차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 : 전 비켜 Electroporation에 접근

이 절차의 전반적인 목표는 망막 세포의 고효율 플라스미드 형질 주입을 달성하여 1차 망막 배양에서 기능적 유전자 연구를 가능하게 하는 것입니다. 이것은 먼저 햄버거와 해밀턴 시스템의 27단계에서 닭 배아를 수집함으로써 달성됩니다. 최적의 효율성을 달성하기 위해서는 적절한 스테이징이 중요합니다.

두 번째 단계는 배아의 눈을 절개하고 신경 망막을 노출시키는 망막 색소 상피를 제거하는 것입니다. 다음으로, 망막 컵을 플라스미드 용액으로 채워진 챔버에 넣습니다. 그런 다음 쉽게 구성된 맞춤형 전극을 사용하여 최적화된 조건에서 electroporation을 받습니다.

마지막 단계는 유리체와 수정체를 제거하고 저밀도 1차 배양을 위해 신경 망막을 단일 세포로 해리하는 것입니다. 궁극적으로, 형질주입된 세포는 리포터 유전자의 발현 또는 면역조직화학에 의해 시각화될 수 있으며, 효과적인 유전자 조작은 다운스트림 유전자의 발현 및/또는 표현형 세포 변화를 평가하여 평가할 수 있습니다. 리포펙션(lipofection) 또는 화학적 트랜스펙션(chemical transfection)과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 전체 세포 집단의 22-25%의 효율을 5배 증가시켜 망막 세포의 트랜스펙션(transfection) 속도를 증가시킨다는 것입니다.

이 방법은 생물학적으로 의미 있는 통찰력을 제공할 수 있는 효율성 수준에서 1차 망막 배양에서 유전자 발현을 조작할 수 있기 때문에 광수용체 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 약물 개발을 위한 고처리량 기술에 쉽게 적용할 수 있기 때문에 기초 연구를 넘어 확장됩니다. 먼저 수정한 흰다리뿔닭알을 섭씨 37.5도, 상대 습도 60%의 달걀 인큐베이터에서 5일 동안 부화시킵니다.

실험에 앞서, 마이크로 피펫 당기기에 일반적으로 사용되는 상자 필라멘트를 구합니다. 집게를 사용하여 사각형 상자를 취소하고 필라멘트를 긴 스트립으로 곧게 펴십시오. 그런 다음 자를 가이드로 사용하여 필라멘트를 바닥에서 길이 3mm, 다른 쪽과 함께 한쪽 높이가 2mm인 정사각형 u u자형으로 구부리고 필라멘트의 나머지 길이는 집게를 사용하여 전극을 96% 에탄올에 담그고 전극을 잠시 화염에 올려 살균합니다.

그런 다음 작은 악어 클립이 있는 전기 리드를 전극의 긴 암에 연결합니다. 다음으로 70% 에탄올을 사용하여 두꺼운 금색 팁 전극을 청소합니다. 그런 다음 멸균된 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브의 뚜껑을 멸균된 가위로 잘라내고 테이프를 사용하여 100mm 페트리 접시에 평평한 면을 아래로 하여 부착하여 전기천공실을 준비합니다.

다음으로, 기기 팁을 96% 에탄올에 담그고 잠시 불을 붙여 미세 해부 도구를 살균합니다. 또한 70% 에탄올을 사용하여 해부 내시경을 깨끗이 닦습니다. 멸균 칼슘과 마그네슘이 없는 행크스 밸런스 소금 용액 한 병을 섭씨 37도의 수조에서 데웁니다.

따뜻해지면 100mm 멸균 페트리 접시를 4분의 3 정도 채우는 데 사용합니다. 그런 다음 electroporation 챔버를 깨끗한 해부 현미경 아래에 놓습니다. 다음 전극을 electroporation 기구에 연결되, 주문품 전극이 음극에 연결되고, 금에 의하여 기울ᄂ 전극이 기계의 긍정극에 연결된다는 것을 확인하십시오.

껍질 외부를 70% 에탄올로 닦아 계란을 청소합니다. 주의하고 프로토콜의 나머지 부분 동안 무균 상태를 유지하십시오. 크고 구부러진 Maloney 집게를 사용하여 배양물로 오염을 옮기지 않으려면 계란의 둥근 끝 부분을 공기 챔버 바로 위에 부드럽게 두드려 계란 껍질의 구멍을 조심스럽게 엽니다.

다른 집게로 모든 껍질 조각을 당겨 빼냅니다. 막을 제거하고 난자에서 조심스럽게 퍼내어 배아를 수집합니다. 배아를 예열 칼슘과 마그네슘이 없는 행크스 밸런스 소금 용액과 함께 페트리 접시에 넣습니다.

적절한 수의 배아가 수집되면 모두 올바른 단계에 있는지 확인하십시오. 최적의 효율성을 위한 햄버거와 해밀턴의 병기 결정 시스템에 따르면, 배아는 27기에 있어야 합니다. 멀로우니 집게를 사용하여 참수를 통해 배아를 안락사시킨 다음 듀몬트 핀셋을 사용하여 조심스럽게 눈에 핵을 주입합니다.

칼슘과 마그네슘이 없는 HBSS가 함유된 새로운 페트리 접시로 눈을 옮깁니다. 시신경두에 가까운 각 눈의 뒤쪽 부분에서 시작하여 신경 망막과 망막 색소 상피 사이에 각 듀몬트 핀셋 한 쌍의 팁을 하나씩 삽입합니다. 눈의 뒤쪽 부분에서 앞쪽으로 작업하면서 핀셋을 사용하여 망막 색소 상피를 조심스럽게 절개합니다.

신경 망막이 손상되지 않도록 주의합니다. 50밀리초 지속 시간과 950밀리초 간격으로 15볼트의 5개 제곱 펄스를 전달하도록 전기 퍼터를 설정합니다. 다음으로, 전기천공(electroporation) 챔버에 PBS에서 마이크로리터당 1.5마이크로그램의 농도로 120마이크로리터의 플라스미드 용액을 채웁니다.

그런 다음 U자형 음극을 마이크로 원심분리기 뚜껑 전기천공실 내부에 놓습니다. 곡선형 듀몬트 핀셋을 사용합니다. 하나의 망막 컵을 전기천공실로 옮기고 U자형 전극 내부에 놓습니다.

망막의 뒤쪽 부분이 전극의 아래쪽을 향하고 수정체가 위쪽을 향하도록 망막을 배치합니다. 그런 다음 렌즈 옆의 눈 앞쪽에 닿도록 양극을 놓습니다. 그런 다음 일렉트로 레이더의 풋 페달을 사용하여 5개의 전기 펄스를 전달합니다.

완료되면 전기천공된 망막 컵을 칼슘과 마그네슘이 없는 HBSS로 채워진 새 페트리 접시에 옮깁니다. 각 추가 망막 컵에 대해 전기천공법 절차를 반복합니다. 최대 6개의 망막 컵을 동일한 플라스미드 용액으로 전기천공할 수 있으며, transfection 효율의 현저한 감소가 없습니다.

다음으로, 본드 톱니 겸자를 사용하여 각 전기천공된 샘플에서 수정체와 유리체를 부드럽게 제거하면서 곡선형 dumont 핀셋의 뒷면으로 눈을 제자리에 고정한 후 제거한 후 표준 기술을 사용하여 전기천공된 망막 세포의 해리 및 배양을 진행합니다. 여기에 표시된 망막 세포를 GFP 발현, 플라스미드로 전기천공하고 해리한 후 4일 동안 배양했습니다. 형광 현미경 사진은 dappy 염색 핵과 GFP가 망막 세포를 발현하는 것을 보여주었습니다.

광수용체 세포를 확인하기 위해 항 visin 항체 염색을 수행했습니다. 이 프로토콜에 설명된 매개변수는 4일 후 전체 모집단과 비교할 때 평균 22%의 transfection 효율을 얻기 위해 최적화되었습니다. 배양에서 이 측정은 광수용체 집단만 숙달되면 고려되는 것으로 간주될 때 평균 25%의 효율로 증가합니다.

배아 채취에서 전기 수술에 이르는 이 기술은 제대로 수행된다면 6개의 눈에 대해 30분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 양질의 배양을 얻기 위해 배아를 채취하고 해리된 세포 도금을 하는 데 3시간 이상이 지나서는 안 된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술은 예를 들어 RNAi 시스템을 사용하여 유전자 과발현 또는 상관 관계에 적용할 수 있습니다.

또한, 이 절차에 따라 형질주입된 망막은 유기형 망막 배양에 사용할 수 있습니다.