Name: 이외에 Microdissection에 의해 개발 소뇌 차별화 된 세포 집단의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 배우세요 형광 마커를 가진 신생아 마우스의 발달 중인 소뇌에서 네스틴 발현 전구세포를 분리하는 방법을. 미세해부와 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 살아있는 세포를 순수하게 분리하고 배양할 수 있습니다.

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저자는 지원 유동 세포 계측법 제임스 Oesterling에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 미국 국립 암 연구소 (R01-CA178380, ZY)와 미국 국립 연구소 박사후 훈련 보조금 (5T32CA009035-37, LWY)에서 부여에 의해 지원되었다.

이 프로토콜에서 동물의 사용은 폭스 체이스 암 센터의 동물 관리 및 사용위원회의 승인 절차에 따라 수행되었습니다. 인스트루먼트, 솔루션 및 Coverslips는의 1 준비 <ol><li> # 5 미세 집게의 청소 두 세트, # 7 한 세트의 미세 곡선 포셉, 하나의 큰 수술 가위, 한 microdissecting 가위, 한 주걱 하나 천공 숟가락. 자체 밀봉 멸균 파우치 및 오토 클레이브에 악기를 배치합니다. 사용할 준비가 될 때까지 주머니에 상품을 보관하십시오. </li><li> 3 % 낮은 용융 온도 아가로 오스 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 거품이 나타날 때까지 멸균 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS) 50 ㎖에 1.5 g 아가로 오스를 추가 한 다음 전자 레인지와 더위에 배치합니다. 모든 아가 때까지 소용돌이 플라스크 및 재가열은 해산했다. 수풀이 나타나면 이전 가열 교반 막대와 솔루션을 섞는다. </li><li> 37 ° C의 물을 욕조에 보관 솔루션까지 필요. </li><li> 장기 저장 상에 대한전자, 개월 동안 실온에서 4 ° C에서 향후 사용을 위해 아가로 오스 솔루션을 저장합니다. 액화 전자 레인지에 재가열. 아가로 오스 용액의 반복 가열 따뜻한 멸균 증류수 초기 중량을 유지하도록 가열하기 전에 플라스크의 무게. </li></ol></li><li> 이전에이 설명 된대로 파파인 기반의 세포 분리에 대한 다음과 같은 솔루션을 준비 : <ol><li> 멸균 페놀 레드를 DPBS에 함유 파파인 (100 U / ㎖), 시스테인 (0.2 ㎎ / ㎖) 및 DNase의 (250 U / ml)로 파파인 용액. </li><li> 소 혈청 알부민과 오보 뮤코 이드 용액 (BSA, 8 ㎎ / ㎖), 대두 트립신 억제제 (8 ㎎ / ㎖))과의 DNase (250 U / ㎖) 멸균 페놀 레드 - 함유 DPBS에서. 필터 솔루션을 모두 소독 및 페놀 레드 함유 DPBS의 원래 색상을 반환하는 산도를 조정합니다. </li></ol></li><li> 세포 배양액 (NB / B27)를 제조 : 1 mM 피루브산 나트륨, 2 mM의 L-글루타민을, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (P / S) 및 B27 보충제와 기저 용지를 보충. FilteR 소독 및 빛으로부터 보호합니다. 사용하기 전에 37 ° C에서 미디어와 5 % CO 2를 평형. </li><li> FACS 버퍼를 준비 : 5 % 소 태아 혈청 DPBS에서 (FBS). 47.5 ML의 DPBS에 2.5 ML의 FBS를 추가합니다. </li><li> 폴리-D-라이신 (PDL) 코팅 된 커버 슬립을 준비합니다. <ol><li> 오토 클레이브 새로운 유리 커버 슬립. </li><li> 코트 PDL와 커버 슬립 (멸균 증류수 100 μg / ㎖) 및 37 ° C에서 2 시간 동안 배양 또는 실온에서 하룻밤. </li><li> 세척 멸균 증류수로 된 커버. NB / B27 매체와 한 번 씻으십시오. 커버 슬립은 사용하기 전에 조직 문화 후드 완전히 건조 시키십시오. </li></ol></li></ol> 조직 조각의 2 해부 및 준비 <ol><li> 해부의 날, 흡수 패드와 70 % 에탄올 및 커버 해부 영역을 닦아. </li><li> 멸균 파우치 해부 도구를 제거합니다. 얼음 차가운 얼음에 작은 페트리 접시와 장소에 멸균 DPBS / 1 % P / s의를 추가합니다. </li><li> 목을 벨 P4 MATH1-GF큰 수술 가위로 P / 네 스틴 - CFP 마우스 새끼는 잘 곡선 집게로 머리를 누르십시오. 피부를 제거하고 부드럽게 미세 겸자 후 주걱을 이용하여 두개골로부터 뇌를 꺼내서 DPBS / 1 % P / 초를 포함하는 페트리 접시로 전송 # 5와 두개골을 벗겨. <ol><li> # 5 미세 집게를 사용하여 조심스럽게 뇌의 나머지 부분에서 소뇌를 구분합니다. 가능한 빨리 한 번에 하나의 강아지를 해부해야합니다. </li><li> 분자 및 기능적 분석을위한 충분한 네프를 얻기 위해 8 소뇌의 최소 수집. </li></ol></li><li> 3 % 낮은 용융 온도 아가로 오스 용액을 2 × 2 × 2cm를 측정 삽입 금형을 입력합니다. 아가로 오스의 온도가 더 이상 37 °의 C 없는지 확인하십시오. </li><li> 실험실 조직을 부드럽게 dabbing에 의해 소뇌 물기를 제거합니다. 수직으로 금형에 소뇌를 놓습니다. 신속 공고히 할 수 있도록 얼음에 금형을 놓습니다. 블록 당 ~ 4 소뇌를 사용합니다. </li><li> 리를 얻진동 블레이드와 vibratome ving 조직 섹션. 면도날과 소뇌 함유 아가로 오스 블록을 낸다. 수직으로 지향 소뇌와 vibratome 판 아가로 오스 블록을 붙인다. </li><li> 아래 얼음처럼 차가운 멸균 DPBS / 1 % P / S와 장소 얼음 vibratome의 트레이를 입력합니다. <ol><li> 소뇌의 전체 길이를 600 μm의 섹션을 잘라. 천공 숟가락을 사용하여 얼음 트레이에서 섹션을 수집합니다. 얼음에 DPBS / 1 % P / S 가득 페트리 접시에 넣어 섹션. </li></ol></li></ol> 3 이외에 Microdissection 및 세포 분열 <ol><li> 형광 해부 현미경 조직 슬라이스가 들어있는 페트리 접시를 놓습니다. <ol><li> 신중하게 (도 1에 점선 참조) CFP + 분자 층 및 GFP + EGL 사이에서 해부에 의해 미세 핀셋을 이용하여 소뇌 섹션의 나머지로부터 분리 EGL. 될 것이다, 분자 층의 일부를 포함하지 않도록주의하십시오네 스틴 발현 버그만 글리의 오염. </li><li> 가능한 한 빨리이 단계를 완료하고 세포 사멸을 방지하기 위해 얼음에 조직을 유지합니다. </li><li> 다음 단계로 진행하기 전에 주변 조직 아가로 오스를 제거한다. </li></ol></li><li> 이전에 단일 세포 현탁액을 수득 2 바와 같이 파파인 기반 프로토콜을 사용 microdissected EGL 조직 다이제스트. <ol><li> FACS를 통해 CFP 양성 세포의 수집을 위해 FACS 버퍼에 세포를 다시 일시 중지합니다. </li></ol></li></ol> 4 셀 정렬 및 도금 <ol><li> CFP 적절한 필터를 포함하고 얼음에 FACS 완충액에 세포를 수집 사이토 멸균, 고속의 흐름을 이용하여 CFP 형광 용 정렬 셀. 각 P4 소뇌에서 약 100,000 네프를 얻습니다. </li><li> 5 분 동안 300 XG에 원심 분리기 세포. 추가 실험을위한 분자 분석이나 문화에 대한 즉시 세포를 사용합니다. </li><li> 배양 세포에, 미리 예열 NB / B27의 m에서 세포를 다시 일시 중단PDL-코팅 된 커버에 edia 및 판은 이전에이 설명했다. </li></ol>

<ol><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li>
<li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+neuronal+precursor+proliferation+in+the+cerebellum+by+Sonic+Hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog.</a> Neuron. 22, 103-114 (1999).</li>
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</ol>

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여기에 설명 된 미세 절제 방법은 분자와 기능적 분석에 사용하기 위해 살아있는 세포의 순수 모집단을 분리 할 제 절차이다. 리 등. 구에 의해 알 수 있듯이, 이 방법에 의해 얻어진 배양 네프 다양한 실험에 통합 때문에 고순도, 또한 마이크로 어레이 분석에 이용 될 수있다. 그것은이 미세 절제 기술에 능숙하게 시간이 걸리는 것이 매우 중요하다. 네프는 네 스틴 발현 버그만 글리는 NEP 세포 격리을 오염 및 순도를 손상시킬 수있는 분자 층에 매우 가까이에 EGL의 깊은 지역에 위치하고 있습니다. 미세 절제 따라서 포함되지 않은 인접 조직에 있는지 오염 세포를 만들기 위해 보수적으로 수행해야합니다. 여기에 설명 된 미세 절제 기술의 주요 장점은 furthe 배양 살아있는 세포 수를 얻을 수있는 능력이다연구 실험. 이 때문에,이 절차의 모든 단계 중에 신속하게 수행하고 조직이 최대한 얼음에 보관하는 것이 중요하다. 또한, 모...

소뇌 여러 세포층, 각각 별개 함유 세포 유형으로 구성된다. 분자 층 및 조롱박 층은 각각 버그만 글리와 조롱박 신경 세포를 포함하는 동안 개발 과정에서 EGL은 과립 신경 세포 전구체 (GNPs)를 증식 포함되어 있습니다. 소뇌 내 깊은 신경 줄기 세포 (NSCs의)와 희소 돌기 아교 세포 하나가 들어있는 흰색 물질을,있다. 소닉 헤지 호그 (쉬) 소뇌 발달을 조절하는데 중요한 역할을하고, 특히, 그것은 기워 수용체 PTC (), 쉬 2-4 시그널링 네거티브 레귤레이터에 결합을 통하여 GNPs의 증식을 촉진시킨다. 쉬 시그널링의 비정상적인 활성화가 모세포종 (MB), 5,6 어린이에서 가장 흔한 악성 뇌종양을 생성한다. PTC 돌연변이 MB 형질 전환 마우스 모델은 MB의 연구를위한 강력한 도구이며, 인간의 MB 7,8를 닮은 종양을 개발합니다. 사용이마우스, 그것은 GNPs 고슴도치 형 MB 7의 원래 세포 것을 발견되었다. 또한, GNPs 외에, 우리는 또한 최근에 MB를 야기 할 수있는 현상 소뇌 EGL 내의 신경 전구 세포의 집단을 고유 식별했습니다. 이러한 세포 유형 VI 중간 필라멘트 단백질, 네 스틴의 높은 수준의 발현 및 네프 9 불린다. 네프는 EGL의 깊은 부분에 위치한 유일한 신생아 소뇌 개발 과정에서 일시적으로 존재한다. 그들은 GNPs와 과립 세포 계보에 최선을 다하고 있지만,이 대기하고 MATH1, 기존의 GNPs 10 잘 설립 마커를 발현하지 않는 별개 있습니다. 또한, 네프 그들 MB의 종양에 대한 새로운 기원하게 쉬의 신호 전달 경로 (9)의 활성화 이후 MB에 상승보다 효율적으로보다 GNPs을 제공합니다. 우리는 이전에 미세 절제 기술에 의해 출생 후의 일 4 (P4)에서 소뇌 EGL에서 네프 격리여기에 9 설명했다. 조직의 직접 현미경 시각화를 통해 미세 절제는 소뇌 EGL의 특정 해부 수 있습니다. 네 스틴도 소뇌 백질과 분자 층 1,7,11,12에서 버그만 글리에 의해 NSCs을 표현하고 분석을 혼동 하듯이,이 세포를 포함하지 않는 것이 중요했다대로이 필요합니다. microdissected 조직에서 분리 한 세포는 분자 분석을 위해 즉시 이용 될 수도 있고 또 애플리케이션을 배양 할 수있다. 특히 EGL을 microdissecting을 돕기 위해 더욱 네프를 정화, MATH1-GFP (녹색 형광 단백질) 마우스는 네 스틴-CFP (시안 형광 단백질) 마우스와 함께 넘어졌다. 구체적 MATH1 GNPs 및 GFP 발현에 의해 표현되는 전사 인자는 EGL 9, 13에서 명확하게 볼 수있다. 네 스틴 - CFP 생쥐 CFP의 핵 형태를 표현하고 쉽게 9,14 분자 층으로 시각화 될 수있다. 함께, CFP 및 GFP 발현 EGL의 미세 절제를위한 경계를 생성 (도 1 참조). CFP 양성 네프는 다음 해부 EGLs의 효소 분해 다음, FACS에 의해 고립되었다. 현재 EGL에서 세포를 분리하기위한 가장 잘 이용 방법은 전체 소뇌 조직 (15, 16)의 퍼콜 구배 원심이다. 그러나,이 방법은 완전히 분자 층과 백질에서의 네 스틴 + 세포 집단을 배제 할 수 없으며, 따라서 네프의 연구에 사용될 수 없다. 관심의 세포를 제거하기 위해 레이저 에너지의 전달을 사용하여 레이저 캡처 미세 절제는 이종 조직 (17, 18)의 특정 세포를 분리하기 위해 사용되지만 캡처 세포에서만 DNA, RNA 및 단백질의 복구를 위해 사용될 수없는 수있는 또 다른 방법이다 수는 배양한다. 이 프로토콜은 특히 EGL에서 네프의 살아있는 순수한 인구를 분리하는 방법을 제공합니다.이 기술은 인식 할 수있는 해부학 적 구조 또는 형광 표지 세포 / 영역들 중 하나가 다른 조직 유형에 적용될 수있다. 따라서, 세포 격리 프로토콜에이 신규 한 미세 절제 기술을 통합의 주요한 장점은 세포 조직에 인접 오염을 제거하는 특정 조직 영역으로부터 분리 될 수 있고, 셀이 다른 애플리케이션에 대한 분석 또는 배양 즉시 수집 될 수 있다는 것이다.

<table><tbody><tr><td>Neurobasal 매체</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>, Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr>, <tr><td>초순수 저용융 온도 아가로스</td><td>, Invitrogen</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>DPBS,</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr></tbody></table>

이외에 microdissection에 의해 개발 소뇌 차별화 된 세포 집단의 분리

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

미세 절제는 조직의 특정 지역을 격리하며 인접 지역에서 휴대 소스에서 오염을 제거 할 수있는 새로운 기술이다. 이 방법의 첫 번째 연구에서 이용 된 네 스틴을 발현하는 전구 세포 (네프)를, 소뇌 새싹 외부 층 (EGL) 세포의 새롭게 식별 인구. 형광 활성화 세포 분류 (FACS)과 조합 미세 절제를 사용 네프의 순수한 인구 소뇌 EGL 종래 과립 뉴런 전구체로부터 다른 오염 네 스틴 발현 세포 별도로 수집 하였다. 미세 절제없이 네프의 기능성 분석은 퍼콜 구배 원심 분리 및 레이저 캡처 미세 절제으로 사용할 현재의 방법으로 불가능했을 것이다. 이 기술은 또한 인식 할 수있는 영역 또는 형광 표지 된 세포 중 하나를 포함하는 다양한 조직과 함께 사용하기 위해 적용될 수있다. 이 microdissectio 중 가장 중요한 것은, 가장 큰 장점N 기법은 절연 세포 사는 다른 한 방법으로 현재 불가능 추가적인 실험, 배양 될 수 있다는 것이다.

도 1a에 도시 된 바와 같이, 소뇌 슬라이스 된 소뇌 EGL는 GFP 발현 GNPs을 지배하고, 분자 층은 CFP 양성 신경 교세포에 의해 농축시키고, P4 MATH1-GFP / CFP 네 스틴 - 마우스로부터 제조 하였다. (; 그림 1A 점선을 따라) EGL의 깊은 부분에있는 네프를 분리하려면 슬라이스 EGL 및 분자 층 사이에 microdissected되었다. 해부 EGLs (그림 1B)는 다음 FACS 다음 효소 분해에 수집되었다. 예상대로, 해부 EGL에서 세포의 대부분 (85 % 이상)은 GFP (그림 2A)에 대해 긍정적이었다 기존 GNPs이었다. 네프 EGL 세포 인구의 약 5 %를 (CFP +) 계정. 대부분의 세포 중 어느 것도 FACS 분석을 기반으로 GFP 및 CFP 더블 양성 없었다. FACS에 의해...

네 스틴 발현 전구 세포는 개발 소뇌의 신경 전구 세포의 새로 확인 된 집단이다. 형광 - 활성화 세포 분류와 조합하여 여기에 제시된 미세 절제 기술을 사용하여,이 세포 집단은 다른 소뇌 영역에서 오염없이 정제 될 수 있고, 추가 연구 동안 배양 될 수있다.

이외에 Microdissection에 의해 개발 소뇌 차별화 된 세포 집단의 분리

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

이 절차의 전반적인 목표는 발달 중인 소뇌에서 특정 세포 집단을 분리하는 것입니다. 이것은 형광 단백질을 운반하는 신생아 마우스에서 소뇌를 먼저 채취하여 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 비브라토를 사용하여 살아있는 조직 절편을 얻는 것입니다.세 번째 단계는 형광 해부 현미경으로 소뇌의 외부 생식층을 미세 해부하는 것입니다. 마지막 단계는 조직을 단일 세포 현탁액으로 해리하고 형광 활성화 세포 분류를 통해 세포를 수집하는 것입니다. 궁극적으로 결과는 특정 세포 집단이 소뇌에서 분리될 수 있음을 보여줄 수 있습니다.레이저 캡처, 미세 해부와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 세포가 살아 있고 배양할 수 있다는 것입니다. 추가 실험을 위해 이 절차를 위해 오토클레이브를 사용하여 수술 도구를 멸균합니다. 섭씨 37도의 수조에서 사용할 수 있도록 3% 저융점 aros를 신선하게 또는 재가열하십시오.파파얀 기반 세포 해리에 필요한 솔루션을 구성합니다. 새로운 NBB 27 배양 배지를 준비합니다. 그런 다음 여과하고 살균하여 인큐베이터에 보관하십시오.팩스 버퍼를 준비하고 poly de lycine 커버 슬립을 준비합니다. 첫 번째 코팅 오토클레이브 커버는 멸균수 1밀리리터당 100마이크로그램의 폴리 드 리신으로 미끄러집니다. 그런 다음 커버 슬립을 섭씨 37도에서 2시간 동안 또는 실온에서 밤새 배양합니다.나중에 커버 슬립을 사용하기 전에 증류수로 커버 슬립을 세척한 다음 NBB 27 매체를 세척하십시오. 완전히 말리십시오. 시작하기까지 최소 한 시간이 걸립니다.먼저 해부 부위를 준비합니다. 70% 에탄올로 깨끗이 닦으십시오. 그런 다음 흡수 패드로 덮으십시오.둘째, 멸균 파우치에서 도구를 제거하고 사용할 수 있도록 배치합니다. 셋째, 접시에 1% 펜 스트립이 있는 얼음처럼 차가운 멸균 DPBS를 넣고 얼음 위에 올려 놓습니다. 형광 마커를 발현하는 P 4 강아지의 뇌를 해부합니다.그런 다음 DPBS의 준비된 접시에 옮깁니다. 집게를 사용하여 소뇌를 뇌의 나머지 부분과 조심스럽게 분리한다. 이 소뇌는 마커 math one, GFP 및 EGL이 GFP를 발현하고 분자층이 CFP에 대해 양성인 CFP에 둥지를 틀고 있습니다.다음으로, 2cm 세제곱 임베딩 몰드에 농업 용액을 채웁니다. 섭씨 37도보다 따뜻하지 않은지 확인하십시오. 구멍이 뚫린 숟가락으로 소뇌를 집어 들고 티슈를 부드럽게 두드려 말립니다.그런 다음 집게를 사용하여 금형에 설정합니다. 바늘을 사용하여 소뇌를 수직 방향으로 만듭니다. 일단 약 4 개가 금형에 적재됩니다.곰팡이가 빨리 굳어지도록 얼음 위에 놓으십시오.면도날을 사용합니다. 구획 시간을 줄이기 위해 블록을 자릅니다. 그런 다음 소뇌가 수직이 되도록 블록을 플레이트 방향에 붙입니다.1% 펜트 스트랩으로 얼음처럼 차가운 DPBS를 충전 트레이에 넣고 트레이 아래에 얼음을 넣어 차갑게 유지합니다. 이제 바이브레이터로 블록을 절단합니다. 600미크론 단면을 절단하고 수집합니다.구멍이 뚫린 숟가락을 사용하여 얼음 트레이에서 꺼내 얼음 위에 A-D-P-B-S로 채워진 접시에 옮깁니다. 형광 해부 현미경 아래. 가능한 한 빨리 조각을 검사합니다.EGL을 소뇌의 나머지 부분과 조심스럽게 분리합니다. 미세한 집게를 사용하여 CFP 양성 분자층과 GFP 양성 EGL 사이를 절개합니다. 인접 영역의 오염을 피하기 위해 현저해부 중에는 매우 보수적으로 하십시오.GFP 양성 EGL 조직을 얼음 위에 담긴 새 DPBS 충전 접시에 옮깁니다. 분자층 조직을 포함하면 Bergman glia를 발현하는 중첩으로 배양물을 오염시킬 수 있으므로 피하십시오. 다음으로, 분리된 EGL 조직을 둘러싼 아그로스를 제거합니다.EGL은 이제 단일 세포 현탁액을 위한 paan 기반 프로토콜을 사용하여 해리할 수 있습니다. 이 작업이 완료되면 resus는 팩스 버퍼의 셀을 일시 중단합니다. 팩스를 사용하여 CFP 셀 수집을 진행합니다.고속 유세포 분석기와 CFP 필터를 사용하여 분류하고 얼음 차가운 팩스 버퍼로 끌어옵니다. 대략 100는, P 4 소뇌 당 000의 NPS 얻어져야 한다. 그런 다음 풀링된 세포를 300Gs에서 5분 동안 원심분리합니다.세포를 즉시 사용하여 배양하십시오. 예열 NBB 27 미디어에 매달아 놓습니다. 그런 다음 폴리 D 라이신 코팅 커버 슬립에 넣습니다.세포 벨라 슬라이스는 CFP 마우스에서 P 4 수학 1 GFP 둥지에서 준비되었습니다. 소뇌 EGL은 주로 GMP를 발현하는 GFP를 함유하고 있으며 신경교세포를 발현하는 CFP가 풍부한 분자층에서 쉽게 분리될 수 있음 사실 분석에 따르면 EGL의 세포 중 85% 이상이 기존 GNP인 것으로 나타났습니다. NEP는 미세해부에 의해 EGL의 깊은 부분에서 분리한 후 사실관계를 확인했습니다.이 세포는 EGL 4일 배양에서 세포의 약 5%를 차지했습니다. 사실은 NPS가 뉴런을 발현하는 베타 튜불린을 발생시켰다. 이것은 계통 제한 신경 전구 세포의 특징입니다.이 절차를 시도하는 동안 신속하게 작업하고 가능한 한 얼음 위에 조직을 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기서 우리는 분리 방법 및 출생 후의 마우스 문화 소뇌 과립 신경 세포의 전구 세포와 소뇌 과립 신경을 제시.

포스트 - 나탈 마우스 소뇌 과립 신경 세포의 전구 세포 뉴런의 분리 및 문화

이 비디오는 마우스 소뇌에서 조직 절편을 생성하는 방법을 설명합니다. 소뇌 절편은 수초화 역학을 포함한 신경 발달 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 유기형 배양에 사용할 수 있습니다.

소뇌 절제 및 절편 준비: 마우스 소뇌에서 조직 절편을 생성하는 방법

이 동영상은 출생 후 쥐 소뇌에서 줄기세포를 분리하여 신경세포로 분화하는 방법을 보여줍니다. 분리된 세포 현탁액의 줄기세포는 항체로 코팅된 마그네틱 비드를 사용하여 정제되고 배양되어 신경구를 형성합니다. 그런 다음 신경구는 신경 세포를 생성하기 위해 분화 매질에서 유지됩니다.

출생 후 마우스 소뇌에서 줄기세포의 분리 및 신경 세포로의 분화

미세 아교 세포 생물학의 성공적인 조사에 하나의 키는 CNS의 조직으로부터 분리하는 동안 생체 미세 아교 immunofunction의 보존이다. 형광 이미징, 면역 세포 화학, 및 염증성 자극 지질 다당류 (LPS)와 팸 3 CSK 4 (팸)와 ELISA 다음 미세 아교 세포의 활성에 의해 평가 매우 순수하고 immunofunctional 세포 배양에 회전 흔들림 결과를 통해 미세 아교 세포를 분리.

쥐과 신생아에서 보존 면역 표현형과 기능으로 두피 소교 세포의 분리

소뇌 외부 과립 층은 개발 뇌에서 가장 큰 교통 증폭의 사이트입니다. 여기, 우리는 배아의 날 (14) 병아리 배아에서 생체 전기와 소뇌 조각의 문화를 사용하여 확산의 절정에이 계층에 유전자 변형을 대상으로하는 프로토콜을 제시한다.

예 생체 병아리 소뇌 조각의 문화가 공간적으로 Electroporation에 과립 세포 전구체의 표적

여기 우리 organotypic 슬라이스 문화 마우스 소 뇌 및 myelination와 중앙 신 경계에 remyelination의 메커니즘을 조사 적합 immunohistochemistry에 의해 얼룩 myelin 칼 집에서 준비 하는 방법을 제시.

준비 및 Immunostaining Myelinating Organotypic 소 뇌 조각 문화

생체 외에서 가능한 한 적절 하 게 생체 외 조건에서 반영 하는 실험을 실시 하는 것은 쉬운 일이 아니다. 1 차적인 세포 배양물의 사용은 전체 유기체에 있는 세포 생물학을 이해하는 쪽으로 중요한 단계입니다. 제공된 프로토콜은 배아 마우스 소뇌 뉴런을 성공적으로 성장시키고 배양하는 방법을 간략하게 설명한다.

배아 마우스 소뇌에서 분리 된 뉴런의 기본 문화

우리는 성인 마우스 뇌 반구의 다른 해부 된 영역에서 microglia의 격리를위한 프로토콜을 제공하고, 전체 길이 전사체의 깊은 단일 세포 RNA 시퀀싱을위한 반자동 라이브러리 준비를 제공합니다. 이 방법은 건강과 질병에서 microglia의 기능적 이질성을 해명하는 데 도움이됩니다.

깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리

여기에서는 마우스 CNS로부터 다중 신경교 세포 집단의 시험관 내 분리를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 국소 미세아교세포, 희소돌기아교세포 전구체 세포 및 성상세포를 분리하여 다양한 배양 시스템에서 각각의 표현형을 연구할 수 있습니다.

여러 중추 신경계 영역에서 쥐 아교 세포의 해부 및 분리

다른 소뇌 영역은 뚜렷한 행동 출력에 있는 역할을 하기 위하여 연루되었습니다, 그러나 근본적인 분자 기계장치는 알려지지 않은 남아 있습니다. 이 작품은 RNA를 분리하고 유전자 발현의 차이를 테스트하여 분자 차이를 조사하기 위해 반구, 전방 및 후방 영역 및 깊은 소뇌 핵의 소뇌 피질을 재현하고 신속하게 해부하는 방법을 설명합니다.

분자 분석을 위한 소뇌 지역 해부

여기서, 우리는 비용 효율적이고 효율적이며 실행 가능한 1 차성 과립 세포 전구체 (GCP)의 유전 조작을 위한 시험관 내 전기화 프로토콜을 제시합니다. 더욱이, 이 프로토콜은 또한 1 차적인 GCP 세포에 있는 1 차적인 고슴도치 신호 통로의 분자 연구를 위한 간단한 방법을 보여줍니다.

과립 세포 전구체에서 1 차적인 실륨 의존적 신호 경로를 연구하는 효율적이고 비용 효율적인 전기 포기법

배우세요 형광 마커를 가진 신생아 마우스의 발달 중인 소뇌에서 네스틴 발현 전구세포를 분리하는 방법을. 미세해부와 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 살아있는 세포를 순수하게 분리하고 배양할 수 있습니다.

이외에 Microdissection에 의해 개발 소뇌 차별화 된 세포 집단의 분리

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