Name: 에피 솜과 HDAC 억제제를 사용하여 혈액에서 효율적인 유도 만능 줄기 세포 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 배우세요 주변 혈액에서 에피솜과 HDAC 억제제를 활용한 비통합 유도 만능 줄기 세포 생성 방법을. 이 기술은 재생의학 연구에 안전하고 효율적인 줄기 세포 확보를 가능하게 합니다.

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저자는 이 연구를 지원하기 위해 NIH로부터 K08DK082783(AR), P30DK56465(BTS), U01HL099993(BTS), T32HL00715036(SKS) 및 K12HL0806406(SKS)의 보조금을 받았으며 JP McCarthy Foundation(AR)에 감사드립니다.

프레드 허친슨 암 연구 센터(Fred Hutchinson Cancer Research Center)와 필라델피아 아동 병원(Children's Hospital of Philadelphia)의 기관 검토 위원회(Institutional Review Boards)에서 승인한 서면 동의서는 말초 혈액 샘플을 채취하기 전에 환자로부터 얻었습니다. 모든 제도적 지침을 준수했습니다. MEF 생성 및 기형종 형성을 포함한 모든 동물 실험은 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
1. PBMCS의 Ficoll 분리 및 적혈구 증식 – Day 0
<ol>
	<li>말초 혈액을 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 1:1로 희석합니다. 15ml의 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브에 7ml의 희석된 혈액을 실온 Ficoll-Hypaque 3ml에 조심스럽게 겹칩니다.</li>
	<li>400 x g에서 30분 동안 시료를 원심분리합니다.</li>
	<li>PBMC는 플라즈마와 흐린 백색 층으로 보이는 Ficoll-Hypaque 사이의 계면에 정착할 것입니다. 멸균 전사 피펫을 사용하여 PBMC를 하나의 15ml 원뿔형 튜브에 모읍니다. DPBS를 사용하여 부피를 10ml로 가져옵니다.</li>
	<li>혈구계를 사용하여 PBMC를 계수합니다.</li>
	<li>피펫 2 × 106 PBMC를 별도의 15ml 원뿔형 튜브에 넣고 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 나머지 세포를 스핀다운하고 90% 소 태아 혈청(FBS)/10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)에서 2 × 106 PBMCs/ml의 농도로 동결합니다.</li>
	<li>팽창 배지 준비: QBSF-60 무혈청 배지(빛으로부터 보호) + 페니실린/스트렙토마이신(1%) + 아스코르브산(50ng/ml) + 줄기세포 인자(SCF, 50ng/ml) + 인터루킨 3(IL-3, 10ng/ml) + 에리트로포이에틴(EPO, 2U/ml) + 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1, 40ng/ml) + 덱사메타손(1μM, 빛으로부터 보호, 배지가 변경될 때마다 새로운 분취액을 해동).</li>
	<li>갓 만든 팽창 배지 2ml에 2 × 106 PBMC를 재현탁하고 12 웰 조직 배양 플레이트의 한 웰에 넣고 5 % O2, 5 % CO2 및 90 % N2 분위기의 37 ° C 가습 인큐베이터에서 배양합니다.</li>
	<li>3일차와 6일차에 미디어를 교체합니다.
	<ol>
		<li>세포를 모으고 QBSF-60 2ml로 웰을 세척하여 남은 세포를 수집합니다.</li>
		<li>세포 현탁액을 300 x g에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 흡입합니다.</li>
		<li>2ml의 새로운 확장 배지에 세포를 재현탁시키고 동일한 12웰 플레이트에 다시 넣습니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 핵 절제에 의한 세포 재프로그래밍 – 9일차
<ol>
	<li>재프로그래밍된 플라스미드를 멸균된 1.5 ml Eppendorf tube에 피펫팅합니다(표 1).</li>
	<li>nucleofection solution과 Supplement(제조업체에서 제공) 및 피펫을 멸균 1.5 ml Eppendorf tube에 혼합합니다.</li>
	<li>팽창 배지 2ml를 12웰 플레이트의 한 웰에 피펫팅하고 세포를 추가하기 전에 평형을 위해 가습된 37°C 인큐베이터(5% O2, 5% CO2 및 90% N2)에 넣습니다.</li>
	<li>배양된 세포를 모으고 QBSF-60 2ml로 웰을 세척하여 남은 세포를 수집합니다.</li>
	<li>300 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 흡인합니다.</li>
	<li>5ml의 DPBS에 재현탁하고 300 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 세척합니다.</li>
	<li>상층액을 흡인합니다.</li>
	<li>세포 펠릿을 100μl의 핵 펙션 용액 + 보충제에 재현탁하고 기포가 생성되지 않도록 주의합니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 재프로그래밍 플라스미드가 포함된 튜브에 피펫팅하고, 위아래로 한 번 피펫팅하고, 샘플을 뉴클레펙션 큐벳의 바닥에 피펫팅합니다.</li>
	<li>큐벳을 핵융합 기계에 넣고 프로그램 T-019를 실행합니다.</li>
	<li>예열된 팽창 배지 100μl(2.3단계의 평형판에서)를 핵 펙션 큐벳으로 옮깁니다.</li>
	<li>즉시 전체 샘플을 수집하고 예열된 팽창 매체의 우물에 침전합니다. 하얗고 떠다니는 죽은 세포 파편을 수거하지 마십시오.</li>
	<li>성장을 위해 플레이트를 가습된 37°C 인큐베이터(5% O2, 5% CO2 및 90% N2)에 넣습니다.</li>
</ol>
3. 도금 피더 셀 – 10일 또는 11일
<ol>
	<li>10일째에는 플레이트 피더 셀.
	<ol>
		<li>젤라틴으로 6 웰 조직 배양 플레이트 하나를 코팅합니다.
		<ol>
			<li>Hank's Buffered Saline Solution(HBSS)에 있는 0.1% 젤라틴 1m를 플레이트의 각 웰에 피펫으로 넣습니다.</li>
			<li>플레이트를 가습된 37°C 인큐베이터에 최소 5분 동안 놓습니다.</li>
			<li>사용 직전에 플레이트에서 젤라틴 용액을 흡입하십시오.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>3,000 cGy로 조사된 2 × 106 마우스 배아 섬유아세포 1바이알을 10ml의 예열된 MEF 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) + FBS(10%) + 페니실린/스트렙토마이신(1%))으로 해동합니다.</li>
		<li>300 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 흡인합니다. 12ml의 MEF 배지 및 피펫 2ml에 세포를 젤라틴으로 코팅된 6웰 플레이트의 각 웰에 재현탁합니다. 플레이트를 가습된 37°C 인큐베이터(5% O2, 5% CO2 및 90% N2)에 12일까지 놓습니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 피더 셀의 도금 셀 및 매체 변경 – Day 12
<ol>
	<li>핵형성된 세포를 하나의 15ml 원뿔형 튜브에 모으고 2ml의 QBSF-60으로 웰을 세척하여 남은 세포를 수집합니다. 샘플을 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>재프로그래밍 배지 준비: Iscove의 변형된 둘베코 배지(IMDM) + FBS(10%) + 비동물성 L-글루타민(1mM) + 비필수 아미노산(NEAA, 1%) + 페니실린/스트렙토마이신(1%) + β-메르캅토에탄올(0.1mM) + 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF, 수유 시 신선하게 첨가, 10ng/ml) + 아스코르브산(수유 시 신선하게 첨가, 50μg/ml).</li>
	<li>상등액을 흡인하고 12ml의 Reprogramming Medium에 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액의 웰당 2ml를 피더 셀의 6웰 플레이트에 넣습니다(섹션 3에서 준비한 대로). 실온에서 50 x g으로 플레이트를 30분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>성장을 위해 플레이트를 가습된 37°C 인큐베이터(5% O2, 5% CO2 및 90% N2)에 넣습니다. iPSC 콜로니가 나타나기 시작할 때까지(1-2주) 격일로 Reprogramming Medium을 변경합니다.</li>
	<li>hESC 배지 준비: DMEM/F12 1:1 + 녹아웃 세럼 대체물(20%) + 페니실린/스트렙토마이신(1%) + NEAA(1%) + 비동물 L-글루타민(1mM) + 피루브산나트륨(1%) + 중탄산나트륨(0.12%) + β-메르캅토에탄올(0.1mM) + bFGF(수유 시 신선 첨가, 10ng/ml)</li>
	<li>HDAC 억제제를 준비합니다: 부티르산나트륨(수유 시 신선하게 첨가, 100μM), 수베아닐로하이드록사믹산(SAHA, 수유 시 신선하게 첨가, 200nM). iPSC 콜로니가 나타나면 hESC 배지 + HDAC 억제제를 세포에 공급하기 시작하고 매일 배지를 교체하십시오. 
	참고: 부티르산나트륨은 플라스틱 튜브에 흡착되는 작은 분자이므로 4°C의 붕규산 유리관에 보관하십시오.</li>
</ol>
5. iPSC 클론 분리
<ol>
	<li>iPSC 콜로니가 분리할 수 있을 만큼 충분히 커지면(20-25개 세포) P20 피펫으로 선별합니다.</li>
	<li>HDAC 억제제 준비: 부티르산나트륨(수유 시 신선하게 첨가, 100μM), SAHA(수유 시 신선하게 첨가, 200nM)</li>
	<li>hESC Medium + HDAC 억제제 + Cloning & Recovery Supplement가 들어있는 개별 35mm 접시에 분리된 콜로니를 iMEF에 놓습니다.</li>
	<li>콜로니를 채취한 다음 날, 배지를 hESC 배지 + HDAC 억제제로 변경합니다.</li>
	<li>iPSC 콜로니가 계대 형성 준비가 될 때까지 배지를 매일 교체합니다.</li>
	<li>통로 2-3에서 집락이 안정화되면 배지에서 HDAC 억제제를 제거합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Koche, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+factor+expression+initiates+widespread+targeted+chromatin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodeling.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 96-105 (2011).</li>
<li>Baum, C., Kustikova, O., Modlich, U., Li, Z., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+and+oncogenesis+by+chromosomal+insertion+of+gene+transfer+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors.</a> Human Gene Therapy. 17 (3), 253-263 (2006).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324 (5928), 797-801 (2009).</li>
<li>Hong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+induced+pluripotent+stem+cell+generation+by+the+p53-p21+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway.</a> Nature. 460 (7259), 1132-1135 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Yates, J. L., Warren, N., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+replication+of+plasmids+derived+from+Epstein-Barr+virus+in+various+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells.</a> Nature. 313 (6005), 812-815 (1985).</li>
<li>Ware, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibition+elicits+an+evolutionarily+conserved+self-renewal+program+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibition elicits an evolutionarily conserved self-renewal program in embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (4), 359-369 (2009).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butyrate+greatly+enhances+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+promoting+epigenetic+remodeling+and+the+expression+of+pluripotency-associated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes.</a> Stem Cells. 28 (4), 713-720 (2010).</li>
<li>Azuara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+signatures+of+pluripotent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin signatures of pluripotent cell lines.</a> Nature Cell Biology. 8 (5), 532-538 (2006).</li>
<li>Sommer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+peripheral+blood+using+the+STEMCCA+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector.</a> J. Vis. Exp. (68), e4327(2012).</li>
<li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5, 237-241 (2009).</li>
<li>Abbondanzo, S. J., Gadi, I., Stewart, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Embryonic+Stem+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Derivation of Embryonic Stem Cell Lines.</a> Methods in Enzymology. 225, 803-823 (1993).</li>
<li>Kim, H. J., Bae, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors%3A+molecular+mechanisms+of+action+and+clinical+trials+as+anti-cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs.</a> American Journal of Translational Research. 3 (2), 166-179 (2011).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 프로토콜을 사용할 때 성공적인 iPSC 생성을 위해서는 고려해야 할 몇 가지 중요한 주의 사항이 있습니다. 적혈구 확장 단계에서는 편차가 표적 전구 세포 집단의 비효율적인 자극과 iPSC 생성 효율의 저하로 이어질 수 있으므로 배지 변경 일정을 엄격히 따라야 합니다. 매체가 바뀔 때마다 새로운 덱사메타손으로 새로운 확장 배지를 만드는 것이 중요합니다. QBSF-60 기본 배지와 덱사메타손은 보관 중에 빛으로부터 보호해야 합니다. 핵박신 중에 DPBS 세척은 핵 접시관에서 전류를 아크로 일으켜 광범위한 세포 사멸을 초래할 수 있는 세포 현탁액에서 과도한 용질을 제거하는 데 중요합니다. 핵접합 후 약 10일 후에 플레이트를 매일 iPSC 콜로니 모양에 대해 검사해야 합니다. 여러 개의 작은 콜로니가 존재하면 혈청에 장기간 노출되면 자발적인 분화를 유도할 수 있으므로 재프로그래밍 배지를 hESC 배지(HDAC 억제제 포함)로 변경해야 합니다.
실험실 설정 및 사용 가능한 자원에 따...

iPSCs는 만능 유전자의 최소한의 자궁외 표현을 통해 체세포 조직에서 파생됩니다. 이 기술은 처음에 매우 만능 상태 1로 표현된다 OCT4, SOX2, KLF4, 및 cMYC 인간 섬유 아세포의 레트로 바이러스 전달에 의해 입증되었다. 이러한 일시적 발현 &quot;리 프로그래밍 인자&quot;는 인간 배아 줄기 세포 (2) 표적 세포의 후성 프리 및 유전자 발현 프로파일이 유사한 변경. 생성 한 후에, iPSCs는 잠재적으로 추가 조사에 대한 조직 형으로 구분 될 수있다. 따라서, 그들은 재생 의학, 질병 모델링, 유전자 치료의 용도로 약속을 누르고 있습니다. 그러나, 바이러스 통합과 함께 게놈을 방해하는 내인성 유전자 발현, 영향 세포 표현형을 변화시킬 가능성이 있고, 궁극적으로 과학적 결과를 편향. 또한, 임의의 바이러스 통합은 해로운 세포 전자로 이어질 수악성화 3 발암 유전자 (4)의 재 발현의 가능성을 포함 ffects. 미래의 임상 적용은 비 통합 IPSC 생성을 필요로 할 것이다. 여분의 염색체 원형 DNA 분자이다 에피 좀은 비용 효율적인 통합없는 iPSCs 5를 생성하기위한 전략을 제공한다. 표 1에 나타내는 에피 솜 벡터의 조합은 리 프로그래밍이 OCT4, SOX2, KLF4, MYCL 및 LIN28A 인자 표현한다. pCXLE_hOCT3 / 4 shp53-F 플라스미드는 세포 재 프로그래밍 (6)을 향상시키기 위해 TP53의 일시적인 억제를위한 p53의 shRNA를 포함되어 있습니다. 복제 - 결핍 pCXWB EBNA1 벡터가 EBNA1 발현 7 일시적인 증가를 제공함으로써 리 프로그래밍 인자의 증폭과 증가 된 리 프로그래밍 효율을 촉진한다. pCXLE_EGFP 플라스미드 dete의 목적 nucleofection 혼합물에 첨가 될 수있다셀 정렬 응용 프로그램에 대한 형질 전환 효율 또는 rmining. P는 CXWB-EBNA1을 제외하고,이 프로토콜에서 사용하는 에피 솜 플라스미드는 숙주 세포 (8)의 분할 중에 복제 및 에피 솜의 파티션을 매개 바이러스 복제 및 EBNA1 유전자의 엡스타인 바 바이러스 원점을 함유한다. 에피 솜은 자발적으로 연속 IPSC 확장 7 손실됩니다. 서브 클로닝 및 eGFP는 표현의 손실을 추측 할 수있다 에피 솜 벡터 손실과 iPSCs의 특성은 미래의 임상 응용 프로그램에 완전히 통합 무료 iPSCs로 이어질 수 있습니다. IPSC 생성의 과정에 고유 혈통 특정 유전자의 억제 및 분화능 관련 유전자의 활성화입니다. 유전자 발현의 규제 대상으로 전사 인자를 허용하는 DNA 및 염색질 변형을 규제 DNA 요​​소, 및 RNA 폴리머 라제 이용과 같은 핵 내부의 여러 레벨에서 일어난다유전자. 글로벌 염색질 수정을 통해 후성 유전 적 풍경의 리모델링을 다시 표현하는 핵심 요소 다 능성 유전 적 프로그램입니다. 유전자 발현의 조절에 중요​​한 특정 염색질 변형 히스톤-DNA 코일 장력의 감소를 통해 유전자를 타겟팅 액세스를 허용하는 특정 리신 잔기에서 히스톤의 아세틸 화이다. HDAC 억제제 인해 아세틸 상태 (11)를 지원하는 것으로, IPSC 리 프로그래밍 및 hESC의자가 재생 (self-renewal) 9,10 향상하는 것으로 나타났다 작은 분자이다. 통합 렌티 12을 사용 전에 공보에서 적응 후술 프로토콜은 말초 혈액 이용한 에피 솜 및 HDAC 억제제에서 최적화 IPSC 생성을위한 단계적인 방법을 제공한다. 여기에 사용되는 HDAC 억제제의 농도는 도자기에 의해 설명 된의 절반, 등. 9, 일상적으로 표준을 통해 완벽하게 재 프로그램 IPSC 식민지에서 2 배 증가 주도HDAC 억제제없이 에피 솜 재 프로그래밍 프로토콜. 재 프로그래밍의 수준은 우리가 렌티 바이러스 방법과 관찰 효율성과 비슷한 수준이다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 효율적으로 나이 팔십칠년만큼 오래된 개인에서 IPSC를 생성 한.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-750</td><td>4°C에서 보관하십시오. 사용하기 전에 실온으로 데우십시오.</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td>4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>4 &deg;C.에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10437028</td><td>-20 &deg에 보관; C는 필요할 때까지. 해동, 분취, 4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>시그마-알드리치</td><td>154938</td><td>실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>QBSF-60 무혈청 배지</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-983-234</td><td>4°C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>4°C에 매장</td></tr><tr><td>세포주 핵 펙터 키트 V</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>4 &deg;C에 저장.</td></tr><tr><td>2% 젤라틴 해결책</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td>는 <td>4 &deg에 저장한다; C, 37 &deg에서 액화; C 사용 전 수조.</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Saline Solution(HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td>매장 4°C.</td></tr><tr><td>Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>Store at 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Iscove의 Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>Life Technologies</td><td>12440-061</td><td>Store at 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>L-글루타민, 200mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>부분 표본, -20°C에서 동결</td></tr>.<tr><td>비필수 아미노산(NEAA), 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>4 &deg에 저장; C, 빛에서 멀리 떨어져.</td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12, 1:1</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30023.02</td><td>4°C에 보관.</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>부분 표본, -20°C에서 동결.</td></tr><tr><td>나트륨 피루브산, 100 mM</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>4 &deg;C에 저장.</td></tr><tr><td>중탄산나트륨, 7.5%</td><td>Life Technologies</td><td>25080094</td><td>4°C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0263</td><td>DPBS에 10 mg/ml 스톡을 만들고 분취량은 -20 °C에서 동결합니다. 해동되면 4°C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>부티르산나트륨&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887-1G</td><td>DPBS로 2000x 재고(400mM)를 만들고 분취량, -20°C에서 동결합니다. 해동되면 4°C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>hES 세포 클로닝 및 회복 보충제</td><td>Stemgent</td><td>01-0014-500</td><td>-20 &deg에 저장; C는 필요할 때까지. 해동되면 4°C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>ESC 인증 BD matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>35-4277</td> 4°C<td>에서 얼음 위에서 밤새 해동; C, 미리 냉각된 피펫 팁을 사용하여 미리 냉각된 튜브로 분취합니다. -20 &deg에서 보관하십시오. C는 필요할 때까지. 4 &deg에서 해동; C, 즉시 사용하십시오.</td></tr><tr><td>스템스팬 SFEM&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9650</td><td>분취량, -20°C에서 동결.</td></tr><tr><td>아스코르브산, 분말</td><td>시그마-알드리치</td><td>A4403-100MG</td><td>DPBS, 멸균 필터에 5mg/ml 재고를 만들고 4°C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>재조합 인간 줄기 세포 인자 (SCF)</td><td>R & D 시스템</td><td>255-SC-010</td><td>Make 100 &mu; SFEM의 g/m 재고, 부분 표본, -20 &deg;C에서 동결. 해동되면 4°C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>재조합 인간 인터루킨 3 (IL-3)</td><td>R & D 시스템</td><td>203-IL-010</td><td>메이크 100 &mu; SFEM의 g/ml 재고, 분취량, -20°C에서 동결. 해동되면 4°C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>에리트로포이에틴(EPO)</td><td>R & D Systems</td><td>287-TC-500</td><td>SFEM으로 1000 U/ml 재고를 만들고 분취량, -20°C에서 동결합니다. 해동되면 4°C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>재조합 인간 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF-1)</td><td>R & D 시스템</td><td>291-G1-200</td><td>Make 100 &mu; SFEM의 g/ml 재고, 분취량, -20°C에서 동결. 해동되면 4°C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>&beta;-메르캅토에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td>DPBS로 1000배 재고(100mM) 제조.</td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>시그마-알드리치</td><td>D4902-25MG</td><td>50x 주식 만들기 (50 &mu; M)을 DPBS에 넣고 멸균 필터를 4°C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>SAHA (vorinostat)</td><td>Cayman Chemical</td><td>149647-78-9</td><td>DPBS로 2,000x 재고(400mM)를 만들고 분취량, -20°C에서 동결합니다. 해동되면 4°C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>12웰 조직 배양 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>15ml 원뿔형 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>62553002</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml Eppendorf 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>6웰 조직 배양 플레이트</td><td>Fisher</td><td>Scientific 08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>35mm 티수 배양 플레이트</td><td>BD Biosciences</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 일회용 혈청학 피</td>펫 <td>Fisher Scientific</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 일회용 혈청학 피</td>펫 <td>Fisher Scientific</td><td>13-675-22</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 일회용 혈청학 피</td>펫 <td>Fisher Scientific</td><td>13-675-17</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l 피펫 팁, 배리어 팁</td><td>Genessee</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피</td>펫 <td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>피펫 원조</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-15</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3/4-shp53-F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-EGFP</td><td>애드젠</td><td>27082</td><td></td></tr><tr><td>pCXWB-EBNA1</td><td>애드겐</td><td>37624</td><td></td></tr></tbody></table>

에피 솜과 hdac 억제제를 사용하여 혈액에서 효율적인 유도 만능 줄기 세포 생성

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

이 원고는 효율적으로 에피 솜 플라스미드와 히스톤 탈 아세틸 화 효소 (HDAC) 억제제를 사용하여 말초 혈액에서 통합이없는 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)를 생성하기위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 방법의 장점은 : (1) 원료로서 말초 혈액의 최소량의 사용; (2) 프로그램을 다시 벡터를 nonintegrating; (3) 자유 iPSCs 벡터를 생성하는 비용 효과적인 방법; (4) 단일 트랜; (5) 작은 분자의 사용은 후생 유전 학적 리 프로그래밍을 용이하게한다. 리 프로그래밍 현저 의무가 높은 증식 적혈구 전구 세포 집단을 수득 요약하면, 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)는 루틴 채혈 샘플로부터 분리되어 정의 된 증식 인자에서 배양 하였다. Nonintegrating, OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A 및 p53의 짧은 머리 핀의 자형 (SH) RNA를 발현하는 nontransmissible 에피 솜 플라스미드는 introdu 있습니다하나의 nucleofection를 통해 도출 된 적혈구 모세포에 세드릭. 녹색 형광 단백질을 강화 표현한다 에피 솜 (eGFP는) cotransfection 된 세포는 형질 전환 된 세포를 쉽게 식별 할 수 있습니다. 엡스타인 - 바르 핵 항원 1 (EBNA1)를 별도의 발현 플라스미드의 복제 - 결함은 에피 솜 단백질의 발현 증가에 대한 반응 혼합물에 첨가된다. 형질 감염된 세포는 계속 재 프로그래밍에 대한 조사 마우스 배아 섬유 아세포 (iMEFs) 층에 도금되어있다. 즉시 IPSC 같은 식민지 nucleofection 후 약 십이일에 나타나는대로, HDAC 억제제는 후생 유전 학적 리모델링을 용이하게하기 위해 중간에 추가됩니다. 우리는 HDAC 억제제를 포함 정기적으로 2 배 완전히 재 프로그래밍 IPSC 식민지의 생성을 증가 시킨다는 것을 발견했다. IPSC 식민지 일반적인 인간 배아 줄기 세포 (hESC의) 형태를 전시되면, 그들은 부드럽게 지속적인 성장과 확장을위한 개별 IMEF 코팅 조직 배양 플레이트로 전송됩니다.

뉴클레오펙션 후 3일이 지나고 뉴클레오펙션된 세포를 iMEF 상에 도말하기 전에, 형광 현미경을 사용하여 eGFP의 발현 여부를 확인함으로써 뉴클레오펙션 성공 효율을 추정해야 합니다. 그림 1은 전체 세포 집단의 약 5-10%가 eGFP를 발현하는 전형적인 뉴클레오펙션 실험 결과를 보여줍니다.
리프로그래밍된 iPSC 콜로니는 뉴클레오펙션 후 약 2주 뒤부터 나타나기 시작합니다. 콜로니는 일반적으로 경계가 뚜렷한 원형이며, (1) 핵-질 비율이 높고 조밀하게 밀집된 작은 세포들과 (2) 관찰 가능한 인을 포함한 특징적인 hESC 형태를 통해 식별할 수 있습니다(그림 2, 명시야). 불완전하게 리프로그래밍된 세포들은 퇴화하거나, 실제 iPSC 콜로니와 쉽게 구별되는 불균일한 세포 덩어리를 형성하게 됩니다.
완전한 특성 분석을 위해 선택한 대표 세포주들은 모두 표준 다능성 마...

여기에서는 에피솜 기반 재프로그래밍 전략과 히스톤 탈아세틸화효소 억제제를 사용하여 말초 혈액에서 인간 유도 만능 줄기 세포를 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

에피 솜과 HDAC 억제제를 사용하여 혈액에서 효율적인 유도 만능 줄기 세포 생성

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

다음 실험의 전반적인 목표는 소량의 말초 혈액에서 통합 자유 유도 만능 줄기 세포를 생성하는 것입니다. 이는 정의된 성장 인자에서 분리된 말초 혈액 단핵 세포를 배양하여 재프로그래밍에 매우 반응하는 적혈구 전구 집단을 생성함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 재프로그래밍 유전자를 운반하는 비통합형 에피솜 플라스미드는 핵 애정에 의해 적혈구로 도입되어 재프로그래밍 과정을 시작합니다.다음으로, 핵에 영향을 받은 세포를 방사선 조사된 마우스 배아 섬유아세포층(mouse embryonic fibroblasts)층에 도말하여 궁극적으로 성공적으로 재프로그래밍을 계속할 수 있도록 합니다. 재프로그래밍된 유도 만능 줄기세포 군집은 형태학적 특성, 알칼리성 포스파타제 활성, 다능성 마커에 대한 양성 면역화학 및 내인성 다능성 유전자의 발현을 기반으로 식별할 수 있습니다. 바이러스 기반 재프로그래밍과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 프로토콜이 통합 없는 IPSC의 일관된 생성을 보장한다는 것입니다.오늘 절차를 시연하는 사람은 Jesse, 저 및 Gretchen Johnson이 될 것입니다.실험실의 기술자 DPBS에서 말초 혈액을 1:1 비율로 희석하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 15 밀리리터의 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브에 희석 된 혈액 7 밀리리터를 실온 3 밀리리터의 하이 팩에 조심스럽게 겹쳐 놓습니다. 400 GS와 실온에서 30분 동안 샘플을 분리한 후, pbmc는 플라즈마와 파이얼 하이 팩 사이의 흐린 흰색 계면층에 정착합니다.멸균 이송 피펫을 사용하여 P BMC를 15ml 원추형 튜브로 옮기고 새 DPBS로 부피를 최대 10ml까지 가져옵니다. 그런 다음 세포를 계수 한 후, 6 개의 P BMC에 2 회 10을 새로운 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 나머지 세포를 스핀 다운하고, 펠렛 화 된 세포를 10 % 디메틸 설폭 사이드가 함유 된 90 % 태아 소 혈청에서 밀리리터 당 6 pbmc 농도로 2 배 10으로 동결합니다. 그런 다음 따로 보관된 P BMC를 회전시킨 후 펠릿을 2밀리리터의 새로 준비된 팽창 매체에 현탁시키고 12웰 조직 배양 플레이트의 한 웰에 플레이트화하여 산소 5%, 이산화탄소 5% 및 질소 90%의 분위기에서 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.그런 다음 3일차와 6일차에 웰에서 세포를 수집하여 배지를 교체합니다. 2ml의 QBSF 60으로 웰을 세척하여 남아 있는 세포를 수집하고 원심분리로 세포를 펠릿화한 다음 2ml의 새로운 팽창 배지에 펠릿을 현탁시킵니다. 그런 다음 세포를 동일한 12 well plate에 다시 넣고 배양을 계속합니다.9일째에 표와 같이 재프로그래밍 플라스미드를 멸균 1.5ml einor tube에 피펫팅합니다.다음으로, nucleo affection solution을 제조업체에서 제공한 보충제와 혼합하고 혼합물을 멸균 1.5ml 업엔드 DPH 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 2ml의 팽창 배지를 새로운 12웰 플레이트의 한 웰에 분배하고 세포가 준비될 때까지 가습된 섭씨 37도 인큐베이터에서 배지를 평형화합니다. 세포를 모으고, 방금 시연한 대로 세포 배양을 잘 세척하고, 5ml의 DPBS로 세포를 세척합니다.그런 다음 resus, 100 마이크로 리터의 핵 애정 용액 플러스 보충제에 세포 펠렛을 현탁시키고 거품 생성을 피하고 세포 현탁액을 재 프로그래밍 플라스미드를 포함하는 튜브로 옮깁니다. 위아래로 한 번 피펫팅하여 세포를 혼합하고 전체 용액을 nucle affection vete의 바닥으로 옮깁니다. 그런 다음 수의사를 Nucle affection 기계에 넣고 프로그램 T 0 1 9를 실행합니다.이제 100마이크로리터의 EQUILIBRATED 팽창 배지를 nucle affection vete에 첨가하고 즉시 전체 샘플을 수집하여 흰색 부유 사체 파편을 피하고 예열 배지의 웰에 증착합니다. 그런 다음 10일 또는 11일에 세포를 가습된 인큐베이터에 다시 넣습니다. 6 개의 우물 조직 배양 플레이트의 각 웰에 HBSS의 0.1 % 젤라틴 1 밀리리터로 젤라틴을 코팅 한 다음 플레이트를 가습 인큐베이터에 넣거나 인큐베이션 중 최소 5 분 동안 6 개의 3000 섭씨 방사선 조사 마우스, 배아, 섬유 아세포 또는 mes를 10 밀리리터의 예열 메스 배지로 2 회 10 회 이동합니다. 그런 다음 세포가 회전하는 동안 세포를 원심분리합니다.6개의 웰 플레이트에서 젤라틴 용액을 흡입한 다음 12ml의 신선한 메스암페타민 매체에 메스를 재현탁합니다. 코팅된 젤라틴의 각 웰에 즉시 2밀리리터 OFM을 분배합니다. 6. 웰 플레이트를 만들고 12일째까지 가습 인큐베이터에 다시 넣습니다.12일째에 웰에서 핵에 영향을 받은 세포를 하나의 15ml 원추형 튜브로 수집하고 남은 세포를 수집하는 것으로 입증된 대로 웰을 세척합니다. 세포를 스핀다운한 후, 펠릿을 12ml의 새로 준비된 재프로그래밍 배지에 현탁시키고 2ml의 세포를 공급세포의 각 웰에 분배합니다. 6개의 우물 판에서 다음 75 GS 및 실내 온도에 30 분 동안 격렬하게 판을 원심 분리하고, 그 후에 격주로 매체를 바꾸어 1 2 주 동안 격주로 격하게 한 배양기로 판을 두십시오.유도성 만능 세포 군체가 나타나면, 핵 주입 3일 후 그리고 도금하기 전에 핵이 유도성 필로폰에 영향을 미친 세포를 함유한 히스톤 탈아세틸화효소 억제제를 함유한 새로 준비된 인간 배아 줄기 세포 배지를 세포에 공급하기 시작합니다. 성공적인 NU 핵 애정의 효율성은 형광 현미경 검사에 의해 추정되어야 합니다.EGFP의 경우, 예를 들어, 여기에 표시된 것은 EGFP를 재프로그래밍한 유도성 만능 줄기 세포 콜로니를 발현하는 전체 세포 집단의 약 5-10%가 NU 핵 애정 후 약 2주 후에 나타나기 시작하는 전형적인 핵 애정 실험입니다. 군체는 일반적으로 경계가 잘 정의된 원형이며 핵 대 세포질 비율이 높은 작고 밀집된 세포와 완전히 특성화된 대표 계통의 가시적인 핵을 포함하여 특징적인 인간 배아 줄기 세포 형태로 식별될 수 있습니다.알칼리성 포스파타제 활성에 대한 모든 검사에서 양성 반응이 나오면 표준 다능성 마커를 발현하고 내인성 다능성 유전자를 재활성화합니다. 이 기술은 적절하게 수행되면 4주 내에 통합 무료 IPSC를 일관되게 생성할 수 있습니다. 이 절차에 따라 모든 조직 유형에 대한 질문에 답하기 위해 분화 연구를 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

그들은 pluripotency에 대한 표준 테스트를 통과 때도 생성 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 라인이 발달 가능성을 서로 다른 행을 생산하고 있습니다. 여기 가진 전체 pluripotency로 iPSC 라인을 정의 iPSCs에서 완전히 파생 쥐를 생산하기 위해 프로토콜을...

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

여기 하나의 lentiviral 재활 벡터를 사용하여 말초 혈 3-4 ML에서 인간 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 보여줍니다. 즉시 사용할 수 혈액 세포의 재 프로그래밍하면 폭 넓은 연구 공동체에 액세스하여 iPSC 기술의 활용을 촉진 것을 약속드립니다.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

여기, 우리는 일관된 결과 및 향상된 효율성을 보여줍니다 센다이 바이러스와 유전자가없는 인간 유도 만능에 인간의 체세포를 재 프로그램하는 우리의 설립 방법을 제시한다.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 임상 응용 프로그램 및 기초 연구에 대한 환자의 특정 조직의 소스를 나타냅니다. 여기서는 비 - 에피 솜 통합 플라스미드를 사용하여 바이러스 프리 iPSCs에 냉동 버피 코트로부터 얻은 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)를 재 프로그래밍 상세한 프로토콜을 제시한다.

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

우리는 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 유도만능줄기세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 프로토콜을 제안합니다. 원심분리를 통해 형질도입된 혈액 세포를 매트릭스 코팅된 플레이트에 도금함으로써 부유 세포에서 iPSC를 성공적으로 유도할 수 있습니다. 이 기술은 PBMC 및 CBMC와 같은 셀에 대한 간단하고 효과적인 재프로그래밍 프로토콜을 제안합니다.

센다이 바이러스 원심 분리를 이용하여 혈액 세포로부터 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 인간 성인 말초 혈액 세포에서 통합이 없는 iPSC를 효율적으로 생성하기 위한 자세한 방법을 설명합니다. 재프로그래밍 인자를 발현하기 위해 KLF4, MYC, BCL-XL 또는 OCT4 및 SOX2와 같은 4개의 oriP/EBNA 기반 에피솜 벡터를 사용하여 1mL의 말초 혈액에서 수천 개의 iPSC 콜로니를 얻을 수 있습니다.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

이 CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins 및 수정된 된 특성을 사용 하 여 편집 다음 프로토콜 자세히 설명 발자국 없는 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)의 세대 급지대 무료 조건에서 인간의 췌장암 세포에서 단일 셀 복제합니다.

효율적인 생성 및 급지대 무료 Ipsc CRISPR Cas9 시스템을 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서의 편집

이 프로토콜은 조혈 줄기 및 전구 세포를 생성하는 전사 인자 GATA2, GFI1B 및 FOS의 발현을 강제함으로써 인간 진피 섬유아세포에서 혈생 프로그램의 유도를 입증한다.

전사 요인의 강제 표현에 의한 인간 섬유아세포의 혈생 재프로그래밍

세포 재프로그래밍은 다능성 세포 상태를 조절하고 유지하는 주요 유전자의 도입을 요구합니다. 기술된 프로토콜은 바이러스/통합 방법 없이 인간 진피 섬유아세포로부터 유도된 만능 줄기 세포(iPSCs) 콜로니의 형성을 가능하게 하지만, 세포 방어 메커니즘을 감소시키는 면역 회피 인자와 결합된 비변형 RNA(NM-RNAs)를 사용한다.

비통합 방법을 사용하여 복부 피부에서 성인 인간 진피 섬유 아세포의 분리 및 유도 만능 줄기 세포의 생성

현재 프로토콜은 제조사 지침에 따라 재프로그래밍이 어려운 환자 샘플의 말초혈 단핵세포(PBMC)에서 유도 다능성 줄기세포(iPSC) 유도 문제를 해결하는 절차를 상세히 설명합니다. 이 프로토콜은 냉동 버피 코트 샘플에 특이적이지만 정제된 PBMC 재프로그래밍에도 적용될 수 있습니다.

냉동 버피 코트 샘플에서 유도된 다능성 줄기세포주 재프로그래밍

배우세요 주변 혈액에서 에피솜과 HDAC 억제제를 활용한 비통합 유도 만능 줄기 세포 생성 방법을. 이 기술은 재생의학 연구에 안전하고 효율적인 줄기 세포 확보를 가능하게 합니다.

에피 솜과 HDAC 억제제를 사용하여 혈액에서 효율적인 유도 만능 줄기 세포 생성

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