일시적 또는 영구적 인 뇌허혈 모델에서 백혈구 부분 집단의 Stereological 및 유동 세포 계측법 특성

이 절차의 전반적인 목표는 두 가지 다른 방법론을 통해 허혈성 뇌의 마우스 골수성 세포 부분 집합을 특성화하는 것입니다. 첫째, 주로 뇌 피질에 영향을 미치는 경색증을 유발하는 총경동맥(CCA)과 중대뇌동맥의 원위 몸통 또는 MCA를 모두 폐색하여 뇌허혈의 영구적인 모델을 도입합니다. 그런 다음 골수성 세포 하위 집합의 스테레오 논리적 정량화를 위해 뇌의 연속 관상 절편을 관심 세포에 대한 면역 염색한 다음 광학 분획기 접근 방식으로 침투된 세포를 정량화합니다.

또는 기계적 해리를 통해 새로운 뇌 조직에서 골수성 세포를 분리한 다음 유세포 분석으로 염색 및 분석할 수 있습니다. 궁극적으로, 뇌허혈 후 마우스 뇌에 침투하는 특정 골수성 세포 subset의 정확한 정량화와 상세한 정성적 특성화는 각각 입체 정량화 및 다중 매개변수 유세포 분석을 통해 달성할 수 있습니다. 기존의 다른 모델에 비해 이 허혈 연속 모델의 주요 장점은 우리의 기술이 다른 방법보다 사망률이 현저히 낮아 연구에 필요한 동물의 수를 최소화한다는 것입니다.

이 분야는 뇌졸중 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있는 방법이며, 예를 들어 뇌 손상에서 미세 재활성화, 적혈성 대식세포의 유출 또는 호중구의 역할은 무엇입니까? 이 논문에서 제시된 다파라메트릭 세포 분석 접근법에 대한 정확한 신학적 정량화는 CE 허혈에 대한 선천성 면역 반응 모두에서 골수성 세포 집단의 수, 표현형 및 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. CCA를 먼저 접합하려면 수술용 현미경으로 동물의 목 복부 표면 주위를 1cm 정중선 절개를 만듭니다.

절개가 끝나면 6개의 제로 나일론 봉합사를 사용하여 영구 매듭으로 왼쪽 CCA를 폐색하여 원위 MCA를 결찰합니다. 다음으로 측두근을 오른쪽에서 왼쪽으로 수평 절개합니다. 그런 다음 측두근의 오른쪽에 두 번째 수직 절개를 만듭니다.

측두 정맥이 절단되지 않도록 주의하십시오. 측두근을 두개골에서 분리하고 봉합사로 잡아 두개골 표면을 깨끗하게 유지합니다. 그런 다음 저온 멸균 식염수로 두개골을 세척하여 두개골 투명도를 통해 왼쪽 MCA의 정확한 위치를 감지합니다.

MCA가 확인되면 스테인리스강 버를 사용하여 접합궁과 편평골 사이의 전두엽에서 1mm 원형 개두술을 수행합니다. MCA가 노출되는 두개골을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 9 제로 나일론 봉합사를 사용하여 영구적인 매듭으로 전두엽과 후방 MCA 분기점 사이의 분기점 직전에 원위 몸통의 왼쪽 MCA를 폐색합니다.

뇌를 제거하려면, 안락사된 쥐의 척수 바로 위의 목을 베고 피부를 뒤쪽 전방으로 절개하여 두개골을 노출시킨다. 그런 다음 측벽과 두개골 기저부의 접합부를 두 개의 측면 절단하고 작은 뼈 조각을 제거합니다. 다음으로, 시상 봉합선을 따라 두개골을 절단하고 집게를 사용하여 각 반구 위에 있는 두개골을 제거하여 뇌를 노출시킵니다.

주걱을 사용하여 두개골에서 뇌를 분리하고 4% PFA 용액으로 옮깁니다. 3시간 후, PFA를 제거하고 뇌를 동결 보호하기 위해 30% 자당 용액으로 뇌를 배양합니다. 48시간 후, 자당 용액을 제거하고 뇌를 섭씨 영하 40도의 isop pentane에서 빠르게 동결한 다음 냉동 마이크로톰을 사용하여 30마이크로미터 관상 동맥 뇌 절편을 만듭니다.

cryo 방부제 용액에서 10개의 연속 세트를 수집합니다. 각 시리얼 세트는 약 14-16개의 코로나 슬라이스로 구성되며 인터 슬라이스 거리는 300마이크로미터입니다. bgma 후방의 1.94에서 음의 2.46 사이의 마우스 뇌의 적절한 샘플링을 보장하여 침투된 호중구의 총 수를 추정합니다.

광학 분획기에 의한 MCA 폐색 후, 기존의 면역형광 기법에 의해 1차 호중구를 rat anti LY six G 항체 및 적절한 2차 항체로 부동 절편에 면역 염색합니다. 그런 다음 경색 부위가 오른쪽에 배치된 상태에서 뇌 단면을 Super Frosts 현미경 슬라이드에 장착하고 스테레오 조사자 소프트웨어를 엽니다. 그런 다음 도구 직렬 섹션 관리자 메뉴를 클릭하고 새 섹션 버튼이 있는 새 섹션을 추가합니다.

10번째 슬라이스 샘플링 분율 하나에 대해 평가 간격을 10으로 설정합니다. 그런 다음 contour down 메뉴에서 infarcted area contour 도구를 선택합니다. 10 x 대물렌즈 아래의 경색 영역을 윤곽으로 그립니다.

그런 다음 현미경과 대물렌즈 메뉴에서 100 x 대물렌즈로 전환합니다. probes 메뉴에서 호중구를 정량화하려면 이제 광학 분획기를 선택하고 X 및 Y 그리드 크기 모두에 대해 카운팅 프레임의 XY 배치를 230으로 설정합니다. 이제 마커 바에서 호중구 버튼을 선택하고 경색 부위에 염색된 호중구를 표시합니다.

정량화 결과를 스프레드시트 파일로 내보내 뇌를 단일 세포 현탁액으로 해리합니다. 방금 시연한 대로 뇌를 제거한 후, 뇌 허혈성 쥐의 뇌에서 동측 피질의 코어와 경색 부위를 해부합니다. 뇌 조직의 무게를 측정하고 실험 그룹 간의 정상화를 위해 호출당 5ml의 얼음처럼 차가운 RPMI에 넣은 다음 테프론 유봉이 있는 조직 분쇄기를 사용하여 조직을 단일 세포 현탁액으로 해리합니다.

세포 현탁액을 50ml 초원심분리기 튜브로 옮기고 시료에 호출 용액당 5ml의 RPMI를 더 추가합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 7, 800GS 및 섭씨 25도에서 30분 동안 원심분리한 후. 수초에 해당하는 흰색 층이 용액의 맨 위에 나타나는지 확인합니다.

미엘린 층을 조심스럽게 제거하고 40마이크로미터 나일론 메쉬 스트레이너를 통해 펠릿화된 세포를 포함한 전체 세포 현탁액을 여과합니다. 10ml의 RPMI로 스트레이너를 세척하여 모든 세포가 메쉬를 통해 여과되었는지 확인한 다음 용액을 50ml 튜브로 옮깁니다. 20ml의 RPMI를 세포에 첨가한 다음 세포를 회전시킨 후 백혈구 펠릿을 재현탁합니다.

PBS 1밀리리터에서 실온에서 4밀리리터의 용해 완충액에 2-3분 동안 세포를 배양하여 적혈구를 용해한 다음 세포를 스핀다운합니다. 1%BSA가 포함된 200마이크로리터의 PBS에 있는 세포와 적절한 항체를 얼음에 표식합니다. 그런 다음 45분 후 1ml의 차가운 PBS로 샘플을 세척하고 Resus는 유세포 분석을 위해 100마이크로리터의 팩스 흐름 버퍼에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

이 모델은 카발리에리 방법으로 추정된 바와 같이 중대뇌동맥 폐색 후 24시간에 재현성이 높은 경색 부피를 특징으로 합니다. 이전 연구와 일치하는 nial 염색 절편에서 호중구 침윤은 경색 크기와 직접적인 상관관계가 있습니다. 또한, 백혈구 분리 및 유세포 분석법 특성 분석을 통해 허혈성 마우스의 IPS 병변 반구의 피질에서 골수성 세포를 분리할 수 있으며, 이는 세포 현탁액에서 발견되는 총 이벤트의 10-30%를 차지하고 세포 파편과 관련된 낮은 전방 산란 매개변수를 나타냅니다.

CD 11 B 양성 세포는 더 높은 전방 산란 값을 가지며, 이는 세포 파편이 이 마커로 표지되지 않았음을 시사하며, 앞서 지적한 바와 같이, FSC 역치를 200개의 호중구로 설정함으로써 추가 분석에서 제외될 수 있음을 시사하며, LY 6 G 양성 세포는 이러한 뇌허혈 모델을 사용하여 허혈성 마우스 뇌에서 MCA 폐색 후 24시간에 발견되는 가장 많은 침투 세포 집단입니다. CD 11 B 긍정적 인 CD 45 높은 세포의 70-80 %를 포함합니다. 나머지 세포는 대부분 CD 11 B, 양성 CD 45, 높은 LY 6G, 음성 6 C 높은 전염증성 단핵구의 하위 집단이며, 이는 중대뇌 동맥 폐색 후 24시간에서 48시간 사이에 허혈성 뇌 영역에서 높은 수로 발견됩니다. 이 P-M-C-A-O 모델은 유세포 분석 절차에 따라 적절하게 수행되면 30분 이내에 수행할 수 있습니다.

특정 세포 하위 집합의 정렬과 같은 다른 방법을 수행하여 이 모델 시스템에서 골수성 세포의 발현 패턴, 대사 변화 또는 아세트 활성이 무엇인지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후 허혈 모델을 만드는 방법과 가장 중요하게는 세레 허혈 후 마우스 뇌 손상 또는 TPE에서 두 가지 다른 접근 방식으로 침투 골수성 세포의 수와 표현형을 특성화하는 방법을 잘 이해했습니다.