Name: 차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 : 전 비켜 Electroporation에 접근 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 배우세요 병아리 망막 세포 배양에서 고효율 유전자 전송 기법을 전기천공법으로 수행하는 방법을. 이 기술은 광수용체 생물학 연구와 기능 유전학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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데이터 분석에 도움을 준 David O'Brien과 비판적인 토론을 해준 Canto-Soler 연구실의 모든 구성원에게 감사드립니다. 이 작업은 MVCS(NIH 보조금 EY004859 및 EY022631), Core Grant EY1765 및 Research to Prevent Blindness, Inc.의 무제한 부서 보조금의 지원을 받았습니다.

이 작품에 설명 된 모든 절차는 존스 홉킨스 대학에서 동물 관리 및 사용위원회에서 권장하는 지침에 따라 수행 하였다. 미리 1 :기구, 시약 및 요리의 준비 <ol><li> 계란의 준비 : 계란 배양기에서 5 일간 37.5 ℃, 상대 습도 60 %에서 수정 된 백색 레그혼 닭 알을 품어. 참고 : 표준화 및 배아 발달을 동기화 도움이 될 수있는 능력을 흔들하지만, 락과 보육이 프로토콜의 결과에 대해 엄격하게 할 필요가 없습니다. </li><li> 플라스미드 준비 : <ol><li> 필요에 따라 설계 플라스미드 (1,34의 RNAi 기술을 사용하여 예를 들어) 유전자 과발현 또는 하향 조절을 위해 구축. 가능한 한 구조에서 리포터 유전자 (예 : EGFP, RFP 또는 LacZ를 등)를 포함한다. 참고 : 같은 거대 세포 바이러스와 같은 일부 일반적으로 사용되는 프로모터는, 시간이 지나면 침묵이 될 수 있습니다. CAG의 PROMOT어 (닭 베타 - 액틴 CMV 인핸서와 프로모터) 관심 35-37의 유전자를 효율적으로 장기 식을 제공하는 아주 좋은 대안이다. </li><li> 멸균 PBS 1.5 μg의 / μL의 농도에서 플라스미드 솔루션을 준비합니다. 옵션 : 시간 ​​앞서 플라스미드 솔루션을 준비하고 냉동 사용할 준비가 될 때까지 저장할 수 있습니다. 주 : 높은 플라스미드 농도를 사용하는 반면 낮은 농도는 플라스미드 트랜 스펙 션 효율을 낮추는 1, 효율의 현저한 증가를 초래하지 않는다. </li></ol></li><li> 전극 : <ol><li> 양극 사용을 위해 두꺼운 금 (특정 재료 / 장비의 표 참조) 전극을 냈습니다. 70 % 에탄올로 닦아. 주 : 금 절연 노출 약 0.5 mm를두고 전극 스쳐, 전류의 누출을 최소화하는 것이 바람직하다. 절연 재료에 대한 정보는 특정 재료의 표에서 찾아 볼 수있다. </li><li> 2.5 mm의 정사각형 B에서 음극을 확인(일반적으로 마이크로 피펫 끌어 당기는에서 사용) 4.5 mm 폭 황소 필라멘트. 집게의 도움으로, 사각형 상자를 취소하고 긴 스트립에 필라멘트를 펴. 그 후, 해부 현미경 및 가이드로자를 사용 하에서, 기지 3mm 긴 사각형 &#39;U&#39;자형으로 필라멘트를 구부리고 반대편 필라멘트의 나머지 길이 (도 1, 일측 2mm 높은 , C - D). 집게를 사용하여 96 %의 에탄올과 불꽃의 전극 소독 찍어. 그런 다음 전극의 긴 팔에 작은 악어 클립으로 전기 리드를 연결합니다. </li></ol></li><li> 전기 상공 회의소 설정 : <ol><li> 100mm 페트리 접시 사용하여 테이프 (그림 1E)에, 아래로, 평평한면을 멸균 1.5 ML의 microcentrifuge 관의 뚜껑을 절단 부착하여 전기 챔버를 준비합니다. 참고 : 일하는 것이 비슷한 크기의 잘의 형태로 다른 컨테이너; 그러나 microcentrifuge 관 덮개는 쉽게 접근하고 멸균한다. 잘플라스미드 솔루션의 낭비가 발생하는 등의 병아리의 눈과 음극 전극을 수용 할 정도로 큰,하지만 너무 큰되지해야합니다. </li></ol></li></ol> 2. 예 비켜 Electroporation에 절차 <ol><li> 악기의 제조 : <ol><li> 마이크로 해부 도구를 소독을 찍기로 (달걀 껍질을 열고 배아, 망막 색소 상피를 제거 뒤몽 핀셋을 꽂아 미세 팁 2 쌍을 떠서위한 큰 곡선 몰 로니 집게 2 쌍을 본 한 쌍은 제거 렌즈와 유리체 위해 집게를 톱니) 96 % 에탄올과 불타는에 팁. 70 % 에탄올에 담근 잎사귀를 사용하여 청소 해부 범위. 37 ° C의 물을 욕조에 멸균 칼슘 마그네슘 무료 행크의 균형 소금 솔루션 (CMF-HBSS)의 병을 따뜻하게. 따뜻한 CMF-HBSS 전체 3/4에 100mm 멸균 배양 접시를 채우십시오. </li><li> 다른 깨끗한 해부 현미경으로 전기 챔버를 놓고 플라스미드 솔루션의 120 μL로 입력합니다. , 전기 장치에 전극을 연결하고반드시 맞춤형 전극을 음극에 연결하고 금은 양극에 전극을 밀고있다. </li></ol></li><li> 배아 컬렉션 : <ol><li> 70 % 에탄올에 젖은 잎사귀와 껍질을 닦아 계란을 청소합니다. 문화에 오염을 운반 방지하기 위해 프로토콜의 나머지 부분에 걸쳐 멸균 절차를 유지한다. 큰 곡선 몰 로니의 집게를 사용하여 조심스럽게 부드럽게 (공기 실 이상) 달걀의 둥근 끝을 두드리고 다음 그립과 쉘 부분을 잡아 당겨 달걀 껍질에 구멍을 엽니 다. </li><li> 집게의 또 다른 한 쌍은 세포막을 제거하고 달걀에서 그것을 떠서하여 배아를 수집로 (조심 배아를 손상하지 말 것). CMF-HBSS와 함께 접시에 넣습니다. 주 : 2.4.4에 규정 된 전기에 대한 망막 컵의 수를 얻기 위해 필요한만큼 모아서 배아 </li><li> 중요한 단계 : 햄버거와 해밀턴 (38)에 따라 배아를 스테이지. 참고 : 최적의 효율 배아를 얻으려면단계 27 (그림 2A)에 있어야합니다. </li><li> 몰 로니의 집게를 사용 잘린 배아를 안락사. </li></ol></li><li> 망막 컵을 가져 오기 : <ol><li> 미세 뒤몽 핀셋을 사용하여 조심스럽게 눈을 명백히하다 새로운 CMF-HBSS 접시에 전송할 수 있습니다. </li><li> 시신경 유두에 가까운 각각의 눈의 후방 부분에서 시작, 2 개의 미세 뒤몽 핀셋을 사용하여, 신경에 손상을주지에 RPE는 신중 해부 신경 망막과 망막 색소 상피 조심스럽게 사이에 핀셋의 각 쌍 중 하나 팁을 소개합니다 망막 (그림 2B). 참고 : RPE 도움이 될 것 용액에서 칼슘과 마그네슘 2+의 부족은 더 쉽게 신경 망막에서 분리합니다. </li></ol></li><li> 전기 : <ol><li> 15 볼트, 50 밀리 초 지속 시간 950 밀리 초 간격의 5 제곱 펄스를 제공하기 위해 electroporator의 매개 변수를 설정합니다. 장소 &#39;U&#39;는 전기 챔버 (마이크로 원심 뚜껑 채우기 내부에 음극 모양플라스미드 함유 용액 120 μL)와 ED. </li><li> 사용 만곡 듀 핀셋 (아닌 떠서 누름) 일렉트로 포 레이션 챔버 한 망막 컵을 전송하고, 상기 전극의 아래쪽 및 위쪽으로 향하게 렌즈쪽으로 망막의 후방 부와, &#39;U&#39;형상의 전극 내부에서 배치 ( 그림 2D). </li><li> 그 다음 렌즈로, 눈의 앞쪽 부분을 터치하고 electroporator의 발 페달이 전기 펄스를 제공하는 사용하도록 양극을 놓습니다. </li><li> CMF-HBSS로 새로운 배양 접시에 전기 천공 망막 컵을 전송하고 나머지 망막 컵의 각각 전기의 절차를 반복합니다. 주 : 6 망막 컵까지는 형질 전환 효율이 크게 감소하지 않고 동일한 플라스미드 용액으로 전기 천공 할 수있다. </li><li> 본의 톱니 포셉으로 그들을 그립 부드럽게 T를 통해 당겨 각 일렉트로 망막 컵의 렌즈와 유리체를 제거곡선 뒤몽 핀셋의 다시 제자리에 눈을 유지하면서 그는 개방 학생. </li><li> 표준 절차에 따라 일렉트릭 망막 세포의 분리 및 배양을 진행합니다. 참고 : 병아리 망막 세포의 분리 및 문화에 대한 자세한 프로토콜의 벌 가라과 칸토 - 솔러, 2012 년 추가 파일 4 (21)을 참조하십시오이 프로토콜에서 세포가 폴리 오르니 틴 코팅 6 웰 플레이트 또는 35 낮은 밀도에서 씨앗을 품고있다. -mm 요리 (6 × 10 5 세포 / 35mm 직경의 우물 또는 접시). 사용 된 배지는 페니실린 / 글루타민, 10 % 소 태아 혈청 (FCS), 100 μg의 / ㎖에서 리놀산-BSA (199)와 매체이다. 문화는 5 % CO 2와 가습 37 ° C 배양기에서 유지된다. 이 과정을 사용하여 - 5 6 × 106 세포는 일반적으로 각 단계마다 27 일렉트로 눈을 얻을 수있다. 참고 : 이상적으로, 더 이상 3 시간이 배아 수집 및 세포 도금 사이를 통과한다, 좋은 세포 생존을 보장하기 위해스트레스를 최소화 할 수 있습니다. 관찰과 추가 분석을 위해 일반적인 타이밍이 시점에서 세포가 좋은 형태 학적 및 분자 차별화를 달성 생존이 여전히 높기 때문에, 문화 4 일 후에입니다. </li></ol></li></ol>

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저자는 경쟁하는 재정적 이해관계나 기타 이해 상충이 없음을 선언합니다.

이 프로토콜의 성공을위한 가장 중요한 단계는 배아의 적절한 단계를 선택하는 것입니다. 이전의 출판물에서, 배아 단계의 범위는 일반적으로 배양 또는 배아 일의 일 (ED)에 의해 정의 된, 이러한 문화에 대한 주어진다; 따라서 보통 ED 6 배아 ED 5를 사용하여 동등한 결과를 얻을 수 있다고 가정한다. 그러나 우리는 전술 한 바와 같이 단계 (27) (ED 5)에 형질 전환 효율, 전체 세포 인구의 약 22 %가 될 것입니다 것으로 나타났습니다; 아직 효율이 단계를 단계 29에서 28 배아 (ED 5.5) 및 12 % (ED 6)을 사용하는 경우 16 %로 감소 1.합니다 다른 중요한 단계는 공정 전반에 걸쳐 무균 조건을 유지 포함한다; 필요한 손재주를 획득하는 해부 및 전기 중 망막의 손상을 방지하기 위해; 세포 도금 시간 배아 컬렉션으로부터 긴 시간 간격을 피. 또 다른 중요한 고려 사항은 좋은 형질 efficien을 보장하기 위해CIES는 플라스미드...

배아 병아리 망막에서 해리 된 세포 배양 널리 생존 2-9, 차별화 10-12, 신경 돌기의 파생물 (13) 등을 포함한 광 수용체 세포 생물학의 다양한 측면을 연구하는 데 사용되었다. 루벤 애들러와 공동 작업자에 의해 1980 년대에 개발하고 자신과 다른 그룹 (14-20)에 의해 완성이 시스템의 장점은, 동물 모델 (21)와 여자의 고유 특성에 있습니다. 심지어 배아 단계에서 병아리 눈의 큰 크기는, 문화에 대한 자료의 많은 양을 제공한다. 배아는 배양 일 (ED) 5 이용하여 수행 될 때 더욱이, - 6 망막, 55 -이 동물 감광체의 약 86 %이기 때문에 그들의 선조 세포의 80 %가 감광체 14,15,18,22,23으로 구별하고, 콘 (24)은,이 배양 물이 세포 유형에 집중 연구에 특히 적합하다. 우리는 최근 develo의이PED는 ​​따라서 유전 missexpression 연구 1 촉진함으로써이 시스템의 유용성을 넓히고,이 배양 물에서 세포의 고효율 플라스미드 형질 감염을 허용하는 간단한 기술을 특징으로한다. 이 기술의 개발은 세포 자율 방식으로 유전자 기능 연구를 허용하도록 형질의 허용 가능한 수준을 제공 할 방법 과학 문헌에서 보이드로부터 비롯. 일차 배양 신경 세포를 형질 25,26 악명 하드 때문 부분이다. 이 목적을 위해 이전에 사용 가능한 가장 일반적으로 사용되는 기술 중 일부는 3-5 % 정도의 효율을 야기하고 상당한 독성을 발휘 27-32 예컨대 리포 펙션, 칼슘 포스페이트 - 매개 된 형질 전환과 같은 화학적 형질 전환 방법을 포함. 효소 리포터 플라스미드 시스템의 사용은 신호를 증폭하여 불량한 형질 감염 효율의 문제를 피할 수있다하더라도, 그들은하지셀 고유의 효과를 판별하고, 그 결과 전체를 대표하지 않을 작은 세포군에 기초한다. 병아리에서 널리 사용되는 또 다른 방법은, RCA 단자 바이러스 감염은 세포 증식에만 적용이 망막 일차 배양 시스템 (33), 따라서 적합하지 않다. 현재 프로토콜에서 배아 병아리 눈 단계 27 (ED 5), 망막 색소 상피 (RPE)를 제거하고, 망막 컵이 플라스미드를 함유 용액으로 가득 전기 챔버에 배치에서 적출 및 사용하여 전기 천공되는 주문 제작 표준 기술 (21)을 이용하여 망막 해리와 문화를 이어 전극. 이 절차를 최적화 한 결과의 생존과 분화 특성을 손상시키지 않고 지속적으로 배양 세포 단독 감광체 인구 내의 25 %의 총 수의 22 % 정도의 형질 전환 효율을 달성 할 수 있었다문화 1. 여기에서 우리는이 기술의 성공과 재현성을 보장하기 위해이 절차의 모든 중요한 단계를 요약 한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>ECM 830 Electro Square Porator</td><td>BTX/ Harvard Apparatus</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Genetrode, L-shaped, 5mm Gold Tip</td><td>BTX/ Harvard Apparatus</td><td>45-0115 모델 512</td><td>양극으로 사용되는 Gold tipped electrode</td></tr><tr><td>Polyimide Tubing</td><td>Vention Medical</td><td>맞춤형</td><td>내경: 0.5mm/벽 두께: 0.15 - 0.2mm. 금 팁 전극</td></tr><tr><td>을 절연하는 데 사용됩니다.2.5mm 정사각형 상자 필라멘트, 4.5mm 너비</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>FB245B</td><td>음극 전극</td></tr><tr><td>HBSS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 레드</td><td>Gibco 없음 - Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Moloney 집게</td><td>Roboz</td><td>RS-8254</td><td>톱니; 약간의 곡선; 4.5" 길이</td></tr><tr><td>Dumont 핀셋 5/45</td><td>Roboz</td><td>RS-5058</td><td>패턴 #5, 45도 각도; .10 x .06mm 팁 크기; 109mm 길이</td></tr><tr><td>Bonn 마이크로 펜셉, 1x2 이빨</td><td>Roboz</td><td>RS-5172</td><td>타이잉 플랫폼; 1x2 이빨, 0.12 mm 이빨; 3.75" 길이; 0.3 mm 팁 너비</td></tr></tbody></table>

차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 : 전 비켜 electroporation에 접근

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

배아 병아리 망막에서 파생 된 콘 광 수용체가 풍부한 문화 망막 신경 세포, 특히 광 수용체의 생물학을 공부하는 전세계 연구자를위한 필수적인 도구가되었다. 그들은 쉽게 약물 개발을위한 높은 처리량의 기술에 적용 할 수 있으므로이 시스템의 응용 프로그램은 기초​​ 연구를 넘어. 그러나 이러한 문화 망막 광 수용체의 유전자 조작은 시스템의 유용성에 중요한 제한 포즈, 매우 어려운 것으로 입증되었습니다. 우리는 최근에 개발 및 기타 현재 사용 가능한 프로토콜 (1)에 비해 5 배 이러한 문화 망막 세포의 형질 전환의 속도를 증가 플라스미드 전기 기술 비켜 전을 검증했다. 이 방법에서 병아리 배아 눈 RPE를 제거하고, 스테이지 (27)에서 적출하고, 망막 컵 플라스미드 - 함유 용액에 배치되어 쉽게 구성된 고객이나 전기 천공을 사용하여만든 전극. 망막은 해리 배양 표준 절차를 사용하고 있습니다. 이 기술은 일반적으로 감광체 인구의 25 %의 유전자 발현을 달성 플라스미드 기반의 RNAi 기술의 사용을 통해, 예를 들면, 과발현 연구뿐만 아니라 유전자 발현의 하향 조절에 적용될 수있다. 본 공보의 비디오 포맷은 망막 일차 배양에서의 유전자 기능 연구를 가능 분야의 연구자에이 기술이 용이하게 접근 할 수 있도록한다. 우리는 또한 성공적인 결과 및 재현성이 절차의 중요한 단계에 대한 자세한 설명을 포함하고있다.

여기에서 우리는 다음 해리 세포 배양을위한 탈핵 병아리 망막 컵에 플라스미드 형질에 대한 간단한 프로토콜을 제시한다. 형질 사용자 정의 전극 (- 2 그림 1)을 쉽게 만들 수 사용 전기에 의해 달성된다. 이 프로토콜에 기재된 파라미터는 20 % 내지 27 (도 3d) (22 %의 평균) 레인지에 형질 전환 효율을 얻기 위해 최적화되었다. 위에서 언급 한 이유로, 이러한 결과는 문화 4 일 후에 정량화, 알 수 있습니다. 이러한 맥락에서, 형질 전환 효율은 전체 세포 집단 내에서 유전자를 발현하는 세포의 백분율을 말한다. 만 감광체 인구가 고려되는 경우, 형질 전환 효율은 25 %의 평균 (도 3d)으로 증가한다. 이러한 유형의 배양 물은 주로 감광체를 연구하는 데 사용되기 때문에, 이것은 중요한 특징이다. electroporat 된 세포 배양 이 기술을 사용 에드 DIC 조명, 세포 ...

배아 병아리 망막 세포 배양은 광 수용체 생물학의 연구에 유용한 도구를 구성한다. 우리는 이전에 배양 망막의 플라스미드 일렉트로 오보 EX에 기초한 효율적인 유전자 전달 기술을 개발했다. 이 기술은 상당히이 시스템에 대한 가능한 유전자 조작을하고, 현재 사용 가능한 프로토콜을 통해 형질 전환 효율을 증가시킨다.

차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 : 전 비켜 Electroporation에 접근

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

이 절차의 전반적인 목표는 망막 세포의 고효율 플라스미드 형질 주입을 달성하여 1차 망막 배양에서 기능적 유전자 연구를 가능하게 하는 것입니다. 이것은 먼저 햄버거와 해밀턴 시스템의 27단계에서 닭 배아를 수집함으로써 달성됩니다. 최적의 효율성을 달성하기 위해서는 적절한 스테이징이 중요합니다.두 번째 단계는 배아의 눈을 절개하고 신경 망막을 노출시키는 망막 색소 상피를 제거하는 것입니다. 다음으로, 망막 컵을 플라스미드 용액으로 채워진 챔버에 넣습니다. 그런 다음 쉽게 구성된 맞춤형 전극을 사용하여 최적화된 조건에서 electroporation을 받습니다.마지막 단계는 유리체와 수정체를 제거하고 저밀도 1차 배양을 위해 신경 망막을 단일 세포로 해리하는 것입니다. 궁극적으로, 형질주입된 세포는 리포터 유전자의 발현 또는 면역조직화학에 의해 시각화될 수 있으며, 효과적인 유전자 조작은 다운스트림 유전자의 발현 및/또는 표현형 세포 변화를 평가하여 평가할 수 있습니다. 리포펙션(lipofection) 또는 화학적 트랜스펙션(chemical transfection)과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 전체 세포 집단의 22-25%의 효율을 5배 증가시켜 망막 세포의 트랜스펙션(transfection) 속도를 증가시킨다는 것입니다.이 방법은 생물학적으로 의미 있는 통찰력을 제공할 수 있는 효율성 수준에서 1차 망막 배양에서 유전자 발현을 조작할 수 있기 때문에 광수용체 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 약물 개발을 위한 고처리량 기술에 쉽게 적용할 수 있기 때문에 기초 연구를 넘어 확장됩니다. 먼저 수정한 흰다리뿔닭알을 섭씨 37.5도, 상대 습도 60%의 달걀 인큐베이터에서 5일 동안 부화시킵니다.실험에 앞서, 마이크로 피펫 당기기에 일반적으로 사용되는 상자 필라멘트를 구합니다. 집게를 사용하여 사각형 상자를 취소하고 필라멘트를 긴 스트립으로 곧게 펴십시오. 그런 다음 자를 가이드로 사용하여 필라멘트를 바닥에서 길이 3mm, 다른 쪽과 함께 한쪽 높이가 2mm인 정사각형 u u자형으로 구부리고 필라멘트의 나머지 길이는 집게를 사용하여 전극을 96% 에탄올에 담그고 전극을 잠시 화염에 올려 살균합니다.그런 다음 작은 악어 클립이 있는 전기 리드를 전극의 긴 암에 연결합니다. 다음으로 70% 에탄올을 사용하여 두꺼운 금색 팁 전극을 청소합니다. 그런 다음 멸균된 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브의 뚜껑을 멸균된 가위로 잘라내고 테이프를 사용하여 100mm 페트리 접시에 평평한 면을 아래로 하여 부착하여 전기천공실을 준비합니다.다음으로, 기기 팁을 96% 에탄올에 담그고 잠시 불을 붙여 미세 해부 도구를 살균합니다. 또한 70% 에탄올을 사용하여 해부 내시경을 깨끗이 닦습니다. 멸균 칼슘과 마그네슘이 없는 행크스 밸런스 소금 용액 한 병을 섭씨 37도의 수조에서 데웁니다.따뜻해지면 100mm 멸균 페트리 접시를 4분의 3 정도 채우는 데 사용합니다. 그런 다음 electroporation 챔버를 깨끗한 해부 현미경 아래에 놓습니다. 다음 전극을 electroporation 기구에 연결되, 주문품 전극이 음극에 연결되고, 금에 의하여 기울ᄂ 전극이 기계의 긍정극에 연결된다는 것을 확인하십시오.껍질 외부를 70% 에탄올로 닦아 계란을 청소합니다. 주의하고 프로토콜의 나머지 부분 동안 무균 상태를 유지하십시오. 크고 구부러진 Maloney 집게를 사용하여 배양물로 오염을 옮기지 않으려면 계란의 둥근 끝 부분을 공기 챔버 바로 위에 부드럽게 두드려 계란 껍질의 구멍을 조심스럽게 엽니다.다른 집게로 모든 껍질 조각을 당겨 빼냅니다. 막을 제거하고 난자에서 조심스럽게 퍼내어 배아를 수집합니다. 배아를 예열 칼슘과 마그네슘이 없는 행크스 밸런스 소금 용액과 함께 페트리 접시에 넣습니다.적절한 수의 배아가 수집되면 모두 올바른 단계에 있는지 확인하십시오. 최적의 효율성을 위한 햄버거와 해밀턴의 병기 결정 시스템에 따르면, 배아는 27기에 있어야 합니다. 멀로우니 집게를 사용하여 참수를 통해 배아를 안락사시킨 다음 듀몬트 핀셋을 사용하여 조심스럽게 눈에 핵을 주입합니다.칼슘과 마그네슘이 없는 HBSS가 함유된 새로운 페트리 접시로 눈을 옮깁니다. 시신경두에 가까운 각 눈의 뒤쪽 부분에서 시작하여 신경 망막과 망막 색소 상피 사이에 각 듀몬트 핀셋 한 쌍의 팁을 하나씩 삽입합니다. 눈의 뒤쪽 부분에서 앞쪽으로 작업하면서 핀셋을 사용하여 망막 색소 상피를 조심스럽게 절개합니다.신경 망막이 손상되지 않도록 주의합니다. 50밀리초 지속 시간과 950밀리초 간격으로 15볼트의 5개 제곱 펄스를 전달하도록 전기 퍼터를 설정합니다. 다음으로, 전기천공(electroporation) 챔버에 PBS에서 마이크로리터당 1.5마이크로그램의 농도로 120마이크로리터의 플라스미드 용액을 채웁니다.그런 다음 U자형 음극을 마이크로 원심분리기 뚜껑 전기천공실 내부에 놓습니다. 곡선형 듀몬트 핀셋을 사용합니다. 하나의 망막 컵을 전기천공실로 옮기고 U자형 전극 내부에 놓습니다.망막의 뒤쪽 부분이 전극의 아래쪽을 향하고 수정체가 위쪽을 향하도록 망막을 배치합니다. 그런 다음 렌즈 옆의 눈 앞쪽에 닿도록 양극을 놓습니다. 그런 다음 일렉트로 레이더의 풋 페달을 사용하여 5개의 전기 펄스를 전달합니다.완료되면 전기천공된 망막 컵을 칼슘과 마그네슘이 없는 HBSS로 채워진 새 페트리 접시에 옮깁니다. 각 추가 망막 컵에 대해 전기천공법 절차를 반복합니다. 최대 6개의 망막 컵을 동일한 플라스미드 용액으로 전기천공할 수 있으며, transfection 효율의 현저한 감소가 없습니다.다음으로, 본드 톱니 겸자를 사용하여 각 전기천공된 샘플에서 수정체와 유리체를 부드럽게 제거하면서 곡선형 dumont 핀셋의 뒷면으로 눈을 제자리에 고정한 후 제거한 후 표준 기술을 사용하여 전기천공된 망막 세포의 해리 및 배양을 진행합니다. 여기에 표시된 망막 세포를 GFP 발현, 플라스미드로 전기천공하고 해리한 후 4일 동안 배양했습니다. 형광 현미경 사진은 dappy 염색 핵과 GFP가 망막 세포를 발현하는 것을 보여주었습니다.광수용체 세포를 확인하기 위해 항 visin 항체 염색을 수행했습니다. 이 프로토콜에 설명된 매개변수는 4일 후 전체 모집단과 비교할 때 평균 22%의 transfection 효율을 얻기 위해 최적화되었습니다. 배양에서 이 측정은 광수용체 집단만 숙달되면 고려되는 것으로 간주될 때 평균 25%의 효율로 증가합니다.배아 채취에서 전기 수술에 이르는 이 기술은 제대로 수행된다면 6개의 눈에 대해 30분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 양질의 배양을 얻기 위해 배아를 채취하고 해리된 세포 도금을 하는 데 3시간 이상이 지나서는 안 된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술은 예를 들어 RNAi 시스템을 사용하여 유전자 과발현 또는 상관 관계에 적용할 수 있습니다.또한, 이 절차에 따라 형질주입된 망막은 유기형 망막 배양에 사용할 수 있습니다.

efficient-gene-transfer-chick-retinas-for-primary-cell-culture

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

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이 프로토콜은, 해부 실험 조작과 닭의 배아에서 문화 전체 망막 외식하는 방법을 설명합니다. 높은 성공률, 효능 및 재현성은 전기 및 / 또는 시약의 물질, 즉, 효소 억제제 플라스미드의 효과를 테스트하기 위해 필요할 때 이식편 배양 물은 유용하다.

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형광 라벨 tangentially 마이그레이션에 대 한 방법을 설명 셀 electroporation, 그리고 마이그레이션 시각화 하기 위해 플랫-마운트 문화에서 레이블이 지정 된 셀 이동의 시간 경과 영상 셀 개발 병아리 광섬유 tectum에 동작 .

개발 병아리 광섬유 Tectum에 접선 셀 이동의 시각화

우리는 ovo electroporation 및 Tol2 transposon 시스템을 사용하여 병아리 배아에 인공 마이크로 RNA 서열을 도입하고 게놈 통합하는 새로운 기능 상실 접근 방식을 개발했습니다. 이 기술은 개발 중 유전자 기능 연구를 위한 강력하고 안정적인 유전자 녹다운 방법론을 제공합니다.

인공 microRNA의 Tol2 Transposon-Mediated 형질전환 발현을 사용한 배아 병아리 망막의 기능 상실 접근법

병아리는 다양한 연구를 위해 비용 효율적이고 접근 가능하며 널리 이용 가능한 모델 유기체입니다. 여기에서는 조류 내이 발달 및 재생의 기초가되는 분자 메커니즘을 이해하기 위해 일련의 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다.

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