Name: 만들기 해부학 적으로 정확하고 인간의 두뇌 종양의 재현 두개 내 이종 이식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 학습하세요 정밀한 두개 내 이종 이식 기법을 통해 생쥐에 인간 뇌종양 모델을 구축하는 방법을. 이 기법은 신경종양학 연구에서 새로운 치료 전략을 정확하게 테스트하고 종양 성장률을 측정하는 데 필수적인 도구를 제공합니다.

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박사 키팅은 DOD 부여 CA100335에 의해 투자되고, 세인트 Baldrick의 재단 장학생이다.

모든 설명 된 절차를 검토하고 우리의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 1 계획 실험 <ol><li> 셀을 선택하는 주입한다. 부착 성 세포 배양 라인, 유 전적으로 변형 된 클론, neurosphere 셀, 차 배양, 또는 분해 된 종양 : 다양한 소스로부터 세포를 주입 후보들이다. 원하는 모델의 종류는 분사의 가장 적절한 위치를 정의하는 것이다. <ol><li> 주입 세포 수를 결정합니다. 종양을 형성하는데 필요한 세포의 수는 세포주에 따라 다양하고 경험적으로 결정되어야한다; 종양 성장 속도는 세포 유형, 세포 수 및 조직 배양 통과 수에 크게 의존한다. 1 × 104 내지 2 × 105 또는 주입 당 더 많은 범위의 세포 수는 변화 성장률의 종양을 제조했다. </li><li> 주입의 볼륨을 제한합니다. 세포를 혈청이없는 배지 또는 인산염 완충 (S)의 최소 용적에 현탁되어야26 G 바늘을 통해 부드럽고 쉽게 통과를 위해 수 있습니다 알린 (PBS). 더 작은 부피가 실제로 뇌에 전달하며,보다 정확한 결과를 정의 종양; 최적의 결과는 3에서 6 μL에 이르기까지 주입 볼륨에 의해 얻을 수있다. 정확한 측정, 혼합 및 샘플링을 허용하는 관계없이 계획된 주입 수, 부유 세포의 적어도 50 μL의 최종 총 부피를 준비 할 계획이다. </li></ol></li><li> 모델에 적합한 마우스를 선택합니다. 인간 종양의 쥐 모델은 일반적으로 면역 매개 성 거부 반응을 방지하기 위해 젊은 면역 손상 마우스를 사용합니다. 적절한 예방 조치가 살균, 소독, 재료 및 장비의 살균 포함한 촬영하는 경우 작업이 생물학적 안전 캐비넷에 일어날 필요는 없다. 여기에 표시된 작업은 6 세부터 12 주 사이에, 남성과 여성의 무 흉선 누드 마우스에 완료되었습니다. 어려울 수 있습니다보다 20g 무게 쥐로 위치합니다및 tereotaxic 프레임 저체온증에 더 취약 할 수있다. </li></ol> 2 장비를 조립 <ol><li> 구하여 마우스에게 고정대, 배향 콘솔, 마우스 가스 마취 헤드 홀더, 또는 마이크로 펌프, 열 패드, 마취 기계, 광섬유 작업 등, 및 가변 속도 회전 드릴 오염을 제거. 청소하고 모든 장비의 오염을 제거. </li><li> 주사기 펌프의 동작에 필요한 변수 및 다른 (레​​이트, 레이트 단위, 주사기 형 흐름 주입량 포함) 주입 파라미터를 프로그래밍. 각각의 특정 모델에 대한 설정을 최적화 할 수 있습니다. NOTE : 설정 3,000 NL 샘플 25 μL 주사기 (장치 타입 &quot;E&quot;) 비 그룹화에 ( &quot;N&quot;) 모드를 사용하여 (레이트 단위 &quot;M&quot;) 400 NL / 분의 속도로 된 이러한 주사한다. </li><li> 최종 리를하고, 멸균 증류수 여러 린스와 26 G 바늘 정밀 마이크로 실린 (DIH 2 O) 및 70 % 에탄올 (EtOH로)를 청소DIH 2 O.와 NSE 일부를 제외한 모든 모델은 멸균하도록 설계되지. 플런저의 이동이 원활하고 무료 있는지 확인하십시오. </li><li> 마취 배달 장비를 얻습니다. 이 마취 깊이 및 길이를 조절하기 쉽다는 이소 플루 란으로 마취 바람직한 것이다. 정위 장치가 마우스를 마취 가스 첨부하고 필요한 튜브 및 커넥터를 마우스로 취 기계에서 가스 혼합물을 제공하는 장소에 있는지가 장착되어 있는지 확인합니다. </li><li> 좋은 팁 (이빨) 가위,이 집게 / 지혈 봉합을 위해, 중간 크기의 위, 중간과 끝이 뾰족한 핀셋, 적어도이 1mm 치과 드릴 비트를 포함하여 오토 클레이브 수술 도구. 70 % EtOH로, 소독제, 또는 비드 살균기와 절차를 수행하는 동안 청소 도구를 보관하십시오. </li><li> 이소 플루 란으로부터, 진통제, 안연고 / 윤활제, 항생제 연고, 식염수, 30 % 과산화수소 (H 2 O 2), 방부제, 및 원하는 경우 뼈 왁스를 구하는수의학 또는 의료 공급. 멸균 DIH 2 O와 70 %의 EtOH를 준비합니다. 거즈 패드, 멸균 드레싱, 봉합, 에탄올, 면봉,면 스쳐 면봉, 무균 수술 장갑, 수술 블레이드 등과 같은 일회용품은 물질 목록에 항목별로된다. 두개골을 표시하기위한 좋은 팁 영구 마커 오염 제거 및 수술 용으로 전용해야합니다. </li></ol> 3 사출에 대한 세포를 준비 <ol><li> 여기에 도시 된 실험에서, 불멸화 된 인간 GBM 세포주를 선택한다. 세포 수 (2 × 105)과 경험적으로 주입되는 현탁액의 부피 (3 μL)을 결정하고; 자세한 사항은 세포 유형에 따라 차이가 날 수 있습니다. 정확한 측정, 혼합 및 주입을 용이하게하기 위해 최소 50 μL의 볼륨을 사용합니다. </li><li> 미디어 또는 PBS의 세포에 resuspend을를 Trypsinize. 세포 주입 직전에 다음 단계를 수행 : <ol><li> 흡인 세포에서 용지를 제거하고 100mm 플레이트 당 10 ㎖의 PBS로 씻어; PBS를 제거합니다. </li><li> 광고각 100mm 플레이트 D 1 ml의 트립신 및 단일 세포 현탁액을 수득 단지 충분히 RT에서 배양한다. </li><li> 5 트립신의 활동을 중지 ML 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) + 10 % 100mm 플레이트 당 태아 혈청 (FBS). </li><li> 100mm 플레이트 당 ~ 5 ㎖의 무 혈청 DMEM (SF-DMEM)에서 450 XG에 원심 분리 및 재현 탁하여 펠렛 세포. </li><li> hemacytometer 또는 자동 셀 카운터를 사용하여 가능한 세포를 계산합니다. </li><li> 2 × 105 세포 / 3 μL로 살아있는 세포 밀도를 조절 (또는 실험에 의해 결정된 바와 같이) 세포 펠렛과 SF-DMEM에 재현 탁하여. </li></ol></li><li> 얼음 또는 차가운 팩 (세포가 동결 허용하지 않는)에 차게 세포를 보관하십시오. 손가락 긋기에 의해 부드럽게 섞는다. </li></ol> (4) 마취 및 수술을 위해 마우스를 준비합니다 <ol><li> 마취를 사용하여 ~ 5 % 이소 플루 란 (산소 흐름 ~ 2 L / 분) 또는 수의사의 지시에 따라을 유도한다. 유도는 2 분 3를 취해야한다. 적절한 깊이에 마우스를 유지~ 3 % 이소 플루 란으로 마취. <ol><li> 발가락 핀치에 의해 마취의 깊이를 확인 표시된 경우 이소 플루 란을 조정하고 절차를 통해 호흡과 발가락 핀치 반응을 모니터링하기 위해 계속합니다. 따뜻함 거즈 패드와 마우스를 커버 및 사출 속도에 따라 1 시간에 45 분 정도 걸릴 수 있습니다 절차 전반에 걸쳐 정기적으로 마우스를 모니터링 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 조심스럽게 혀를 통해 입으로 미각 줄을 밀어 고정대에서 마우스를 놓습니다. 치아에 구멍 앞니 후크. 가능한 한 수평 근처로 귀를 눈 표면, 머리를 안정시키기 위해 귀 막대를 사용합니다. 외이도에 막대를 강요하지 마십시오. 그것은 안전하게 머리를 배치하는 것이 중요합니다 : 손가락 끝으로 부드럽게 나란히과 상하 움직임을 확인합니다. 맞는 최적화 정위 장치의 조정 컨트롤을 사용합니다. </li><li> 안과 연고 눈을 윤활합니다. 두 번 포비돈 - iodin의 교류 응용 프로그램과 함께 눈과 귀 사이의 피부를 청소전자 방부제 및 70 %의 EtOH. </li><li> 측면에 선택 진통 피하 (SQ)를 주입 (또는 감독). </li></ol> (5) 주입을 수행 <ol><li> 주사 부위를 결정합니다. 주사 부위는 크기 및 마우스 균주 및 세포의 종류에 따라 달라질 수있다. 심실에 너무 가까이 주입 된 세포는 질병의 cranio - 척추 확산으로 이어질 수 있습니다. 너무 얕은 주입 된 세포는 바늘 트랙을 통해 성장할 수있다. NOTE : 여기에 도시 된 실험에서, 타겟은 대뇌 피질의 전두부로 정의 하였다 사이트는 2.5 mm (오른쪽), 1.5 mm의 전방 및 브레 그마에 대하여 3.5 mm 복부가 선택되었다 측 방향 (도 1), 제조 20-30g까지 마우스의 중뇌 종양. </li><li> 브레 그마 및 주사 부위를 노출 헤드의 피부를 통해 무균 기술을 사용하여 작은 절개 (~ 8mm 길이)을 확인. 정중선 축과 오른쪽 귀쪽으로 우안 (포인트 사이에서 대각선 잘라 <strong&gt;도 2) 브레 그마 및 주사 부위 모두에 액세스를 허용한다. </li><li> 피부를 후퇴와 두개골의 표면을 건조 멸균 면봉을 사용합니다. 브레 그마를 시각화 H 2 O 2에 적신 다른 면봉으로 뼈를시킨다. H 2 O 2는 브레 그마에서 교차 관상 및 시상 봉합을 따라 하얀 거품의 얇은 선을 떠나, 산소 거품을 생성합니다. </li><li> 마이크로 바늘에 빈 주사기를 잠그고 직접 브레 그마 위에 바늘의 선단을 기동; 세트는 0.0 mm 측면, 0.0 mm의 전방 / 후방 및 0.0 mm 복부 / 지느러미에 정렬 콘솔에서 조정합니다. </li><li> 정위 기기의 컨트롤 노브를 사용하여 2.5 mm 측면 (오른쪽)와 브레 그마 (또는 원하는 위치)에 대한 1.5 mm 전방에 바늘을 이동합니다. 약간 주사기를 올리고 전용 펠트 펜으로 두개골의 정확한 위치를 표시합니다. 두개골의 외부 표면은 브레 그마 (Ⅰ와 평면 레벨에 있지 않으면.전자., 지느러미 / 복부 좌표 더 이상 리셋)에 0이 표시 복부 / 지느러미 0.0에 읽는 주사의 깊이가 이동되지 않도록합니다. </li><li> 단계 5.5에서 펜으로 표시 해당 사이트에서 멸균 치과 팁이 장착 휴대용 회전 드릴로 두개골에 작은 구멍을 뚫는다. 두개골 각도로 드릴을 잡고 아주 부드럽게 뼈 끝을 터치합니다. 필요에 따라 반복합니다. 실제로 두개골의이 층을 관통하는 바늘을 떠나 뼈를 통해 거의가 아니라 완전히 드릴링, 깨끗한 주입의 결과. </li><li> PBS 또는 식염수에 적신 면봉으로 뼈 먼지를 제거합니다. 펌프에 주사기를 돌려과 위치를 확인하기 위해 아래로 똑바로 버 구멍에 바늘을 낮 춥니 다. 버 홀을 바늘로 중앙에 있지 않은 경우, 개구를 확대 된 드릴을 사용한다. </li><li> 부드럽게 세포 현탁액을 혼합하고 펌프 제어기를 사용하여 주사기로 세포를 그린다. 거품 덩어리를 피하고 바늘 재치를 닦아알코올 면봉 시간은 외부 표면에 오염 세포를 제거합니다. 주사기 / 바늘이 막히거나 동결하는 경우, 제거하고 멸균 70 % EtOH로 빠르게 청소. </li><li> 두개골 표면의 레벨까지 바늘 (0.0 mm 복부 / 지느러미)을 내린다. 그런 다음 천천히 이상 (약 1 분) 두개골의 전체 두께를 관통하고 4mm의 ventrall의 깊이로 뇌를 관통하는 바늘을 낮 춥니 다. 복부 3.5 mm 천천히 바늘을 철회. 마우스 헤드 정위 부에 고정 유지되는 경우, 두개골의 움직임이 거의 없어야한다. </li><li> 올바른 매개 변수가 펌프 컨트롤러에 입력되어 있는지 (2.2 절)을​​ 입력하고 Enter 키를 눌러 &quot;RUN / STOP&quot;을 확인 (또는 제품 설명서의 지시에 따라) 세포를 autoinject 할 수 있습니다. 마우스를 모니터하고 표시하는 경우 이소 플루 란을 조정합니다. 주사기를 보면서 플런저 배럴에 이동되어 있는지 확인합니다. 냉동 또는 막힌 운동은 굴곡 / 깨진 플런저가 발생할 수 있습니다. </li><li> B의 바늘로 2 분에 일을 기다립니다비는 매우 천천히 (3-4 분 이상) 조직에서 바늘을 철회. 주사가 완료된 후 바늘을 제거하는 전체 시간은 5 분이다. 버 구멍 주위를 지워하기 위해 면봉을 사용하여; 뼈가 건조 할 수 있도록 열려있는 피부의 가장자리를 둡니다. </li><li> 펌프에서 주사기를 제거하고 신속하게 70 % EtOH로, 멸균 H 2 O 3 배를 배를 세척, 멸균 H 2 O 3 배 (또는 메이커의 지시에 따라). EtOH로 바늘을 닦아 따로 설정합니다. </li><li> 버 구멍 (1 또는 2 μL에 해당) 멸균 뼈 왁스를 적용하고에 뼈에 왁스를 탐포하는 멸균 면봉의 나무 끝​​을 사용합니다. 표면을 충분히 건조 할 경우, 부착한다. </li><li> 마우스와 주변의 작업 영역을 통해 무균 드레이프 확산 절개 봉합; 세 바늘은 충분합니다. 다르게는, 수술 접착제가 사용될 수있다. 국소 항생제를 적용합니다. </li><li> 0 %로 이소 플루 란을 줄이고 C 인, 정위 장치에서 마우스를 제거치아를 보호하기 areful. 귀, 입과 혀를 확인합니다. </li><li> 밀접하게 주입 다음 마우스를 모니터링합니다. 5 분 ~ 10에 대한 열 패드의 장소 마우스; 다음 (열 패드) 케이지에 전송하고 마우스가 깨어 및 외래 될 때까지 관찰한다. 이 흉골로 누워을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 마우스를 방치하지 마십시오. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 마우스를 반환하지 않습니다. 통증의 징후가 발견 된 경우 추가 진통제의 사용을 고려한다. </li></ol> 6 마침 모니터 복구 및 종양 개발 <ol><li> 70 % EtOH로, 마우스 사이에 비드 소독 또는 살균 소독제를 사용하여 청소 모든 악기 및 장비. </li><li> 통증, 감염 또는 기타 합병증의 징후 시술 후 이틀 동안 주입 된 쥐를 모니터링합니다. 시술 후 24 및 48 시간 (또는 지시)에 진통제를 주사. 필요한 경우, 7~10일에 봉합사를 제거합니다. </li><li> 질병, paralysi의 임상 증상의 쥐를 평가S, 체중 감소, 발작, 또는 일반적 질병 활성을 감소시켰다. </li><li> [생체 이미징 시스템에서 자기 공명 영상 (MRI), (IVIS) 등] 적절한 방법으로 종양 발생을 모니터링합니다. </li></ol>

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</ol>

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인체 뇌암의 동 소성 마우스 모델은 임상 치료의 효과를 평가하기위한 훌륭한 도구 일 수 있지만, 뇌 조직에서 세포의 위치를​​ 최적화하기 위해 수행해야 상관있다. 연구는 과도한 나누어 볼륨, 최적 주입 기술과 성급한 사출 속도는 (종양의 크기 2 leakiness 바람직하지 않은 위치 (심실, 척추, 경막 지역, 등.)에서 종양 세포의 모양과 높은 변화에 개인 관측을 이끌 수 있다는 것을 보여 주었다 ). 비 세포 샘플의 마이크로 프로세서 기반의 배달의 분석은 마이크로의 사용이 더 focalized 배달, 적은 샘플 역류와 부드럽고 균일하게 전달하고 일관된 압력 3에 의한 주입 수동 방법보다 적은 변동성을 생산 것을 발견했다. 오직 2 또는 4 μL, 정위 악기와 배향 콘솔 당량의 사용 양에 필요한 세포의 수를 응축하기 어려울 수도 있지만비슷한 성장 속도와 재현성 및 신뢰성있는 종양을 생성 할 수있는 프로그램 가능한 마이크로 펌프 uipped. 이종 이식 모델은 진정한 특...

뇌 종양 세포의 시험 관내 (in vitro) 연구에서 성장, 생존, 마이그레이션 및 암 세포의 침입을 운전하는 분자 메커니즘을 해부 매우 귀중한 아르; 배양 세포 실험, 신호 전달 경로 정의 잠재적 인 치료 목표를 제시하고, 약물 치료에 대한 세포 반응의 특성을 수 있습니다. 그러나 체외에서 시스템은 의약품에 대한 유기체의 반응을 예측하기가 너무 단순하다; 그들은 생리적 반응, 면역 반응, 세포 미세 환경, 동물 시스템을 생활의 전반적인 이질성이 부족하다. 유전자 조작 모델은 헤아릴 때 사용할 수 있지만, 분자 적 차이는 임상 적 관찰 ​​(1) 동물 모델을 비교할 때 상당한 차이의 결과로, 인간 공정 이벤트 요점을 되풀이하지 않을 수 종 및 뮤린 세포간에 존재. 플랭크의 피부 아래 인간 뇌종양 세포주의 피하 (SQ) 주사를 포함하는 마우스 이종 이식 모델을 수행하기 쉽다및 측정; 그들은 유전자 변형 및 약물 투여 / 전달, 대사 및 독성 효과를 해결하기 위해 사용될 수있다. 중요한 단점은, 그러나, SQ 모델의 유용성을 제한한다. 미세 환경은 자연적으로 발생하는 뇌종양의 요점을 되풀이하지 않습니다 : 다양한 종류의 세포와 조직의 상호 작용을; 뇌 혈관계 고유 로컬 및 무수한 다른 요인은 복제 될 수 없다. 보다 정확하게 천연 뇌종양의 고유 적 환경을 재현하고 약학 개입의 영향을 시험하기 위해, 마우스 동 소성 모델이 이용되어야한다. 또한, 동 소성 기술은 유전자 종양 발생, 또는 인간 간질 세포없이 수정 및 마우스의 관련 사이트에 주입 인간 기본 비 - 암성 세포 (분화 또는 전구)하는 유전 공학적 접근 방법의 일부로서 사용될 수있다 유사한 인간 1에서 볼. 이 문서에서는방법은 정확하고 재현성 생쥐에서 뇌 종양을 만들 수 있습니다. 이 기술을 사용하여, 사용자가 정확히 마우스 대뇌 피질 fronto-두정 시간 영역의 지정된 위치에 현탁 세포의 작은 분취 액을 주입 할 수있다. 마우스의 사망률은 매우 낮습니다; 우리 손에 더 마우스는 185 절차 후 수술 합병증으로 사망 없다. 얻어진 종양의 특성은 전형적인 인간 임상 종양의 것과 비교 될 수있다; 예를 들어 : 성장, 괴사의 정도, 침해의 정도, 세포 유형, 유사 분열 세포의 존재 등의 증식과 세포 자멸사의 마커의 이질성의 인텔리 세포주 또는 세분화 된 인체 조직 또는 종양 샘플은 자신의 능력에 따라 평가 될 수있다 실제 임상 양상을 시뮬레이션합니다. 제약은, 세포 배양에서의 성능에 기초하여 선택, 대사 기능, 순환계 및 혈액 - 뇌 장벽의 문맥에서 시험 될 수 그들은 동물 부담 재치에 존재하는하 종양, 관련 건축 맥락에서 모든. 또한, 주입을 위해 선택된 세포 유전자, 종양의 성장 및 생존에 등 노크 인 돌연변이를 특정 knockdowns, 삭제의 영향을 조사하기 위해 수정 될 수있다. 출판물의 수가 두개 다양한 기술을 이용하여 종양 연구를 문서화. 야마다 등의 알. 염료 및 U87 세포의 주입의 상세한 연구를하고 양과 분사 율을 최소화하는 최적의 종양이 생산하였습니다. . 브룩스 등은 마이크로 프로세서 제어 인젝터보다는 바이러스 벡터를 제공하는 수동 방법을 사용하여 뛰어난 재현성과 효율성을 발견; 최적 주입 파라미터에 관한 그들의 결론 셀 전달 3에 적용 가능하다. Shankavaram 외는. 뇌로 CL의 유전자 발현 프로필을 효과적으로 요약 (수동 방법을 사용하여) 다형성 아교 모세포종 (GBM) 세포주 orthotopically 주입 것으로 보여inical 종양보다 더 가깝게하거나 또는 SQ 체외 이식편의 전임상 연구를 위해 두개 4 모델의 사용을 지원. 지아니니 외은. 추가 마우스의 뇌에 직렬 계대하여 누드 마우스의 옆구리에 유지되었던 사람 수술 표본에서 세포를 주입하고,이 방법은 모델 (5)에 환자의 종양 유전자 변형을 유지하는 것이 나타났다. 비슷한 결과는 이순신 외 (6)에 의해보고되었다. 정위 설치 신중 정의 주사 부위, 및 느린 상승과 분사량을 이용하여, 그들이 일관된 성장 속도 및 높은 (100 %) 생착 레이트로 재현 뇌종양 획득. 이 기술의 유효성 따라서 잘 설립되었습니다; 문헌 조사는이 기술의 응용 프로그램이 광범위 것이 좋습니다. 카티 등은. 성공적으로 transgeni의 전두엽 피질에 치료 유전자를 발현하는 바이러스 벡터를 제공하기 위해 두개 내 주사를 사용알츠하이머 병 (7)의 C 모델입니다. Thaci는 외. 이미 orthotopically 주입 GBM 종양 8 운반 누드 마우스에게 신경 줄기 세포 기반 치료 용 담체에 온 콜리 틱 아데노 바이러스를 제공하는 두개 내 주사의 사용을 설명했다. 분명히, 두개 내 주사는 임상 연구를위한 다양하고 효과적인 도구입니다. 가시화 실험의 저널 이전 출판물 근본적인 접근 방법 9-11을 설명하지만, 우리는 쉬운에 마스터 기술을 사용하여보다 높은 정밀도로 두개 내 종양 주입 및 소성을 모델링의 개념을 가지고.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console</td><td>Kopf</td><td>모델 940</td><td></td></tr><tr><td>마우스 가스 마취 헤드 홀더</td><td>Kopf</td><td>모델 923-B</td><td></td></tr><tr><td>마우스 이어 바</td><td>Kopf</td><td>Medel 922</td><td></td></tr><tr><td>광섬유 조명기</td><td>Fisher</td><td>12-562-36</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump III</td><td>WPI</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Micro4 마이크로프로세서</td><td>WPI</td><td>UMC4</td><td></td></tr><tr><td>가변 속도 휴대용 로터리 드릴</td><td>Dremel</td><td>모델 300</td><td></td></tr><tr><td>치과 드릴 비트, 1.0mm</td> 치과 드릴 비트용 <td>Spoelting</td><td>514554</td><td></td></tr><tr><td>어댑터: 3/32인치 콜릿</td><td>Dremel</td><td>481</td><td></td></tr><tr>마우스용<td>가열 패드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>이<td>소플루란 기화기를</td> 위한 <td>마우스용</td>의료 튜브 및 커넥터를 입체성 프레임과 연결하는 이소플루란 기화기 시스템<td></td><td></td></tr><td colspan="4">Instruments<tr><td></td><td></td>Precision 25 &mu;<td></td><td></td></tr><tr></td></tr><tr><td> l 마이크로 주사기</td><td>해밀턴&nbsp;</td><td>7636-01</td><td>모델 702, 바늘</td></tr><tr><td>없는 마이크로주사기 바늘, 26s G</td><td>해밀턴&nbsp;</td><td>7804-04</td><td>RN, 25mm 포인트 스타일 2</td></tr><tr><td>파인 팁 가위 (스트레이트, 샤프 / 샤프)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>중형 표준 가위</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>표준 톱니 겸</td><td></td><td></td><td></td></tr>자 <tr><td>톱니 지혈 (2)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>파인 팁 집</td><td></td><td></td><td></td>게</tr> <tr>< colspan = "4">Supplies</td></tr><tr><td>Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon)</td><td>MWI</td><td>J463G</td><td></td></tr><tr><td>수술용 칼날 #10, 스테인리스 (깃털)</td><td>Fisher</td><td>296#10</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane (Fluriso)&nbsp;</td><td>베트원&nbsp;</td><td>NDC 13985-528-60</td><td>항목 #502017. 액체 흡입 마취제. 연방법은 이 약물을 면허가 있는 수의사가 사용하거나 수의사의 지시에 따라 사용하도록 제한합니다.</td></tr><tr><td>Carprofen (Rimadyl Injectable 50 mg/ml)</td><td>Pfizer</td><td>NDC 61106-8507-01</td><td>식염수에 희석</td></tr><tr><td>안과 연고 (인공 눈물)</td><td>Rugby</td><td>NDC 0536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>국소 항생제 (AK-Poly-Bac)</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-238-35</td><td></td></tr><tr><td>포비돈 요오드 국소 소독제, 10% (베타딘)</td><td>Betadine</td><td>NDC 67618-150-04</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소, 30%</td><td>어부&nbsp;</td><td>두개골 랜드마크 시각화를 위한</td> <td>H325-100</td></tr><tr><td>멸균 식염수</td><td>VetOne&nbsp; &nbsp;</td><td>NDC 13985-807-25</td><td>희석 용액, 청소 조직</td></tr><tr><td>뼈 왁스</td><td>WPI</td><td>항목 #501771</td><td></td></tr><tr><td>멸균 드레이프</td><td>McKesson</td><td>25-517</td><td></td></tr><tr><td>멸균 수술용 장갑</td><td>McKesson</td><td>(적합)</td><td></td></tr><tr><td>멸균 거즈 패드, 2 x 2</td><td>Fisherbrand&nbsp;</td><td></td><td></td>22028556</tr><tr><td>멸균 거즈 패드, 4 x 4</td><td>Fisherbrand&nbsp;</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>알코올 준비 패드 (중간)</td><td>PDI</td><td>B603</td><td></td></tr><tr><td>멸균 면 팁 애플리케이터</td><td>Fisherbrand&nbsp;</td><td>23-400-114</td><td></td></tr><tr><td>멸균 0.5 ml 스크류 캡 튜브와 셀용</td><td>USA Scientific</td><td>1405-4700</td><td>셀용</td></tr><tr><td>개별 포장된 멸균 디스포 피펫</td><td>Fisher</td><td>BD 357575</td><td>바늘 청소 솔루션</td></tr><tr><td>BD 인슐린 주사기와 바늘&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>329461</td><td>진통제</td></tr><tr><td>70% 세척용 에탄올</td><td></td><td></td><td>세척용</td></tr><tr><td>멸균 diH2O</td><td></td><td></td><td>세척</td></tr>용 <tr><td>마이크로퓨지 튜브 세척 용액 세척 용액</td><td></td><td></td><td></td></tr> 두<tr><td>개골 표시용</td> <td>펠트 팁 펜(전용)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

만들기 해부학 적으로 정확하고 인간의 두뇌 종양의 재현 두개 내 이종 이식

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

특히 뇌 독특한 생리 학적 및 건축 자질을 가진 사이트에서 시험관과 자궁외 모델은 할 수 없습니다 - 정위 종양 모델은 살아있는 동물의 맥락에서, 현재에 개입하지 않고, 종양 유형의 특성을 연구하는 가장 좋은 방법입니다. 이러한 혈관, 혈액 뇌 장벽, 대사, 약물 전달 및 독성 및 다른 관련 요소의 호스트로서 기능을 차지한다. 동 소성 모델도 자신의 한계를 가지고 있지만, 관심의 적절한 기술 종양 세포가 정확하게 조직으로 접목 할 수와 함께 그 사람의 뇌에서 가장 밀접하게 모방 조건. 정확하게 재현성 생성 될 수 일관된 속도 및 압력 예측 성장률 인간 뇌 종양 마우스 모델에서의 위치를​​ 정의하기 위해 정밀하게 측정 된 볼륨을 제공하며 다양한 중재 신뢰성 분석에 적합한 방법을 사용함으로써. 여기에 설명 된 프로토콜은 TE에 집중chnical 성공 재현 종양의 성장을 설계 및 두개 내 주입을 준비하고, 수술을 수행하고, 보장의 내용과는 다른 뇌종양 모델의 범위를 사용자 정의 할 수있는 다양한 조건 포인트를 시작 제공합니다.

신뢰할 수있는 두개 내 이종 이식이 설명 된 기술로 만들 수 있습니다. 마우스 두개골의 중요한 구조 (그림 1) 식별 브레 그마의 인식을 허용하고 정확하고 재현성 주입 위치에 수사관을 안내합니다. 이러한 연구에서 U251 부모 행은, 루시퍼 라제 (U251 뤽) 또는 U87 형질 U251 세포는 인간 GBM 조직 배양 세포는 SF-DMEM 4-6 μL에 현탁 불멸화 및 2.5 mm (오른쪽) 측면, 1.5 mm 전방 주입 , 그리고 브레 그마에 대해 3.5 mm 복부 (그림 2). 얻어진 종양 시각화 및 자기 공명 영상 (MRI,도 3), 생체 내 형광 영상 (IVIS,도 4), 또는 루틴 병리학 적 기법 (H &amp; E 염색,도 5)에 의해 분석 될 수있다. 특별한주의를 기울여야합니다 및 최적화는 appr...

뇌는 잘 시험관이나 자궁외 분석으로 표시되지 않은 자질을 가진 유일한 사이트입니다. 위치 재현성과 성장 특성 정위 마우스 모델을 확실 정위 고정기구 및 저압 주사기 펌프를 사용하여 두개 내 주사로 생성 될 수있다.

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

이 절차의 전반적인 목표는 새로운 치료 전략의 정확한 테스트 및 비교에 사용할 수 있는 일관되고 재현 가능한 인간 뇌종양 모델을 만드는 것입니다. 이것은 동물이 수술을 받을 수 있도록 준비하고 주사를 맞을 올바른 위치를 찾음으로써 이루어집니다. 일단 찾으면 두개골에 구멍을 뚫고 주사기를 적절한 깊이로 내립니다.종양 성장을 얻기 위해 세포를 천천히 조절된 방식으로 주입한 다음 바늘을 지연시키고 점진적으로 빼냅니다. 궁극적으로, 조직병리학적으로 인간의 상태와 유사한 종양 성장을 가진 일관된 마우스 모델을 개발할 수 있으며, Lucci 기반 생체 내 이미징으로 성장 속도를 측정할 수 있습니다. 이 기술의 정확성은 인간 뇌종양에 대한 새로운 치료 전략을 이해하는 데 매우 중요합니다.종양 주사의 다양한 국소화는 미세 환경, 약물 전달 또는 뇌의 다른 영역에 따라 크게 다른 다른 것들로 인한 종양 성장의 변화로 이어질 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 마우스 위치 지정 및 주입 부위 위치 파악과 관련된 단계에서 서면 또는 그래픽 형식으로 쉽게 설명할 수 없는 3차원 조작이 필요하기 때문에 중요합니다. 먼저 마우스 입체 안경테와 수술에 필요한 기타 모든 장비를 청소하고 오염을 제거합니다.선택한 모델, 프로그램, 주입 매개 변수 및 주사기 펌프의 작동을위한 기타 변수에 최적화 된 설정을 사용합니다. 다음으로, 작업 영역에 오토클레이브 수술 도구를 배치하고 직렬 절차를 위해 최소 2개의 1.0mm 치과용 드릴 비트를 포함합니다. 70% 에탄올로 수술 기구를 소독한 다음 각 동물 사이에 비드 살균기로 30초 동안 또는 IACUC 프로토콜의 조언에 따라 소독합니다.마지막으로, 필요한 모든 의료 용품과 일회용 재료를 함께 모으십시오 두개골을 표시하기 위한 미세한 팁, 영구 마커는 오염을 제거하고 수술용으로 전용해야 합니다. 트립신 리서스 후, PBS에 세포를 현탁시키고 원심분리 Resus에 의해 펠릿화합니다. 100mm 플레이트당 약 5ml의 무혈청 dmem에 세포를 현탁시킵니다.다음으로, 혈구, 세포 분석기 또는 자동화된 세포 계수기를 사용하여 생존 가능한 세포를 계수합니다. 계수 후 세포를 펠릿화하고 SF DMM을 현탁하여 살아있는 세포 밀도를 조정합니다. 세포를 얼음이나 냉각 팩에 넣어 차갑게 유지하되 세포가 얼지 않도록 하십시오.손가락으로 가볍게 튕겨 동물 마취제를 유도하고 쓰기, 반사 또는 활동 부족을 확인하여 동물이 적절하게 진정되었는지 확인합니다. 마취가 끝나면 거즈 패드로 마우스를 덮어 따뜻하게 하고 절차 전반에 걸쳐 동물을 정기적으로 모니터링합니다. 다음으로, 입체식 프레임에 마우스를 놓습니다.팔레트 바와 이어 바를 사용하여 귀와 눈 표면이 가능한 한 수평을 유지하도록 하십시오. 마지막으로 안과 연고로 눈을 윤활하고 포비돈, 요오드 소독제, 70% 에탄올을 번갈아 가며 귀와 눈 사이의 피부를 두 번 닦습니다. 진통제를 피하로 주입한 후 발가락 핀치 반사를 확인하여 동물이 완전히 마취되었는지 확인합니다.피부 절개 직전에 BMA와 주사 부위가 노출되도록 작게 절개합니다. 정중선 축과 오른쪽 눈 사이의 지점에서 오른쪽 귀를 향하는 대각선 절단은 bgma와 주사 부위 모두에 축을 허용합니다. 피부를 수축시키고 멸균 면봉을 사용하여 두개골 표면을 건조시킵니다.과산화수소를 적신 다른 면봉으로 뼈를 닦아냅니다. bgma를 시각화하려면 바늘이 달린 빈 주사기를 마이크로 펌프에 잠그고 팁을 bgma 바로 위로 움직입니다. 선형 콘솔의 좌표를 0으로 설정합니다.바늘을 옆으로 2.5mm, 앞쪽으로 1.5mm로 움직입니다. 토레마. 입체식 장치의 제어 손잡이를 사용하여 주사기를 약간 올리고 전용 펠트 팁으로 두개골의 정확한 위치를 표시합니다. 펜. 두개골의 외부 표면이 더 이상 등쪽 평면에서 bgma와 수평이 아닌 경우 등쪽 복부 판독값을 0으로 재설정하여 주입 깊이가 올바른지 확인합니다.멸균 치과 팁이 장착된 휴대용 회전식 드릴로 두개골에 작은 구멍을 뚫습니다. 드릴을 두개골에 비스듬히 대고 끝을 뼈에 아주 부드럽게 만집니다. 뼈를 완전히 뚫지 마십시오.외상이 가장 적은 가장 깨끗한 주사를 얻습니다. 세포 주입 시 주사기 바늘로 두개골을 뚫었을 때는 PBS나 식염수를 적신 면봉으로 뼛가루를 제거합니다. 주사기를 펌프에 다시 넣고 바늘을 버 구멍까지 똑바로 내립니다.위치를 확인하려면 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하고 세포를 주사기로 끌어당깁니다. 펌프 컨트롤러를 사용하여 거품과 덩어리를 피하고 알코올 면봉으로 바늘을 닦습니다. 외부 표면의 오염 세포를 제거하려면 바늘을 두개골 표면 높이로 내립니다.그런 다음 바늘을 천천히 내립니다. 두개골의 전체 두께를 뚫고 1분 동안 복부 4mm 깊이까지 뇌를 관통한 후 바늘을 복부 3.5mm까지 천천히 빼내고 펌프 컨트롤러에 올바른 매개변수가 입력되었는지 확인하고 실행을 누릅니다. 멈추다. 세포를 자동 주입하려면 주사기를 관찰하고 플런저가 배럴 안으로 움직이고 있는지 확인하십시오.조직에서 바늘을 아주 천천히 빼내기 전에 1-2분 동안 바늘을 제자리에 두십시오. 바늘은 5분에 걸쳐 제거해야 합니다. 면봉을 사용하여 가시 구멍 주변을 닦아내고 뼈가 건조될 수 있도록 피부 가장자리를 열어 둡니다.펌프에서 주사기를 제거하고 멸균수와 에탄올로 빠르게 교체합니다. 다음으로, 멸균 뼈 왁스를 버 구멍에 바르고 멸균 면봉의 나무 끝을 사용하여 왁스를 뼈 위와 뼈 속으로 밟습니다. 표면이 적절하게 건조되면 상처를 봉합한 후 불소를 0%로 줄이고 입체 장치에서 마우스를 제거해야 합니다.동물을 가열된 표면에 놓고 완전히 회복될 때까지 관찰하십시오. 70% 에탄올과 비드 살균기를 사용하여 모든 기구와 장비를 청소하거나 각 동물 사이를 소독하는 것이 중요합니다. 주사된 마우스는 시술 후 2일 동안 통증, 감염 또는 기타 합병증의 징후가 있는지 모니터링해야 합니다.원하는 시간에 질병 마비, 활동 감소, 체중 감소, 발작 또는 일반적인 질병의 임상 징후에 대해 마우스를 평가합니다. 주사 후 자기 공명 영상 또는 생체 내 이미징 시스템으로 종양 발달을 모니터링합니다. 이 MRIT 2개의 가중 이미지는 U 87 세포에서 유래한 종양과 U2 51 세포에서 유래한 종양을 비교합니다.시간 경과에 따라 플롯된 종양 부피는 모든 실험에서 일관된 종양 발달 및 성장의 재현 가능한 창을 보여줍니다. 누드 마우스에 두개내 주입된 U2 51 루시퍼 형질도입 교모세포종 세포의 IVIS 이미지는 왼쪽의 마우스가 성공적으로 주입되었음을 보여주고 원하는 위치에서 매우 강한 발성 신호를 보여줍니다. 오른쪽의 마우스는 부적절한 사출 주입 위치 또는 기술로 인한 실패한 결과를 보여줍니다.종양 크기는 관심 뇌 영역의 루시퍼 활동에서 추정되고 시간 경과에 따라 플롯됩니다. 파란색 선은 두개내 주사에 성공한 마우스에 해당하고, 빨간색 선은 H와 E 염색 후 척추에 종양 세포가 변위된 마우스에 해당하며, U에서 종양을 염색한 87 GBM 세포는 악성 세포의 미세한 침입으로 종양이 밀집된 영역과 인접한 정상 뇌 조직을 보여줍니다. U2 51 GBM 세포에서 유래한 종양 중심의 이 부분은 전형적인 인간 교모세포종에서 볼 수 있는 다핵 악성 세포와 함께 기괴한 조직병리학을 매우 밀접하게 복제합니다.이 절차를 시도할 때 종양 모델 재현성은 마우스 머리의 정확하고 안전한 위치와 주사 부위의 일관된 위치 파악에 달려 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 또한 점진적인 속도와 일정한 사출 압력이 필수적입니다. 이 기술을 통해 신경 종양학 분야의 연구자들은 뇌종양 세포 주입의 부정확한 국소화로 인해 발생하는 변동성을 일부 제거하는 동시에 인간 뇌종양에 대한 새로운 치료 전략을 모색할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

루시페라제 - 수정된 인간의 뇌 종양의 xenografts은 종양 성장과 bioluminescence 이미징을 사용하여 치료에 대한 응답의 후속 모니터링과 athymic 생쥐에 intracranially 설정할 수 있습니다. 생존 분석과 함께, bioluminescence 모니터링 뇌 종양 치료를위한 고려되는 요법의 사전 임상 시험을위한 필수적인 연구 도구입니다.

Bioluminescence 이미징을 사용하여 종양 성장과 치료에 반응 이후 분석 Intracranial 뇌종양의 Xenografts 구축

glioma의 치료에 새로운 치료 패러다임을 평가하기 위해, 생리 관련 모델은 필수적입니다. 우리는 stereotactic 접근 방식보다 더 빠르고 안전 intracranial 이종 이식 모델의 설립을위한 implantable 가이드 스크류 절차를 사용합니다.

마우스에 Intracranial 이종 이식 연구에 대한 간단한 안내 스크류 방법

우리는 누드 마우스 및 이후 일련의 뇌에 인간 glioblastoma multiforme의 세포의 정확한, stereotactic 주입을위한 통합 방법을...

Stereotactic Intracranial 주입 및<em&gt; 생체에</emGlioblastoma의 Multiforme의 마우스 모델 시스템에서 종양 Xenografts의&gt; 발광 생물 이미징

악성 글리오마스는 뚜렷한 임상 및 분자 특징을 가진 고도로 침입된 신경교 신생물의 이질적인 그룹을 구성합니다. 1 차 성 치열 교정 이종이식은 전임상 동물 모델에서 악성 신경종 아류형의 조직 병리학 및 분자 특징을 재구성합니다.

1차 성우 성안 성액 제노이식은 침투 성장을 재구성하고 탈수소 효소 I 돌연변이를 이소염시분해합니다.

우리는 종양의 성장하는 동안 재생에 일반적으로 생물 물리학 적 제약 조건을 되풀이되었습니다의 intravital 두 광자 현미경을위한 마우스에서 대뇌 피질의 소성을 glioblastoma의 모델을 설립했다. 종양 위의 두개골을 대체 만성 유리 창에는 두 개의 광자 현미경에 의해 시간이 지남에 따라 종양의 진행을 추적 할 수 있습니다.

소성을 Glioblastoma의 마우스 모델은 뇌 실질 물리적 제약 조건을 유지하고의 intravital 두 광자 현미경에 적합

플록스, 조건부 발암성 대립유전자로 조작되고 바이러스 Cre 매개 재조합을 통해 형질전환된 마우스에서 채취한 표현형 야생형 성상세포와 신경 줄기세포는 syngeneic, immune-competent littermate의 뇌에 형질전환된 세포의 orthotopic 주입에 의해 in vitro 및 in vivo에서 성상세포종 발병기전을 모델링하는 데 사용할 수 있습니다.

모델링 성상 세포종 병인 체외와 생체 대뇌 피질의 성상이나 조건, 유전자 조작 쥐에서 신경 줄기 세포를 사용하여

줄기 세포는 내재 된 종양 향성으로 인해 뇌종양 치료제로서 유망한 치료제입니다. 비 침습적 비강 내 줄기 세포 전달은 혈액 뇌 장벽을 우회하여 임상 번역의 가능성을 보여줍니다. 이 기사는 신경 교종 마우스 모델에서 비강 줄기 세포 전달의 기본 원리를 요약합니다.

마우스 모델에서 아교 모세포종에 치료 용 줄기 세포 비강 전달

여기, 선물이 orthotopic 인간의 기본 뇌 종양을 들고 immunodeficient 마우스에 준비 및 수용자 인간 림프 톨의 stereotaxic 관리에 대 한 프로토콜. 이 연구는 타당성과 세포 immunotherapies intrabrain 전달의 antitumor 효능에 대 한-의 증거-개념을 제공합니다.

정위 적 입양 전송 Orthotopic 인간 세포종 님 Xenografts Murine 모델에서 세포 독성 면역 세포의

여기에서 우리는 유전자 조작 마우스 모델 종양에서 파생된 세포의 두개내 주입에 의해 확립된 GBM에 대한 전임상 동소 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델은 인간 GBM의 질병 특징을 표시합니다. 중개 연구를 위해 마우스 뇌종양은 생체 내 MRI 및 조직병리학에 의해 추적됩니다.

다형성 교모세포종의 번역 동소 모델

정형소 소아 뇌종양 모델의 개발에는 암세포를 정밀하게 이식하기 위해 입체 장치를 사용하는 세심한 정밀도가 필요합니다. 여기에 제시된 방법론은 뇌종양 세포를 준비하고, 두개내 주사를 수행하고, 뇌종양 생착을 평가하기 위한 수술 후 모니터링 시스템을 구현하는 것과 관련된 단계를 간략하게 설명합니다.

Stereotaxic Device를 이용한 뇌종양에 대한 Orthotopic Patient-derived Xenograft Models 구축

이 프로토콜의 목표는 연구자들에게 두개내 이식에 대한 고재현 기술을 제공하는 것입니다.

쥐에서 교모세포종 환자 유래 이종이식 세포주의 입체정위 두개내 이식

학습하세요 정밀한 두개 내 이종 이식 기법을 통해 생쥐에 인간 뇌종양 모델을 구축하는 방법을. 이 기법은 신경종양학 연구에서 새로운 치료 전략을 정확하게 테스트하고 종양 성장률을 측정하는 데 필수적인 도구를 제공합니다.

만들기 해부학 적으로 정확하고 인간의 두뇌 종양의 재현 두개 내 이종 이식

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