2014년 10월 22일
세포외이입 후, 융합된 원형질막은 세포내이입(endocytosis)으로 알려진 과정을 통해 회수됩니다. 이 메커니즘은 다음 방출을 위해 새로운 시냅스 소포를 형성합니다. 개별 내포성 이벤트는 마우스 부신 크로마핀 세포에서 세포 부착 커패시턴스 기록을 사용하여 캡처되고 분석됩니다.
이 절차의 전반적인 목표는 단일 소포, 세포작용 및 세포내이입(endocytosis)을 검출하는 것입니다. 이것은 먼저 쥐의 부신 조직을 깨끗하고 완벽하게 소화함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 부신에서 세포를 분리하고 플레이트를 만드는 것입니다.
다음으로 크로민 세포를 식별하고 패치 클램핑하여 셀 부착 커패시턴스 기록을 얻습니다. 궁극적으로 단일 소포, 세포작용 및 세포내이입이 관찰될 수 있습니다. 단일 이온 채널의 세포 부착 기록과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 단일 소포의 엑소사이토시스(exocytosis) 및 세포내이입(endocytosis)을 검출할 수 있다는 것입니다.
이 방법의 시각적 시연은 기가 씰을 얻는 것이 배우기 어렵기 때문에 유용합니다. 또한 플레이트 내에서 발견되는 혼합 세포 유형 중에서 세포를 식별하기 어려울 수 있습니다. 수술을 준비하려면 한 쌍의 크고 작은 절개, 가위, 두 쌍의 집게를 고압멸균하는 것으로 시작하십시오.
그런 다음 해부 트레이를 얼음 양동이에 놓습니다. 또한 5%의 이산화탄소와 95%의 산소로 효소 용액에 거품을 일으키기 시작합니다. 해결책은 거품이 나기 전의 밝은 분홍색입니다. 다음.
생후 3일까지의 신생아를 안락사시키고 목을 베인 후, 더 작은 가위 세트를 사용하여 경추에서 척추 부위까지 척추를 따라 강아지의 등을 자릅니다. 체강을 뚫지 않도록 피부 아래를 표면적으로 절단하십시오. 그런 다음 근육 조직이 노출되고 척추가 명확하게 보이도록 척추에서 피부를 벗겨냅니다.
이제 경추 척수를 횡단면 절단한 다음 동물의 본체를 잡고 있는 한 쌍의 집게로 척추 측면을 따라 두 개의 평행 절단을 만듭니다. 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 척추를 잡고 신장이 노출될 때까지 척추를 벗겨냅니다. 신장 위에 있는 부신을 찾은 후 집게를 사용하여 제거합니다.
그런 다음 부신을 자물쇠 용액으로 채워진 원뿔형 튜브에 조심스럽게 넣으십시오. 두 번째 집게를 사용하여 부신을 제거합니다. 첫 번째 집게에 달라붙으면 원뿔형 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
땀샘은 최대 2시간 동안 잠금 용액에 보관할 수 있습니다. 이 시점에서 효소 용액을 확인하여 평형 용액이 밝은 분홍색에서 분홍빛이 도는 주황색으로 변했는지 확인합니다. 다음으로, 밀리리터당 20-25단위의 최종 농도로 갓 거품이 일어난 효소 용액에 파페를 첨가합니다.
그런 다음 프로판 효소 용액을 새 원뿔형 튜브에 넣고 집게를 사용하여 부신을 프로판 효소 튜브로 이동합니다. 섭씨 37도에서 40-60분 동안 땀샘을 배양합니다. 그런 다음 각 튜브에 75%의 불활성화 용액을 추가하고 섭씨 37도에서 10분 더 배양합니다.
10분 후, 땀샘을 새로 표지된 튜브로 부드럽게 옮기고 배양 배지로 땀샘을 세 번 씻습니다. 세척 후 땀샘을 200마이크로리터의 배양 배지에 넣은 다음 200마이크로리터 피펫의 피펫 팁을 통해 땀샘을 위아래로 부드럽게 적정합니다. 적정 시 200마이크로리터 피펫 팁에서 아래쪽으로 향하는 힘으로 튜브 바닥의 땀샘을 유지하고 조직을 부드럽고 천천히 맞물립니다. 적정 후 빠르게 또는 갑작스럽게 피펫팅하지 말고 느리고 연속적인 스트로크를 사용해야 하며, 250마이크로리터의 배양 배지를 추가하여 배양 배지의 총 부피를 최대 450마이크로리터까지 늘릴
수 있습니다.다음으로, 7개의 12mm PDL 사전 코팅된 커버가 60 x 50mm 배양 접시에 미끄러집니다. 그런 다음 용액이 들어있는 셀 60 마이크로 리터를 7 개의 커버 슬립 각각에 플레이트합니다. 플레이트가 완성되면 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 30분 동안 놓습니다.
배양 후, 5ml의 예열 배양 배지를 배양 접시에 부드럽게 첨가한 다음 세포 부착 기록을 수행하기 전에 24시간 동안 배양합니다. 배양 장소 후, 부신 세포를 포함하는 12mm 덮개가 세포 외 용액으로 미끄러집니다. 부신 전체를 사용했기 때문에 다음 단계는 크로민 세포와 피질 세포를 구별하는 것입니다.
배양에서 크로민 세포는 일반적으로 갈색을 띤 베이지색과 거의 완벽한 원형 형태로 매우 밝습니다. 대조적으로, 피질 세포는 CHRO 세포보다 작고 어둡습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 패치 피펫을 당긴 후 피펫 팁을 녹은 왁스에 담궈 유리의 커패시턴스를 줄입니다.
그런 다음 팁을 불로 닦아 피펫 팁 내부에서 이 왁스를 불어냅니다. 다음으로, 저항이 약 2메가옴이 되도록 패치 피펫 솔루션으로 피펫을 구축합니다. 패치 피펫을 매니퓰레이터에 부착하고 세포의 수 미크론 이내로 가져옵니다.
피펫을 계속 전진시켜 약간의 세포 변형이 있는지 확인합니다. 변형이 발견되면 기가 옴 씰이 달성될 때까지 부드럽게 흡입합니다. 셀 부착 구성을 생성합니다.
기가 옴 씰이 공개되면 EPC 7 plus 패치 클램프 증폭기 및 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 2상 아날로그 락인앰플리파이어를 사용하여 셀 부착 녹음을 하고 락인앰플리파이어의 위상을 설정하여 부드러운 흡입에 의해 생성되는 과도 커패시턴스 변화가 발생하도록 합니다. 펄스는 패치 커패시턴스에만 나타나거나 패치, 전도도 또는 패치 프로세스로 재추적되지 않은 Im 트레이스에서만 나타나며 패치 프로세스는 기계적 자극 역할을합니다. 동작 전류는 일반적으로 대부분의 셀에서 기록될 수 있으므로 표시된 하향 단계로 일반적인 커패시턴스 변화를 식별합니다.
마지막 단계는 향후 분석을 위해 데이터를 저장하는 것입니다. 여기에 표시된 것은 여러 개의 하향 단계가 있는 일반적인 셀 부착 커패시턴스 기록입니다. 각 하향 단계는 단일 iCal 세포내이입과 관련이 있습니다.
마스터링되면 세포 배양은 2-3시간 이내에 완료될 수 있으며, 개발 후 4일 이내에 기록을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 시냅스 전달 분야의 연구자들이 신경내분비 크로민 세포에서 시냅스 소포 재활용을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
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이 연구는 마우스 부신 수질 세포에서 단일 소포의 세포질 내 운반 및 세포 내 유입을 감지하는 데 초점을 맞추고 있습니다. 이 방법은 패치 클램핑을 통해 세포 부착 용량 기록을 얻어 단일 소포의 세포외 운반 및 세포 내 유입을 관찰할 수 있습니다.
High-resolution cell-attached capacitance measurements in mouse adrenal chromaffin cells enable direct quantification of single-vesicle endocytosis, a critical process in synaptic vesicle recycling. This capability strengthens mechanistic de-risking and predictive confidence in early neurobiology target validation. The method supports translational continuity by providing quantitative, reproducible data on vesicle dynamics relevant to neurotransmission and neuroendocrine function.
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical model validation, supporting both target validation and assay development for neuroendocrine and synaptic transmission research.