Name: 마우스 부신하는 chromaffin 세포에서 세포 부착 된 정전 용량 측정을위한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 배우세요 마우스 부신 chromaffin 세포에서 patch clamping을 이용한 세포 부착 정전 용량 측정법으로 단일 소포의 exocytosis와 endocytosis를 실시간 관찰하는 방법을 통해 신경전달 메커니즘을 심층 연구하세요.

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주 : 시카고 일리노이 대학의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 전체 절차는 국립 보건원 (NIH)의 지침에 따라 실시 하였다. 1 솔루션 및 문화 미디어 준비 <ol><li> 최대 6 개월 -20 ° C에서 모든 솔루션을 유지합니다. 최대 3 개월 동안 4 ° C에서 배양 배지를 보관하십시오. </li><li> DMEM 100 ml의 ITSX (인슐린 트랜스페린 - 셀레늄 보충제)의 한 펜 연쇄상 구균의 수용액 1 ml에 혼합하여 배양 배지 100 ㎖를 준비합니다. </li><li> DMEM 250 ㎖, 100 MM의 염화칼슘이 2.5 ml의 50 mM의 EDTA의 2.5 ML을 혼합하여 효소 솔루션을 준비합니다. </li><li> DMEM의 225 ML, FBS의 25 ML, 알부민 625 ㎎, 625 mg을 트립신 억제제를 혼합하여 불 활성화 솔루션을 준비합니다. </li><li> 154 밀리미터의 NaCl, 5.6 밀리미터의 KCl, 5.0 mM의 HEPES, 3.6 mM의 NaHCO3를, 5.6 mM의 포도당의 로크의 솔루션을 준비합니다. NaOH로 7.3로 pH를 조정합니다. </li><li>50 ㎎ / ㎖의 폴리-D-라이신 (PDL) 솔루션을 준비합니다. 코트 커버 슬립을 1 ㎎ / ㎖의 최종 농도를 사용한다. </li><li> 140 mM의 NaCl을, 5 밀리미터의 KCl, 2 mM의 염화칼슘 2, 1 mM의 MgCl2를, 10 mM의 HEPES-NaOH를, 10 mM의 포도당의 세포 외 용액을 준비합니다. ~ 310 nmol의 / kg의 삼투압과 NaOH로 7.3로 pH를 조정합니다. </li><li> 50 mM의 NaCl을, 100 mM의 TEACl, 5 밀리미터의 KCl, 2 mM의 염화칼슘 2, 1 mM의 MgCl2를, 10 mM의 HEPES의 피펫 솔루션을 준비합니다. ~ 290 nmol의 / kg의 삼투압과 NaOH로 7.3으로 산도를 조정합니다. </li></ol> 2 부신 격리 <ol><li> 크고 작은 해부 가위와 집게 이쌍 한 쌍의 압력솥. 전체 과정 동안 장갑을 착용하고 얼음 양동이에 해부 트레이를 배치합니다. </li><li> 주 0-3 일에 찍은 마우스를 사용합니다. 잘린 다음에 가압 CO 2 탱크와 동물을 안락사. </li><li> cervi에서 척추 다음 강아지의 뒷면을 줄이기 위해 위의 작은 세트를 활용<html> 칼은 지역을 꼬리 지느러미합니다. 피부 아래 표면적으로 잘라 체강 내에 뚫지해야합니다. </li><li> 다음으로, 멀리 척추에서 껍질 피부가 근육은 척추의 명확한 전망이 노출되도록. 여기에서 자궁 경부 척수에서 transectional 컷을 한 후 척추의 측면을 따라 두 개의 평행 한 컷을합니다. </li><li> 동물의 본체를 들고 집게 일쌍으로 척추를 잡아 신장이 노출 될 때까지 척추를 벗겨 집게의 다른 쌍을 사용합니다. </li><li> 이 때, 신장의 위쪽에있는 부신을 시각화. 그런 다음 조심스럽게 로크의 솔루션으로 가득 원뿔 튜브에 각 동물에서이 샘을 배치합니다. 참고 : 때때로 땀샘은 집게에 충실 할 것이다. 이 경우, 부드럽게 집게로부터 로크의 용액에 땀샘의 제거에 도움이 다른 한 쌍의 집게를 사용한다. 땀샘 2 시간까지이 상태에서 유지 될 수있다. </li></ol>전자 &quot;&gt; 3. 조직 소화 <ol><li> 한편, 거품을 15 분 동안 5 % CO 2 + 95 % O 2 효소액 사용 전에. 평형 솔루션은 분홍빛 / 오렌지 색상에 밝은 핑크 색상에서 켜지는지 확인합니다. </li><li> 2,025 단위 / ㎖의 최종 농도 갓 버블 효소액 파파인 추가. 파파인으로 효소 용액에 37 ° C에서 40 ~ 60 분 동안 각 동물에서 동맥의 각 쌍을 품어. </li><li> 각 튜브에 불 활성화 솔루션의 75 %를 추가하고 또 다른 10 분 동안 37 ° C에서 배양. 이 배양은 파파인 효소의 활성을 불 활성화. </li><li> 불 활성화 용액으로 10 분 배양 후, 부드럽게 새로 레이블 튜브로 땀샘을 전송 한 후 샘은 문화 미디어 3 배 씻는다. </li></ol> 4 셀 해리와 도금 <ol><li> 세안 후, 배양 배지의 200 μL에이 글 랜드 위치하게 한 후, 부드럽게 분비를 적정하고다운 200 μL 피펫 피펫 팁을 통해 더 이상 용액 조직의 큰 조각이 없을 때까지. NOTE : 적정하면, 200 μL 피펫 팁으로부터 하방으로의 힘으로 튜브의 하단에 분비를 유지 조심스럽게 천천히 결합 조직. 느린 연속 스트로크를 사용하여 특정 수는 결코 빠르거나 갑작스러운 피펫 없습니다. </li><li> 450 μL까지 배양 배지의 전체 볼륨을 가지고 추가로 250 ㎕의 문화 매체를 추가합니다. </li><li> 플레이트 60 X 15mm 배양 접시에 배치 일곱 12mm PDL 미리 코팅 된 커버, 각각에이 세포 함유 용액의 60 μL. </li><li> 일단 도금, 세포 생존을위한 환경을 보장하기 위해 30 분 동안 5 % CO 2의 꾸준한 흐름 / 공급 37 ° C로 설정되고 유지되는 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 배양 후, 부드럽게 배양 접시에 미리 예열 문화 매체의 5 mL를 넣고 24 시간 동안 인큐베이터에 다시 접시를 반환 세포 무관 이전D 녹음. 주 : 일반적으로, 세포가 최대 4 일 동안 전기 생리 레코딩에 사용될 수있다. </li></ol> (5) 셀 식별 및 기가 옴 인감 형성 <ol><li> 세포 외 용액에 12mm coverslip에 놓습니다. 전체 부신 셀 제조에 사용되기 때문에, 대뇌 피질의 세포 (작고) 셀을하는 chromaffin보다 디머와 문화에하는 chromaffin 세포 (갈색 / 베이지 색상과 완벽에 가까운 원형 형태로 일반적으로 매우 밝은 (그림 1)을 섞는다. </li><li> 프로그램 P-97 풀러를 사용하여 네 단계의 패치 피펫을 당깁니다. 다음 유리의 용량을 줄이고 데 도움이됩니다 녹은 왁스로 피펫 팁을 찍어은 피펫 팁의 안쪽에서 끝이 &quot;불어 멀리&quot;하는 폴란드어이 왁스를 발생. 참고 : 패치 피펫 솔루션 가득 할 때, 패치 피펫은 일반적으로 1 ~ 2 MΩ의 저항이있다. </li><li> 몇 m 내에서 세포에 가까운 패치 피펫 접근icrons. 세포 부착 된 구성을 달성하기 위해, 셀에 가까운 패치 피펫의 접근 중에 약간 변형 셀을 찾는다. GΩ 시일이 달성 될 때까지 부드러운 흡입을 적용합니다. </li></ol> 6 셀 첨부 용량 녹음 <ol><li> GΩ 시일이 계시되면 EPC-7 플러스 패치 - 클램프 증폭기의 사용을 통해 세포 부착을 녹음하고 두 상 아날로그 락 - 인 증폭기 (장비 첨부 표 참조). 잠금 증폭기에서 50 MV (RMS)의 진폭과 주파수 20kHz의 사인파를 적용합니다. </li><li> 1 밀리 초 시정 및 24dB의 종속 증폭기의 출력 필터를 설정합니다. 잠금 증폭기와 같은 부드러운 흡입 펄스에 의해 생성 된 일시적인 정전 용량 변경 사항은 패치 전도도 (재) 추적에 투영법으로 패치 용량 (임) 추적에서 나타나는 (그림 2)의 위상을 설정합니다. 참고 : 재에서 시스템의 교정에 대한 세부 정보를 참조하십시오(19) 전파 방해. </li><li> &quot;아래로&quot;단계 (그림 3)에 의해 일반적인 정전 용량의 변화를 확인합니다. 참고 : 고체 기록이 하나의 소포를 내면화 나타냅니다 많은 아래 단계를 &quot;계단&quot;형 닮은으로 볼 수 있습니다. 패치 프로세스는 동작 전류는 일반적으로 대부분의 세포에서 기록 될 수 있기 때문에 기계적 자극의 역할을한다. </li><li> 해당 파일 내에서 mm / 일 / 년 및 자신의 개인 번호 (XX) 등의 각 셀에 연결된 기록 : 개별 날짜 등의 폴더로 파일의 이름을 지정합니다. </li></ol>

<ol><li>Rettig, J., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+presynaptic+proteins+in+Ca%2B%2B-triggered+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of presynaptic proteins in Ca++-triggered exocytosis.</a> Science. 298, 781-785 (2002).</li>
<li>Gong, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+phosphate+kinase+type+I+gamma+regulates+dynamics+of+large+dense-core+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol phosphate kinase type I gamma regulates dynamics of large dense-core vesicle fusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5204-5209 (2005).</li>
<li>Lindau, M., Alvarez de Toledo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fusion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The fusion pore.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1641, 167-173 (2003).</li>
<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389, 509-512 (1997).</li>
<li>Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitance+flickers+and+pseudoflickers+of+small+granules%2C+measured+in+the+cell-attached+configuration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Capacitance flickers and pseudoflickers of small granules, measured in the cell-attached configuration.</a> Biophys J. 75, 53-59 (1998).</li>
<li>Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+fusion+pore+of+small+granules+has+a+conductance+similar+to+an+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The exocytotic fusion pore of small granules has a conductance similar to an ion channel.</a> The Journal of cell biology. 129, 99-104 (1995).</li>
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<li>Gong, L. W., de Toledo, G. A., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytotic+catecholamine+release+is+not+associated+with+cation+flux+through+channels+in+the+vesicle+membrane+but+Na%2B+influx+through+the+fusion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exocytotic catecholamine release is not associated with cation flux through channels in the vesicle membrane but Na+ influx through the fusion pore.</a> Nature Cell Biology. 9, 915-922 (2007).</li>
<li>Gong, L. W., Hafez, I., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+vesicles+membrane+area+is+regulated+in+tandem+with+quantal+size+in+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Secretory vesicles membrane area is regulated in tandem with quantal size in chromaffin cells.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 23, 7917-7921 (2003).</li>
<li>Yao, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+does+not+provide+direct+mechanical+forces+for+vesicle+fission+during+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization does not provide direct mechanical forces for vesicle fission during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 33, 15793-15798 (2013).</li>
<li>Yao, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+1+is+necessary+for+the+Ca2%2B+dependence+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin 1 is necessary for the Ca2+ dependence of clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 3778-3785 (2012).</li>
<li>McMahon, H. T., Boucrot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+and+physiological+functions+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 12, 517-533 (2011).</li>
<li>Murthy, V. N., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+the+presynaptic+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cell biology of the presynaptic terminal.</a> Annu Rev Neurosci. 26, 701-728 (2003).</li>
<li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51, 773-786 (2006).</li>
<li>Rosenboom, H., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exo-endocytosis+and+closing+of+the+fission+pore+during+endocytosis+in+single+pituitary+nerve+terminals+internally+perfused+with+high+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Exo-endocytosis and closing of the fission pore during endocytosis in single pituitary nerve terminals internally perfused with high calcium concentrations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 5267-5271 (1994).</li>
<li>MacDonald, P. E., Eliasson, L., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+increases+endocytotic+vesicle+size+and+accelerates+membrane+fission+in+insulin-secreting+INS-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Calcium increases endocytotic vesicle size and accelerates membrane fission in insulin-secreting INS-1 cells.</a> Journal of Cell Science. 118, 5911-5920 (2005).</li>
<li>Zhao, Y., Fang, Q., Straub, S. G., Lindau, M., Sharp, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+inhibition+of+endocytosis%3A+novel+roles+for+noradrenaline+and+G+protein+G%28z%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hormonal inhibition of endocytosis: novel roles for noradrenaline and G protein G(z).</a> J Physiol. 588, 3499-3509 (2010).</li>
<li>Debus, K., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+patch+capacitance+recordings+and+of+fusion+pore+conductances+in+small+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Resolution of patch capacitance recordings and of fusion pore conductances in small vesicles.</a> Biophys J. 78, 2983-2997 (2000).</li>
</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

세포 부착 커패시턴스 측정이 성공적으로 고품질 레코딩 얻기 위해서는 몇 가지 중요한 단계가 필요 : 부신으로부터 제조 1) 실용적이고 건강한 세포; 커버 슬립의 2) PDL 코팅; 3) 기가 옴 씰 형성; 4) 시스템의 노이즈 레벨; 5) 위상 보정. 동물의 수술 한 잠재적 수 변형이 가장 적합 기용으로 수술 접근을 조정하고, 박리시 손상을 방지하는 것이다. 전기 생리 녹음을 위해 이용 될 세포가 부신 수질에서 독점적으로 와서 또한, 위치 및 부신을 제거하기에 충분한 연습은 필수적입니다. 효소 분해의 경우, 5 % CO 2 + 95 % O 2 버블 링시켜 용액을 효소 용액을 평형화 중요하다. 실린더에 연결된 튜브가 더 누수 충분하고 꽉 것을 확신합니다. 또한 반드시 그 끝 난N 용액 적절히 전체 15 분 동안 버블 링에 배치되고; 이 적절히 공기 흐름을 지시하도록 상기 튜브의 단부에 평활화 된 20 G 바늘 끝 배치로 달성 될 수있다. ...

시냅스 전달은 신경 전달 물질 - 함유 소포 시냅스 세포 외 유출에 의해 매개되고, 이러한 소포는 장기적으로 신경의 통신을 유지하기 위해 신경 말단 내의 지방 세포 내 이입 재활용을 거쳐야한다. 시냅스 소포 사이클 전체적으로 셀룰러 통신의 더 나은 이해를 향해 필수적인 토대 구성 분자 기계 이해, 뇌 시냅스 전달의 중요한 역할을 감안. 셀 모델 시스템 중 부신하는 chromaffin 세포는 시냅스 소포 재활용의 기초가되는 분자 기계에 관하여 가장 정확한 통찰력의 일부를 제공하고 있습니다. 세포 외 유출, 신경 전달 물질 방출의 마지막 단계는, 대단히 공부 부신하는 chromaffin 셀 1,2를 사용하여 조사되었다. 사실, 분비 과립의 형성, 타겟팅, 도킹 및 융합을 조율 분자 선수 대부분 기인 DIV의 애플리케이션에 확인 된하는 chromaffin 세포 하나에서 ERSE 기술. 더욱이, 세포 외 유출에 관여하는 단백질의 단일 기계 소포 해상도를 허용 할 수있는 기회를 제공하여, 셀하는 chromaffin 소포 융합의 3 문제를 해결하기 위해 강력한 모델 남아있다. 세포 부착 된 용량 측정은 첫째 세포 외 유출 세 동안 단일 소포 융합 해결에 사용되었다. ~ 60 nm의 직경이 입증 된만큼 작은 소포 세포 외 유출은 세포 부착 구성 4-7에서 패치 클램프 기술로 세포막 어드미턴스 측정에 의해 검출된다. 어드미턴스는 회로 또는 장치에 전류가 흐르도록하는 방법을 쉽게의 척도로서 정의된다; 이것은 임피던스의 역이다. 따라서, 어드미턴스의 측정은 막의 커패시턴스의 이해를 제공한다. 이는 세포막 소포 막에 혼입함으로써 달성된다; 이 법인은 표면의 변화를 보여준다지역 8. 각 융합 막 소포는 커패시턴스 9,10에서 단계적으로 증가시킨다. 또한,이 측정은 어드미턴스 막 컨덕턴스 및 이벤트 exocytotic 3 중 융합 기공 컨덕턴스를 제공한다. 이 기술은 세포 외 유출 동안 단일 소포 반응 속도를 식별에 고유 한 도구를 제공하고, 우리의 연구소는 최근 하나의 소포 11, 12의 엔도 사이토 시스를 감지하는이 개념을 적용하고있다. 우리의 특정 관심이 많은 셀 (13)과의 연결 단자 (14, 15)에서 시냅스 소포 엔도 시토 시스에 대한 주요 경로로 기본적인 가사 구성 요소로 간주하고있다 clathrin 매개 엔도 시토 시스 (CME)입니다. CME는하지만, 그 반응 속도로 인해 단일 ​​세포 내 이입 된 사건을 검사하는 경우에 기술적 인 제한으로 잘 이해되지 남아, 생물학적으로 중요한 것으로 알려져있다. 하는 chromaffin 세포와 신경 세포 일 사이 exocytic 메커니즘의 유사성을 감안할 때, 그것이 와줘하는 chromaffin 세포 분열 메커니즘 가능성이 뉴런에서 시냅스 소포 엔도 시토 시스에 적용 할 수 있음을 ausible. 세포 부착 된 용량 측정은 각각의 세포 내 이입 이벤트를 모니터링하고 대부분의 방법으로 해결할 수없는 핵분열 반응 속도를 분석하는 데 이용되어왔다. 우리의 세포 - 부착 기록에서, 20 kHz에서 사인파 들고 잠재적 겹쳐되며, 출력 전류는 증폭기 로크에 두 단계에서 다른 채널에서 하나의 채널과 멤브레인 커패시턴스 막 컨덕턴스로 분리 16 18. 멤브레인 컨덕턴스 및 커패시턴스의 변화로부터, 하나의 가능성 소포 핀치 오프 이전 원형질막에 내재화 소포 연결 관형 막 목에 대응 핵분열 기공의 동력학을 계산할 수있다. 종합적으로,이 기술은 우리에게 CME 동안 소포 분열의 규제 메커니즘을 조사 할 수있는 기회를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>15066024</td><td>UV</td></tr><tr><td>Dulbecco에서 제외 s Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>커버 글라스</td><td>캐롤라이나 생물학적</td><td>633029</td><td>12mm</td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>생명 기술</td><td>15140122</td><td>100ml</td></tr><tr><td>인슐린-트랜스-셀-X</td><td>생명 기술</td><td>51500056</td><td>얼음에서만 해동!</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>39S11614</td><td></td></tr><tr><td>EPC-7 플러스 패치 증폭기</td><td>HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BNC-2090 데이터 수집 보드</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor 데이터 수집 소프트웨어</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 피펫 풀러</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Scientific Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-110-10</td><td>외경 : 1.5 mm 
내경: 1.10 mm 
길이: 10cm</td></tr></tbody></table>

마우스 부신하는 chromaffin 세포에서 세포 부착 된 정전 용량 측정을위한 방법

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

신경 세포 전달은 뇌 내 세포 통신의 필수적인 부분입니다. 시냅스전 막(presynaptic membrane)의 탈분극(depolarization)은 시냅스 전달을 매개하는 엑소사이토시스(exocytosis)로 알려진 소포 융합(vesicle fusion)을 유발합니다. 시냅스 소포의 후속 검색은 세포내이입(endocytosis)으로 확인된 과정에서 새로운 신경전달물질로 채워진 소포를 생성하는 데 필요합니다. 세포외이입 중에는 소포막을 융합하면 표면적이 증가하고 이후 세포내이입은 표면적이 감소합니다. 여기에서, 우리 연구실은 마우스 부신 크로마핀 세포에서 단일 내포성 이벤트의 세포 부착 커패시턴스 기록에 대한 기본적인 소개를 보여줍니다. 이러한 유형의 전기 기록은 단일 소포 수준에서 외포작용(exocytosis) 및 세포내이입(endocytosis)의 고해상도 기록에 유용합니다. 이 기술은 소포 세포내이입과 세포내이입증을 모두 검출할 수 있지만, 우리 연구실의 초점은 소포내포작용입니다. 또한 이 기술을 통해 단일 내포성 이벤트의 동역학을 분석할 수 있습니다. 여기에서는 마우스 부신 조직 해부 방법, 크로마핀 세포 배양, 기본 세포 부착 기술 및 단일 세포 내 세포 이벤트를 측정하는 개별 미량의 후속 예가 설명됩니다.

세포 생존 및 기가 옴 시일의 품질은 셀에 연결된 커패시턴스 레코딩의 품질을 결정하는데 중요하다. 따라서, 종래 전기 생리 레코딩, 및 일반적인 생존 세포로도 1에 도시되어 효과적이고 효율적인 세포 배양을 조달하는 것이 중요하다. 연습 시간은 고품질 기가 옴 시일을 달성하는데 도움이 될 것이다. 하나 명확 프로토콜 단계 5.3에 기재된 바와 같이 패치 피펫 셀 다가 세포 변형을 알 수 있다면, 고품질의 도장을 얻는 더 나은 기회가있다. 3과 관련된 여러 아래쪽 단계와 막의 커패시턴스의 일반적인 기록을 보여주는 도표 하나의 소포 엔도 시토 시스. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52024/52024fig1highres.jpg"> 가능한 마우스 부신하는 chromaf...

세포외이입 후, 융합된 원형질막은 세포내이입(endocytosis)으로 알려진 과정을 통해 회수됩니다. 이 메커니즘은 다음 방출을 위해 새로운 시냅스 소포를 형성합니다. 개별 내포성 이벤트는 마우스 부신 크로마핀 세포에서 세포 부착 커패시턴스 기록을 사용하여 캡처되고 분석됩니다.

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

이 절차의 전반적인 목표는 단일 소포, 세포작용 및 세포내이입(endocytosis)을 검출하는 것입니다. 이것은 먼저 쥐의 부신 조직을 깨끗하고 완벽하게 소화함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 부신에서 세포를 분리하고 플레이트를 만드는 것입니다.다음으로 크로민 세포를 식별하고 패치 클램핑하여 셀 부착 커패시턴스 기록을 얻습니다. 궁극적으로 단일 소포, 세포작용 및 세포내이입이 관찰될 수 있습니다. 단일 이온 채널의 세포 부착 기록과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 단일 소포의 엑소사이토시스(exocytosis) 및 세포내이입(endocytosis)을 검출할 수 있다는 것입니다.이 방법의 시각적 시연은 기가 씰을 얻는 것이 배우기 어렵기 때문에 유용합니다. 또한 플레이트 내에서 발견되는 혼합 세포 유형 중에서 세포를 식별하기 어려울 수 있습니다. 수술을 준비하려면 한 쌍의 크고 작은 절개, 가위, 두 쌍의 집게를 고압멸균하는 것으로 시작하십시오.그런 다음 해부 트레이를 얼음 양동이에 놓습니다. 또한 5%의 이산화탄소와 95%의 산소로 효소 용액에 거품을 일으키기 시작합니다. 해결책은 거품이 나기 전의 밝은 분홍색입니다. 다음.생후 3일까지의 신생아를 안락사시키고 목을 베인 후, 더 작은 가위 세트를 사용하여 경추에서 척추 부위까지 척추를 따라 강아지의 등을 자릅니다. 체강을 뚫지 않도록 피부 아래를 표면적으로 절단하십시오. 그런 다음 근육 조직이 노출되고 척추가 명확하게 보이도록 척추에서 피부를 벗겨냅니다.이제 경추 척수를 횡단면 절단한 다음 동물의 본체를 잡고 있는 한 쌍의 집게로 척추 측면을 따라 두 개의 평행 절단을 만듭니다. 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 척추를 잡고 신장이 노출될 때까지 척추를 벗겨냅니다. 신장 위에 있는 부신을 찾은 후 집게를 사용하여 제거합니다.그런 다음 부신을 자물쇠 용액으로 채워진 원뿔형 튜브에 조심스럽게 넣으십시오. 두 번째 집게를 사용하여 부신을 제거합니다. 첫 번째 집게에 달라붙으면 원뿔형 튜브를 얼음 위에 놓습니다.땀샘은 최대 2시간 동안 잠금 용액에 보관할 수 있습니다. 이 시점에서 효소 용액을 확인하여 평형 용액이 밝은 분홍색에서 분홍빛이 도는 주황색으로 변했는지 확인합니다. 다음으로, 밀리리터당 20-25단위의 최종 농도로 갓 거품이 일어난 효소 용액에 파페를 첨가합니다.그런 다음 프로판 효소 용액을 새 원뿔형 튜브에 넣고 집게를 사용하여 부신을 프로판 효소 튜브로 이동합니다. 섭씨 37도에서 40-60분 동안 땀샘을 배양합니다. 그런 다음 각 튜브에 75%의 불활성화 용액을 추가하고 섭씨 37도에서 10분 더 배양합니다.10분 후, 땀샘을 새로 표지된 튜브로 부드럽게 옮기고 배양 배지로 땀샘을 세 번 씻습니다. 세척 후 땀샘을 200마이크로리터의 배양 배지에 넣은 다음 200마이크로리터 피펫의 피펫 팁을 통해 땀샘을 위아래로 부드럽게 적정합니다. 적정 시 200마이크로리터 피펫 팁에서 아래쪽으로 향하는 힘으로 튜브 바닥의 땀샘을 유지하고 조직을 부드럽고 천천히 맞물립니다. 적정 후 빠르게 또는 갑작스럽게 피펫팅하지 말고 느리고 연속적인 스트로크를 사용해야 하며, 250마이크로리터의 배양 배지를 추가하여 배양 배지의 총 부피를 최대 450마이크로리터까지 늘릴 수 있습니다.다음으로, 7개의 12mm PDL 사전 코팅된 커버가 60 x 50mm 배양 접시에 미끄러집니다. 그런 다음 용액이 들어있는 셀 60 마이크로 리터를 7 개의 커버 슬립 각각에 플레이트합니다. 플레이트가 완성되면 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 30분 동안 놓습니다.배양 후, 5ml의 예열 배양 배지를 배양 접시에 부드럽게 첨가한 다음 세포 부착 기록을 수행하기 전에 24시간 동안 배양합니다. 배양 장소 후, 부신 세포를 포함하는 12mm 덮개가 세포 외 용액으로 미끄러집니다. 부신 전체를 사용했기 때문에 다음 단계는 크로민 세포와 피질 세포를 구별하는 것입니다.배양에서 크로민 세포는 일반적으로 갈색을 띤 베이지색과 거의 완벽한 원형 형태로 매우 밝습니다. 대조적으로, 피질 세포는 CHRO 세포보다 작고 어둡습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 패치 피펫을 당긴 후 피펫 팁을 녹은 왁스에 담궈 유리의 커패시턴스를 줄입니다.그런 다음 팁을 불로 닦아 피펫 팁 내부에서 이 왁스를 불어냅니다. 다음으로, 저항이 약 2메가옴이 되도록 패치 피펫 솔루션으로 피펫을 구축합니다. 패치 피펫을 매니퓰레이터에 부착하고 세포의 수 미크론 이내로 가져옵니다.피펫을 계속 전진시켜 약간의 세포 변형이 있는지 확인합니다. 변형이 발견되면 기가 옴 씰이 달성될 때까지 부드럽게 흡입합니다. 셀 부착 구성을 생성합니다.기가 옴 씰이 공개되면 EPC 7 plus 패치 클램프 증폭기 및 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 2상 아날로그 락인앰플리파이어를 사용하여 셀 부착 녹음을 하고 락인앰플리파이어의 위상을 설정하여 부드러운 흡입에 의해 생성되는 과도 커패시턴스 변화가 발생하도록 합니다. 펄스는 패치 커패시턴스에만 나타나거나 패치, 전도도 또는 패치 프로세스로 재추적되지 않은 Im 트레이스에서만 나타나며 패치 프로세스는 기계적 자극 역할을합니다. 동작 전류는 일반적으로 대부분의 셀에서 기록될 수 있으므로 표시된 하향 단계로 일반적인 커패시턴스 변화를 식별합니다.마지막 단계는 향후 분석을 위해 데이터를 저장하는 것입니다. 여기에 표시된 것은 여러 개의 하향 단계가 있는 일반적인 셀 부착 커패시턴스 기록입니다. 각 하향 단계는 단일 iCal 세포내이입과 관련이 있습니다.마스터링되면 세포 배양은 2-3시간 이내에 완료될 수 있으며, 개발 후 4일 이내에 기록을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 시냅스 전달 분야의 연구자들이 신경내분비 크로민 세포에서 시냅스 소포 재활용을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

부신 골수의 chromaffin 세포 배양 시스템은 체외 설정에의 자극 - 분비 커플링 연구를 위해 매우 유용합니다. 이 프로토콜은 adrenals을 해부하다 다음 부신 피질 멀리 벗겨진하여 골수의 영역을 분리하는 데 사용되는 방법을 보여줍니다. 단일 chromaffin 세포로 골수의 소화는 다음 증명됩니다.

마우스 부신 Chromaffin 셀 절연

여기 우리는 전기 생리학 및 Ca2 + 이미징에 적합 한천 - 임베디드 망막 조각의 준비를 위해 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 하나 하나 presynaptic 신경 터미널 직접 패치 - 클램프 녹음을 사용하여 망막 microcircuits의 리본 형태의 시냅스를 공부하실 수 있습니다.

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA 2 +</sup망막 조각의 단일 신경 터미널에서> 영상

이 비디오는 쥐의 대뇌 동맥 분절의 내피 세포에서 세포 내 칼슘 수치와 막 전위의 변화를 동시에 측정하는 것을 보여줍니다. 분리된 내피관에는 형광 칼슘 지시약이 적재되어 세포 내 칼슘 방출을 유도하는 약물로 처리되어 막 전위의 변화를 일으킵니다. 지표의 형광을 통해 칼슘 수치를 측정할 수 있으며, 기록 전극을 세포에 삽입하여 막 전위의 변화를 측정합니다.

Simultaneous Measurement of Intracellular calcium and Membrane Potential in a Mouse Cerebral Endothelium(쥐 대뇌 내피에서 세포 내 칼슘 및 막 전위)

이 비디오 문서에서는 세포 기관을 패치하는 셋업 절차 및 방법 전체 마운트 마우스 망막의 신경절 세포에서 동적 클램프 레코딩을 구현하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 흥분성과 억제 시냅스 입력의 정확한 기여도 조사 및 신경 스파이크에 대한 상대적인 크기와 타이밍을 할 수 있습니다.

마우스 망막 신경절 세포의 시냅스와 인공 컨덕턴스와 동적 클램프 구현

삼투성 스트레스에는이 과정을 발표 하는 신경 전달 물질의 양과 exocytosis 영향을 줍니다. 전송 전자 현미경 검사 법 함께 전기 화학 방법 결합 수 있습니다 사용 하는 방법을 exocytosis 활동, 소포 quantal 크기, 출시 하는 신경 전달 물질의 양과에 extracellular 삼투성 압력의 효과 연구 설명 동안 exocytosis.

분 비 소포 및 Exocytosis 삼투성 스트레스의 효과 모니터링

Enterochromaffin (EC) 셀 위장 상피 세포의 작은 하위 집합으로 구성 됩니다. EC 셀 전기 고르기가 고 아직 경작 하 고 EC 셀 식별 어려움 생리 연구 제한 세로토닌을 출시. 여기에 제시 된 방법 전기 생리학에 의해 의무가 단일 EC 셀의 기본 문화 모델을 설정 합니다.

기본 교양된 Murine Enterochromaffin 셀의 전체 셀 전기 생리학

여기 우리는 마우스에서 아드레날린을 분리, 조직, 그들, 섹션 고치고 면역 형광 염색 법을 수행 하는 방법을 제시.

절연, 고정, 및 마우스 아드레날린의 면역 형광 이미징

부 신 피 질에서 분 비 하는 호르몬은 스트레스와 질병에 대 한 동물에 대 한 중요 합니다. 여기, 우리는 문화 기본 쥐 프로토콜 부 신 셀을 제시. 그것은 부 신 steroidogenesis와 지질 생 합성의 약의 메커니즘을 조사 하기 위한 좋은 생체 외에서 플랫폼을 수 있습니다.

쥐 Adrenocortical 셀 및 Steroidogenic 기능의 분석 실험의 기본 문화

이 프로토콜은 소 부신 크로마핀 세포에서 세 가지 융합 모드를 검출하기 위한 공초점 이미징 기술을 기술한다. 이러한 융합 모드에는 1) 융합 기공 개폐 및 폐쇄를 포함하는 근접 융합 (키스 앤 런이라고도 함), 2) 융합 기공 개방 및 개방 된 기공 유지를 포함하는 체류 융합, 3) 융합 된 소낭 수축을 포함하는 수축 융합이 포함됩니다.

부신 크로마핀 세포에서 융합 기공 역학의 세 가지 모드를 측정하는 공초점 현미경 검사

마우스 부신 피질에 대해 대(zona glomelosa) 및 다소 포시큘라타(zona fasciculata) 풍부 세포의 2D 1차 배양을 확립하는 견고하고 재현 가능한 접근법이 개발되었습니다. 이 시스템은 각 영역의 핵심 분자 및 기능적 특징을 보존하여, 신호 전달 경로, 호르몬 생성, 부신 피질 세포 행동에 대한 체 외 내 집중 연구를 가능하게 합니다.

마우스 부신 피질에서 존 강화된 1차 배양 형성

배우세요 마우스 부신 chromaffin 세포에서 patch clamping을 이용한 세포 부착 정전 용량 측정법으로 단일 소포의 exocytosis와 endocytosis를 실시간 관찰하는 방법을 통해 신경전달 메커니즘을 심층 연구하세요.

마우스 부신하는 chromaffin 세포에서 세포 부착 된 정전 용량 측정을위한 방법

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