에피 솜과 HDAC 억제제를 사용하여 혈액에서 효율적인 유도 만능 줄기 세포 생성

다음 실험의 전반적인 목표는 소량의 말초 혈액에서 통합 자유 유도 만능 줄기 세포를 생성하는 것입니다. 이는 정의된 성장 인자에서 분리된 말초 혈액 단핵 세포를 배양하여 재프로그래밍에 매우 반응하는 적혈구 전구 집단을 생성함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 재프로그래밍 유전자를 운반하는 비통합형 에피솜 플라스미드는 핵 애정에 의해 적혈구로 도입되어 재프로그래밍 과정을 시작합니다.

다음으로, 핵에 영향을 받은 세포를 방사선 조사된 마우스 배아 섬유아세포층(mouse embryonic fibroblasts)층에 도말하여 궁극적으로 성공적으로 재프로그래밍을 계속할 수 있도록 합니다. 재프로그래밍된 유도 만능 줄기세포 군집은 형태학적 특성, 알칼리성 포스파타제 활성, 다능성 마커에 대한 양성 면역화학 및 내인성 다능성 유전자의 발현을 기반으로 식별할 수 있습니다. 바이러스 기반 재프로그래밍과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 프로토콜이 통합 없는 IPSC의 일관된 생성을 보장한다는 것입니다.오늘 절차를 시연하는 사람은 Jesse, 저 및 Gretchen Johnson이 될 것입니다.

실험실의 기술자 DPBS에서 말초 혈액을 1:1 비율로 희석하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 15 밀리리터의 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브에 희석 된 혈액 7 밀리리터를 실온 3 밀리리터의 하이 팩에 조심스럽게 겹쳐 놓습니다. 400 GS와 실온에서 30분 동안 샘플을 분리한 후, pbmc는 플라즈마와 파이얼 하이 팩 사이의 흐린 흰색 계면층에 정착합니다.

멸균 이송 피펫을 사용하여 P BMC를 15ml 원추형 튜브로 옮기고 새 DPBS로 부피를 최대 10ml까지 가져옵니다. 그런 다음 세포를 계수 한 후, 6 개의 P BMC에 2 회 10을 새로운 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 나머지 세포를 스핀 다운하고, 펠렛 화 된 세포를 10 % 디메틸 설폭 사이드가 함유 된 90 % 태아 소 혈청에서 밀리리터 당 6 pbmc 농도로 2 배 10으로 동결합니다. 그런 다음 따로 보관된 P BMC를 회전시킨 후 펠릿을 2밀리리터의 새로 준비된 팽창 매체에 현탁시키고 12웰 조직 배양 플레이트의 한 웰에 플레이트화하여 산소 5%, 이산화탄소 5% 및 질소 90%의 분위기에서 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.

그런 다음 3일차와 6일차에 웰에서 세포를 수집하여 배지를 교체합니다. 2ml의 QBSF 60으로 웰을 세척하여 남아 있는 세포를 수집하고 원심분리로 세포를 펠릿화한 다음 2ml의 새로운 팽창 배지에 펠릿을 현탁시킵니다. 그런 다음 세포를 동일한 12 well plate에 다시 넣고 배양을 계속합니다.9일째에 표와 같이 재프로그래밍 플라스미드를 멸균 1.5ml einor tube에 피펫팅합니다.

다음으로, nucleo affection solution을 제조업체에서 제공한 보충제와 혼합하고 혼합물을 멸균 1.5ml 업엔드 DPH 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 2ml의 팽창 배지를 새로운 12웰 플레이트의 한 웰에 분배하고 세포가 준비될 때까지 가습된 섭씨 37도 인큐베이터에서 배지를 평형화합니다. 세포를 모으고, 방금 시연한 대로 세포 배양을 잘 세척하고, 5ml의 DPBS로 세포를 세척합니다.

그런 다음 resus, 100 마이크로 리터의 핵 애정 용액 플러스 보충제에 세포 펠렛을 현탁시키고 거품 생성을 피하고 세포 현탁액을 재 프로그래밍 플라스미드를 포함하는 튜브로 옮깁니다. 위아래로 한 번 피펫팅하여 세포를 혼합하고 전체 용액을 nucle affection vete의 바닥으로 옮깁니다. 그런 다음 수의사를 Nucle affection 기계에 넣고 프로그램 T 0 1 9를 실행합니다.

이제 100마이크로리터의 EQUILIBRATED 팽창 배지를 nucle affection vete에 첨가하고 즉시 전체 샘플을 수집하여 흰색 부유 사체 파편을 피하고 예열 배지의 웰에 증착합니다. 그런 다음 10일 또는 11일에 세포를 가습된 인큐베이터에 다시 넣습니다. 6 개의 우물 조직 배양 플레이트의 각 웰에 HBSS의 0.1 % 젤라틴 1 밀리리터로 젤라틴을 코팅 한 다음 플레이트를 가습 인큐베이터에 넣거나 인큐베이션 중 최소 5 분 동안 6 개의 3000 섭씨 방사선 조사 마우스, 배아, 섬유 아세포 또는 mes를 10 밀리리터의 예열 메스 배지로 2 회 10 회 이동합니다. 그런 다음 세포가 회전하는 동안 세포를 원심분리합니다.

6개의 웰 플레이트에서 젤라틴 용액을 흡입한 다음 12ml의 신선한 메스암페타민 매체에 메스를 재현탁합니다. 코팅된 젤라틴의 각 웰에 즉시 2밀리리터 OFM을 분배합니다. 6. 웰 플레이트를 만들고 12일째까지 가습 인큐베이터에 다시 넣습니다.

12일째에 웰에서 핵에 영향을 받은 세포를 하나의 15ml 원추형 튜브로 수집하고 남은 세포를 수집하는 것으로 입증된 대로 웰을 세척합니다. 세포를 스핀다운한 후, 펠릿을 12ml의 새로 준비된 재프로그래밍 배지에 현탁시키고 2ml의 세포를 공급세포의 각 웰에 분배합니다. 6개의 우물 판에서 다음 75 GS 및 실내 온도에 30 분 동안 격렬하게 판을 원심 분리하고, 그 후에 격주로 매체를 바꾸어 1 2 주 동안 격주로 격하게 한 배양기로 판을 두십시오.

유도성 만능 세포 군체가 나타나면, 핵 주입 3일 후 그리고 도금하기 전에 핵이 유도성 필로폰에 영향을 미친 세포를 함유한 히스톤 탈아세틸화효소 억제제를 함유한 새로 준비된 인간 배아 줄기 세포 배지를 세포에 공급하기 시작합니다. 성공적인 NU 핵 애정의 효율성은 형광 현미경 검사에 의해 추정되어야 합니다.EGFP의 경우, 예를 들어, 여기에 표시된 것은 EGFP를 재프로그래밍한 유도성 만능 줄기 세포 콜로니를 발현하는 전체 세포 집단의 약 5-10%가 NU 핵 애정 후 약 2주 후에 나타나기 시작하는 전형적인 핵 애정 실험입니다. 군체는 일반적으로 경계가 잘 정의된 원형이며 핵 대 세포질 비율이 높은 작고 밀집된 세포와 완전히 특성화된 대표 계통의 가시적인 핵을 포함하여 특징적인 인간 배아 줄기 세포 형태로 식별될 수 있습니다.

알칼리성 포스파타제 활성에 대한 모든 검사에서 양성 반응이 나오면 표준 다능성 마커를 발현하고 내인성 다능성 유전자를 재활성화합니다. 이 기술은 적절하게 수행되면 4주 내에 통합 무료 IPSC를 일관되게 생성할 수 있습니다. 이 절차에 따라 모든 조직 유형에 대한 질문에 답하기 위해 분화 연구를 수행할 수 있습니다.