근육 영양 장애 환자에서 유도 만능 줄기 세포의 생성 : 소변 유래 세포의 효율적인 통합이없는 프로그램을 다시

다음 실험의 전반적인 목표는 소변 유래 세포 배양과 통합 무료 재프로그래밍 방법을 시작으로 근이영양증 환자로부터 유도 만능 줄기세포 또는 IPSC를 효율적으로 생성하는 것입니다. 이는 먼저 근이영양증 환자의 소변 샘플을 수집하여 달성됩니다. 두 번째 단계로, 소변 세포를 분리하여 소변 유래 세포 배양으로 확장합니다.

다음으로, 소변 유래 세포에 야마나카 인자를 함유한 센다이 바이러스가 형질주입되고 12일 후에 군체와 같은 전형적인 만능 세포가 나타납니다. 궁극적으로 13번 통과문에 의해, 만능 줄기세포의 전이유전자가 없는 상태는 R-T-P-C-R 분석에 의해 확인될 수 있다. 렌티바이러스 벡터를 사용하여 분리된 피부 섬유아세포의 재프로그래밍과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술을 사용하면 환자로부터 체세포를 비침습적으로 얻을 수 있고 바이러스 재프로그래밍의 제로 발자국 방법을 사용하여 IPC를 효율적으로 생성하는 데 사용할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 근이영양증 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 인체 적용에 대한 안전 문제 없이 이러한 조건을 체외에서 모델링하는 방법과 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 박사 후 연구원인 Mohammad Zishan Al, 기술자인 Courtney Guesting, 그리고 제 연구실의 대학원생인 Melanie Ryder가 절차를 시연할 것입니다.소변 샘플을 채취하려면 환자에게 채취 30분 전에 수분을 마셔 약 30-40밀리리터의 소변을 채취할 수 있도록 조언하는 것으로 시작합니다. 환자가 준비가 되면 다음 항목이 포함된 소변 채취 키트, 멸균 또는 깨끗하고 습한 항균 변기 및 샘플 항균 변기를 구하는 방법에 대한 서면 지침, 100ml 멸균 검체 채취 컵을 환자에게 제공합니다.

샘플이 수집되면 즉시 수집 컵을 얼음 위에 놓고 샘플을 쿨러에 넣어 실험실로 옮깁니다. 그런 다음 멸균 피펫을 사용하여 소변 샘플을 멸균 50ml 원심분리 튜브로 옮기고 실온에서 10분 동안 400배 G로 튜브를 돌립니다. 다음으로, BSL에서 두 개의 생물 안전 캐비닛은 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 마지막 하나인 상등액 밀리리터를 제외한 모든 것을 흡인합니다.

그런 다음 7ml의 세척 버퍼로 세포를 씻고 세포를 다시 회전시킵니다. 이번에는 마지막을 제외한 모든 것을 약 0.2-0.5 밀리리터의 상층액을 흡인합니다. 지금 펠릿을 2 3 밀리리터의 요로 전구 세포 또는 UPC 매체에 재사용하고 72 시간 후에 코팅되지 않은 24 웰 플레이트의 4 내지 6 웰로 현탁액을 옮기고, 웰 당 0.5 밀리리터의 신선한 UPC 배지로 배양을 보충합니다.

4일에서 6일 사이의 배양 동안 배양을 모니터링합니다. 각각 1형 또는 2형 신장 상피 세포를 대표하는 둥글거나 길쭉한 세포로 구성된 2-4개의 작은 세포 군집이 나타나기 시작해야 합니다. 2-3일마다 매체를 계속 교체하십시오.

콜로니는 약 9-15일의 배양에서 급속한 확장 단계를 거치게 되므로 이 시점에서 세포는 80-90% 융합되어야 하며, 추가 확장을 위해 24웰 플레이트의 2-4웰로 세포를 분할해야 합니다. 세포 통로 1로 이 배양을 표시해서, 소변 세포는 그 때 유세포 분석, immunohistochemical 염색을 통해, 또는 형질 도입 씨, 60, 웰 당 000의 세포 이전에 일일 전에 고능률 reprogramming를 지키기 위하여 역전사 효소 폴리메라이제 연쇄 반응을 통해 계통 특정한 마커를 위해 성격을 나타낼 수 있습니다. 통로 1에서 5 문화까지 0 일에 6 개의 우물 플레이트의 2 개의 우물로 문화합니다.

1ml의 예열 UPC 매체에 재프로그래밍을 위한 적절한 MLI에서 4개의 OSKM 인자 각각을 추가하여 Sendai 재프로그래밍 벡터를 준비하고, 서스펜스 매체를 흡인하고, 다음 6일 동안 소변 세포의 한 웰에 바이러스 현탁액을 천천히 추가합니다. 5일째에 상등액을 매일 신선한 UPC 배지로 교체하고, 6일째에 젤라틴으로 코팅된 100mm 정사각형 배양 접시에 MES를 도금한 미토마이신 종자 처리. 소변 세포를 트립신으로 해리하고, UPC 배지에 재현탁시킨 후 메타 공급판 당 5 배의 10배에서 5배의 10배로 판화합니다.

다음날, UPC 배지를 인간 배아 단계 또는 HES 배지로 교체하고 현미경으로 세포를 모니터링하여 약 12-18일 동안 변형된 세포를 관찰합니다. 형질도입 후, 세포는 특유의 조약돌 형태와 더 높은 핵 대 세포질 비율을 가진 클론 응집체를 형성해야 합니다. 재프로그래밍된 IPSC 클론을 식별하기 위해 TRA 180 1 항체에 대한 라이브 셀 염색을 수행합니다.

그런 다음 26 게이지 1/2 인치 바늘을 사용하여 TRA 180 1 양성 클론 응집체를 클론당 4-6개의 작고 동일한 크기의 조각으로 교차 해칭합니다. 다음으로, 멸균 피펫 팁을 사용하여 여러 클론에서 10-20개의 교차 해칭 조각을 선택하여 HESC가 있는 각 웰 A 24웰 마트리겔 코팅 플레이트로 옮깁니다. 중간, 재프로그래밍된 클론이 마트리겔 표면에 도금된 후 24-48시간.

매체를 IPSC 매체로 교체합니다. 피펫 팁을 사용하여 분화된 세포 또는 오염된 메스암페타민 공급세포를 수동으로 긁어내어 완전히 재프로그래밍된 만능 영양 이상성 IPSC 클론의 정제를 돕습니다. 클론의 크기가 약 100마이크로미터에 도달한 후, 3분 동안 EDTA로 세포를 해리한 다음 RO 키나아제 억제제가 보충된 IPSC 배지에 현탁된 재프로그래밍된 영양 장애 IPSC의 작은 세포 응집체를 새로운 마트리겔로 코팅된 12 호일 플레이트에 플레이트화합니다.

마지막으로, 유전자 발현 분석과 면역조직화학 염색을 통해 각 클론의 다능성을 확인합니다. 만능 마커의 경우, 인간의 소변에서 분리된 대부분의 세포는 CD 44, CD 73 및 CD 1 46과 같은 전구 세포 및 줄기 세포 마커에 대해 양성입니다. 세포는 또한 알파, 평활근, actin 및 menton과 같은 중간엽 마커를 나타냅니다.

분리된 세포의 R-T-P-C-R은 배양물에서 세포가 혼합되어 있다는 증거를 제공합니다. 그 점에서 사이토케라틴 7 및 UIN 1 A 및 3 유로 상피 세포의 마커의 발현이 약합니다. 소변 세포는 0일차에 길쭉한 2형 세포에서 재프로그래밍 4일차에 조약돌 패턴으로 변형됩니다.

12일째가 되면 전형적인 만능 클론이 관찰되고 피더가 없는 조건에서 만능 형태를 유지할 수 있습니다. TRA 180 1에 대한 라이브 셀 염색을 사용하여 재프로그래밍된 클론을 식별할 수 있습니다. 벡터 및 전이유전자, 유리 만능 클론의 생성을 확인하기 위해 센다이 바이러스 게놈 및 각 외인성 OSKM 인자에 대한 프라이머를 사용하여 R-T-P-C-R을 수행할 수 있습니다.

외인성 유전자 발현은 더 이상 13번 통로에 의해 검출되지 않지만, 내인성 인자의 상향 조절은 관찰될 수 있다. 면역형광 염색은 IPC에서 만능 마커의 발현을 확인하지만 소변 세포에서는 확인하지 않습니다. 그런 다음 dystrophin 단백질 및 유전자의 발현은 야생형 대조군 및 이영양성 세포주에서 이러한 대표적인 이미지로 입증된 바와 같이 각각 추가 면역형광 염색 웨스턴 블로팅 및 R-T-P-C-R에 의해 검증될 수 있습니다.

마스터가 되면 이 기술을 사용하여 ucs의 ene free reprogramming을 달성할 수 있습니다. 몇 주 안에 이 절차를 따라 IPC를 심근세포 또는 골격근세포로 구별하여 근이영양증의 기전을 더욱 발전시킬 수 있습니다.