpg"> 그림 5 :. 소 뼈 매트릭스 세포 증식 세포의 증식은 AB 감소에 의해 평가 및 재배 7 일 함께 상대 흡광도 단위로 표현했다. 결과는 부정적 조건 (-bone 행렬)에 비해 정적 달랐다 AM-중배엽 줄기 세포 증식 뼈 매트릭스 (+ 골 기질)의 영향을 나타낸다. (* p &lt;0.05) <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig6highres.jpg"> 그림 6 : 중간 엽 줄기 세포의 CFU 분석 초기에 다양한 밀도에서 도금 14 일 동안 배양 (- SD, N = 10 * / 의미). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 세포 접착 </td><td> 세포 부착 (%) </td></tr><tr><td> 바닥에 셀 </td><td> 187,667 ± 1,208 </td><td> 62.47 </td></tr><tr><td> 인공 지지체에 세포 </td><td> 312,333 ± 1,208 </td><td> 37.53 </td></tr></tbody></table> 표 1 :. 중으로 두 독립적 인 실험에 소 행렬에 부착 효율 플레이트 접시의 바닥 지지체에 부착 된 세포를 접착 세포 표에 trypsinization.The 데이터에 의해 회수 된 후 혈구에 의해 계수 하였다 대응 표준 편차를 ±

중간엽 줄기세포(MSC)는 용해성 인자 또는 특정 생체 물질로 자극될 때 조골세포 계통으로 분화 가능성이 있습니다. 이 연구는 소 뼈 기질 Nukbone(NKB)을 골격으로 사용하는 인간 양막(AM-hMSC)에서 MSC를 전달하기 위한 새로운 옵션을 제시합니다.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

이 절차의 전반적인 목표는 다공성 뼈 기질에서 인간 중간엽 줄기 세포를 배양하는 것입니다. 이는 먼저 인간 양막 또는 AM hcs에서 중간엽 줄기세포를 분리함으로써 달성됩니다. 다음으로, 다공성 뼈 기질 디스크는 세포가 성장할 수 있도록 영양분의 올바른 분포를 선호하도록 준비됩니다.그런 다음 AM hcs를 다공성 뼈 기질 디스크에서 배양합니다. 마지막으로, 식민지 형성 단위를 계산하고 형태를 지정합니다. 세포 증식 및 세포 부착을 모두 분석합니다.궁극적으로 세포 형태, 집락 형성 단위의 수, 세포 증식 및 세포 부착은 각각 활성 염료를 사용한 광학 현미경 염색 및 주사 전자 현미경을 통해 분석됩니다. 이 기술의 의미는 뼈 손상 치료로 확장되는데, 중간엽 줄기세포를 자연 뼈를 모방한 거대 다공성 생체 물질에 전달할 수 있기 때문입니다. 인간 양막에서 중간엽 줄기세포를 분리하려면 한 손으로 탯줄을 잡고 다른 손으로 반투명 시트처럼 보이는 양막을 분리합니다.샘플에 choon이 있는 경우 수동으로 해부하여 양막 조직에서 분리합니다. PBS 5ml를 사용하여 샘플을 세 번 세척하여 잔여 혈액을 제거하고 간단한 집게를 사용하여 메스로 혈전을 제거합니다. 양막을 작게 절개하여 약 0.5제곱센티미터의 파편을 생성합니다.멤브레인을 소화하려면 50ml 원추형 튜브에 조각을 넣고 0.125% 트립신 0.5 millimolar EDTA 용액 5ml를 추가합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 30분 동안 배양한 후 200Gs와 섭씨 25도에서 5분 동안 회전합니다. 그런 다음 상등액을 버리십시오.다음으로, 15ml의 콜라겐 분해 효소 유형 2 용액을 넣고 섭씨 37도에서 2 시간 동안 배양하고 al의 용암 프로토콜에 따라 가끔 흔들어 먹습니다. 분해 직후 15 ml의 PBS와 원심 분리기를 200G 및 25 °C에서 10 분 동안 첨가합니다. 상층액을 버리고 PBS를 사용하여 세포 펠릿을 세척한 후 15분 동안 다시 회전시킵니다.상등액을 버린 후 펠릿에 H-G-D-M-E-M 10ml를 넣고 부드럽게 흔들어 재현탁합니다. 중간엽 줄기세포를 확장하기 위해. 배양 플라스크에 2ml의 세포 현탁액을 시딩하고 2ml의 H HG DMEM 배양을 추가합니다.그리고 5-7일 후에 배양 배지를 변경하여 비접착 세포를 제거합니다. 그런 다음 추가로 7-10일 동안 3일마다 세포가 90% 융합될 때까지 배양 배지를 변경합니다. EDTA에 0.125%트립신을 첨가하고 5분 동안 배양한 후 세포 현탁액을 흡인하고 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다.세포를 회전시키고 상층액을 버린 후 HG DMEM을 사용하여 세포 펠릿 배양을 재현탁합니다. 2 75 평방 센티미터 플라스크의 세포는 90 % 합류점에서 배양을 유지합니다. 아홉 번째 통로 또는 하위 배양까지 화와 반복 도금을 반복합니다.그런 다음 유세포 분석 또는 다른 연구를 위해 세포를 복구합니다. 다공성 뼈 매트릭스 디스크를 준비합니다. 먼저 각 NKB 디스크에 FBS가 없는 HG DMEM 3ml를 첨가하고 다음 날 FAA etal에 따라 가습된 분위기에서 밤새 배양합니다.각 디스크를 50ml 원뿔형 튜브에 넣고 200GS에서 5분 동안 회전하여 과도한 배양 배지를 제거한 다음 24웰 배양 플레이트로 옮깁니다. 500마이크로리터의 H-G-D-M-E-M을 추가하고 영양소와 세포의 올바른 분포를 위해 디스크에 기포가 없는지 확인합니다. 섭씨 25도에서 30분 동안 3개의 하위 배양에서 천천히 그리고 지속적으로 배양합니다.사전 결혼 된 생체 재료 디스크의 표면에 세포 현탁액을 파종하고 배양 후 30 분 동안 배양하고 1.5 밀리리터의 전쟁 전 H-G-D-M-E-M을 조심스럽게 첨가하고 세포 증식 분석을 수행하기 위해 3 일 동안 배양을 유지하고 제조업체의 지침에 따라 세포 디스크 샘플에 150 마이크로 리터의 필수 착색제 AB를 첨가합니다. 600나노미터의 기준 파장으로 570나노미터에서 흡광도를 즉시 측정합니다. 7일 동안 세포를 배양하고 24시간마다 흡광도를 측정합니다.H-G-D-M-E-M에서 100mm 조직 배양 디스크당 100개의 세포를 배양하여 집락 형성 단위를 측정하고 14일 동안 배양합니다. PBS를 사용하여 배양액을 세척하고 메탄올에 0.5% 크리스탈 바이올을 사용하여 실온에서 5-10분 동안 세포를 염색합니다. 이러한 유세포 분석 히스토그램에서 볼 수 있듯이 현미경을 사용하여 세포를 계수하기 전에 PBS를 사용하여 플레이트를 두 번 세척합니다.양막에서 분리된 세포 집단은 표면 중간엽 마커 CD 90, CD 73 및 CD 1 0 5에 강하게 반응하고 조혈 마커 CD 34 및 CD 45에 음적으로 반응하여 AM HSC가 실제로 중간엽임을 나타냅니다. 이 스캐닝 현미경 사진에서 볼 수 있듯이, 생체 물질의 표면은 첫째 날에 구형 세포로 덮여 있었고 AMC는 7일째 되는 날에 소 매트릭스 표면에 부착된 것으로 보입니다. 더 높은 배율에서 podal 과정을 채우는 것을 통해 세포는 서로 접촉을 형성합니다.이 그래프는 소 행렬의 상대 흡광도 단위가 약간 감소한 것을 보여줍니다. 배양 하루 후, 골격의 존재는 세포 증식의 증가를 유도하며, 줄기 세포를 분석하기 위해 콜로니 형성 단위 분석을 사용하여 소 매트릭스가 없을 때 수행된 배양과 비교하여 통계적으로 유의합니다. 이 그래프는 이 비디오에서 보여준 것처럼 분리되고 다양한 밀도로 도금된 AM HSC가 배양에서 14일 동안 개별 콜로니를 형성하는 능력을 보존했음을 보여줍니다.이 비디오를 시청한 후에는 중간엽 줄기세포와 거대다공성 생체 재료에 전달하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

인간 perivascular 줄기 세포는 (PSCs) mesenchymal 줄기 세포 (MSCS)와 유사한 골격 조직 재생을위한 소설 줄기 세포 클래스입니다. PSCs는 표준 지방 흡입 절차 동안 조달 지방 조직에서 FACS (형광 활성 세포 분류)에 의해 격리 수 있습니다 다음, 뼈 형성을 달성하기 osteoinductive 비계와...

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Purification, Expansion, and Flow Cytometry-Based Phenotyping of Mouse Derived Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

인간의 근육에서 유래한 주요 부착 세포 유형은 근육 세포와 섬유아세포입니다. 여기에서 세포 집단은 CD56 항원을 기반으로 하는 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 농축됩니다. 이후 특정 항체를 사용한 면역 라벨링과 이미지 분석 기법을 사용하여 개별 세포의 세포질 및 핵 특성을 정량화할 수 있습니다.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

배우세요 인간 중간엽 줄기세포를 양막에서 분리하여 다공성 소뼈 매트릭스에서 배양하는 방법을. 이 기술은 뼈 손상 치료를 위한 세포 전달 및 재생의학 연구에 활용됩니다.

인간 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 다공성 뼈 매트릭스에 자신의 재배

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