정량 면역 형광 분석은 중심체에서 단백질 수준의 변화를 측정하기 위해

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 조건에서 Centrosomes에서 단백질 수준의 상대적 변화를 정량화하는 것입니다. 예를 들어, 프로테아좀이 억제된 후 세포주기의 특정 지점에서 커버 슬립에서 자라는 세포를 프로테아좀 억제제 MG one 15 또는 대조 용매 DMSO로 먼저 처리함으로써 달성됩니다. 그런 다음 즉시 BRDU를 두 세포에 추가하고 세포 배양 인큐베이터에서 4시간 동안 배양합니다.

두 번째 단계는 커버 슬립을 24웰 플레이트로 옮겨 셀을 고정하는 것입니다. 다음으로, 세포를 BRDU 및 관심 단백질에 대한 항체로 염색한 다음 해당 2차 항체로 염색합니다. 마지막 단계는 형광 현미경 및 디지털 이미징 소프트웨어를 사용하여 BRDU 양성 세포의 이미지를 획득하여 각 샘플의 세포에 동일한 노출 시간과 Z축 길이를 적용하는 것입니다.

그런 다음 이미지를 분석하여 romal VDA C3의 상대적 수준을 정량화합니다. 궁극적으로, 정량적 면역형광 현미경 검사는 S기 동안 프로테아좀이 억제될 때 VDA C3의 Centro somal pool이 2배 증가한다는 것을 보여주기 위해 사용됩니다. 유세포 분석, 면역 블로팅 또는 정량 현미경과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술이 두 개의 서로 다른 커버 슬립에서 처리되는 두 개의 서로 다른 처리된 샘플에서 단백질의 상대적 romal 수준을 분석한다는 것입니다. 이 방법은 내부 표준물질에 대한 정규화를 사용하여 두 개의 실험 세포 집단을 처리해야 할 필요성을 제어합니다.

이와는 별개로, 이 방법은 중심체에서 특정 단백질의 조절에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 다른 세포 내 구조와 같은 다른 상황에도 적용하거나 세포 내의 여러 위치에서 발견되는 특정 단백질 풀을 검사하는 데 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 연구실의 박사후 연구원인 Schu majumder가 할 것입니다: 실험 통로를 두 번 10에서 5번째 비동기식으로 성장시키는 RPE 1개를 이전에 준비된 35mm 접시에 뚜껑을 덮고 2ml의 완전한 배지로 세포를 성장시킵니다.

24시간마다 배양 배지를 44시간 후에 새로운 예열 배지로 교체하십시오. 배양 배지를 5 마이크로 몰의 최종 농도에서 0.05 % DMSO 또는 MG one 15를 함유 한 완전한 배지로 교체하고, 동시에 40 마이크로 몰의 최종 농도에서 세포에 BRDU를 첨가하여 4 시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 각 커버 슬립을 24웰 플레이트로 옮깁니다.

각 웰에 500마이크로리터의 사전 경운된 메탄올을 추가하고 플레이트를 섭씨 영하 20도에서 배양하여 세포를 고정합니다. 10분 후 즉시 500마이크로리터의 세척 버퍼로 커버 슬립을 세 번 세탁하십시오. 덮개에 고정된 세포를 배양하고 세포가 배양하는 동안 30분 동안 200마이크로리터의 차단 버퍼를 넣습니다.

빈 1000 마이크로 리터 피펫 팁 상자의 아래쪽 절반에 젖은 종이 타월을 놓아 가습 챔버를 준비합니다. 랙 표면에 퍼퓸 스트립을 놓고 차단 버퍼로 희석된 토끼 안티 V DDA 3 및 마우스 안티 감마 튜불린 항체 20마이크로리터 방울을 파라폼에 추가합니다. 차단 후 항체 용액의 각 방울에 커버 슬립을 뒤집습니다.

셀이 잠겨 있는지 확인하고 팁 상자의 뚜껑을 닫습니다. 1차 항체가 있는 세포를 가습실에서 섭씨 4도의 온도에서 밤새 배양합니다. 커버 슬립을 다시 뒤집어 24로 되돌립니다.

커버 슬립을 잘 세척 한 다음 2 차 항체의 150 마이크로 리터 용액에 배양하고 실온에서 1 시간 동안 차단 버퍼에 희석하여 배양 후 세척 버퍼로 커버 슬립을 세 번 세척합니다. 염색된 RPE one 세포를 섭씨 영하 20도에서 냉각된 500마이크로리터의 메탄올로 고정합니다. 세포가 10분 동안 고정되면 세척 버퍼에서 3회 세척합니다.

다음으로, 200마이크로리터의 2개의 정상 HCL에 세포를 30분 동안 배양합니다. 실온에서 300 마이크로 리터의 1 몰 트리스 CL pH 8로 세포를 중화하고 세포를 3 회 세척합니다. 세척 버퍼를 사용하면 실온에서 30분 동안 200마이크로리터의 차단 버퍼로 셀을 차단합니다.

차단 후 가습 챔버에서 rat anti BRDU 항체와 차단 버퍼로 세포를 섭씨 37도에서 45분 동안 배양합니다. 덮개 슬립을 24로 되돌립니다. 글쎄, 접시에 담아 세포를 씻으십시오.

다음으로, 150마이크로리터의 차단 완충액에 희석된 2차 항체로 배양합니다. 24 웰 접시에 실온에서 1 시간 동안. 그런 다음 유리 현미경에 Antifa 시약이 포함된 장착 용액의 6마이크로리터 방울인 XPBS 스폿 하나로 커버 슬립을 세 번 세척합니다.

슬라이드 반전 커버 슬립은 셀 쪽이 장착 용액 위로 아래를 향하도록 합니다. 부드러운 세척 티슈로 커버 슬립을 슬라이드에 부드럽게 눌러 과도한 액체를 제거하고 커버 슬립을 현미경에 밀어 넣습니다. 커버 슬립의 가장자리를 따라 매니큐어를 바르면 됩니다.

1.4 개구수가 있는 100 x plan APO 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 실온에서 BRDU positive RPE one cells의 이미지를 획득합니다. 0.2 미크론 스텝 크기로 Z축을 따라 적절한 상단 및 하단 초점면을 결정하고 Z축을 따라 이미지를 획득합니다. 다음으로, Z축을 따라 수집된 모든 이미지 스택의 디콘볼루션을 수행합니다.

각 이미지의 총 강도 투영을 구합니다. 중심체가 2미크론 미만으로 떨어져 있는 세포에 대해 Z축을 따라 쌓습니다. 두 중심체 주위에 한 면당 20-30픽셀의 작은 사각형을 그리고 선택한 영역을 표시합니다.

첫 번째 사각형 주위에 한 변당 24-35픽셀의 더 큰 사각형을 그리고 큰 사각형의 선택한 영역을 표시합니다. 그런 다음 각 fluoro four의 면적과 총 형광 강도를 얻습니다. 각 상자에서 각 형광의 배경 보정된 형광 강도를 계산합니다. 4.

마지막으로, 형광의 배경 보정된 형광 강도의 비율을 계산하여 VDA C3의 정규화된 형광 강도를 얻습니다. 선택된 내부 표준 이미지에 사용된 4개의 플루오로 이미지는 비동기적으로 성장하는 RPE의 무작위 필드에서 캡처되었으며, BRDU와 프로테아솜 억제제 MG one 15 또는 대조 용매 DMSO 및 디스플레이 DNA 및 BRDU와 함께 배양된 세포 1개를 캡처했습니다. 배경은 Centro Somal에 해당하는 형광 강도를 보정했습니다.

VD 3은 MG 1 15 처리 세포에서 약 2.5 배 더 높았으며, 이 상자 및 수염 다이어그램에서 입증 된 바와 같이 대조 세포에서 더 높았습니다. 감마 튜불린의 형광에 대한 총 VD 3 형광에 대한 데이터를 정규화했을 때 폴드가 증가하여 약 2배로 약간 떨어졌습니다. non romal cyte 또는 VD three의 총 세포 수준에서의 VD C3 염색은 프로테아솜 억제의 영향을 받지 않았다.

따라서, VDA C3의 romal pool은 proteasome mediated degradation에 의해 조절됩니다. 이 절차를 시도하는 동안 테스트 단백질과 내부 표준물질에 대한 항체는 서로 다른 숙주 종에서 증가해야 하며, 디지털 이미징의 영향을 최소화하기 위해 제왕절개 횟수 및 노출 시간과 같은 동일한 이미징 매개변수를 사용하여 두 샘플의 이미지를 획득해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.