Name: 정량 면역 형광 분석은 중심체에서 단백질 수준의 변화를 측정하기 위해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 학습하세요 정량 면역 형광 분석법으로 중심체에서 단백질 수준 변화를 측정하는 방법을. RPE1 세포와 프로테아좀 억제제를 사용하여 세포 주기 단계별 단백질 조절 메커니즘을 정밀하게 연구할 수 있습니다.

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이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, GM77311)과 오하이오 암 연구소(Ohio Cancer Research Associates)의 종자 보조금(H.A.F.)의 지원을 받았습니다. SM은 오하이오 주립 대학 종합 암 센터의 인간 암 유전학 프로그램의 Up on the Roof 펠로우십의 일부 지원을 받았습니다.

1. 세포 배양 <ol><li> 역전사 효소 (는 hTERT) 불후의 망막 색소 상피 세포 인간 텔로 머라 아제를 사용 (의 hTERT-RPE1하면, RPE1 여기 함). 주 : RPE1 세포 일반적 중심 소체 조립체와 ciliogenesis을 연구하는 데 사용되는 근거리 이배체 인간 형질 전환되지 않은 세포이다. 이 세포들은 규제 세포주기와 조정 정상적인 중심 소체 중복주기를 따르십시오. </li><li> 통로 1에서 RPE1 세포의 거의 합류 100mm 세포 배양 접시 : 10 ㎖를 함유하는 신선한 100mm 접시에 원래 배양 5 희석 DME / F-12 (1 : 1) 중 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 100 U / ml의 페니실린 G 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신 (전체 매체가 DME / F-12 매체로 함). 5 % CO 2 존재하에 37 ℃에서 세포를 성장한다. <ol><li> 물 목욕이나 인큐베이터에서 60 ° C에서 흔들림없이 덮여 유리 비커, O / N에서 1 N 염산 50ml에 12mm 라운드 커버 글라스를 품어. </li><li> AF산 용액을 폐기 터가 가끔 흔들어 15 분간 배양하여 커버 슬립을 증류수 100㎖를 세 번 씻는다. 70 % 에탄올 및 95 % 에탄올 중의 마찬가지로 세탁을 반복. </li><li> 개별적으로 60 분 동안 자외선으로 살균 다음에 생물 안전 캐비닛의 실험실 블로 팅 종이에 그들을 밖으로 확산으로 된 커버를 건조시킵니다. </li></ol></li><li> 35mm 세포 배양 접시에 2-4 건조 된 커버를 놓습니다. 세포 배양 물에서 25 μg의 PBS / ㎖의 농도로 엔지니어링 중합체 (1 ㎎ / ㎖의 스톡 농도) 등 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 용액을 희석. <ol><li> 각 커버 슬립에 희석 된 용액의 80 ~ 100 μl를 놓고 코트에 60 분의 coverslip의 상단 동안 품어. 전체 매체를 추가하기 전에 PBS를 사용하여 삼배 된 커버를 세척 할 것. </li></ol></li></ol> 2. 성장 세포와 프로 테아 좀 억제제 치료 세포 <ol><li> 항로 2 × 10 5 비동기 적으로 성장각 35mm 접시 ING RPE1 세포는 커버 슬립을 함유하는 2 ml의 완전 배지에서 세포를 성장한다. 배양액에게 신선한 미리 예열 완료 매체와 매 24 시간을 교체합니다. <ol><li> 시험 단백질의 수준에 centrosomal 테아 좀 억제의 효과를 분석하는 (여기 VDAC3 또는 튜 불린-γ)은 44 시간 동안 두 35mm 접시에서 세포를 성장한다. 완전 배지로 배지를 교체하고, 각각 5 μM 또는 0.05 %의 최종 농도 제어 MG115 또는 용매로서 DMSO를 추가한다. 동시에, 4 시간 동안 세포를 40 μM의 최종 농도로 세포를 BrdU의 추가 배양한다. </li><li> 24 웰 플레이트의 각 coverslip에 전송합니다. 각 웰에 500 ㎕의 냉각 메탄올을 추가하고 10 분이 된 커버에 세포를 해결하기 위해 -20 ° C에서 접시를 품어. 즉시 된 커버 500 μL 세척 버퍼로 3 회 세척 (0.5 mM의의 MgCl 2와 0.05 %를 포함하는 1X PBS를 트리톤-X 100). </li></ol></li><li> 잔류를 수확35mm 접시 원심 분리기 5 분 1,000 XG에 세포에서 세포. 웨스턴 블롯 (단계 6)에 의해 전체 단백질을 분석하기 위해 세포 펠렛을 사용한다. </li></ol> 3. BrdU의 펄스 체이스 분석은 다른 세포주기 단계에서 단백질 수준을 분석하기 위해 <ol><li> 44 시간 동안 커버 슬립을 함유하는 두 개의 35mm 접시에서 세포 성장, 세포주기의 다른 단계에서의 중심체에서 단백질 (VDAC3 여기서, Sas6 또는 Cep135)의 레벨의 변화를 분석한다. 40 μm의 BrdU의를 포함하는 완전한 매체와 문화 매체를 교체하고 세포 배양 인큐베이터에서 4 시간 동안 세포를 배양한다. </li><li> 한 접시에서, 단계 2.1.2에서 설명 된 바와 같이 냉각 된 메탄올을 사용하여 세포를 고정하는 24- 웰 플레이트로 커버 슬립을 전송. </li><li> 4 시간의 BrdU의 펄스 후, BrdU를 함유 배지를 제거 PBS로 한번 세포를 세척하고 완전 배지로 한번, 다양한 시간 (전형적으로 추가의 4 시간 동안의 BrdU의 부재 하에서 세포를 새로운 배지를 추가하고 성장할단계 2.1.2에 기재된 바와 같이 세포를 고정하기 전에 RPE1 세포)에 대한. 주 : RPE1 전지, BrdU의 양성 세포의 대부분은 4 시간 후 체이스 늦은 S 또는 G2 상에있다. 이는 각각의 세포 유형에 대해 독립적으로 결정되어야한다. </li></ol> 4. 면역 염색 <ol><li> 30 분 동안 (1X PBS로 2 % BSA 및 0.1 % 트리톤-100)을 블로킹 완충액 200 μL의 고정 된 커버에 세포를 배양한다. <ol><li> 차 항체가 혼합 된 세포를 품어 가습 실에서 4 ° C에서 버퍼 O / N 차단에 희석 (일반적으로 한 토끼에서 제기하고 다른 마우스에서 제기). </li><li> 가습 실을하려면 빈 1,000 μL 피펫 팁 상자의 아래쪽에 젖은 종이 타월을 넣어. 랙 파라 필름의 표면 상에 스트립을 마련하고, 배양 될 각 커버 슬립에 대해 파라 필름 상에 항체 용액의 액적 (15 ~ 20 μL)을 더럽힐. 항체 용액의 방울에 커버 슬립을 반전 (세포 몰입되도록) 및 close팁 상자의 뚜껑. </li><li> 다시 된 커버 전환하고, 24 웰 접시에 그들을 다시 돌아갑니다. 된 커버를 세척 한 다음 실온에서 1 시간 동안 (녹색 형광 염료 복합 항 - 토끼와 붉은 형광 염료 복합 항 - 마우스가 버퍼를 차단에 희석 여기) 150 μL 차 항체 혼합물에서 그들을 품어. 커버 슬립을 세 번 씻으십시오. 참고 : 형광 접합 차 항체 광 감응성. 단계에서 빛으로부터 샘플을 보호 4.1.3-5.1.2. </li></ol></li><li> 단계 2.1.2에 기재된 바와 같이, 10 분 동안 -20 ℃에서 500 ㎕의 냉각 된 메탄올로 다시 염색 RPE1 세포를 고정함으로써 방지 BrdU의 염색을 위해 준비한다. 세 번 된 커버를 세척 할 것. 주 :이 고정은 다음의 단계에서 산 가수 분해 과정에서 관심 단백질 (들)의 일차 및 이차 항체 표지를 고정. <ol><li> RT에서 30 분 동안 2 N 염산 200 μL에서 세포를 배양한다. 1 M 트리스 (CL)의 300 μL, pH를 8로 중화세포를 세척 완충제로 3 회 세척 좋아. </li><li> 다시 RT에서 30 분 동안 블로킹 완충액 200 μL를 사용하여 세포를 차단. </li><li> 가습 챔버 내에서 37 ° C에서 45 분 동안 (블로킹 완충액에 희석) 래트 항 BrdU의 항체로 세포를 배양한다. , 24 웰 접시에 다시 된 커버를 돌려 그들을 씻어 준 후 실온에서 1 시간 동안 24 잘 접시에 버퍼를 차단 150 μL에 희석 블루 형광 염료 복합 항 쥐 이차 항체 (에 품어. </li></ol></li><li> 커버 슬립을 세 번 씻으십시오. 유리 현미경 슬라이드에 antifade 시약을 함유하는 용액의 장착 방울 (약 3-6 μL)를 스팟. 셀 측이 장착 솔루션에, 아래로 향하게하여, 커버 슬립을 반전. 부드럽게 부드러운 세정 티슈를 사용하여 슬라이드에 커버 슬립을 눌러 물기를 닦아주십시오. 현미경 슬라이드에 그것을 밀봉 커버 슬립의 가장자리를 따라 투명 매니큐어를 적용합니다. </li></ol> 5. 면역 형광 이미지 Acquisition 및 분석 <ol><li> 상온에서의 BrdU 양성 RPE1 세포의 이미지를 획득 (1.4 개구 수) 100X 계획 아포 오일 침지 목표를 사용합니다. <ol><li> 디지털 이미징 할 수있는 카메라에 부착 된 현미경 (장비 참조)에 슬라이드를 넣습니다. 각각의 형광의 경우, 수동으로 실험의 모든 샘플을 검사하여 (일반적으로 300 - 1,000 밀리 초 사이) 적절한 노출 시간을 결정합니다. 셀의 이미지를 획득하기 전에 수동으로 Z 축 (일반적으로 0.2 μm의 스텝 크기)에 따라 적절한 상단과 하단에 초점면을 결정합니다. 디지털 현미경 이미징 소프트웨어 패키지를 이용하여 Z 축을 따라 서로 다른 형광 물질에 대해 동일한 노출 시간을 사용하여 분리 된 커버에 서로 다른 샘플의 이미지를 수집. </li></ol></li><li> Z 축을 따라 취득한 모든 화상 스택 (아니오 이웃 알고리즘을 사용하지 않고 이러한 경우) 디콘 볼 루션을 수행한다. <ol><li> 따라서 각 이미지 스택의 총 강도 투영을 구하는Z 축. </li></ol></li><li> 중심체가 (두 중심체 사이의 거리가 2㎛ 미만이다) 가까이있는 세포에서 두 중심체 주위에 작은 사각형 (측면 당 일반적으로 20 ~ 30 픽셀)를 그리는 선택 영역을 표시합니다. <ol><li> 첫 번째 광장을 둘러싼 더 큰 정사각형 (측면 당 일반적으로 24 ~ 35 픽셀)를 그려 큰 사각형의 선택 영역을 표시합니다. </li><li> 면적 (A)과, 각 박스의 각 형광 물질의 총 형광 강도 (F)을 얻었다 (S 작은 박스를 나타내고, L은 큰 상자를 나타낸다). </li><li> . 하웰 등 (29)에 의해 설명 된 공식을 사용하여 각 형광의 배경 보정 형광 강도를 분석 : F = F S - [(F의 L - F S)는 S / (A L를 - S) ×]. </li><li> 그 FL의 배경 보정 형광 강도의 비를 계산함으로써 관심 (여기 VDAC3 또는 Sas6)의 단백질의 정규화 형광 강도를 구하는(여기에 γ-tubulin에, Sas6 또는 Cep135) 선택 내부 표준에 사용되는 형광의 그것과 uorophore. </li></ol></li><li> 중심체가 잘 분리되는 경우 세포 분석의 경우, 두 개의 분리 된 박스의 도면 세트를 각각 별도로 분석 중심체 (두 중심체 사이의 거리가 큰, 2㎛ 이상이다). 각 중심체 주위에 작은 사각형 (측면 당 일반적으로 15 ~ 25 픽셀)를 그려 선택 영역을 표시합니다. 첫 번째 광장을 둘러싼 더 큰 정사각형 (측면 당 20 ~ 30 픽셀)를 그려 선택 영역을 표시합니다. <ol><li> 면적 (A)과, 각 박스의 각 형광 물질의 총 형광 강도 (F)를 얻어, 단계 5.3.3에서 설명 된 바와 같이, 각각의 중심체 별도로, 각 형광 물질의 배경 형광 농도 보정을 계산한다. </li><li> 그 셀에서 해당 단백질의 총 centrosomal 레벨을 얻기 위해 두 중심체에서 각 단백질의 배경 형광 농도 보정 수확기. </li><li> 취득내부 표준 물질의 총 centrosomal 강도 총 centrosomal 강도의 비율을 계산하여 관심 단백질 정규화 강도. </li></ol></li><li> 각 실험 조건에 대해 적어도 15-25 세포를 분석하여 스프레드 시트의 그래프를 플롯. </li></ol> 6. 웨스턴 블로 팅을 사용하여 총 단백질 분석 <ol><li> 50mM 트리스 - 염산 pH를 8, 150 mM의 염화나트륨, 1 % Nonidet P-40, 1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 0.1 % 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)를 포함하는 (RIPA) 버퍼 radioimmunoprecipitation 분석에서 세포를 재현 탁하고 얼음 위에서 10 분 동안 인큐베이션 용균. <ol><li> 10 분 동안 10,000 XG에서 혼합물을 원심 분리하여 펠릿 분획으로부터 해물을 분리 bicinchoninic 산 (BCA) 분석 키트를 사용하여 각 분해물의 총 단백질 농도를 측정한다. </li></ol></li><li> 4X SDS-PAGE 로딩 완충액 (50 mM Tris-CL, pH가 6.8, 2 % SDS, 10 % 글리세롤, 100 mM의 디티 오 트레이 톨, 0.1 % 브롬으로 40 μg의 해물 믹스) 블루 ophenol. <ol><li> 10 분 동안 샘플을 비등 200 V.의 정전압으로 SDS-PAGE 변성 12.5 %의 샘플을 실행할 </li></ol></li><li> (냉간에서 1 시간 90 V의 정전압) 웨스턴 블로 팅 기법을 사용하여 니트로 셀룰로오스 막 상으로 SDS-PAGE상에서 분리 된 단백질을 전송. <ol><li> 1X PBS에서 3 % 무 지방 우유 멤브레인을 차단 한 다음 1 (이 경우 토끼 방지 VDAC3, 토끼 반 γ-tubulin에와 마우스 항-α-tubulin의)에 희석 차 항체의 솔루션을 막을 배양 실온에서 시간. </li><li> 멤브레인을 PBS-T 완충액 3 회 (진탕 각 5 분 인큐베이션) 세척 한 후 (1X PBS 및 0.2 %의 트윈 -20), 근적외선 (IR​​) 형광 염료 공액 항 - 토끼의 혼합물에 막을 부화 1 시간 동안 (PBS-T에 희석) IR 형광 염료 공액 항 - 마우스 이차 항체. </li><li> 막 세 번 세척 한 후 적외선 F를 사용하여 대역을 분석 막을 검색면역 검출에 적합한 luorescence 촬상 시스템. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+linking+extra+centrosomes+to+chromosomal+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability.</a> Nature. 460, 278-282 (2009).</li>
<li>Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulating+the+transition+from+centriole+to+basal+body%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulating the transition from centriole to basal body.</a> J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).</li>
<li>Azimzadeh, J., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+centriole%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Building the centriole.</a> Curr. Biol. 20, 816-825 (2010).</li>
<li>Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAS-6+is+a+cartwheel+protein+that+establishes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).</li>
<li>Strnad, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+HsSAS-6+levels+ensure+formation+of+a+single+procentriole+per+centriole+during+the+centrosome+duplication+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle.</a> Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).</li>
<li>Hilbert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+centriolar+protein+SAS-6+forms+a+spiral+that+is+consistent+with+imparting+a+ninefold+symmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).</li>
<li>Pike, A. N., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centriole+assembly+and+the+role+of+Mps1%3A+defensible+or+dispensable%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Div%22%5BJournal%5D)">Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable.</a> Cell Div. 6, 9(2011).</li>
<li>Haren, L., Stearns, T., Luders, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plk1-dependent+recruitment+of+gamma-tubulin+complexes+to+mitotic+centrosomes+involves+multiple+PCM+components%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components.</a> PLoS One. 4, e5976(2009).</li>
<li>Andersen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+the+human+centrosome+by+protein+correlation+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling.</a> Nature. 426, 570-574 (2003).</li>
<li>Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R. 3rd, Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+isolated+chlamydomonas+centrioles+reveals+orthologs+of+ciliary-disease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes.</a> Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).</li>
<li>Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEP+proteins%3A+the+knights+of+centrosome+dynasty%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">CEP proteins: the knights of centrosome dynasty.</a> Protoplasma. 250, 965-983 (2013).</li>
<li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+functional+interaction+between+mortalin+and+Mps1+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase.</a> Genes Cells. 12, 797-810 (2007).</li>
<li>Jakobsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+asymmetrically+localizing+components+of+human+centrosomes+identified+by+complementary+proteomics+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods.</a> Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).</li>
<li>Sang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+NPHP-JBTS-MKS+protein+network+reveals+ciliopathy+disease+genes+and+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways.</a> Cell. 145, 513-528 (2011).</li>
<li>Dowdle, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+a+ciliary+B9+protein+complex+causes+Meckel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome.</a> Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).</li>
<li>Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VDAC3+regulates+centriole+assembly+by+targeting+Mps1+to+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes.</a> Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).</li>
<li>Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plk4+trans-autophosphorylation+regulates+centriole+number+by+controlling+betaTrCP-mediated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation.</a> J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).</li>
<li>Holland, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autoregulated+instability+of+Polo-like+kinase+4+limits+centrosome+duplication+to+once+per+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle.</a> Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).</li>
<li>Kasbek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+the+degradation+of+mps1+at+centrosomes+is+sufficient+to+cause+centrosome+reduplication+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).</li>
<li>Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antizyme+restrains+centrosome+amplification+by+regulating+the+accumulation+of+Mps1+at+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).</li>
<li>Puklowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCF-FBXW5+E3-ubiquitin+ligase+is+regulated+by+PLK4+and+targets+HsSAS-6+to+control+centrosome+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication.</a> Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).</li>
<li>Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cep97+and+CP110+suppress+a+cilia+assembly+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program.</a> Cell. 130, 678-690 (2007).</li>
<li>Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrin-2+is+required+for+centriole+duplication+in+Mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells.</a> Curr. Biol. 12, 1287(2002).</li>
<li>Lukasiewicz, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+centrin+stability+by+Aurora+A%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Control of centrin stability by Aurora A.</a> PLoS One. 6, e21291(2011).</li>
<li>Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+is+recruited+to+the+centrosome+in+response+to+inhibition+of+proteasomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes.</a> J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).</li>
<li>Korzeniewski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cullin+1+functions+as+a+centrosomal+suppressor+of+centriole+multiplication+by+regulating+polo-like+kinase+4+protein+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels.</a> Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).</li>
<li>Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signal+transduction+by+Smoothened%3A+pharmacologic+evidence+for+a+2-step+activation+process%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).</li>
<li>Majumder, S., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VDAC3+and+Mps1+negatively+regulate+ciliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).</li>
<li>Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Mad2+dynamics+at+kinetochores%2C+along+spindle+fibers%2C+and+at+spindle+poles+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells.</a> J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).</li>
<li>Meraldi, P., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+cohesion+is+regulated+by+a+balance+of+kinase+and+phosphatase+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities.</a> J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).</li>
<li>Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis-specific+anchoring+of+gamma+tubulin+complexes+by+pericentrin+controls+spindle+organization+and+mitotic+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).</li>
<li>Lee, K., Rhee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLK1+phosphorylation+of+pericentrin+initiates+centrosome+maturation+at+the+onset+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis.</a> J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).</li>
<li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microcephaly+protein+CEP135+binds+to+hSAS-6+and+CPAP%2C+and+is+required+for+centriole+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly.</a> Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).</li>
<li>Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+cytoskeletal+organization+by+digital+fluorescent+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy.</a> Cytometry A. 54, 8-18 (2003).</li>
<li>Keller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+centriole+proteome%3A+the+conserved+WD40+domain+protein+POC1+is+required+for+centriole+duplication+and+length+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).</li>
<li>Venoux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poc1A+and+Poc1B+act+together+in+human+cells+to+ensure+centriole+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity.</a> J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).</li>
<li>Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DSas-6+and+Ana2+coassemble+into+tubules+to+promote+centriole+duplication+and+engagement%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement.</a> Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).</li>
<li>Machiels, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+analysis+of+cell+cycle+kinetics+upon+proteasome+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition.</a> Cytometry. 28, 243-252 (1997).</li>
<li>Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mps1+phosphorylation+sites+regulate+the+function+of+centrin+2+in+centriole+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).</li>
<li>Tsou, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polo+kinase+and+separase+regulate+the+mitotic+licensing+of+centriole+duplication+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells.</a> Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li>
<li>Buck, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2%27-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry%2C+an+alternative+to+using+5-bromo-2%27-deoxyuridine+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44, 927-929 (2008).</li>
<li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

세포 생물학의 양적 현미경은 일반적으로 고정 된 다른 양적 현미경 분석을 개발하고 세포 생물학의 성장 사례가있다, 그러나 등 (FRAP) 광표백 후 같은 형광 공명 에너지 전달 (FRET), 형광 복구와 같은 라이브 세포 이미징 분석과 연관된 최근 몇 년 동안 27,34-36 세포. 중요한 것은, 중심체 생물학을 이해 진행은 종종 centrosomal 풀을 다른 풀과 다르게 조절 될 수있다 단백질의 중심체 특정 기능에 대한 이해가 필요합니다. 따라서, 우리는 특별히 다르게 취급 두 시료에서 단백질의 상대적인 수준을 centrosomal 분석 IIF 정량 분석​​법을 개발 하였다. 이 세포가 분리 된 고정 된 커버에 처리되는 것을 요구하기 때문에, 우리는 따라서 두 experime 인해 취급 필요성 가능한 아티팩트에 더 정규화 제어의 목적으로 내부 표준 도입ntal 세포 집단은 별도로하고, 분석의 정확성을 증가시킨다. 시험 단백질의 상대적 형광 강도를 측정하는 등의 내부 표준을 사용한 이전 연...

중심체는 pericentriolar 물질 (PCM)으로 둘러싸인 중심 소체의 쌍으로 구성되어 있습니다. 포유 동물 세포의 주요 미세 소관 조직 센터 (MTOCs)이기 때문에, 중심체는 분할 세포에서 유사 분열 스핀들의 두 기둥 역할을하고, 따라서 게놈 무결성 1을 유지하는 데 도움이. (G0 단계에서 예) 대기 세포에서, 중심체, 즉 머더 중심 소체의 두 중심 소체 중 하나는 일차 섬모, 세포 표면 (2)로부터 돌출 감각 소기관 조립 기부 본체로 변형된다. 일단 세포가 세포주기를 다시 입력 일차 섬모 분해하여 각 중심 소체 서서히 성숙한 중심 소체 (3)을 형성하는 그것의 신장 기단부 procentriole의 조립을 지시한다. S 단계의 개시시에 중심 소체 9 대칭성을 제공 수레 바퀴 형 구조는 기존의 각 중심 소체의 표면에 형성되고, 각각의베이스 procentriole해질 것이다. Sas6의 t중심 소체 조립체 4-6 수레 바퀴의 중심을 형성하기 위해 채용되는 모자 불가결하다. 다른 centriolar 단백질은 말초 방식으로 7 엄격한 규제, 근위부의 수레 바퀴에 조립된다. 정확하게 중심 소체 중복을 완료 한 후, 세포를 G2 단계 (8)의 단부가 두 기능 중심체를 구축하는 추가 물질 pericentriolar 조립한다. 핵심 centriolar 구성 요소 9-11, 키나제, 포스, 보호자, 비계 구성 요소, 멤브레인 관련 단백질 분해 기계 등 여러 가지 다른 단백질뿐만 아니라 세포주기 12-16의 서로 다른 시간에 중심 소체, 기저 기관 및 PCM과 연결되어 있습니다. 그것은 종종 많은 단백질의 centrosomal 레벨이 일시적으로 centrosomal 타겟팅 메커니즘 및 / 또는 중심체에서 프로 테오 저하에 의해 규제된다는 점에 유의한다. 중요한 것은, 이러한 PLK4, Mps1, Sas6 및 CP110의 여러 단백질의 centrosomal 수준의 변동세포주기 t의 상이한 점은 중심 소체 조립체 5,17-22을 조절하는 것이 중요 할 것처럼,이 열화를 방지 centrosomal Mps1의 경우에 과량의 중심 소체 (19)의 형성을 이끈다. 한편, 여러 가지 단백질의 세포질 분획 centrosomal 풀에 비해 덜 불안정하다. 예를 들어 하향 조절 Centrin 2 (Cetn2)의 매개 된 siRNA는 그 전체 셀 레벨 (23)에서 큰 감소에도 불구 중심 소체에서 단백질의 수준이 적당하게 감소되었다. 오히려 그들의 중심체 특정 기능을 평가할 때 전 세포 단백질 수준을 측정하는 것보다 중심체에서 centrosomal 단백질 수준에서의 변화를 측정하는 것이 중요하다. 본 연구에서 우리는 중심체에서 단백질의 상대적인 수준을 정량화하는 간접 면역 형광 (IIF)를 사용하여 분석을 개발 하였다. 이 분석은 다른 샘플로부터 아르 세포를 분석하는데 특히 개발따라서 동시에 묘화 될 수 없다. 이들 샘플은 상이한 시점에서 수집 된 다른 시약 (즉, 약물 대 제어) 처리 한 세포가 될 수있다 (즉, 체이스 대 펄스) 또는 세포주기의 상이한 위상에있다. 이 분석의 원리는 배경 형광 강도 보정 소 영역에서 단백질에 대응하고, 그 레벨 선택 실험 조건에서 변화하지 않는 또 다른 단백질에 대해 동일한 값이 정상화 측정에있다. 중심체 생물학의 여러 연구는 최근에 후보 단백질 24 ~ 27의 중심체 고유의 기능을 결정하기 위해, 모두 라이브 또는 고정 세포에서 다양한 정량적 현미경 기술을 활용했다. 이러한 분석과 유사하게, 본 기술은 또한 시험 단백질의 백그라운드 보정 된 형광 강도를 측정한다. 그러나,이 분석에서 내부 표준을 사용하여 정규화 포함될 가능성이 큰 것이라고 알려정확성과 커버 슬립 상에 두 개의 서로 다른 두 개의 서로 다른 시료를 분석의 신뢰도. 또한, 중심체의 단백질 수준을 조사 이외에 약간의 조정으로이 방법은 실험 조건의 다양한 세트 또는 다른 부위에서 세포에 적용될 수있다. 여기서 우리는 다른 세포주기 단계에서 세포를 비교하는 BrdU의 펄스 체이스 전략과 우리의 양적 현미경 분석을 결합한다. 대신에, 다양한 세포주기 시점 공부 비동기식 성장하는 세포를 표준 세포주기 정지 및 해제 방법을 사용하는 S 단계에서 세포를 라벨 BrdU를 배양하고, 표지화 된 세포는 다양한 시간 (전형적으로 4-6 시간) 미국 쫓기는. 표지 된 세포의 대부분은 즉시 펄스 후 S 상에있을 것입니다. 체이스 후, 표지 된 세포는 형태 학적 특성 NUC에 대한 중심체의 이러한 된 직후 위치하여 확인할 수 있습니다 늦게 S, G2, 또는 유사 분열에 될 수 있도록 체이스의 길이는 선택레이, 중심체 사이 거리 등의 염색체 축합 따라서, 추적의 길이를 S, G2 및 특정 세포 유형의 M상의 평균 지속 기간에 의존한다. 이 접근법 등 히드 록시, aphidicolin, nocodazole 같은 세포주기 억제제를 방지하기 때문에, 더욱 중요한 생리 학적 세포주기 분석을 허용한다. 따라서, 우리는 단독 정량적 형광 현미경 분석법 또는 BrdU의 펄스 - 체이스 분석과 조합하여, 정확하게 섭동 세포주기 동안 후보 단백질 centrosomal 수준의 상대적인 변화를 측정하기위한 간단하지만 강력한 방법 인 것은 여기에서 설명한다. 우리는이 어 세이를 이용하여, VDAC3, 우리가 최근 16, 28을 미토콘드리아에 부가 중심체에서 식별 centrosomal 단백질 수준을 측정 하였다. 여기에서 얻어진 결과 VDAC3의 centrosomal 풀 저하에 의해 규제되는 우리의 이전의 관찰을 확인하고 또한 세포주기 dependen에 변화t 방식 (16)은 또한이 방법의 적용 성을 검증.

<table><tbody><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F8141</td><td>물 속에 1 mg/ml 재고</td></tr><tr><td>DMSO</td><td></td><td>Sigma D2650</td><td></td></tr><tr><td>MG115</td><td>Sigma</td><td>SCP0005</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>BrdU</td>에 10 mM 재고 <td>Sigma</td><td>B5002</td> DMSO Anti-&#947에 <td>10 mM 재고</td></tr><tr><td>;-tubulin (마우스 단클론, 클론 GTU 88)</td><td>Sigma</td><td>T 6557</td><td>1:200 IIF 차단 버퍼&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-VDAC3 (토끼 다클론성)&nbsp;</td><td>Aviva Systems Biology</td><td>ARP35180-P050</td><td>IIF 차단 버퍼에서 1:50, WB 차단 버퍼에서 1:1,000</td></tr><tr><td>Anti-Sas6 (마우스 단클론)&nbsp;</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-81431</td><td>1:100 in IIF 차단 버퍼</td></tr><tr><td>Anti-Cep135 (토끼 다클론)</td><td>Abcam</td><td>ab-75005</td><td>1:500 in IIF 차단 버퍼</td></tr><tr><td>Anti-BrdU (랫 단클론)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>1:250 in IIF 차단 버퍼</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A21093</td><td>1:200 in IIF 차단 버퍼</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) 항체</td><td>Life technologies</td><td>A21202</td><td>1:1,000 in IIF 차단 버퍼</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 당나귀 Anti-Mouse IgG (H+L) 항체</td><td>Life technologies</td><td>A21203</td><td>1:1,000 in IIF 차단 버퍼</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 당나귀 Anti-Rabbit IgG (H+L) 항체</td><td>Life technologies</td><td>A21206</td><td>1:1,000 in IIF 차단 버퍼</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21207</td><td>1:1,000 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-&#947;-tubulin (rabbit polyclonal)</td><td>Sigma</td><td>T5192</td><td>1:1,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-&#945;-tubulin (mouse monoclonal, DM1A)</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1:20,000 in WB 블로킹 버퍼</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A10043</td><td>1:10,000 in WB 블로킹 버퍼</td></tr><tr><td>Mouse IgG (H& L) 항체 IRDye800CW Conjugated</td><td>Rockland 항체</td><td>610-731-002</td><td>1:10,000 in WB 차단 버퍼</td></tr><tr><td>SlowFade Gold Antifade 시약&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>S36936</td><td>마운팅 미디어</td></tr><tr><td>라운드 커버슬립 12CIR.-1</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX-81 현미경</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retiga ExiFAST 1394 IR 카메라</td><td>QImaging&nbsp;</td><td>32-0082B-238</td><td></td></tr><tr><td>100X Plan Apo 오일 이멀젼 대물렌즈</td><td>Olympus</td><td></td><td>1.4 개구수</td></tr><tr><td>슬라이드북 소프트웨어 패키지</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey IR 이미징 시스템</td><td>Li-cor Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid (BCA) 분석</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>U-MNU2 Narrow UV cube</td><td>올림푸스</td><td>U-M622</td><td>필터</td></tr><tr><td>U-MNU2 내로우 블루 큐브</td><td>올림푸스</td><td>U-M643</td><td>필터</td></tr><tr><td>U-MNU2 내로우 그린 큐브</td><td>올림푸스</td><td>U-M663</td><td>필터</td></tr></tbody></table>

정량 면역 형광 분석은 중심체에서 단백질 수준의 변화를 측정하기 위해

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

중심체는 게놈 무결성을 유지 또는 세포에서 감각 기능을 용이하게하기 위해 차 섬모를 조립하는 유사 분열 스핀들의 기둥 역할을 작지만 중요한 소기관이다. 단백질의 수준은 다른 위치들에서보다 .cellular 중심체에서 다르게 조절 될 수 있고, 세포주기의 여러 다른 지점에서의 centrosomal 단백질 레벨의 변화는 중심 소체 조립체의 적절한 조절에 중요​​한 것으로 보인다. 우리는 세포주기의 다른 단계에서와 같은 각종 시약으로 처리 한 후 다른 샘플들로부터 고정 된 세포 중심체에서 단백질의 상대 수준의 변화를 측정하는 정량적 형광 현미경 분석법을 개발 하였다. 이 분석의 원리는 소 영역에서의 단백질에 대응하는 배경 보정 된 형광 강도를 측정에 놓여, 및 선택된 실험 C 하에서 변하지 않는 또 다른 단백질에 대해 동일한 측정을 정상화 그ondition. BrdU의 펄스와 교란 세포주기를 연구 추격 전략과 함께이 분석을 활용하여, 우리는 정량적으로 특별히 중심체에서 프로 테아 좀 중재 저하에 의해 가능성이 VDAC3의 centrosomal 풀 세포주기 동안 중심체에서 규제되고 우리의 최근의 관찰을 검증했다.

우리의 최근의 연구 VDAC3, 미토콘드리아 porins 16, 28 중 하나의 새로운 centrosomal 현지화 및 기능을 확인했다. VDAC3 특이 항체를 이용한 RPE1 세포를 포함한 여러 포유 동물 세포의 면역 염색 띄는 centrosomal 염색 비교적 약한 미토콘드리아 염색을 보여 주었다. 우리는 또한 centrosomal VDAC3이 우선적으로 어머니 중심 소체 및 내인성 모두의 centrosomal 풀과 연관된 및 ectopically VDAC3이 저하 (16)에 의해 규제되는 표현되는 것을 보여 주었다. 양적 IIF 분석을 검증하기 위해 우리는 S 상에있는 세포의 중심체 관련 VDAC3 풀의 변화를 조사했다. 여기서, 비동기식 성장 RPE1 세포는 프로 테아 좀 억제제 MG115 또는 4 시간 동안 제어 중 DMSO 용매로 처리 하였다. S 상과 중심체 어셈블리를 겪고에있는 세포에 대한 우리의 분석을 제한하려면, 우리는...

여기에서는 단백질의 형광 강도를 적절한 내부 표준물질의 농도로 정규화하여 중심체에서 단백질의 수준 변화를 측정하기 위해 새로운 정량적 형광 분석법이 개발되었습니다.

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 조건에서 Centrosomes에서 단백질 수준의 상대적 변화를 정량화하는 것입니다. 예를 들어, 프로테아좀이 억제된 후 세포주기의 특정 지점에서 커버 슬립에서 자라는 세포를 프로테아좀 억제제 MG one 15 또는 대조 용매 DMSO로 먼저 처리함으로써 달성됩니다. 그런 다음 즉시 BRDU를 두 세포에 추가하고 세포 배양 인큐베이터에서 4시간 동안 배양합니다.두 번째 단계는 커버 슬립을 24웰 플레이트로 옮겨 셀을 고정하는 것입니다. 다음으로, 세포를 BRDU 및 관심 단백질에 대한 항체로 염색한 다음 해당 2차 항체로 염색합니다. 마지막 단계는 형광 현미경 및 디지털 이미징 소프트웨어를 사용하여 BRDU 양성 세포의 이미지를 획득하여 각 샘플의 세포에 동일한 노출 시간과 Z축 길이를 적용하는 것입니다.그런 다음 이미지를 분석하여 romal VDA C3의 상대적 수준을 정량화합니다. 궁극적으로, 정량적 면역형광 현미경 검사는 S기 동안 프로테아좀이 억제될 때 VDA C3의 Centro somal pool이 2배 증가한다는 것을 보여주기 위해 사용됩니다. 유세포 분석, 면역 블로팅 또는 정량 현미경과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술이 두 개의 서로 다른 커버 슬립에서 처리되는 두 개의 서로 다른 처리된 샘플에서 단백질의 상대적 romal 수준을 분석한다는 것입니다. 이 방법은 내부 표준물질에 대한 정규화를 사용하여 두 개의 실험 세포 집단을 처리해야 할 필요성을 제어합니다.이와는 별개로, 이 방법은 중심체에서 특정 단백질의 조절에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 다른 세포 내 구조와 같은 다른 상황에도 적용하거나 세포 내의 여러 위치에서 발견되는 특정 단백질 풀을 검사하는 데 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 연구실의 박사후 연구원인 Schu majumder가 할 것입니다: 실험 통로를 두 번 10에서 5번째 비동기식으로 성장시키는 RPE 1개를 이전에 준비된 35mm 접시에 뚜껑을 덮고 2ml의 완전한 배지로 세포를 성장시킵니다.24시간마다 배양 배지를 44시간 후에 새로운 예열 배지로 교체하십시오. 배양 배지를 5 마이크로 몰의 최종 농도에서 0.05 % DMSO 또는 MG one 15를 함유 한 완전한 배지로 교체하고, 동시에 40 마이크로 몰의 최종 농도에서 세포에 BRDU를 첨가하여 4 시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 각 커버 슬립을 24웰 플레이트로 옮깁니다.각 웰에 500마이크로리터의 사전 경운된 메탄올을 추가하고 플레이트를 섭씨 영하 20도에서 배양하여 세포를 고정합니다. 10분 후 즉시 500마이크로리터의 세척 버퍼로 커버 슬립을 세 번 세탁하십시오. 덮개에 고정된 세포를 배양하고 세포가 배양하는 동안 30분 동안 200마이크로리터의 차단 버퍼를 넣습니다.빈 1000 마이크로 리터 피펫 팁 상자의 아래쪽 절반에 젖은 종이 타월을 놓아 가습 챔버를 준비합니다. 랙 표면에 퍼퓸 스트립을 놓고 차단 버퍼로 희석된 토끼 안티 V DDA 3 및 마우스 안티 감마 튜불린 항체 20마이크로리터 방울을 파라폼에 추가합니다. 차단 후 항체 용액의 각 방울에 커버 슬립을 뒤집습니다.셀이 잠겨 있는지 확인하고 팁 상자의 뚜껑을 닫습니다. 1차 항체가 있는 세포를 가습실에서 섭씨 4도의 온도에서 밤새 배양합니다. 커버 슬립을 다시 뒤집어 24로 되돌립니다.커버 슬립을 잘 세척 한 다음 2 차 항체의 150 마이크로 리터 용액에 배양하고 실온에서 1 시간 동안 차단 버퍼에 희석하여 배양 후 세척 버퍼로 커버 슬립을 세 번 세척합니다. 염색된 RPE one 세포를 섭씨 영하 20도에서 냉각된 500마이크로리터의 메탄올로 고정합니다. 세포가 10분 동안 고정되면 세척 버퍼에서 3회 세척합니다.다음으로, 200마이크로리터의 2개의 정상 HCL에 세포를 30분 동안 배양합니다. 실온에서 300 마이크로 리터의 1 몰 트리스 CL pH 8로 세포를 중화하고 세포를 3 회 세척합니다. 세척 버퍼를 사용하면 실온에서 30분 동안 200마이크로리터의 차단 버퍼로 셀을 차단합니다.차단 후 가습 챔버에서 rat anti BRDU 항체와 차단 버퍼로 세포를 섭씨 37도에서 45분 동안 배양합니다. 덮개 슬립을 24로 되돌립니다. 글쎄, 접시에 담아 세포를 씻으십시오.다음으로, 150마이크로리터의 차단 완충액에 희석된 2차 항체로 배양합니다. 24 웰 접시에 실온에서 1 시간 동안. 그런 다음 유리 현미경에 Antifa 시약이 포함된 장착 용액의 6마이크로리터 방울인 XPBS 스폿 하나로 커버 슬립을 세 번 세척합니다.슬라이드 반전 커버 슬립은 셀 쪽이 장착 용액 위로 아래를 향하도록 합니다. 부드러운 세척 티슈로 커버 슬립을 슬라이드에 부드럽게 눌러 과도한 액체를 제거하고 커버 슬립을 현미경에 밀어 넣습니다. 커버 슬립의 가장자리를 따라 매니큐어를 바르면 됩니다.1.4 개구수가 있는 100 x plan APO 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 실온에서 BRDU positive RPE one cells의 이미지를 획득합니다. 0.2 미크론 스텝 크기로 Z축을 따라 적절한 상단 및 하단 초점면을 결정하고 Z축을 따라 이미지를 획득합니다. 다음으로, Z축을 따라 수집된 모든 이미지 스택의 디콘볼루션을 수행합니다.각 이미지의 총 강도 투영을 구합니다. 중심체가 2미크론 미만으로 떨어져 있는 세포에 대해 Z축을 따라 쌓습니다. 두 중심체 주위에 한 면당 20-30픽셀의 작은 사각형을 그리고 선택한 영역을 표시합니다.첫 번째 사각형 주위에 한 변당 24-35픽셀의 더 큰 사각형을 그리고 큰 사각형의 선택한 영역을 표시합니다. 그런 다음 각 fluoro four의 면적과 총 형광 강도를 얻습니다. 각 상자에서 각 형광의 배경 보정된 형광 강도를 계산합니다. 4.마지막으로, 형광의 배경 보정된 형광 강도의 비율을 계산하여 VDA C3의 정규화된 형광 강도를 얻습니다. 선택된 내부 표준 이미지에 사용된 4개의 플루오로 이미지는 비동기적으로 성장하는 RPE의 무작위 필드에서 캡처되었으며, BRDU와 프로테아솜 억제제 MG one 15 또는 대조 용매 DMSO 및 디스플레이 DNA 및 BRDU와 함께 배양된 세포 1개를 캡처했습니다. 배경은 Centro Somal에 해당하는 형광 강도를 보정했습니다.VD 3은 MG 1 15 처리 세포에서 약 2.5 배 더 높았으며, 이 상자 및 수염 다이어그램에서 입증 된 바와 같이 대조 세포에서 더 높았습니다. 감마 튜불린의 형광에 대한 총 VD 3 형광에 대한 데이터를 정규화했을 때 폴드가 증가하여 약 2배로 약간 떨어졌습니다. non romal cyte 또는 VD three의 총 세포 수준에서의 VD C3 염색은 프로테아솜 억제의 영향을 받지 않았다.따라서, VDA C3의 romal pool은 proteasome mediated degradation에 의해 조절됩니다. 이 절차를 시도하는 동안 테스트 단백질과 내부 표준물질에 대한 항체는 서로 다른 숙주 종에서 증가해야 하며, 디지털 이미징의 영향을 최소화하기 위해 제왕절개 횟수 및 노출 시간과 같은 동일한 이미징 매개변수를 사용하여 두 샘플의 이미지를 획득해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 단순 포진 바이러스-1 감염에서 감염된 세포 단백질 0, ICP0 이동을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. Post-de novo synthesis, ICP0는 핵으로 전위되었다가 나중에 감염이 진행되는 동안 세포질로 이동합니다. 면역형광 현미경 검사는 단백질의 세포 내 국소화를 밝히고 분석하여 감염 단계 전반에 걸친 단백질의 이동에 대한 통찰력을 제공합니다.

감염된 세포의 바이러스 단백질 국소화를 위한 면역형광 기술

형광 표지 된 세포의 다중 이미지 기반 분석을 가능하게하는 유연한 정보학 워크 플로우입니다 발표. 워크 플로는 핵 및 세포질 마커를 정량화하고 이러한 구획 사이에 마커 전위를 계산한다. 절차 96- 웰 포맷으로 간접 면역 형광에 의해 마커 검출 용 siRNA를 안정적인 방법을 사용하여 세포의 섭동 제공된다.

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포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 조직 샘플 (FFPE)에 관심사의 단백질을 측정 하는 수단으로 이미지 분석와 결합 하 여 면역 형광 조직학 유효성을 양적 immunoblotting 사용 하 여를 설명 합니다. 우리의 결과 일상적인 생 검 견본에 있는 바이오 마커 단백질의 상대적 수량을 ascertaining에 대 한 면역 형광 조직학의 유틸리티를 보여 줍니다.

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여기, 우리 면역 형광 염색 법을 사용 하 여 마커 단백질, confocal 현미경 검사 법 및 컴퓨터 기반 분석 시 냅 스 단백질의 분포를 결정 하는 양적 접근 방식을 설명 합니다.

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