Name: 근육 영양 장애 환자에서 유도 만능 줄기 세포의 생성 : 소변 유래 세포의 효율적인 통합이없는 프로그램을 다시 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 배우세요 근육 영양 장애 환자의 소변 유래 세포를 이용한 비침습적 iPSC 생성 방법을. Sendai 바이러스를 활용한 통합 없는 재프로그래밍으로 12일 만에 만능 줄기 세포를 효율적으로 유도하고 13대에서 트랜스진 프리 상태를 확인합니다.

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이 프로토콜의 개발은 보조금 번호 8UL1TR000055를 통해 Advancing a Healthier Wisconsin과 National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health의 지원을 받았습니다. 그 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

참고 : 환자 및 / 또는 보호자는 연구를 승인 심사위원회 (Institutional Review Board)에 참여하는 동의를 제공해야합니다. 1. 버퍼 및 미디어 준비 <ol><li> 세척 버퍼 : 세척 버퍼 100 ㎖를 준비 인산염 완충 식염수 (PBS)의 99 ml의 100 배 펜 / 연쇄상 구균 솔루션 (스트렙토 마이신의 100 U / ml의 페니실린이 + 100 μg의 / ㎖) 1 ㎖를 추가합니다. </li><li> 소변 전구 세포 (UPC) 중간 : UPC 미디어를 준비 케 라티노 세럼 무료 (KSF) 중간 + 전구 세포 매체의 동일한 볼륨을 혼합합니다. <ol><li> KSF 중간 : 표피 성장 인자의 5 ng를 / ㎖ (EGF), 소 뇌하수체 추출물의 50 ng를 / ㎖ (BPE), 콜레라 독소의 30 ng를 / ㎖, 펜 / 연쇄상 구균 용액 (100 U를 추가, 각질 세포 미디어를 준비 / ml의 페니실린 500 ml의 KSF 매체, 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신). </li><li> 전구 세포 매체 : FBS, 0.4 ㎍ / ㎖의 하이드로 코티손, 0.1 햄 F12 미디어의 1/4과 DMEM의 4 분의 3에 추가하고 10 % 보완nM의 콜레라 독소, 5 NG / ml의 인슐린, 1.8 × 10 -4 M 아데닌, / ㎖ 트랜스페린, 2 × 10 -9 M의 triiodo의 로닌, 10 NG / ml의 EGF, 펜 / 패 혈성 솔루션 5 μg의. </li></ol></li><li> 배아 줄기 중간 : 20 % KO-세럼 교체 (K-SR), 1X MEM 비 필수 아미노산, 2 mM L- 글루타민, 100 μM의 β 머 캅토 에탄올, 20 NG / ㎖의 bFGF 및 펜 / 패 혈성 추가 400 ㎖의 DMEM / F12 배지. </li></ol> 2. 소변 샘플 컬렉션 <ol><li> 소변 적절한 양의 (~ 30 ~ 40 ml)을 수집 할 수 있도록 소변 컬렉션에 30 분 전에 음료수를 마시지하는 환자를 지시합니다. </li><li> 환자 및 / 또는 보호자 다음 항목이 포함 된 소변 수집 키트를 제공한다 : (1) 멸균 또는 클린 캐치 소변 샘플을 구하는 방법에 대한 작성 지침, (2) 습기 항균 toilettes, (3) 100 ml의 멸균 표본 수집 컵. 샘플을 수집하는 환자를 지시합니다. </li><li> 즉시 얼음에 소변 샘플을 배치하고 LABORA로 전송쿨러 토리. 즉시 세포 분리를위한 소변을 처리합니다. 지연이 불가피한 경우, 세포 생존 능력의 손실을 최소화하면서 최대 4 시간 동안 얼음에 표본을 저장합니다. </li></ol> 3. 분리 및 소변 세포의 확장 참고 : BSL2 생물 안전 캐비닛에서 무균 상태에서 다음 단계를 수행하십시오. <ol><li> 멸균 피펫을 사용하여, 전송 소변 샘플은 50 ml의 원심 분리 튜브 멸균한다. RT에서 10 분 동안 400 × g에서 원심 분리한다. </li><li> 튜브에 1 ㎖를 떠나 뜨는을 기음; 세포 펠렛을 방해하지 않도록주의하십시오. </li><li> 재현 탁은 세척 완충액 7 ㎖ 중에 다중 튜브의 펠렛을 결합하고 RT에서 10 분 동안 400 × g에서 원심 분리를 반복하고. </li><li> 조심스럽게 세포 펠렛 및 상등액 ~ 0.2 ~ 0.5 ml를 떠나, 뜨는을 대기음. 소변 전구 세포 (UPC) 매체의 2-3 용액에 재현 탁과 유엔의 4-6 우물에 정지를 전송코팅 된 24 웰 플레이트. </li><li> 72 시간 후, 잘 당 신선한 UPC 매체의 0.5 ml의 문화를 보완하고 2 ~ 3 일 후에 매체 변경합니다. 판에 부착하지 않는 적혈구 및 편평 상피 세포 매체 변화에 제거됩니다. </li><li> 4-6일 후 문화를 모니터링합니다. 참고 : 작은 2-4 세포 식민지가 나타 시작합니다. 세포는 둥근 또는 유형 I 또는 신장 상피 (RE) 세포를 각각 3 종류 II를 대표하는 연장됩니다. </li><li> 세포가 표시되면, 그들은 빠른 확장 단계를 거쳐야하기 때문에 2-3 일마다 매체를 변경합니다. </li><li> 세포가 80-90 %, 도금 후 약 9-15일에 도달하면, 추가 확장 24 웰 플레이트의 2-4 우물에 세포 (15,000-18,000 세포 / cm 2) 해리와 통로. 세포 통로 1 (P1)로이를 표시합니다. </li><li> 유세포 분석을 통해 혈통 사양 소변 세포를 특성화, immunohistochem적인 염색 또는 역전사 효소 - 중합 효소 연쇄 반응을 통한 (RT-PCR). </li><li> 장기 cryostorage에 대한 (DMEM 10 % 혈청과 10 % DMSO로 보충) 절연 소변 세포 (섹션 4)를 다시 프로그램 또는 중간 동결에 그들을 동결. </li></ol> 센다이 바이러스를 사용하여 4. 소변 세포 재 프로그래밍 참고 : 트랜 에이전트를 조작하는 동안 적절한 취급과 PPE (개인 보호 장비)를 사용하는 것이 좋습니다. BSL2 생물 안전 캐비닛에서 무균 상태에서 다음 단계를 수행하십시오. 에이전트 및 / 또는 형질 감염된 세포를 형질의 적절한 폐기는 환경과 건강 위험의 위험을 방지하는 것이 좋습니다. 아래에 설명 된대로 소변 세포 재 프로그래밍은 제조업체의 공급에 의존하는 프로토콜의 수정 센다이 리 프로그래밍 키트를 사용합니다. <ol><li> 센다이 바이러스를 사용하여 고효율의 리 프로그래밍을 보장하기 위해 사용되어 신속한 뇨 세포 1-5 통로해동 분할. 세포가 잘 복제하거나 노화가되지 않는 경우가 효율적으로 재 프로그래밍되지 않으므로 취소하십시오. </li><li> 시드 6 웰 플레이트의 두 우물에 잘 60,000 세포. 마크 일 -2이. 셀 시드 농도를 조정 (5 × 10월 4일에서 9일까지 × 10 4 세포 아니라 당) 일 0으로 80-90 %에 도달하기 위해 필요에 따라. </li><li> 0 일째 (셀 도금 후 48 시간)에서, 네 OSKM 요소 각각을 함유 센다이 리 프로그래밍 벡터 (SEV)을 제조. 미리 예열 UPC 매체의 1 ml의 벡터의 각을 추가합니다. 프로그램을 다시 소변 세포에 충분한 1.5의 MOI (5-7.5 × 10 5 CIU)를 사용합니다. 매체를 대기음 천천히 소변 세포의 잘 하나에 1 ml의 UPC + SEV를 추가합니다. 전달 음성 대조군으로 두 번째 잘 사용합니다. </li><li> 1 일에, 신선한 UPC 매체와 UPC + SEV 매체를 교체합니다. 일부 세포의 죽음으로 인해 바이러스의 세포 독성에 24 시간 후에 볼 수 있습니다. </li><li> 재 프로그램 클론의 효율성에 따라전자 형성하고 컴팩트 한 형태는 하루 6 또는 7까지 매일 매체를 계속 변경. </li><li> 이전에 형질 세포 (5 일 또는 6), 미토 마이신 C (3 시간 10 ㎍ / ㎖)을 0.1에 5 × 104 세포 / cm 2의 밀도에서 처리-MEFs에 도금하여 MEF 피더 플레이트를 준비 해리에 어느 날 % 젤라틴은 100mm 2 배양 접시를 코팅. </li><li> 다음 날 (6 또는 7 일), 0.25 % 트립신으로 세포를 해리 UPC 매체 플레이트 5 × 104 세포에 재현 탁 - 2 × 105 세포 / 100mm이 MEF 피더 플레이트. </li><li> 다음 날, 배아 줄기 매체로 전환 한 매체 매일을 변경합니다. 형질 전환 된 세포를 모니터링 현미경으로 세포를 관찰한다. 참고 : 세포 특성 조약돌 형태와 세포질 비율이 더 높은 핵을 가진 (12-18일 게시물 전달)와 클론 집계를 형성한다. </li><li> 2~3주 내에서 전달 후, 식민지를 선택하고 클론에 대한 새로운 접시로 전송알 확장. </li><li> 37 ℃에서 1 시간 동안 TRA-1-81 항체로 세포를 배양하여 IPSC 클론을 선택하기위한 생균 염색을 수행 ° C에서 CO는 CO 2 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 시간 동안 특정 형광 염료와 접합 된 이차 항체 염색에 의해 대향 인큐베이터 하였다. </li><li> 에 26 G 1.5 인치 바늘을 사용하여 작은 동일한 크기의 조각으로 큰 TRA-1-81 긍정적 인 IPSC 클론 (복제 당 4-6 개) 크로스 - 부화. </li><li> 선택 및 전송 매트 리겔의 각 웰 (10 ㎍ / cm 2)으로 여러 클론에서 10 ~ 20 크로스 해치 조각 배아 줄기 매체 24 웰 플레이트를 코팅 처리하는 멸균 피펫 팁을 사용합니다. 참고 : 하나의 우물에 개별적으로 도금 단일 클론에서 조각 확장 또는 능성을 유지하지 않습니다. </li><li> 재 프로그래밍 클론 마트 리젤의 표면에 부착 한 후 IPSC 매체에 배아 줄기에서 24 ~ 48 시간을 변경합니다. </li><li> 마트 리겔 코팅 플레이트, 수동 scra 유지 보수시PE-오프 완전히 재 프로그래밍과 만능 이영 IPSC (MD-IPSC) 클론 풍부하게 피펫 팁을 사용하는 차별화 된 세포 또는 오염 MEF 피더 세포를. </li><li> 개별 클론 ~ 100 ㎛의 크기에 도달 한 후, 3 분 동안 0.48 mM의 EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산) 용액으로 해리 및 IPSC 배지에 현탁 MD-iPSCs 작은 세포 집합체를 도금함으로써 클론 확장 (5 μM Y27632, RHO 키나제 보충 억제제 ) 신선한 마트 리겔 (10 ㎍ / cm 2) 12 웰 플레이트를 코팅. 매일 IPSC 매체를 변경합니다. </li><li> 각 클론의 완전한 리 프로그래밍은 OSKM 유전자 및 다 능성 마커 (OCT3 / 4, TRA-1-81)의 면역 조직 화학 염색을 모두 유전자 발현 분석에 의해 결정될 수있다. 만능 전위의 엄격한 평가가 완전히 재 프로그램 IPSC 라인 세 배엽으로 분화 할 수 확인하기 위해 채용되어야한다. 이 배아 체 (EB) 형성과 분화 분석 또는 운에 의해 중 수행 할 수 있습니다atoma 형성 분석법. </li></ol>

<ol><li>Guan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin-deficient+cardiomyocytes+derived+from+human+urine%3A+New+biologic+reagents+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery.</a> Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).</li>
<li>Dick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+Skipping+and+Gene+Transfer+Restore+Dystrophin+Expression+in+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Cardiomyocytes+Harboring+DMD+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations.</a> Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).</li>
<li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+the+new+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).</li>
<li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-Specific+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+as+a+Model+for+Familial+Dilated+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147(2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+derived+cells+are+a+potential+source+for+urological+tissue+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction.</a> J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).</li>
<li>Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+overview+of+iPS+induction+from+human+adult+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells.</a> Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).</li>
<li>Malik, N., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+methods+for+human+iPSC+derivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A review of the methods for human iPSC derivation.</a> Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).</li>
<li>Nakanishi, M., Otsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Sendai+virus+vectors+and+their+potential+applications+in+gene+therapy+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine.</a> Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).</li>
<li>González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+nuclear+envelope+localization+of+dystrophin+Dp71+and+dystrophin-associated+proteins+%28DAPs%29+in+the+C2C12+muscle+cells%3A+DAPs+nuclear+localization+is+modulated+during+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis.</a> J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).</li>
<li>Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+dystrophin+Dp71+impairs+PC12+cells+cycle%3A+localization+in+the+spindle+and+cytokinesis+structures+implies+a+role+for+Dp71+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division.</a> PloS One. 6 (8), e23504(2011).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

iPSCs를 사용하여 심혈관 질환을 모델링하는 것은 유전 적 기여 4-6를 이해하는 일반적인 방법이되고있다. 환자 세포로부터 샘플을 얻는 몇몇 예상치 못한 문제, 특히 어린 아이들, 이러한 소변 수집 같이 비 침습적 접근하는 옵션을 제공함으로써 회피 할 수있다. 이 젊은 환자 집단에서, 재 프로그래밍을위한 충분한 세포 소변을 수득하기에 충분한 양의 소변을 수집하는 것이 곤란하다. 유체에게 소변 수집하기 전에 30 분을 마시는 젊은 환자 코칭 소변 세포 분리의 성공을 향상시킨다. 그러나, 반복 소변 컬렉션이 인구에 필요할 수 있습니다. 우리는 합하고 근이영양증 환자에서 UCS의 분리 및 배양을 최적화하기 위해 두 개의 서로 다른 프로토콜을 3,7-을 적응. 유도 된 다 능성 줄기 세포는 근육 이영양증의 patien로부터 피부 섬유 아세포 또는 소변 중 세포에서 생성 된TS 1,2. 그러나 두 리 프로그래밍 프로토콜은 체...

심근증은 뒤 시엔 느와 베커 근이영양증 (MD) 환자에서 두 번째로 높은 사망 원인이다. X-연결 디스트로핀 유전자의 돌연변이가 하나 발생하더라도 3,500 남성 출산, 약간은 진보적 인 심장 근육 손상을 유도하는 분자 및 세포 이벤트에 대한 알려져있다. 근이영양증 환자 유래의 인간 유도 다 능성 줄기 세포는 기저 질환 메커니즘을 연구 약물 1,2- 스크리닝에 사용하는 신규 한 도구로 나왔다. 피부 조직 검사 또는 혈액 샘플의 예상되는 불편 함은 연구 참여에 대한 동의를하는 젊은 환자 및 / 또는 보호자를 설득 할 수 있습니다. 소변 샘플은 리 프로그래밍을 수정할 수있는 방법이다 체세포 비 침습적 원천이다. 우리는 최근 근이영양증 환자로부터 수집 된 소변 세포를 배양 할 수 있다는 것을 도시하고 효율적 야마나카 인자를 사용하여 레트로 바이러스 형질 도입 iPSCs (내로 재 프로그램 한OCT3 / 4, SOX2, Klf4 및 c-Myc와; OSKM) 1. 레트로 바이러스 유전자 전달의 단점은 숙주 염색체로 유전자의 재 프로그래밍 랜덤 통합이다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 소변 세포 리 프로그래밍에 대한 비 통합 센다이 바이러스를 사용 하였다. 이 프로토콜은 추가 연구를위한 심근 세포 또는 다른 종류의 세포로 분화 할 수 근이영양증 환자의 격리 소변 세포의 센다이 바이러스의 재 프로그래밍에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 특정 환자 다른 질환을 위해 더 적응 될 수있다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>4 Oz. 뚜껑이 있는 표본 컵</td><td>STL 의료 공급</td><td>M9AMSAS340</td><td>소변 샘플 수집용</td></tr><tr><td>15 ml BD-Falcon 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml BD-Falcon 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>라운드 글라스 커버슬립</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS Sendai 재프로그래밍 키트</td><td>Life Technologies</td><td>A1378-001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep w/o Glutamine&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>웜 인 37 &deg; C 사용 전 수조</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Warm in 37 &deg; C 사용 전 수욕</td></tr><tr><td>B-27 보충제 w/인슐린 (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>37°C에서 따뜻하게 하세요; 사용 전 C 수욕</td></tr><tr><td>B-27 보충제 인슐린 없음 (50개)</td><td>Life Technologies</td><td>0050129SA</td><td>37°C에서 따뜻하게 하세요. C 사용 전 수조</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>37°C에서 따뜻하게 합니다. C 사용 전 수조</td></tr><tr><td>Versene, 1:5,000</td><td>Life Technologies</td><td>15040066</td><td>37°C에서 따뜻하게; 사용 전 C 수조</td></tr><tr><td>bFGF (10 &마이크로; g)</td> <td>Life Technologies</td><td>13256-029</td><td>Warm in 37 &deg; C 사용 전 수욕</td></tr><tr><td>셀 카운터 카트리지</td><td>Life Technologies</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>녹아웃 세럼 (500&nbsp; ml 병)</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Warm in 37 &deg; C 사용 전 수조</td></tr><tr><td>회수 세포 배양 냉동 매체</td><td>생명 기술</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>각질 세포-SFM (1x), 액체</td><td>생명 기술</td><td>17005-042</td><td>따뜻한 37 &deg; 사용 전 C 수조</td></tr><tr><td>DMEM, High Glucose, Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>10566-016</td><td>37°C에서 따뜻하게 해; 사용 전 C 수욕</td></tr><tr><td>Ham's F-12 영양 혼합물&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11765-054</td><td>Warm in 37 &deg; C 수조 사용 전</td></tr><tr><td>EGF 재조합 인간 단백질, 액체 형태</td><td>생명 과학 PHG0311L</td><td></td><td>37 &deg에서 따뜻하게; 사용 전 C 수욕</td></tr><tr><td>인슐린, 인간 재조합, 아연 Soln</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>37 &deg에서 따뜻하게; 사용 전 C 수조</td></tr><tr><td>TeSR-E8</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5940</td><td>Warm in 37 &deg; C 사용 전 수조</td></tr><tr><td>ROCK 억제제 (Y-27632)</td> <td>Selleck</td><td>S1049</td><td>37 &deg에서 따뜻한; 사용 전 C 수조</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>hESC 인증 매트릭스, LVED Free</td></tr><tr><td>RNeasy 미니 키트&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA 합성 키트</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8890</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR 마스터 믹스 (2x)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>FBS 인증</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Warm in 37 &deg; C 사용 전 수조</td></tr><tr><td>아데닌 바이오 시약</td><td>시그마 알드리치</td><td>A2786-5G</td><td>37 &deg에서 따뜻한; C 수조 사용 전</td></tr><tr><td>콜레라 독소 Vibrio cholerae</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8052-.5MG 37</td>°<td>C에서 따뜻하게 사용 전 C 수조</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888-1G</td><td>37°C 웜 C 물 목욕 사용 전</td></tr><tr><td>홀로 트랜스페린 인간</td><td>시그마 Aldrich</td><td>T0665-50MG</td><td>따뜻한 37 &deg; C 사용 전 수조</td></tr><tr><td>3,3',5-Triiodo-L-thyronine 나트륨 염</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6397-100MG</td><td>37°C에서 따뜻하게; 사용 전 C 수조</td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-3598</td><td></td></tr><tr><td>플루오로마운트 Aquous 장착 매체</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드</td><td>Alfa-Aesar</td><td>43368</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Antibodies</td></tr><tr><td>Mouse anti CD44 - FITC로 표시되어 있음&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>560977</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 CD146 - PE</td><td>BD Biosciences</td><td>561013</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 CD73 - PE</td><td>BD Biosciences</td><td>561014</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 -&알파 라벨링;-평활근 액틴</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A2547</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 Vimentin</td><td>Abcam</td><td>ab8978-100</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 - TRA-1-81</td><td>Life Technologies</td><td>411100</td><td></td></tr><tr><td>토끼 안티 Oct 3/4</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 디스트로핀</td><td>Leica Biosystems</td><td>NCL-DYSB</td><td></td></tr></tbody></table>

근육 영양 장애 환자에서 유도 만능 줄기 세포의 생성 : 소변 유래 세포의 효율적인 통합이없는 프로그램을 다시

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

이영 심근 병증은 근육 이영양증 제대로 이해 결과이다. 근이영양증 환자에서 유도 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 생성하면 체외 질병 모델 시스템을위한 귀중한 셀룰러 소스 및 약물 검사 연구에 사용할 수 있습니다. 환자 뇨 - 유래 세포는 1 이영양증 심근증을 모델링하기 위해 유도 된 다 능성 줄기 세포로의 성공적인 리 프로그래밍에 사용되어왔다. 벡터 시스템을 통합의 안전성 문제를 해결하는, 우리는 야마나카의 전달은 근이영양증 환자로부터 수집 된 소변 세포에 인자 비 통합 센다이 바이러스 벡터를 이용하여 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 완전히 2-3주 내에서 클론을 재 프로그램 생성합니다. 만능 세포 통로 (13)에 의해 벡터 무료입니다. 이 이영 iPSCs는 심근 세포로 분화 및 질병 메커니즘 또는 약물 검사에 대한 공부를 사용할 수있다.

(각각 97.37 %, 97.09 %, 97.3 %; 그림 1A 및 1B) 인간의 소변에서 분리 된 대부분의 전구 세포는 CD44, CD73, 및 CD146 등 uroepithelial 전구 및 혈관 주위 세포 마커에 대한 긍정적이다. 이 세포는 또한 알파 - 평활근 액틴과 멘틴 (그림 1B)와 같은 다른 중간 엽 마커를 표명했다. RT-PCR 분석 아세포-7의 약한 표현이 점에서 문화 세포의 혼합 인구의 증거를 제공합니다 (CK-7) 및 Uroplakin (UP) -ia 및 -IIIa, uroepithelial 혈통의 마커 (그림 1C). 재 프로그래밍 단계는도 2a에 개략적으로 나타내었다. 대표적인 이미지는 프로토콜 (도 2B)에 걸쳐 상이한 시점 동안 세포의 형태를 보여준다. 소변 세포는 연...

이 프로토콜은 근이영양증 환자로부터 소변 유래 세포를 분리하기 위한 상세한 절차를 수반하며, 센다이 바이러스 형질전환(Sendai virus transduction)을 통한 효율적이고 신속한 재프로그래밍 을 수반합니다.

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

다음 실험의 전반적인 목표는 소변 유래 세포 배양과 통합 무료 재프로그래밍 방법을 시작으로 근이영양증 환자로부터 유도 만능 줄기세포 또는 IPSC를 효율적으로 생성하는 것입니다. 이는 먼저 근이영양증 환자의 소변 샘플을 수집하여 달성됩니다. 두 번째 단계로, 소변 세포를 분리하여 소변 유래 세포 배양으로 확장합니다.다음으로, 소변 유래 세포에 야마나카 인자를 함유한 센다이 바이러스가 형질주입되고 12일 후에 군체와 같은 전형적인 만능 세포가 나타납니다. 궁극적으로 13번 통과문에 의해, 만능 줄기세포의 전이유전자가 없는 상태는 R-T-P-C-R 분석에 의해 확인될 수 있다. 렌티바이러스 벡터를 사용하여 분리된 피부 섬유아세포의 재프로그래밍과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술을 사용하면 환자로부터 체세포를 비침습적으로 얻을 수 있고 바이러스 재프로그래밍의 제로 발자국 방법을 사용하여 IPC를 효율적으로 생성하는 데 사용할 수 있다는 것입니다.이 방법은 근이영양증 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 인체 적용에 대한 안전 문제 없이 이러한 조건을 체외에서 모델링하는 방법과 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 박사 후 연구원인 Mohammad Zishan Al, 기술자인 Courtney Guesting, 그리고 제 연구실의 대학원생인 Melanie Ryder가 절차를 시연할 것입니다.소변 샘플을 채취하려면 환자에게 채취 30분 전에 수분을 마셔 약 30-40밀리리터의 소변을 채취할 수 있도록 조언하는 것으로 시작합니다. 환자가 준비가 되면 다음 항목이 포함된 소변 채취 키트, 멸균 또는 깨끗하고 습한 항균 변기 및 샘플 항균 변기를 구하는 방법에 대한 서면 지침, 100ml 멸균 검체 채취 컵을 환자에게 제공합니다.샘플이 수집되면 즉시 수집 컵을 얼음 위에 놓고 샘플을 쿨러에 넣어 실험실로 옮깁니다. 그런 다음 멸균 피펫을 사용하여 소변 샘플을 멸균 50ml 원심분리 튜브로 옮기고 실온에서 10분 동안 400배 G로 튜브를 돌립니다. 다음으로, BSL에서 두 개의 생물 안전 캐비닛은 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 마지막 하나인 상등액 밀리리터를 제외한 모든 것을 흡인합니다.그런 다음 7ml의 세척 버퍼로 세포를 씻고 세포를 다시 회전시킵니다. 이번에는 마지막을 제외한 모든 것을 약 0.2-0.5 밀리리터의 상층액을 흡인합니다. 지금 펠릿을 2 3 밀리리터의 요로 전구 세포 또는 UPC 매체에 재사용하고 72 시간 후에 코팅되지 않은 24 웰 플레이트의 4 내지 6 웰로 현탁액을 옮기고, 웰 당 0.5 밀리리터의 신선한 UPC 배지로 배양을 보충합니다.4일에서 6일 사이의 배양 동안 배양을 모니터링합니다. 각각 1형 또는 2형 신장 상피 세포를 대표하는 둥글거나 길쭉한 세포로 구성된 2-4개의 작은 세포 군집이 나타나기 시작해야 합니다. 2-3일마다 매체를 계속 교체하십시오.콜로니는 약 9-15일의 배양에서 급속한 확장 단계를 거치게 되므로 이 시점에서 세포는 80-90% 융합되어야 하며, 추가 확장을 위해 24웰 플레이트의 2-4웰로 세포를 분할해야 합니다. 세포 통로 1로 이 배양을 표시해서, 소변 세포는 그 때 유세포 분석, immunohistochemical 염색을 통해, 또는 형질 도입 씨, 60, 웰 당 000의 세포 이전에 일일 전에 고능률 reprogramming를 지키기 위하여 역전사 효소 폴리메라이제 연쇄 반응을 통해 계통 특정한 마커를 위해 성격을 나타낼 수 있습니다. 통로 1에서 5 문화까지 0 일에 6 개의 우물 플레이트의 2 개의 우물로 문화합니다.1ml의 예열 UPC 매체에 재프로그래밍을 위한 적절한 MLI에서 4개의 OSKM 인자 각각을 추가하여 Sendai 재프로그래밍 벡터를 준비하고, 서스펜스 매체를 흡인하고, 다음 6일 동안 소변 세포의 한 웰에 바이러스 현탁액을 천천히 추가합니다. 5일째에 상등액을 매일 신선한 UPC 배지로 교체하고, 6일째에 젤라틴으로 코팅된 100mm 정사각형 배양 접시에 MES를 도금한 미토마이신 종자 처리. 소변 세포를 트립신으로 해리하고, UPC 배지에 재현탁시킨 후 메타 공급판 당 5 배의 10배에서 5배의 10배로 판화합니다.다음날, UPC 배지를 인간 배아 단계 또는 HES 배지로 교체하고 현미경으로 세포를 모니터링하여 약 12-18일 동안 변형된 세포를 관찰합니다. 형질도입 후, 세포는 특유의 조약돌 형태와 더 높은 핵 대 세포질 비율을 가진 클론 응집체를 형성해야 합니다. 재프로그래밍된 IPSC 클론을 식별하기 위해 TRA 180 1 항체에 대한 라이브 셀 염색을 수행합니다.그런 다음 26 게이지 1/2 인치 바늘을 사용하여 TRA 180 1 양성 클론 응집체를 클론당 4-6개의 작고 동일한 크기의 조각으로 교차 해칭합니다. 다음으로, 멸균 피펫 팁을 사용하여 여러 클론에서 10-20개의 교차 해칭 조각을 선택하여 HESC가 있는 각 웰 A 24웰 마트리겔 코팅 플레이트로 옮깁니다. 중간, 재프로그래밍된 클론이 마트리겔 표면에 도금된 후 24-48시간.매체를 IPSC 매체로 교체합니다. 피펫 팁을 사용하여 분화된 세포 또는 오염된 메스암페타민 공급세포를 수동으로 긁어내어 완전히 재프로그래밍된 만능 영양 이상성 IPSC 클론의 정제를 돕습니다. 클론의 크기가 약 100마이크로미터에 도달한 후, 3분 동안 EDTA로 세포를 해리한 다음 RO 키나아제 억제제가 보충된 IPSC 배지에 현탁된 재프로그래밍된 영양 장애 IPSC의 작은 세포 응집체를 새로운 마트리겔로 코팅된 12 호일 플레이트에 플레이트화합니다.마지막으로, 유전자 발현 분석과 면역조직화학 염색을 통해 각 클론의 다능성을 확인합니다. 만능 마커의 경우, 인간의 소변에서 분리된 대부분의 세포는 CD 44, CD 73 및 CD 1 46과 같은 전구 세포 및 줄기 세포 마커에 대해 양성입니다. 세포는 또한 알파, 평활근, actin 및 menton과 같은 중간엽 마커를 나타냅니다.분리된 세포의 R-T-P-C-R은 배양물에서 세포가 혼합되어 있다는 증거를 제공합니다. 그 점에서 사이토케라틴 7 및 UIN 1 A 및 3 유로 상피 세포의 마커의 발현이 약합니다. 소변 세포는 0일차에 길쭉한 2형 세포에서 재프로그래밍 4일차에 조약돌 패턴으로 변형됩니다.12일째가 되면 전형적인 만능 클론이 관찰되고 피더가 없는 조건에서 만능 형태를 유지할 수 있습니다. TRA 180 1에 대한 라이브 셀 염색을 사용하여 재프로그래밍된 클론을 식별할 수 있습니다. 벡터 및 전이유전자, 유리 만능 클론의 생성을 확인하기 위해 센다이 바이러스 게놈 및 각 외인성 OSKM 인자에 대한 프라이머를 사용하여 R-T-P-C-R을 수행할 수 있습니다.외인성 유전자 발현은 더 이상 13번 통로에 의해 검출되지 않지만, 내인성 인자의 상향 조절은 관찰될 수 있다. 면역형광 염색은 IPC에서 만능 마커의 발현을 확인하지만 소변 세포에서는 확인하지 않습니다. 그런 다음 dystrophin 단백질 및 유전자의 발현은 야생형 대조군 및 이영양성 세포주에서 이러한 대표적인 이미지로 입증된 바와 같이 각각 추가 면역형광 염색 웨스턴 블로팅 및 R-T-P-C-R에 의해 검증될 수 있습니다.마스터가 되면 이 기술을 사용하여 ucs의 ene free reprogramming을 달성할 수 있습니다. 몇 주 안에 이 절차를 따라 IPC를 심근세포 또는 골격근세포로 구별하여 근이영양증의 기전을 더욱 발전시킬 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

우리는 함께 retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4과 c-myc (OSKM)를 인코딩 벡터, 라이브 염색법에 의해 정확하게 다시 프로그램 hiPSC의 신분을 이용하여 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (hiPSC) Tra-로 인간의 체세포의 효율적인 언어학 재활을위한 프로토콜을 제시 1-81 항체.

인간 유도 Pluripotent 줄기 세포의 선택 및 분리 식민지는 성인 섬유아 세포에서 다시 프로그램

유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)유래 한 근생 선조는 근 이영양증을 치료하는 세포 치료 전략에 대한 유망한 후보입니다. 이 프로토콜은 급성 및 만성 근육 재생의 마우스 모델에서 iPSC 유래 메소포아세포(근육 선조의 일종)의 이식 및 분화를 평가하는 데 필요한 이식 및 기능측정을 설명합니다.

근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식

여기서, 우리는 인간의 생물학적 기능을 다시 요약 관대 배양 조건 하에서 수축성 근섬유 (myospheres)의 입체 클러스터를 형성하는 골격 근육 원종의 균질 한 집단을 생성 향해 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기 세포)의 후생 유전 학적 리 프로그래밍을 기반 프로토콜을 설명 골격 근육.

성적인 프로그램을 다시 만들에 의해 인간 배아 줄기 세포에서 Myospheres의 생성

유도 만능 줄기 세포의 생성은자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 힘든 다시 차별화를 통해 진행은 여전히​​ 임상 번역을 방해한다. 여기에서 우리는 성인 인간 섬유 아세포의 유도와 유도 된 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환과 신경 계통에 후속 차별화를 설명합니다.

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 임상 응용 프로그램 및 기초 연구에 대한 환자의 특정 조직의 소스를 나타냅니다. 여기서는 비 - 에피 솜 통합 플라스미드를 사용하여 바이러스 프리 iPSCs에 냉동 버피 코트로부터 얻은 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)를 재 프로그래밍 상세한 프로토콜을 제시한다.

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 인간 성인 말초 혈액 세포에서 통합이 없는 iPSC를 효율적으로 생성하기 위한 자세한 방법을 설명합니다. 재프로그래밍 인자를 발현하기 위해 KLF4, MYC, BCL-XL 또는 OCT4 및 SOX2와 같은 4개의 oriP/EBNA 기반 에피솜 벡터를 사용하여 1mL의 말초 혈액에서 수천 개의 iPSC 콜로니를 얻을 수 있습니다.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

여기서, 우리는Dmdmdx 마우스 유래 피부 섬유아세포로부터 iPSC에서 디스트로핀 발현을 복원하고 Tet-on MyoD 활성화 시스템을 사용하여 iPSC를 myogenic 전구 세포(MPC)로 직접 분화하는 Cas9 기반 exon23 결실 프로토콜을 제시한다.

iPSC 유래 근육 전조제에서 디스트로핀 발현 복원에 있는 CRISPR/Cas9 기술

이 프로토콜은 센다이 바이러스 감염에 의해 신경 줄기 세포를 유도하는 말초 혈액 단핵 세포의 재프로그래밍을 제시, 도파민성 뉴런으로 iNC의 분화, 일방적으로 병변에 DA 전구체의 이식 파킨슨병 마우스 모델, PD 치료를 위한 iNSC 유래 DA 전구체의 안전성 및 효능에 대한 평가.

말초 단핵 세포에서 유도 된 신경 줄기 세포의 생성 및 이식 연구에 대 한 도파민성 신경 전구체로 분화

이 문서에서는, 우리는 EXON 건너뛰기 후에 dystrophin mRNA 및 단백질 수준의 회복을 평가하기 위하여 MYOD1-변환된소변 유래 세포를 사용하여 Duchenne 근이영양증 근육의 능률적인 모델링을 위한 상세한 프로토콜을 기술합니다.

인간 소변 유래 세포에서 얻은 직접 재프로그래밍 된 Myotube에서 건너 뛰는 Exon

이 프로토콜은 근막세포로 피부 섬유아세포의 변환과 근투로의 분화를 설명합니다. 세포주 신경 근육 장애를 가진 환자에서 파생 되 고 병리학 적 메커니즘을 조사 하 고 치료 전략을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다.

신경 근육 장애에 대 한 치료를 조사 하기 위해 Myoblasts에 인간 섬유 아 세포의 직접 재프로그래밍

본 프로토콜은 인간 및 비인간 영장류 소변 유래 세포를 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로 분리, 확장 및 재프로그래밍하는 방법과 새로 생성된 iPSC의 피더 없는 유지 관리에 대한 지침을 설명합니다.

소변에서 유래한 영장류 유도 만능줄기세포의 생성 및 유지

배우세요 근육 영양 장애 환자의 소변 유래 세포를 이용한 비침습적 iPSC 생성 방법을. Sendai 바이러스를 활용한 통합 없는 재프로그래밍으로 12일 만에 만능 줄기 세포를 효율적으로 유도하고 13대에서 트랜스진 프리 상태를 확인합니다.

근육 영양 장애 환자에서 유도 만능 줄기 세포의 생성 : 소변 유래 세포의 효율적인 통합이없는 프로그램을 다시

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