Name: 일시적 또는 영구적 인 뇌허혈 모델에서 백혈구 부분 집단의 Stereological 및 유동 세포 계측법 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: 학습하세요 뇌허혈 마우스 모델에서 골수성 세포 아군집을 입체측정법과 유동세포측정법으로 정량화하고 특성화하는 방법을. 이 기법은 뇌졸중 후 면역 반응 연구에 필수적입니다.

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이 작업은 스페인 경제경쟁력부 CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) 및 RENEVAS RD06/0026/0005 (IL)와 마드리드 지방 정부 S2010/BMD-2336 (MAM) 및 S2010/BMD-2349 (IL)의 보조금으로 지원되었습니다. IB와 MIC는 스페인 경제경쟁력부(Spanish Ministry of Economy and Competitiveness)의 펠로우입니다.

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

여기에서 소개 뇌허혈 모델은 높은 재현성 경색 볼륨이 24 ~ 48 시간과 다른 접근 방법 8,15,17으로 MCA 결찰 후 7 일 결정 제공합니다. 이 MCAO 모델 연구에 사용 된 동물의 수를 최소화하는 다른 사람에 비해 낮은 사망률 (1 % 미만)을 갖는다. 사망률이 낮은 비율을 얻기 위해 중요한 단계 뇌졸중 유도 후 생존에 손상을 줄 수있는 감염을 방지하기 위해 적절한 무균 상태를 유지하는 것이다. 이 MCAO 모델은 또한 원하는 시간 매듭 후방 재관류 CCA 및 MCA 과도 결찰술 일시적인 모델로서, 병진 연구 18 임상 관련 모델 간주 영구 MCAO 모델로서 이용 될 수 없다 19. 이 방법은 성공적으로 마우스 및 래트 17,20 사용되어왔다. 이 모든 증거는 결찰에 의해 MCAO 여러 응용 프로그램과 뇌경색의 높은 다양한 모델을 나타냅니다. criti이 기술의 CAL 단계는 실체 현미경 침습 수술을 필요로한다는 것이다; MCA뿐만 아니라 광대뼈 손상되지로서 개두술은 매우 신중하게 수행되어야한다. 그러나 가짜 동물의 사용 수술에 의존하는 효과를 구별 할 수있는 유용한 도구가 제공 (수술하지만 CCA와 MCA 결찰을 실시한다 수행되지 않습니다). 이 기술에 따라 뇌 손상의 정도는 다양한 방법에 의해 정량화 될 수있다. 뇌 절편, Nissl 염색 및 카발리 의한 체적의 후속 추정 우리 프로토콜은 손상된 영역의 정확한 정량 분석​​이 가능하며 직렬 뇌 섹션이 또한 서로 다른 면역 분석에 이용 될 수 있기 때문에, 연구의 이러한 유형에서 사용 된 마우스의 수를 최소화한다. 이 방법론의보다 나은 성능이 Stereology를 소프트웨어에 사용 된 적절한 파라미터를 선택하는 것이 중요하다 (표 1) 번째를 추정 할 필요식 상이한 영역의 전자 량 : V = 1 / SSF는 * f를 * t의 *의 ΣP 난 (SSF는 t가 섹션의 평균 두께, 슬라이스 샘플링 분획이고, f는 그리드 간격의 면적이며 ΣP 구조 타격 포인트의 수). 결찰술 원위 MCAO은 백혈구 침윤 및 면역 세포 아 집단 뇌 손상 1-4 다음 염증 과정에 참여하는 8, 13를 특성화하는 것이 유용 할 수있다. 여기서는 뇌 면역 세포 특성화, 정확한 접근법 stereological 나은 여러 백혈구의 아 집단을 특성화 유세포 분석을위한 두 가지 방법을 제안한다. 직렬 뇌 절편을 살려, 호중구의 총수의 정량화 세포 샘플 재치 수의 세포의 총 수를 추정 광학 분별 법 (16)에 의해 달성 될 수있다하 방향 X에 편견 가상 계산 공간 사이의 균일 한 거리와 우리의 경우, 경색 영역을 관심의 전체 영역을 커버 편견 가상 계산 공간의 체계적인 무작위 샘플링 (SRS) 세트, Y 및 Z를이 방법에 대한 정확한 도구를 제공합니다 결찰 후 서로 다른 시간에 허혈성 뇌에 총 호중구 수를 추정한다. 이 본 연구에 도시되지 않았지만,이 프로토콜은 또한 허혈 21 후에 다른 침윤 백혈구 등의 허혈성 뇌에서 발견 된 임의의 다른 세포 집단의 정확한 정량 다른 호중구 개체군의 추정을 위해 사용될 수있다 (단핵구 / 대 식세포) 또한 생존 신경을 추정 또는 뇌졸중 후 신경의 정량. 것들 허혈 영역에서 호중구 부량 표 3에 나타낸 바와 같이, 원하는 영역의 정확한 추정을위한 가장 중요한 단계는, 해당 변수의 선택이다.이러한 매개 변수는 (ΣQ- 함께 카운트 세포의 총 수이고 N = ΣQ- X 1 / SSF X 1 / ASF X 1 / TSF를 수학 식을 이용하여 전체 포지티브 세포 수 (N)를 계산하는 Stereology를 소프트웨어에 사용될 분별, SSF는 ASF 샘플링 면적 분율이고, TSF는 샘플링 분획 두께) (5)이고, 부 샘플링 비율이다. 이 방법론은 다른 정량화 기법보다 느리지 만 (예를 들어, 조직, 대표적인 이미지 또는 필드 당 호중구 수의 밀도 측정의 MG 의한 호중구 마커의 분석), 그것은 공평하고 정확한 제공 고체 기법이 될 수있는 장점을 갖는다 세포 수의 정량. 뇌 백혈구 분리 방식은 바이어스 할 필요 생체 염색 또는 유전자 조작에 의해 시스템이없는 동시 식별 및 여러 면역 세포 아형의 정량화 수 있습니다. 특징 골수 페이지에서 정렬 이후 세포opulations 또는 면역 자기 분리가 이러한 유전자 또는 단백질 발현에 대한 추가 연구 하류 여러 애플리케이션에 사용될 수있다. 이 방법으로 얻은 호중구, 단핵구 및 미세 아교 세포의 정확한 특성은 면역 조직 화학적 연구, 뇌의 선천성 면역 반응을 매개하는 다른 골수 세포에 특정 기능을 할당 할 수있는 장점으로 기존의 방법에 대해 높은 특이성을 제공합니다. 또한, 추가로 혈액 태어난 식세포 (는 CD11b + CD45 하이 CD68 +)와 같이, 적절한 라벨 다른 뇌 개체군을 특성화하도록 확장 될 수 있으며 다른 CNS 병리 또는 부상의 연구에 적용 할 수있다. 따라서이 기술은 뇌의 염증 반응의 이질성을 탐구하는 필수적인 도구를 제공합니다. 이 기술의 주요 제한을 변경할 수있는 새로운 뇌 조직으로부터 백혈구 현탁액의 제조에 상주세포 또는 항원 변경의 활성화 상태. 이 기술은 면역 조직 화학 연구에 비해보다 상세한 정 성적 특성 분석을 할 수 있지만, 그것은 세포의 분리에 기초하여 덜 정확한 정량화를 제공한다. 그럼에도 불구하고, 우리 세포 격리 프로토콜의 효율은 다른 출판 방법론 9 유사하고이를 효율적으로 제어하고 MCAO 그룹 사이 또는 심지어 다른 처리 8 실시 MCAO 그룹 사이의 뇌 면역 세포의 수의 차이를 검출하는데 사용될 수있다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 해부 조직, 조직 파괴 절차 및 미엘린 제거한다. 조직 수집에 대해서, 정규화 단계 인해 상이한 박리 성능에 변동을 피하기 위해 (수집 된 조직을 칭량) &#39;도 포함될 수있다. 또한, 다른 그룹 사이 MCAO 정규화는 경색 량 통해 발생할 수 (미리 자기 R에 의해 결정esonance). 이 문제를 해결하는 또 다른 방법은 허혈성과 대조군의 전체 동측 반구를 사용하거나, 심지어 사용 된 동물의 수를 최소화하는 대조군으로서 마우스의 허혈성 반구 반대측을 사용하는 것이다. 이 방법은 각 절개 차이점을 회피 동안, 주요 단점이있다; 희석 배수는 독점적 동측 피질의 코어 및 경색 주변 영역에있는 골수 세포의 수를 셀의 총 개수를 증가 아니지만 의해 부가된다. 조직 파괴에 대해서는,이 프로토콜은 뇌 세포의 기계적 파쇄 단계 효소 처리를 방지하고 표면 항원 변조 9,22, 염증 세포 개체군의 추가적인 정성 및 정량 분석을위한 필수적인 문제를 방지를 나타낸다. 관심의 세포 현탁액의 제조뿐만 아니라, 뇌 샘플로부터 미엘린 제거 downst와의 간섭을 피하기 위해 추천 단계는이러한 면역 자기 세포 분리 또는 세포 계측법 (23, 24) 흐름으로 연 응용 프로그램. 이것은 여러 가지 방법, 예컨대 수크로오스 또는 퍼콜 구배, 또는 항 미엘린 비드를 사용하여 달성 될 수있다. 여기, 세포 수율을 개선하는 데 사용됩니다 수초를 제거하는 퍼콜 사용과 함께 뇌 세포 현탁액 분리, 기계적 중단을위한 다른 방법을 비교하고 25 생존 이전의 연구를 기반으로.

형태 학적 표현형 및 미세 아교 세포 유전자 발현의 변화뿐만 아니라, 혈관 외 유출 및 haematogenous 식세포의 활성화 및 호중구가 뇌 손상 1-4 다음 병리 생리 캐스케이드에서 핵심적인 역할을 수행 할 것으로 생각된다. 이 프로토콜은 두 가지 방식 허혈성 뇌 골수 세포의 다른 서브 세트들의 수를 추정하고 자신의 표현형을 특성화를 수행하기 위해 제공한다. 또한, 또한, 방법 경색을 평가 포함 원위부 중뇌 동맥 일시적 또는 영구적 결찰 (MCA) 및 총 경동맥 (CCA)로 구성되어 마우스에서 대뇌 허혈 실험 모델의 설명을 제공한다 stereological 소프트웨어를 사용하여 정확한 카발리 법에 의해. 허혈성 뇌의 골수 세포의 서브 세트를 결정하기에 첫 번째 방법은 광학 분별 접근법에 기초하여 5 stereological 방법이다. 이것은 대부분이며일반적으로 생명 과학 분야 stereological 프로브를 사용하고 오류 5-7의 낮은 계수와 높은 정확도를 제공한다. 이 때문에 섹션으로 조직의 분열의 세포 추정에 대한 편견을 피할 수로 조직이, 섹션으로 잘라 때이 세포 정량을위한 최고의 선택입니다. 이 방법은 숫자, 역학과 허혈성 조직 (8)의 침투 호중구 개체군의 표현형 변화를 특징 짓는 매우 강력한 방법입니다. 두 번째 접근법은 특성화 뇌 백혈구 현탁액을 분리 및 유동 세포 계측법에 의해이를 특성화하는 간단한 방법을 제공 캄파넬라 협력자 (9)로부터 개질 된 프로토콜에 기초한다. 종래의 면역 조직 화학 기법과 대조적으로, DIFF에 기초하여 자신의 골수 세포 (CD45 하이는 CD11b +)을 특성화 (LO는 CD11b + CD45) 미세 아교 세포를 구별 허용 유동 세포 계측법 및 침투CD45 9-13의 erent 발현 수준. 또한, 염증성 단구 (CD45 안녕으로 CD11b + LY-6G - LY-6C 안녕은), 호중구는 (CD45 안녕으로 CD11b + LY-6G +) 및 허혈성 조직의 다른 백혈구 부분 집합 구별 할 수있다. 이 접근법은 뇌 허혈 실험 모델에서 신경 염증을 평가하는 신뢰성 있고 신속한 분석을 제공한다. 그러나, 조직 처리가 활성화 상태와 반 정량적 특성을 제공 허혈성 조직에서 발견되는 다양한 세포 집단의 수에 영향을 미칠 수있다.

<table><tbody><tr><td>Photonic Led F1</td><td>WPI</td><td>571329-8</td><td>장비</td></tr><tr><td>온도 컨트롤러&nbsp;</td><td>판랩&nbsp;</td><td>HB 101/2</td><td>장비</td></tr><tr><td>Volvere GX</td><td>NSK</td><td>Ne22L</td><td>장비</td></tr><tr><td>현미경</td><td>WPI</td><td>PZMIII-BS</td><td>장비</td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 버</td><td>FST</td><td>19007-14</td><td>수술 재료</td></tr><tr><td>펜치 Dumont #5/45&nbsp;</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td>수술 재료</td></tr><tr><td>펜치 Dumont #5SF</td><td>FST</td><td>11252-30</td><td>수술 재료</td></tr><tr><td>봉합사 6/0</td><td>LorcaMarin</td><td>55108</td><td>수술 재료</td></tr><tr><td>봉합사 9/0</td><td>LorcaMarin</td><td>61966</td><td>수술 재료</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>TE300</td><td>장비</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Esteve</td><td>571329-8</td><td>화학</td></tr><tr><td>나트륨 펜토바르비탈</td><td>베토퀴놀</td><td>570681</td><td>화학</td></tr><tr><td>냉동 마이크로톰</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td>SM2000R</td><td>장비</td></tr><tr><td>Superfrost 슬라이드</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>2014-07</td><td>실험실 재료</td></tr><tr><td>Cresyl violet acetate</td><td>Sigma</td><td>C5042</td><td>화학</td></tr><tr><td>현미경&nbsp;</td><td>니콘</td><td>니콘 이클립스 TE300</td><td>장비</td></tr><tr><td>XYZ 전동 컴퓨터 무대 및 컨트롤러</td><td>Ludl 전자 제품</td><td></td><td>장비</td></tr><tr><td>스테레오 조사자 시스템</td><td>마이크로 명시야</td><td>버전 7.003 소프트웨어</td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>5ml 티슈 그라인더, 테프론 유봉이 있는 Potter-Elv</td><td>Thomas Scientific</td><td>0913X70</td><td>실험실 재료</td></tr><tr><td>폴리프로필렌 50ml 오크 릿지 원심분리기 튜브</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050&nbsp;</td><td>실험실 재료</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>p1644-100</td><td>화학</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F</td><td>화학</td></tr><tr><td>Beckman 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>장비</td></tr><tr><td>Beckman Coulter 초원심분리기 로터 45 Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>장비</td></tr><tr><td>BD 멸균 세포 여과기, 40 미크론</td><td>BD</td><td>BD 352340</td><td>실험실 재료</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마</td><td>A3733-500G</td><td>Reagment</td></tr><tr><td>FcR 차단 시약, 마우스</td><td>Miltenyi</td><td>130-092-575</td><td>항체</td></tr><tr><td>CD11b-FITC, 인간 및 마우스</td><td>Miltenyi</td><td>130-098-085</td><td>항체</td></tr><tr><td>CD45-PE, 마우스</td><td>Miltenyi</td><td>130-102-596</td><td>항체</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6G-APC, 마우스</td><td>Miltenyi</td><td>130-102-936</td><td>항체</td></tr><tr><td>PerCP / Cy5.5 안티 마우스 Ly-6C</td><td>Biolegend</td><td>128012</td><td>항체</td></tr><tr><td>BD FACS Flow</td><td>BD</td><td>342003</td><td>Reagment</td></tr><tr><td>BD FACSCalibur; 4 색</td><td>BD</td><td>342975</td><td>장비</td></tr><tr><td>BD Cell Quest Pro 소프트웨어</td><td>BD</td><td></td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>FlowJo 소프트웨어</td><td>Treestar inc.</td><td></td><td>소프트웨어</td></tr></tbody></table>

일시적 또는 영구적 인 뇌허혈 모델에서 백혈구 부분 집단의 stereological 및 유동 세포 계측법 특성

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

미세 아교 세포의 활성화뿐만 아니라 haematogenous 식세포와 호중구의 혈관 외 유출은 뇌졸중 후 뇌 손상에서 중추적 역할을하는 것으로 생각된다. 이 골수 세포 개체군은 서로 다른 표현형 및 기능을 표시하고 구별 할 필요가 있고 조직 손상에 대한 그들의 규제와 공헌을 연구하는 특징으로 할 수 있습니다. 정확한 stereological 방법 및 유세포 분석 :이 프로토콜은 뇌 면역 세포의 특성화를 위해 두 가지 방법을 제공합니다. stereological 체계적인 접근법은 랜덤 샘플링에 의해 추정이자 (뇌 경색)의 영역에서 세포의 총 수를 계산 광학 분별 법에 기초한다. 두 번째 접근법은 특성화 뇌 현탁액 백혈구를 분리 및 미세 아교 세포의 특성 분석을 허용 유세포들을 특성화하는 간단한 방법을 제공하고, 단핵구 및 호중구 허혈성 조직의 침투. 또한, 교리독점적 사망률의 낮은 속도 및 카발리 법으로 경색 량을 특성화 뇌 조직 학적 처리 절차 재현성 경색을 발생, 뇌 피질에 영향을 쥐 뇌허혈 모델 etails.

여기에 도시 뇌허혈 모델 선조체 관개 MCA의 lenticulostriatal 분기 (도 1)에 흡장되지 않으므로 선조체 조직에 영향을주지 않고 단독으로 본 피질 경색을 발생시킨다. Nissl 염색으로, 손상된 영역은 담색 피질 영역 (도 2)로 식별 할 수있다. 이 모델은 Nissl 염색 섹션에서 카발리 에리 방법에 의해 추정 MCAO (% IH 15.89 ± 0.28) (그림 2) 후 24 시간에서 높은 재현성 경색 볼륨을 특징으로한다. 카발리 법에 의한 경색 부피의 추정 및 contralesional ipsilesional 반구 Gundersen 님의 에러 (CE)의 계수뿐만 아니라 경색 영역 (표 2)에서 반사되는 낮은 에러와 함께 정확한 접근법이다. 손상된 조직 부피는 3 mm에서뿐만 아니라 섹션 3.2.13에 수식을 이용한 %를 IH로 표현 될 수있다. 또한, 추정ipsilesional contralesional 영역과의 합계 용적의 경색 부피를 보정하고 손상된 조직 (표 2)의 과대 평가를 피하기 위해 부종 지수의 계산을 허용한다. 뇌 조직의 일련 단면 처리 감안 이것은 광학 분별 방법 (도 3 및 표 4)를 사용하여, 허혈 영역에 침투 호중구와 같은 세포의 아 집단의 총 수의 정확한 추정을 수행의 장점을 취할 수 표 3 매개 변수.이 프로토콜은 24 시간과 pMCAO (그림 3D) 후 마우스에서 82,856 ± 8,143 48 시간에 23,328 ± 3,623의 경색 지역에서 호중구 (Ly6G 양성 세포)의 총 수를 추정하고있다. 이전의 연구와 일치, 호중구의 침윤 직접 경색 크기 (그림 3E)와 관련된다. t 추정광학 분별 법에 의해 호중구의 수는 그 Gundersen 님 (표 4)에 의해 반사되는 CE 낮은 에러와 함께 정확한 접근법이다. 백혈구 분리 및 특성화 프로토콜을 유동 세포 계측법은 허혈성 마우스의 ipsilesional 반구의 피질에서 47,922 ± 23,174 골수 세포의 분리를 할 수 있습니다. 이 세포 현탁액에있는 이벤트 총 10-30 %로 포함한다. 세포 파편 (그림 4)에 관련이 프로토콜에 존재하는 낮은 FSC 매개 변수를 사용하여 캡처 사건의 대부분. CD11b를 염색으로 CD11b + 세포는 이전에 표시된 바와 같이이 200 9에서 FSC 임계 값을 설정하여 상기 분석에서 제외 될 수 있음을, 세포 파편이 마커로 표지되지 않은 것을 시사하고, (도 4)보다 높은 FSC 값을 가지고 있음을 보여준다. 이 방법으로 얻은 세포 파편의 양에 따라 샘플 과정에 그 차이를 알 수ING (타이밍, 조직 보존, 시료 온도 효율적인 제거 미엘린 등) 그것을 차지하고있다. 또한, 셀 멤브레인의 사용은 시료에서 셀룰러 클램프의 존재를 피하기 위해 필요하다; 이 단계는 이전의 세포 얼룩을 수행해야합니다. CD11b를 발현하고 CD45에 기초도 5에 도시 게이팅 전략을 사용하여, 우리는 허혈성 조직에 침투 거주자 골수 세포를 구별 할 수있다. 허혈성 반구이는 CD11b + 인구 증가는 (도 4,도 5 및 표 5) 순으로 이들 세포의 대부분이 미세 아교 세포는 허혈 후 확산되어있는 것을 나타내는 CD45의 낮은 발현에 관련되는 가짜 그룹과 비교했을 때 . 허혈성 뇌는 CD11b + CD45 하이 셀 모집단의 출현에 의해 입증되는 바와 같이 이러한 차이 (인해 주변으로부터 세포 침윤에도 4 쉽다그림 5와 순진한와 가짜 뇌에서 적은 수이다 표 5). 뇌 허혈는 CD11b + 세포 침윤 인구의 기여는 매우 역동적 인 과정 4이다. 결찰에 의해 MCAO 모델에서, 30 % 내지 병변의 크기 및 특성이 행해졌 시간 따라 합계는 CD11b + 세포의 60 %로 변할 수있다. LY-6G + 세포로서 특성화 호중구, 그들이는 CD11b + CD45의 70-80 %가 포함 같이, 뇌허혈이 모델을 이용하여 허혈성 마우스 뇌 MCAO 이후 24 시간에서 발견되는 가장 많은 침윤 세포 집단이다 하이. LY-6C 하이 염증성 단핵 세포 - 세포의 나머지는 대부분으로 CD11b + CD45 하이 LY-6G의 하위 집단이다. 이 모델에서는, 본 인구 (24)로부터 48 시간 후 MCAO에 허혈성 뇌 영역의 수를 증가시키는 것이다. 그림 1 :. MCA의 결찰 수술 (A) 시간적인 근육의 수축 후에는, 작은 개두술은 마우스 두개골에서 수행된다. MCA는 매듭 또는 9/0 봉합사를 사용하여 매듭 결찰한다. (B) MCAO 모델에 의해 생성 된 대뇌 피질의 병변의 대표 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig2.jpg"> 그림 2 : 카발리 에리에 의해 경색 볼륨의 정량화. (A) Nissl 염색 뇌 섹션의 대표 이미지 영구 MCA 결찰 후 24 시간. 높은 배율 Nissl 염색 후 hipocromatic 영역을 보여주는MCAO 후 손상된 영역 (코어)를 식별합니다. 경색 주변 (PI) 영역이 또한 도시되어있다. (B) (N = MCAO 이후, 일련 Nissl 염색 섹션 50 쥐를 24 시간을 카발리 방법을 사용하여 % 경색 반구 (%의 IH)로 표현 경색 량 정량 ). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig3.jpg"> 그림 3 : 경색 영역 (24)에서 호중구 및 결찰 후 48 시간의 Stereological 정량화, 광학 분별 방법을 사용. MCAO 후 24 시간에서 허혈 영역에 침투 호중구 (Ly6G 양성 세포)의 (A) 대표 이미지입니다. 경계 획정은 경색 영역을 보여줍니다. (B, C) ​​광학 분별에 의한 호중구 정량 광 해부학자의 예. (D) (24)의 경색 지역에서 총 호중구의 정량화 및 48 시간 (N = 4 마우스). (E)경색 (24)의 크기와 MCA 결찰 후 48 시간과 호중구의 수의 상관 관계. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig4.jpg"> 그림 4 :. 물리적 매개 변수 (SSC와 FSC)에 기초 순진, 가짜 허혈성 (MCAO 후 24 시간) 반구에서 얻은 뇌 백혈구의 대표 도트 플롯 분산 분석으로 CD11b (빨간색)을 표현하는 이벤트의 인구는 확인되었다 모든 그룹에서. 이 인구는 CD45의 발현에 따라 게이트 및 특징이었다. CD45 (녹색) 낮은 수준을 발현하는 세포는 허혈 및 비 허혈성 뇌 피질의 존재 및 소교 세포에 맞습니다. 대조적으로, 세포 (노란색) 높은 수준의 CD45를 발현 만했다허혈성 반구와 가짜 그룹의 낮은 정도에서 발견. 는 CD11b + CD45 안녕하세요 인구의 추가 분석 호중구 (LY-6G + 세포, 파랑)과 염증성 단핵구 (LY-6C 안녕 세포, 오렌지)가 주요 세포 뇌에서 발견 소집단 뇌졸중 후 24 시간을 침투 있음을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig4large.jpg" target="_blank">제발 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig5.jpg"> 도 5 :. 허혈성 조직에 침투 된 골수 세포로부터 상주 차별화 전략 게이팅는 CD11b + 세포는 먼저 이소 타입 형광 강도 (A)에 따른 게이트 하였다. 허혈성 뇌의 세포 현탁액의 대표 도트 플롯은 패널의 위쪽 오른쪽 모서리에 표시됩니다. 에또한,이 기술을 이용하여 취득한 이벤트들의 총 수 및 CD11b를 + 이벤트 수에 대한 일반적인 값은 (도시 아니 셀 / 허혈성 뇌 반구]. (A)는 CD11b + 세포의 CD45 형광 강도 분석을 패널에 나타낸다 게이트는 CD11b + 아군의 CD45와 CD11b를 표현의 B. 대표 도트 플롯 분석은 패널의 위쪽 오른쪽 모서리에 표시됩니다. 또한, 허혈성 뇌 반구 당 획득 CD45 보라 CD45 안녕 세포의 전형적인 수가이 기술을 사용하여 (B)에 도시되어있다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col span="2"></colgroup><tbody><tr><td colspan="2"> 카발리 에리 방법에 사용되는 매개 변수 </td></tr><tr><td> 섹션 두께 (t) </td><td> 30 μm의 </td></tr><tr><td> 목표 </td><td> 10X </td></tr><tr><td> 슬라이스 샘플링 비율 (SSF) </td><td> (1)/ 20 </td></tr><tr><td> 섹션 사이의 거리 </td><td> 600 μm의 </td></tr><tr><td> 그리드 간격 </td><td> 100 ㎛ </td></tr></tbody></table> 표 1 : 경색 조직의 stereological 정량에 사용되는 매개 변수. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 결과 </td><td> Contralesional </td><td> Ipsilesional </td><td> 경색 </td></tr><tr><td> 지역 (μm²) </td><td> 151460000 </td><td> 155060000 </td><td> 22600000 </td></tr><tr><td> 볼륨 (μm³) </td><td> 90876000000 </td><td> 93036000000 </td><td> 13560000000 </td></tr><tr><td> 볼륨에 대한 수정 프로젝션 이상 (μm³) </td><td> 89957100000 </td><td> 92046300000 </td><td> &lt;강한&gt; 13416600000 </td></tr><tr><td> 오류 계수 (Gundersen 님) m = 0 </td><td> 0.068 </td><td> 0.077 </td><td> 0.067 </td></tr><tr><td> 오류 계수 (Gundersen 님) m = 1 </td><td> 0.015 </td><td> 0.017 </td><td> 0.015 </td></tr><tr><td> 오류 계수 (Gundersen 님) 알파 (Q) </td><td> 0.068 </td><td> 0.077 </td><td> 0.067 </td></tr><tr><td colspan="2"> % 경색 반구 </td><td colspan="2"> 14.90 </td></tr><tr><td colspan="2"> 뇌 Oedema (IPS 권 / 계속 권) </td><td colspan="2"> 1.02 </td></tr></tbody></table> 표 2 : 스테레오 탐정 소프트웨어 사용 카발리 법에 의해, contralesional ipsilesional 경색 부피의 대표적인 예. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td col>광학 분별 사용 범위 = "2"&gt; 매개 변수 </td></tr><tr><td> 섹션 두께 (TSF) </td><td> 30 μm의 </td></tr><tr><td> 목표 </td><td> 100X </td></tr><tr><td> 슬라이스 샘플링 비율 (SSF) </td><td> 1/10 </td></tr><tr><td> 프레임 높이를 계산 </td><td> 40 μm의 </td></tr><tr><td> 프레임 폭을 계산 </td><td> 40 μm의 </td></tr><tr><td> X 격자 크기 </td><td> 230 μm의 </td></tr><tr><td> X 격자 크기 </td><td> 230 μm의 </td></tr><tr><td> 안전 가드 </td><td> 2 μm의 </td></tr><tr><td> 광학 Disector 높이 </td><td> 14 μm의 </td></tr></tbody></table> 표 3 : 스테레오 탐정 소프트웨어를 사용하여 광학 프로브 분별 뇌허혈 후 호중구 침윤 stereological 정량화에 사용 파라미터. <table border="0" cellpadding="0" cellspa cing='"0"&gt;'><tr><td colspan="2"> 광학 분별에 의한 호중구의 추정 </td></tr><tr><td> 샘플링 위치의 수 </td><td> (430) </td></tr><tr><td> 형상 인수 </td><td> 6.24 </td></tr><tr><td> 총 마커 카운트 </td><td> (166) </td></tr><tr><td> 광학 분별에 의해 추정 된 호중구 </td><td> 117,608.03 </td></tr><tr><td> 오류 계수 (Gundersen 님), m = 0 </td><td> 0.22 </td></tr><tr><td> 오류 계수 (Gundersen 님), m = 1 </td><td> 0.09 </td></tr></table> 표 4 : 스테레오 탐정 소프트웨어를 사용하여 광학 분별 프로브 뇌 허혈 후 예상 침투 호중구의 대표적인 예. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 는 CD11b + </td><td> 호중구 </td><td> 단핵구 </td><td> 미세 아교 세포 </td></tr><tr><td> 소박한 </td><td> 25,863 ± 4,575.8 </td><td> 473 ± 75.8 </td><td> 525 ± 191.4 </td><td> 19,012 ± 1,523 </td></tr><tr><td> 샴 24 시간 </td><td> 24,563 ± 5,263 </td><td> 873 ± 192.5 </td><td> 1124 ± 391.5 </td><td> 23,734 ± 2,910 </td></tr><tr><td> pMCAO 24 시간 </td><td> 47,922 ± 23,174 </td><td> 4874 ± 748.7 </td><td> 4826 ± 1345 </td><td> 35,395 ± 10,833 </td></tr></tbody></table> 표 5 : 접근 유동 세포 계측법과 뇌 허혈 후 추정 된 골수 세포의 대표 결과.

다음 스트로크 뇌 골수 세포 특성화 광학 분별 법을 이용하여 수행 Stereology를, 뇌의 유세포 분석에 의해 현탁액 백혈구 수있다. 둘 허혈성 뇌에서 발견되는 주된 서브 세트 골수 세포 표현형의 정확한 구별을 수행하는 유용한 기술이다.

일시적 또는 영구적 인 뇌허혈 모델에서 백혈구 부분 집단의 Stereological 및 유동 세포 계측법 특성

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

이 절차의 전반적인 목표는 두 가지 다른 방법론을 통해 허혈성 뇌의 마우스 골수성 세포 부분 집합을 특성화하는 것입니다. 첫째, 주로 뇌 피질에 영향을 미치는 경색증을 유발하는 총경동맥(CCA)과 중대뇌동맥의 원위 몸통 또는 MCA를 모두 폐색하여 뇌허혈의 영구적인 모델을 도입합니다. 그런 다음 골수성 세포 하위 집합의 스테레오 논리적 정량화를 위해 뇌의 연속 관상 절편을 관심 세포에 대한 면역 염색한 다음 광학 분획기 접근 방식으로 침투된 세포를 정량화합니다.또는 기계적 해리를 통해 새로운 뇌 조직에서 골수성 세포를 분리한 다음 유세포 분석으로 염색 및 분석할 수 있습니다. 궁극적으로, 뇌허혈 후 마우스 뇌에 침투하는 특정 골수성 세포 subset의 정확한 정량화와 상세한 정성적 특성화는 각각 입체 정량화 및 다중 매개변수 유세포 분석을 통해 달성할 수 있습니다. 기존의 다른 모델에 비해 이 허혈 연속 모델의 주요 장점은 우리의 기술이 다른 방법보다 사망률이 현저히 낮아 연구에 필요한 동물의 수를 최소화한다는 것입니다.이 분야는 뇌졸중 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있는 방법이며, 예를 들어 뇌 손상에서 미세 재활성화, 적혈성 대식세포의 유출 또는 호중구의 역할은 무엇입니까? 이 논문에서 제시된 다파라메트릭 세포 분석 접근법에 대한 정확한 신학적 정량화는 CE 허혈에 대한 선천성 면역 반응 모두에서 골수성 세포 집단의 수, 표현형 및 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. CCA를 먼저 접합하려면 수술용 현미경으로 동물의 목 복부 표면 주위를 1cm 정중선 절개를 만듭니다.절개가 끝나면 6개의 제로 나일론 봉합사를 사용하여 영구 매듭으로 왼쪽 CCA를 폐색하여 원위 MCA를 결찰합니다. 다음으로 측두근을 오른쪽에서 왼쪽으로 수평 절개합니다. 그런 다음 측두근의 오른쪽에 두 번째 수직 절개를 만듭니다.측두 정맥이 절단되지 않도록 주의하십시오. 측두근을 두개골에서 분리하고 봉합사로 잡아 두개골 표면을 깨끗하게 유지합니다. 그런 다음 저온 멸균 식염수로 두개골을 세척하여 두개골 투명도를 통해 왼쪽 MCA의 정확한 위치를 감지합니다.MCA가 확인되면 스테인리스강 버를 사용하여 접합궁과 편평골 사이의 전두엽에서 1mm 원형 개두술을 수행합니다. MCA가 노출되는 두개골을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 9 제로 나일론 봉합사를 사용하여 영구적인 매듭으로 전두엽과 후방 MCA 분기점 사이의 분기점 직전에 원위 몸통의 왼쪽 MCA를 폐색합니다.뇌를 제거하려면, 안락사된 쥐의 척수 바로 위의 목을 베고 피부를 뒤쪽 전방으로 절개하여 두개골을 노출시킨다. 그런 다음 측벽과 두개골 기저부의 접합부를 두 개의 측면 절단하고 작은 뼈 조각을 제거합니다. 다음으로, 시상 봉합선을 따라 두개골을 절단하고 집게를 사용하여 각 반구 위에 있는 두개골을 제거하여 뇌를 노출시킵니다.주걱을 사용하여 두개골에서 뇌를 분리하고 4% PFA 용액으로 옮깁니다. 3시간 후, PFA를 제거하고 뇌를 동결 보호하기 위해 30% 자당 용액으로 뇌를 배양합니다. 48시간 후, 자당 용액을 제거하고 뇌를 섭씨 영하 40도의 isop pentane에서 빠르게 동결한 다음 냉동 마이크로톰을 사용하여 30마이크로미터 관상 동맥 뇌 절편을 만듭니다.cryo 방부제 용액에서 10개의 연속 세트를 수집합니다. 각 시리얼 세트는 약 14-16개의 코로나 슬라이스로 구성되며 인터 슬라이스 거리는 300마이크로미터입니다. bgma 후방의 1.94에서 음의 2.46 사이의 마우스 뇌의 적절한 샘플링을 보장하여 침투된 호중구의 총 수를 추정합니다.광학 분획기에 의한 MCA 폐색 후, 기존의 면역형광 기법에 의해 1차 호중구를 rat anti LY six G 항체 및 적절한 2차 항체로 부동 절편에 면역 염색합니다. 그런 다음 경색 부위가 오른쪽에 배치된 상태에서 뇌 단면을 Super Frosts 현미경 슬라이드에 장착하고 스테레오 조사자 소프트웨어를 엽니다. 그런 다음 도구 직렬 섹션 관리자 메뉴를 클릭하고 새 섹션 버튼이 있는 새 섹션을 추가합니다.10번째 슬라이스 샘플링 분율 하나에 대해 평가 간격을 10으로 설정합니다. 그런 다음 contour down 메뉴에서 infarcted area contour 도구를 선택합니다. 10 x 대물렌즈 아래의 경색 영역을 윤곽으로 그립니다.그런 다음 현미경과 대물렌즈 메뉴에서 100 x 대물렌즈로 전환합니다. probes 메뉴에서 호중구를 정량화하려면 이제 광학 분획기를 선택하고 X 및 Y 그리드 크기 모두에 대해 카운팅 프레임의 XY 배치를 230으로 설정합니다. 이제 마커 바에서 호중구 버튼을 선택하고 경색 부위에 염색된 호중구를 표시합니다.정량화 결과를 스프레드시트 파일로 내보내 뇌를 단일 세포 현탁액으로 해리합니다. 방금 시연한 대로 뇌를 제거한 후, 뇌 허혈성 쥐의 뇌에서 동측 피질의 코어와 경색 부위를 해부합니다. 뇌 조직의 무게를 측정하고 실험 그룹 간의 정상화를 위해 호출당 5ml의 얼음처럼 차가운 RPMI에 넣은 다음 테프론 유봉이 있는 조직 분쇄기를 사용하여 조직을 단일 세포 현탁액으로 해리합니다.세포 현탁액을 50ml 초원심분리기 튜브로 옮기고 시료에 호출 용액당 5ml의 RPMI를 더 추가합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 7, 800GS 및 섭씨 25도에서 30분 동안 원심분리한 후. 수초에 해당하는 흰색 층이 용액의 맨 위에 나타나는지 확인합니다.미엘린 층을 조심스럽게 제거하고 40마이크로미터 나일론 메쉬 스트레이너를 통해 펠릿화된 세포를 포함한 전체 세포 현탁액을 여과합니다. 10ml의 RPMI로 스트레이너를 세척하여 모든 세포가 메쉬를 통해 여과되었는지 확인한 다음 용액을 50ml 튜브로 옮깁니다. 20ml의 RPMI를 세포에 첨가한 다음 세포를 회전시킨 후 백혈구 펠릿을 재현탁합니다.PBS 1밀리리터에서 실온에서 4밀리리터의 용해 완충액에 2-3분 동안 세포를 배양하여 적혈구를 용해한 다음 세포를 스핀다운합니다. 1%BSA가 포함된 200마이크로리터의 PBS에 있는 세포와 적절한 항체를 얼음에 표식합니다. 그런 다음 45분 후 1ml의 차가운 PBS로 샘플을 세척하고 Resus는 유세포 분석을 위해 100마이크로리터의 팩스 흐름 버퍼에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.이 모델은 카발리에리 방법으로 추정된 바와 같이 중대뇌동맥 폐색 후 24시간에 재현성이 높은 경색 부피를 특징으로 합니다. 이전 연구와 일치하는 nial 염색 절편에서 호중구 침윤은 경색 크기와 직접적인 상관관계가 있습니다. 또한, 백혈구 분리 및 유세포 분석법 특성 분석을 통해 허혈성 마우스의 IPS 병변 반구의 피질에서 골수성 세포를 분리할 수 있으며, 이는 세포 현탁액에서 발견되는 총 이벤트의 10-30%를 차지하고 세포 파편과 관련된 낮은 전방 산란 매개변수를 나타냅니다.CD 11 B 양성 세포는 더 높은 전방 산란 값을 가지며, 이는 세포 파편이 이 마커로 표지되지 않았음을 시사하며, 앞서 지적한 바와 같이, FSC 역치를 200개의 호중구로 설정함으로써 추가 분석에서 제외될 수 있음을 시사하며, LY 6 G 양성 세포는 이러한 뇌허혈 모델을 사용하여 허혈성 마우스 뇌에서 MCA 폐색 후 24시간에 발견되는 가장 많은 침투 세포 집단입니다. CD 11 B 긍정적 인 CD 45 높은 세포의 70-80 %를 포함합니다. 나머지 세포는 대부분 CD 11 B, 양성 CD 45, 높은 LY 6G, 음성 6 C 높은 전염증성 단핵구의 하위 집단이며, 이는 중대뇌 동맥 폐색 후 24시간에서 48시간 사이에 허혈성 뇌 영역에서 높은 수로 발견됩니다. 이 P-M-C-A-O 모델은 유세포 분석 절차에 따라 적절하게 수행되면 30분 이내에 수행할 수 있습니다.특정 세포 하위 집합의 정렬과 같은 다른 방법을 수행하여 이 모델 시스템에서 골수성 세포의 발현 패턴, 대사 변화 또는 아세트 활성이 무엇인지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후 허혈 모델을 만드는 방법과 가장 중요하게는 세레 허혈 후 마우스 뇌 손상 또는 TPE에서 두 가지 다른 접근 방식으로 침투 골수성 세포의 수와 표현형을 특성화하는 방법을 잘 이해했습니다.

stereological-flow-cytometry-characterization-leukocyte

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

현재 문서는 효율적으로 효과적으로 흐름 cytometric 분석을 위해 활용할 수 뇌 및 척수 조직에서 mononuclear 세포를 분리하기 위해 빠른 프로토콜을 설명합니다.

Percoll 그라디언트를 사용하여 두뇌와 척수 Mononuclear 세포의 분리

murine 두뇌에서 침투 leukocytes을 얻는 빠른 방법을 설명합니다. 이 방법은 연속 Percoll 기울기와 백혈구 - 농축 레이어를 선택하고 정화 불연속 Ficoll 기울기를 사용합니다. 절연 leukocytes 그때 흐름 cytometric 측정에 의해 특징 수 있습니다.

브레인 - 침투 Leukocytes의 분리

뇌 관류 모니터링은 허혈성 뇌졸중 모델의 정확성을 향상시키기 위해 입증되었습니다. 기술적 인 문제는 종종 뇌 혈관 연구에 대해이 필수적 도구의 사용을 제한 할 수 있습니다. 이 비디오에서는 최적화 된 시스템은 쥐의 intraluminal 중간 대뇌 동맥 폐색 동안 단일 또는 다중 사이트 hemodynamic 모니터링을 얻기 위해 표시됩니다.

Intraluminal 중간 대뇌 동맥 폐색의 쥐 뇌졸중 모델에서 뇌 관류 모니터링에 최적화 된 시스템

뇌 염증 반응의 복잡성에 새로운 통찰력을 얻을 수있는 방법이 제공됩니다. 우리는 국소 허혈의 마우스 모델에서 미세 아교 세포 / 대식 세포 표현형 마커의 공동 발현 패턴을 조사하기 위해 삼차원 촛점 분석 하였다 면역 형광 기반 프로토콜을 설명한다.

실험 뇌 손상 양극화의 소교 / 대식 세포 마커의 3 차원 공 촛점 분석

혈전색전성 뇌졸중 모델은 재개통 치료를 최적화하기 위한 중요한 도구입니다. 본 연구에서는 혈전증 및 경색을 유발하는 일과성 대뇌 저산소성 허혈성(tHI) 모욕에 기초한 쥐 혈전성 뇌졸중 모델을 보고하며, 뇌졸중 환자와 유사한 치료 창에서 조직 플라스미노겐 활성제(tPA) 매개 섬유소용해에 호의적으로 반응합니다.

과도 대뇌 저산소증 - 허혈을 기반으로 혈전 성 뇌졸중 모델

염증은 허혈성 뇌졸중의 발병기전에서 중심적인 역할을 합니다. 점점 더 많은 증거에 따르면 그것은 초기 뇌 손상을 악화시키는 양날의 검으로 작용하지만 나중에 회복하는 데에도 기여합니다. 이 프로토콜은 허혈성 뇌에서 면역 세포를 분리하고 그에 따른 유세포 분석 표현형을 설명합니다.

허혈성 마우스 뇌에서 면역 세포의 분리 및 유세포 분석

대뇌 국 소 빈 혈 reperfusion의 마우스 모델 선의 이상 조사를 설립 하다. 우리는 distally 오른쪽 중간 대뇌 동맥과 바로 일반적인 경 동맥 선 하 고 국 소 빈 혈의 10 또는 40 분 후 혈액 흐름을 복원.

대뇌 국 소 빈 혈 reperfusion의 2 배 폐색 마우스 모델

이 프로토콜은 허혈성 뇌졸중의 뮤린 모델인 일시적 중간 대뇌동맥 폐색 후 폐 환경에서 면역 세포 조성, 사이토카인 프로파일, 및 케모카인 프로파일의 변화를 확인하기 위한 유세포 분석기의 사용을 기술한다.

폐 환경에서 면역 세포 및 전염증성 중재자의 특성화

뇌 질환에 대한 면역 반응을 조사하기 위한 한 가지 일반적인 접근법은 면역 세포의 변화를 분석하는 것입니다. 여기에서는 쥐 뇌 조직과 두개골 골수에서 면역 세포를 분리하기 위한 두 가지 간단하고 효과적인 프로토콜이 제공됩니다.

생쥐의 뇌와 두개골에서 면역 세포 분리

여기에서는 미니 뇌졸중 모델에서 유세포 분석을 사용하여 허혈성 뇌졸중 후 면역 세포 기능을 평가하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 신경면역 상호 작용을 자세히 검사할 수 있으며 다른 신경퇴행성 질환을 연구하는 데 적용할 수 있어 뇌졸중 병리학의 면역 반응에 대한 이해를 높일 수 있습니다.

Mini-Stroke Murine Model에서 신경면역 상호작용의 분리 및 유세포 분석 평가

학습하세요 뇌허혈 마우스 모델에서 골수성 세포 아군집을 입체측정법과 유동세포측정법으로 정량화하고 특성화하는 방법을. 이 기법은 뇌졸중 후 면역 반응 연구에 필수적입니다.

일시적 또는 영구적 인 뇌허혈 모델에서 백혈구 부분 집단의 Stereological 및 유동 세포 계측법 특성

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