Name: 대안으로 설하 면역 요법은 급성 호흡기 감염에 대한 보호를 유도하기 위해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 56 s
Description: 배우세요 설하 면역 요법을 통해 생쥐에서 폐렴구균 폐렴에 대한 선천성 면역 반응을 유도하는 방법을 학습하세요. 이 비침습적 기술은 호흡기 감염 예방을 위한 안전한 대안을 제공합니다.

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정제된 편모를 친절하게 제공해 주신 릴 감염 및 면역 센터(Center for Infection and Immunity of Lille, Institute Pasteur de Lille-France)의 장-클로드 시라드(Jean-Claude Sirard) 박사님께, 폐렴구균 균주를 친절하게 제공해 주신 우루과이 보건부 국립기준연구소(National Reference Laboratory) 소장인 테레사 카무(Teresa Camou) 박사님께 감사드립니다. 
저자는 전체 비디오 제작 및 에디션 기간 동안 헌신과 노고에 대해 BichoFeo Producciones-Uruguay의 Diego Acosta와 Ignacio Turel에게 감사를 표 하고 싶습니다.
이 작업은 우루과이의 ANII, 우루과이의 PEDECIBA의 기초 과학 개발 프로그램, 우루과이의 CSIC-Universidad de la República의 과학 연구 부문별 위원회의 PR_FCE_2009_1_2783 및 BE_POS_2010_1_2544 보조금의 지원을 받았습니다.

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치료제의 설하 투여는 호흡 기관의 면역 반응을 조절하는 유용한 수단으로 입증되었습니다. 호흡 상태의 치료를위한 SLIT의 주요 장점은 비강 내 투여 (31)에 기초하여 치료보다 안전한 것으로, 폐 또는 콧 구멍으로 화합물의 직접 전달을 포함하지 않는다는 것이다. 설하 면역 요법이 어느 알러지 염증 및 천식 (32)의 증상을 개선하거나, 여기에 도시 된 바와 같이, 급성 폐 감염을 치료하기 위해 선천성 면역 메카니즘의 일시적 활성화를 유도하는 규제 반응의 유도를 위해, 다른 방법으로 면역 반응을 조절하는데 사용될 수있다. 이 비디오에 제시된 마우스 모델은 SLIT 치료제와 같은 다른 화합물의 스크리닝을위한 편리한 방법입니다. 이러한 동물 모델은 영향을 결정하는 유용한 수단을 구비폐 &#39;면역 반응뿐만 아니라 다른 장기 (예., 림프절 또는 원위 점막 사이트 배수) 시험 관내 모델을 사용하여 모방 할 수있는 슬릿. 설하 면역 요법을 사용하여 얻은 결과를 설명하는 여러 논문이 있지만, 설하 투여 절차에 대한 자세한 방법은 아직 제공되지 않았습니다. 또한, 모델은 호흡기 조직에서뿐만 아니라 지역 보호를 부여하는 것을 목표 설하 백신의 평가를 위해 사용될 수있다. 첨부 된 영상에 도시 된 바와 같이, 화합물의 투여는 설하 쉽게 광범위한 훈련의 필요없이 수행 될 수있는 간단한 과정이다. 일반적으로 동물 처리에 능숙 사람은이 프로토콜의 설명에 따라 주 사용 마취제를 사용하여 10 쥐의 그룹에 슬릿을 수행하는 데 1 시간이 필요합니다. 폐렴 구균은 도전뿐만 수행되면, 추가로 90 분을 준비해야한다박테리아 서스펜션과 동물의 비강 도전을 수행합니다. 여기에 제시된 FACS 프로토콜은 폐 &#39;세포 역학 림프절뿐만 아니라 효과를 배출, 관리의 로컬 사이트에서 SLIT의 영향을 편리하게 특성화 할 수 있습니다. 기관지 내용과 폐 실질의 별도의 분석은기도 면역 거주자 및 조직 내에서 남아있는 것과 종류의 세포 침투를 구별하는 것이 중요합니다. BAL 내용의 분석은 폐포 대 식세포 매출의 연구뿐만 아니라 다른 치료에 의해 ​​유도 된 폐포 공간, 예를 들면., 백혈구, 호산구, 단핵구 세포에 모집의 역학을 할 수 있습니다. BAL은 효소 면역 분석법 (ELISA) 또는 설하 백신 후 유도 분비되는 IgA 항체의 검출에 의해 분비되는 사이토 카인 및 케모카인의 존재를 평가하는데 사용될 수있다. 폐 &#39;조직의 연구다른 세포 유형, 고전 수상 세포, T 세포 및 B 세포의 특성화를 허용 할 것이다. FACS 분석을위한 BAL 샘플 및 림프절의 준비는 간단합니다. 시료 채취 후, 일반적으로 60 분 ~ 20 샘플 염색 프로토콜을 완료하는 데 필요합니다. 세포 외 기질의 분해가 요구되기 때문에 반대로, 설하 또는 폐 조직으로부터 세포의 분리는 더 많은 시간을 필요로 할 것이다. 설하 경로에 의해 전달되는 치료제의 흡수는 생체 내 이미징 시스템에서 사용하는 형광 또는 방사성 표지 된 분자의 추적에 의해 해결 될 수있다. 설하 면역 효과적으로 면역 호흡기 반응뿐만 아니라 치료 또는 호흡 상태를 방지하기 위해 사용될 수있다 전신적을 유도하는 매력적인 방법이다. SLIT 나는 후 호흡기에서 면역 반응의 활성화를 허용 대 결정 메카니즘의 해명다른 조건으로부터 호흡 가능한 치료법으로 단독으로 또는 조합하여 사용될 수있는 새로운 치료 전략의 합리적인 설계를 허용하는 결정적이야.

이 연구의 전반적인 목표는 급성 호흡기 감염(ARI) 치료를 위한 설하 면역요법의 이점을 설명하고 다른 투여 경로, 즉 비강 내 투여 경로와 비교하여 이 전달 경로의 장점을 제시하는 것입니다.
ARI는 특히 5세 미만의 어린이에게 매년 수백만 명의 사망을 초래합니다. 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)은 영유아 및 노인에서 세균성 폐렴의 주요 병인항제 중 하나로 남아 있다1,2. 현재 사용 가능한 주요 치료법은 항생제 사용에 의존하지만 내성 균주가 지속적으로 발생하고 있습니다3,4.
SLIT는 전신 및 점막 수준, 특히 호흡기에서 광범위한 반응을 유도합니다5. 인플루엔자 감염에 대한 효과가 입증되어 체액성 및 세포 반응 생성으로 장기적인 보호를 촉진합니다6,7. 또한, 설하 경로를 통해 전달되는 세균 용해물을 이용한 예방적 치료는 노인의 만성 폐쇄성 기관지염의 악화를 감소시키고8 소아의 재발성 호흡기 감염을 예방하는 것으로 나타났다9. SLIT는 알레르기 및 천식 치료에 널리 사용되었습니다. 임상 연구에서는 호흡기의 면역 반응을 조절하는 효능뿐만 아니라 안전성도 입증되었다10. SLIT에 대한 제약 회사와 연구자들의 관심이 높아지고 있음에도 불구하고, 화합물의 설하 전달 후 점막 면역 반응 유도와 관련된 메커니즘은 여전히 모호합니다. 최근에는 알레르기 항원 탈감작과 관련된 내성을 촉진하는 메커니즘에 관심이 집중되고 있습니다. 수지상 세포 및 대식 세포와 같은 설하 점막에 상주하는 세포와 모집된 세포가 SLIT11-13 이후에 내성을 촉진할 수 있다고 제안되었습니다. 구강 점막의 수지상 세포는 IFN-감마 및 IL-10을 촉진하여 T 보조 세포(11)를 생성할 수 있을 뿐만 아니라 원위 생식기 점막으로 재순환하여 CD8+ T 세포(14)를 촉진할 수 있습니다. 그러나 SLIT가 선천성 세포에 미치는 영향이나 급성 호흡기 감염 시 병원체 제거를 개선하는 능력에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.
폐 내 폐렴구균 감염의 자연적 통제는 국소 선천성 방어의 효율적이고 신속한 활성화에 크게 좌우됩니다. 우리는 이전에 TLR5 및 NLRC4 작용제인 편모(FliC)를 비강 내 1회 투여하여 폐의 선천성 면역을 강화하면 폐렴구균 혈청형 1의 임상 분리물을 치사량으로 투여한 쥐의 75-100%를 보호할 수 있음을 보여주었습니다. 이러한 보호는 GR1+ 세포(다형성핵 호중구, PMN으로 추정)의 국소 동원에 의존하며 항체, B 세포 또는 T 세포에 의존하지 않는 것으로 나타났습니다15. 
편모는 박테리아 편모의 구조적 구성 요소입니다. 단량체 형태에서는 두 개의 병원체 인식 수용체(PRR), 즉 세포외 FliC16을 감지하는 TLR5와 세포 내 편모를 감지하는 NLRC4/NAIP5 인플라마솜17,18에 의해 인식됩니다. PRR에 의해 FliC가 감지되면 중요한 염증 반응이 유발됩니다. 우리와 다른 사람들은 Salmonella enterica serovar Typhimurium에서 정제된 FliC를 폐에 주입하면 폐의 상피에 의해 인식될 때 특히 chemokine 및 cytokine의 신속한 생산을 유도하여 주로 PMN15,19-21과 같은 기도로 면역 세포의 동원을 조율한다는 것을 입증했습니다. 일시적이기는 하지만, FliC의 비강 전달 후 기도로 발생하는 상당한 호중구 침투는 인간을 위한 임상 요법으로 옮겨갈 경우 우려가 될 수 있습니다. 과도한 염증은 폐 기능에 해로울 수 있습니다. 더욱이, 면역자극 분자의 비강 내 전달은 안면 마비 및/또는 뇌 독성을 유발할 수 있는 것으로 나타났습니다22-24. 
설하 면역요법은 비강 내 면역요법에 비해 호흡기의 면역 반응을 조절하는 더 안전한 대안을 제공합니다. 비침습적이고, 통증이 없고, 단순하며, 환자 순응도가 우수하다25. 또한, 앞서 언급했듯이 제형의 직접적인 비강 내 또는 폐 내 전달과 관련된 위험 없이 호흡기 점막에서 보호 반응을 유도할 수 있습니다. 설하 경로는 폐의 면역 체계에 큰 영향을 미치지만 독성이 입증되었거나 비강 내 투여 시 큰 염증을 유발하는 것으로 입증된 분자를 전달하는 데 대안적으로 사용될 수 있습니다. 이러한 장점 외에도 설하 면역요법을 위한 제형은 비멸균 제품이 이 경로로 전달될 수 있고 내독성 쇼크가 SLIT에 대한 우려가 없기 때문에 제조 비용이 저렴합니다. 다른 한편으로는, 비강 내 또는 비경구 경로에서 사용되는 것과 비교하여 더 높은 용량의 면역 자극 화합물이 폐에서 면역 반응을 유도하는 데 필요하다는 점에 주목할 가치가 있습니다. 또한 SLIT의 마우스 모델을 사용할 때 제형이 침착되는 해부학적 부위가 작기 때문에 고농축 용액이 필요합니다. 
이전에 발표된 데이터를 바탕으로 편모를 모델 면역자극제로 사용하는 설하 면역요법을 사용하여 보호 모델을 개발했습니다. 우리는 편모를 1회 투여하면 혈청형 1 균주에 의한 침습성 폐렴구균성 폐렴에 대해 60%의 생존율을 유도했으며, 대조군의 모든 마우스는 5일 이내에 감염으로 사망했음을 입증했습니다. 유세포 분석 분석은 편모를 사용한 설하 치료 후 보호 동물의 기도로 더 많은 수의 PMN이 동원되는 것을 보여주었으며, 이는 이러한 세포가 설하 면역 요법에 의해 유도되는 보호 메커니즘에 관여할 수 있음을 시사합니다. 
이 비디오는 설하 면역 요법을 수행하는 방법과 설하 점막에서 관련 조직을 회수하여 림프절과 폐 및 기도를 배출하여 추가 분석을 수행하는 방법을 자세히 보여줍니다. 또한 FACS 분석을 위한 세포 준비의 일반적인 기술을 설명하고 연쇄상구균 폐렴균 현탁액을 준비하는 방법과 마우스에서 비강 내 감염을 수행하여 급성 감염 모델을 설정하는 방법을 간략하게 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>케타민 용액 (50 mg / ml)</td> <td>제약 서비스, 우루과이</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실라신 용액 (2 %)</td> <td>Portinco SA, 우루과이</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 1 ml 주사기</td><td>현대, 우루과이</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 27G 바늘</td><td>현대, 우루과이</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>General Electric Health Care</td><td>E15885</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>ATCC</td><td>302020</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 용액</td><td>SIGMA</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+/Mg2+</td><td>PAA</td><td>H21002</td><td></td></tr><tr><td>Type-I Collagenase</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I(DNAse-I)</td><td>SIGMA</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>Dispase 없음</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 활용 쥐 안티 마우스 IgG2b 안티 CD11b</td><td>BD</td><td>550993</td><td>클론 M1/70</td></tr><tr><td>APC 활용 햄스터 안티 마우스 IgG1 안티 CD11c</td><td>BD</td><td>550261</td><td>클론 HL3&nbsp;</td></tr><tr><td>APC-Cy7 활용 쥐 안티 마우스 IgG2a 안티 Ly6G</td><td>BD</td><td>560600</td><td>클론 1A8</td></tr><tr><td>멸균 식염수</td><td>Laboratorio Farmaco 우루과이요, 우루과이</td><td></td><td></td></tr><tr><td>트립틱 콩 한천</td><td>BD Difco, 프랑스</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>제분된 양 혈액</td><td>Biokey, 우루과이</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 페트리 접시</td><td>Greiner</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>p10 Gilson</td><td></td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>p20 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3120000097</td><td></td></tr><tr><td>p200 피펫</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>p200 피펫</td><td>Capp</td><td>C200</td><td></td></tr><tr><td>p200</td><td>Eppendorf</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>p1000 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3120000062</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Filter Tips p10</td><td>Greiner</td><td>771288</td><td></td></tr><tr><td>멸균 필터 팁 p200</td><td>Greiner</td><td>739288</td><td></td></tr><tr><td>멸균 필터 팁 p1000</td><td>Greiner</td><td>750288</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>BIOSAN</td><td>V1-plus</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 파인 팁 펜치&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>Z168785/Z168777</td><td>곡선형</td></tr><tr><td>및 직선 드레싱 조직 집게 집게</td><td>SIGMA</td><td>F4392</td><td>길이 8인치</td></tr><tr><td>마이크로 해부 집게</td><td>SIGMA</td><td>F4017</td><td>Straight&nbsp;</td></tr><tr><td>마이크로 해부 펜치</td><td>SIGMA</td><td>F4142&nbsp;</td><td>곡선</td></tr><tr><td>메이요 가위</td><td>SIGMA</td><td>Z265993&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>SAKIRA MEDICAL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 생검 펀치 &Oslash; 3mm</td><td>Stiefel Laboratories Ltd.</td><td>직경 5mm의 2079D</td><td>도 사용 가능</td></tr><tr><td>멸균 1.5ml 튜브</td><td>Deltalab</td><td>200400P</td><td></td></tr><tr><td>멸균 15ml 튜브</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>멸균 50ml 튜브</td><td>Greiner</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>멸균 혈청학 피펫 5ml</td><td>Greiner</td><td>606160</td><td></td></tr><tr><td>멸균 혈청학 피펫 10ml</td><td>Greiner</td><td>607160</td><td></td></tr><tr><td>멸균 혈청학 피펫 25 ml</td><td>Greiner</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>생물학 안전 캐비닛, 클래스 II</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 시리즈, 타입 A2</td><td></td></tr><tr><td>마이크로-아이솔레이터&nbsp; 랙</td><td>RAIR&nbsp; 아이소시스템&nbsp;</td><td>76144W</td><td>슈퍼&nbsp; 마우스&nbsp; 1800 알러존&nbsp;</td></tr><tr><td>냉장 마이크로 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>Legend Micro 21R</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>Heraeus</td><td>Biofuge-pico</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorval ST40R</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>모델&nbsp; 3111</td><td></td></tr><tr><td>멸균 박막 파스퇴르 피펫</td><td>Deltalab</td><td>D210022</td><td></td></tr><tr><td>멸균 파스퇴르 피</td>펫 <td>Deltalab</td><td>200007</td><td></td></tr><tr><td>멸균 24웰 플레이트</td><td>Greiner</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>자동 세포 계수기 - Countess</td><td>Life Technologies</td><td>C10227&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Countess 세포 계수 챔버 슬라이드</td><td>Life Technologies</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석 튜브</td><td>BD</td><td>343675</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기 - FACS Canto-II</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실시간 PCR 기기 - 로터 유전자 Q 또는 ABI 7900</td><td>Qiagen / Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizol 시약</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>분자 생물학 학년</td></tr><tr><td>DNAse-I</td><td>Life Technologies</td><td>18068-015</td><td>분자 생물학 학년</td></tr><tr><td>DNAse-I 버퍼 10X</td><td>생명 과학</td><td>18068015</td><td>분자 생물학 학년</td></tr><tr><td>EDTA 25 mM</td><td>생명 과학</td><td>18068015</td><td>분자 생물학 학년</td></tr><tr><td>초순수</td><td>생명 기술</td><td>10977</td><td>분자 생물학 학년</td></tr><tr><td>RNAse Out</td><td>생명 과학</td><td>100000840</td><td>분자 생물학 학년</td></tr><tr><td>무작위 헥사머 프라이머</td><td>생명 과학</td><td>N8080127</td><td>분자 생물학 학년</td></tr><tr><td>M-MLV-RT 버퍼</td><td>생명 과학</td><td>18057-018</td><td>분자 생물학 학년</td></tr><tr><td>M-MLV-RT enzime</td><td>생명 과학</td><td>28025-021</td><td>분자 생물학 학년</td></tr><tr><td>QuantiTect Syber Green PCR 키트</td><td>Qiagen</td><td>204143</td><td>분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>특정 프라이머&nbsp;</td><td>생명 기술</td><td></td><td>분자 생물학 학년</td></tr></tbody></table>

대안으로 설하 면역 요법은 급성 호흡기 감염에 대한 보호를 유도하기 위해

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

설하 경로는 작은 분자를 혈류로 전달하고 다른 부위에서 면역 반응을 조절하는 데 널리 사용되었습니다. 그것은 전신 및 점막 부위, 즉 폐와 비뇨 생식기에서 체액성 및 세포 반응을 효과적으로 유도하는 것으로 나타났습니다. 설하 백신 접종은 하부 및 상부 호흡기에서 감염에 대한 보호를 촉진할 수 있습니다. 또한 알레르기 항원에 대한 내성을 촉진하고 천식 증상을 개선할 수 있습니다. 설하 면역요법(SLIT)에 의한 폐의 면역 반응 조절은 잠재적으로 유해한 분자를 기도로 직접 전달할 필요가 없기 때문에 비강 내 경로를 통한 제형의 직접 투여보다 안전합니다. 비강 내 분만과 대조적으로, 뇌 독성 또는 안면 마비와 같은 부작용은 SLIT에 의해 촉진되지 않습니다. SLIT의 기저에 있는 면역 메커니즘은 여전히 파악하기 어려우며 급성 폐 감염 치료를 위한 용도는 아직 연구되지 않았습니다. 따라서 SLIT의 잠재적 이점을 더 탐구하기 위해 적절한 SLIT의 동물 모델 개발이 필요합니다. 
이 연구는 급성 폐렴구균성 폐렴으로부터 보호할 수 있는 능력을 평가하기 위해 마우스에서 치료제의 설하 투여를 수행하는 방법을 보여줍니다. 설하 접종 중 마우스 취급의 기술적 측면, 설하 점막의 정확한 식별, 림프절 배출 및 조직, 기관지 폐포 세척 및 폐의 격리가 설명되어 있습니다. FACS 분석을 위한 단일 세포 현탁액 준비를 위한 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다. 면역 반응 분석을 위한 다른 다운스트림 응용 분야에 대해 논의합니다. 연쇄상 구균 폐렴 접종 준비 및 마우스의 비강 내 챌린지의 기술적 측면도 설명됩니다.
SLIT는 폐의 면역 반응을 조절하기 위해 후보 분자를 스크리닝할 수 있는 간단한 기술입니다. SLIT의 성공에 영향을 미치는 매개변수는 분자 크기, 분해에 대한 민감성 및 고농축 제형의 안정성과 관련이 있습니다.

설하 면역 성공적 폐 '면역 반응을 조절하는데 사용될 수있다. 우리는 편모, TLR5 및 NLRC4 작용제의 단일 투여 량은, 케모카인의 CXCL1, CCL20 및 염수 처리 된 대조군과 비교 사이토 카인 IL-6 mRNA의 코딩의 중요한 상향 조절을 유도 할 수 있음을 보여 주었다. mRNA 수준의 유도 SLIT 후 8 시간에서 정점을 접고 20 시간 (그림 1) 이후 기저 수준으로 돌아갑니다. 슬릿 S. 폐렴으로 2 시간 전에 비강 내 감염을 수행 할 때 그러나, Cxcl1 및 IL6의 mRNA 수준은 상당히 비 처리 된 동물 (그림 2)에 비해 SLIT 후에도 24 시간을 상향 조절 남아 있었다. FACS에 의해 BAL의 세포 집단과 폐 조직의 분석은 설하 경로로 플릭으로 처리 동물이 폐 '조직 (그림 3)에서기도에 호중구의 수를 증가하지만 한 것으로 나타났습니다. 그림 4에 나타낸 바와 같이, 편모와 SLIT 보호를 추진 급성 폐렴 구균 폐렴에 생존을 증가했다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6.7in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig1highresV2.jpg" width="680"> 편모와 설하 면역 요법 후 그림 폐 '전사 프로파일의 1 속도론. 8 ~ 10 주령 BALB / c 마우스는 (N = 4) 마취 설하 경로로 편모 또는 식염수를 10 μg 처리 하였다. 폐는 상이한 시점에서 수집하고, 핵산 방부제에 넣었다. 전체 RNA 추출을 수행하고, cDNA를 합성 하였다. mRNA 수준은 Tabl에 나열된 특정 프라이머를 사용하여 실시간 PCR에 의해 평가 하였다예 1 상대 정량화 정상화 ACTB mRNA 수준을 사용 ΔCT 방법에 따라 수행 하였다. 결과는 SEM ± 중간으로 생리 식염수 투여군에 비해 배 증가로 표시됩니다. 별표는 맨 - 휘트니 테스트에 따라 계산 통계적으로 유의 한 차이 (p &lt;0.05)를 나타냅니다. 이 결과는 독립적 인 실험의 대표이다. <img alt="그림이" fo:content-width="6.2in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig2highresV2.jpg" width="660"> 와 편모. 8 ~ 10 주령 BALB / c 마우스 (N = 4 대조군이고, n = 7 치료 그룹) 설하 면역 요법 후 폐렴 구균 성 폐렴 중 그림 2 폐 '전사 프로파일에 의해 편모 또는 식염수를 10 μg 처리 하였다 마취 설하 경로. 2 시간 후 마우스는 10의 원인이되는 최소 치사량 (MLD)와 비강 내 경로로 감염시켰다S.의 임상 분리의 0 % 사망률 4 × 5 CFU / 50 μL에 해당하는 폐렴 구균 혈청 형 1 E1585. 폐는 공격 후 24 시간을 수집하고, RNA 추출 및 cDNA의 합성을 행 하였다까지 핵산 방부제에 저장 하였다. 실시간 PCR을 행했다 (표 1의 프라이머 목록 참조)과 상대적 정량화를위한 ​​표준화 ACTB mRNA 수준을 사용 ΔCT 방법에 따라 수행 하였다. 결과는 SEM ± 중간으로 생리 식염수 투여군에 비해 배 증가로 표시됩니다. 별표는 맨 - 휘트니 테스트에 따라 계산 통계적으로 유의 한 차이 (p &lt;0.05)를 나타냅니다. <img alt="그림 3" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig3highresV2.jpg" width="680"> 다형 핵 호중구의 그림 3과 분석 (PMN) SLIT 후 폐 '조직과기도의 모집. 여덟에10 주 BALB / c 마우스는 (N = 4) 마취하에 설하 경로에 의해 편모 또는 식염수를 10 μg으로 처리 하였다. 2 시간 후 마우스를 S.의 MLD와 비강 내 경로로 감염시켰다 폐렴 구균 혈청 형 1 E1585. 공격 후 24 시간은, BAL을 수행하고 폐 FACS 분석을 위해 처리 하였다. PMN은 Ly6G 고 / CD11b를 고 /의 CD11c 음성 세포로 확인하고 FCS-SSC 프로필을 기반으로 하였다. 결과는 BAL 또는 폐에 총 세포 수의 대한 PMN의 백분율로 표시됩니다. 바 SEM ± 평균을 나타냅니다. 별표는 편도 만 - 휘트니 (Mann-Whitney) 테스트에 따라 계산 통계적으로 유의 한 차이 (p &lt;0.05)를 나타냅니다. <img alt="그림 4" fo:content-width="5.3in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig4highresV2.jpg" width="530"> 편모 그림 4 SLIT 급성 폐렴 구균 폐렴에 대한 쥐를 보호합니다. S.의 MLD와 비강 내 경로로 감염시켰다 폐렴 구균 혈청 형 1 E1585. 생존은 매일 평가 하였다. 카플란 - 마이어 곡선은 로그인 랭크 (벽난로 - 콕스) 검사에 따라 비교 하​​였다. 별표는 통계적으로 유의 한 차이 (p &lt;0.05) .Results는이 독립적 인 실험의 대표 나타냅니다. <table align="center" border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody align="center"><tr><td> 이름 </td><td> 서열 5'-3 ' </td><td> PCR 제품 길이 (BP) </td></tr><tr><td> MB-actin_F </td><td> GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT </td><td rowspan="2"> 68 </td></tr><tr><td> MB-actin_R </td><td> CGTCATCCATGGCGAACTG </td></tr><tr><td>mCCL20_F </td><td> TTTTGGGATGGAATTGGACAC </td><td rowspan="2"> 69 </td></tr><tr><td> mCCL20_R </td><td> TGCAGGTGAAGCCTTCAACC </td></tr><tr><td> mCXCL1_F </td><td> CTTGGTTCAGAAAATTGTCCAAAA </td><td rowspan="2"> 84 </td></tr><tr><td> mCXCL1_R </td><td> ACGGTGCCATCAGAGCAGTCT </td></tr><tr><td> MIL-6_F </td><td> GTTCTCTGGGAAATCGTGGAAA </td><td rowspan="2"> 78 </td></tr><tr><td> MIL-6_R </td><td> AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA </td></tr><tr><td> mTNFalpha_F </td><td> CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA </td><td rowspan="2"> 63 </td></tr><tr><td> mTNFalpha_R </td><td> CCTCCACTTGGTGGTTTGCT </td></tr><tr><td> mCxcl2_F </td><td> CCCTCAACGGAAGAACCAAA </td><td rowspan="2"> 72 </td></tr><tr><td> mCxcl2_R </td><td> CACATCAGGTACGATCCAGGC </td></tr></tbody></table> 실시간 PCR 분석을 위해 사용되는 표 1 프라이머리스트. qPCR의 분석에 사용되는 특정 프라이머 서열. 앞으로 및 마우스 ACTB에 대한 역방향 프라이머, Cccl20, Cxcl1, IL6, Tnfa 및 Cxcl1는 5'-3 '서열로 표시하고 제품의 기대 길이는 기본 쌍 (BP)에 표시됩니다.

본 연구는 폐의 선천성 면역 반응을 촉진하고 마우스의 급성 폐렴구균성 폐렴을 예방하기 위해 설하 면역요법을 사용하는 것의 편리함을 보여줍니다.

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

이 절차의 전반적인 목표는 설하 면역 요법을 사용하여 폐의 선천성 면역 반응을 높이고 치명적인 폐렴구균성 폐렴에 대한 편안한 보호를 제공하는 것입니다. 마우스의 경우, 첫 번째 단계는 면역자극제 플래그가 있는 용액을 마취된 마우스의 설하 점막에 투여하는 것으로 구성됩니다. 그런 다음 폐렴의 genic 균주의 치사량을 포함하는 현탁액을 비강 내 뿌리에 의해 이전에 대조군으로 편평선 또는 식염수로 처리한 마취된 마우스에 주입합니다.Broncho bilar lage는 기도에 침투하는 하위 집단을 분석하기 위해 수행되고 폐 조직을 처리하여 세포 집단의 표현형 특성화를 위한 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 다파라메트릭 유세포 분석, 하악 조직 분석을 통해 부속 하악 림프절과 설하 조직도 처리하여 유세포 분석 또는 기타 다운스트림 분석을 수행할 수 있습니다. 기도에 침투하는 세포 집단.폐 또는 설하 점막은 면역 표현형 분석 및 다파라메트릭 유세포 분석으로 식별할 수 있습니다.설하 면역요법 후 다른 조직의 면역 활성화도 realtime PCR에 의한 전사 프로파일을 연구하여 분석할 수 있습니다. 생명 공학부의 백신 연구 실험실에 오신 것을 환영합니다, 우리는 의과 대학, U.University of U.One을 할당하고 있습니다.우리 실험실의 주요 관심사는 호흡기 감염에 대한 면역 개입의 새로운 전략을 생성하는 것입니다. 비강 내로(internasal route)는 폐 감염을 치료하거나 예방하기 위한 면역 자극제의 전달에 성공적으로 사용되어 왔으며, 이는 다른 신학을 의미하는 바입니다.우리는 박테리아 젤의 구성 요소인 비강 내 전달 lin이 STO 마우스로 인한 지속적인 폐 감염을 차단하는 데 효과적으로 사용될 수 있음을 보여주었습니다. 비강내근은 일반적으로 적은 용량의 치료제를 필요로 하고 호흡기에 강한 반응을 유도하지만, 구강 신경을 통한 면역 자극 화합물의 흡수와 관련된 중추 신경계 독성 및 근막 마비와 같은 몇 가지 단점이 있습니다. 따라서 우리는 폐렴구균성 폐렴에 대한 보호 면역을 유도하기 위한 대안으로 UAL 면역요법 모델을 설정했습니다.설하 면역요법은 비강 내 삽입에 비해 더 안전한 대안을 제공합니다. 비침습적이고 통증이 없으며 간단합니다. 더 많은 용량의 치료제가 필요할 수 있지만, 궁극적으로 NA 또는 의약품을 전달하여 궁극적으로 면역 반응을 조절하는 데 사용할 수 있습니다.이제 아첨을 치료제로 사용하여 마우스에서 설하 투여를 수행하는 방법을 보여 드리겠습니다. 아첨을 곁들인 Subin 면역 요법은 폐로 선천성 면역 반응을 유발하여 폐렴 연쇄상 구균으로 인한 치명적인 비강 내 손상으로부터 생쥐를 보호할 수 있습니다. 또한 유동 기하학과 실시간 PCR을 사용하여 감염 중 및 설하 면역요법 후 길이, 선천적 반응의 특성화를 다룰 것입니다.마지막으로, 추가 분석을 위해 국소 입자 림프절과 설하 조직을 수집하는 방법을 보여드리겠습니다. 시험할 각성제의 용액을 준비한 후, 최대 10마이크로리터의 부피로 면역자극제를 함유한 용액을 복강주사 Pet으로 케타민 OSI 용액 200마이크로리터를 투여하여 동물을 마취한다. 그런 다음 왼손으로 마우스를 잡고 다른 손으로 엄지와 검지를 사용하여 마우스를 잡습니다.닫힌 집게를 혀 아래에 부드럽게 놓고 제자리에 고정합니다. 중지와 약지를 사용하여 피펫을 잡고 용액을 입 바닥과 혀의 등쪽에 투여합니다. 겸자를 제거하고 입을 3-5분 동안 그대로 두었다가 케이지에 다시 넣으십시오.이 기술의 주요 특징은 동물을 치료하는 데 사용되는 총 부피와 마취입니다. 구강 마우스의 작은 크기는 설하 비율에 적용할 수 있는 최대 부피를 10마이크로리터로 제한합니다. 복용량을 결정하면 샘플의 농도를 최대 부피로 조정해야 합니다.부피가 크면 용액을 원치 않게 삼키거나 흡인할 수 있습니다. 마취는 삼키는 것을 피하고 상피를 통해 물질이 침투할 수 있도록 하는 데 중요합니다. 쥐가 너무 빨리 깨어날 수 있으므로 마취를 위해 흡입을 사용하지 않는 것이 좋습니다.일부 주사 가능한 마취제는 생쥐의 타액 분비를 유도할 수 있습니다. 이 경우 용액에 치료제를 바르기 전에 작은 핏이나 종이를 사용하여 과도한 타액 분비를 제거하고 효과를 극대화하기 위해 치료제의 용량을 조정해야 하며 여러 용량을 테스트하는 것이 좋습니다. 이전에 비강 내 뿌리로 화합물을 사용한 경우 5-10배 더 높은 복용량이 테스트하는 좋은 출발점이 될 것입니다.설하근으로 치료제를 테스트하십시오. 상피를 통한 흡수는 분자 해동의 크기에 의해 제한되며, 알려진 박테리아 CFU 번호 원심 분리기의 이전에 준비된 연쇄상 구균 폐렴의 작업 재고의 분취액을 2, 500 Gs에서 5 분 동안 원심 분리기하고 supernat Suspend 1 밀리리터의 스터 식염수 및 원심 분리기를 폐기합니다. 다시 상층액을 버리고 휴식을 취하십시오.50 마이크로 리터에서 5 CFU에 4 곱 10의 현탁액을 얻기 위해 펠릿을 멸균 식염수의 적절한 부피로 현탁액을 현탁액을 취하고, 이는 전구 C.Mice에서 100 % 사망을 유발하는 데 사용 된 미립자 혈청형의 최소 박테리아 용량에 해당하며, 이는 박테리아 현탁액의 50 마이크로 리터를 복용하고 이전에 마취 된 마우스의 콧 구멍에 총 부피를 조심스럽게 주입합니다. 마우스를 2분 동안 똑바로 잡고 2분 더 등 쪽 위치에 둡니다. 챌린지 후, 현탁액을 연속 10배 희석하고 혈액에 도금하여 박테리아 현탁액의 CFU 수치를 확인했습니다.한천 플레이트 : 5 % CO2 점액으로 37도에서 밤새 배양하십시오. ethno의 군집은 알파 용혈 박테리아의 특징인 녹색 alo로 구별할 수 있습니다. 식민지 형성 단위를 세고 챌린지 용량 사용을 등록합니다.동물을 안락사시킨 후 흉강을 목까지 완전히 엽니다. 앞다리를 따라 절개하여 기관과 설하 부위를 노출시킵니다. 하악 림프절을 확인합니다.이들은 일반적으로 타액선 위에 앉아있는 하얀 타원형 모양의 구조로 나타납니다. 가는 끝 곡선 집게를 사용하여 설하 조직을 부드럽게 당겨 입 바닥의 등쪽을 노출시킵니다. 하악 림프절을 심부의 얇은 끝 집게로 부드럽게 당겨 조직에서 풀어냅니다.다운스트림 절차에 따라 C-R-P-M-I 또는 핵산 방부액이 들어 있는 튜브에 넣습니다. 그것은 나중에 수행될 것입니다. 이제 목구멍 양쪽 깊숙이 위치한 작은 림프절을 확인하고 제거합니다.이것이 부속 하악 림프절입니다. 흉강을 열어 폐를 노출시키고 흉선을 제거합니다. 하부 빈나 CVA를 절단하고 흡수성 조직으로 과도한 혈액을 제거하여 기관지 세척을 수행합니다.먼저 기관을 노출시킵니다. 그런 다음 메스로 작게 절개하고 얇은 끝을 삽입합니다. 이전에 칼슘, 마그네슘 없이 PBS 1밀리리터와 EDA 1밀리몰로 채워진 페페를 조심스럽게 총 부피를 최소 3번 주입하고 흡인합니다.그런 다음 흡인하여 세포 현탁액을 멸균 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 칼슘, 마그네슘이 없는 PBS 5ml와 EDTA 1밀리몰을 심장의 우심실에 주입하여 폐 혈관에 존재하는 모든 적혈구와 면역 세포를 제거하여 폐를 관류합니다. 관류가 올바르게 수행되면 폐 색이 분홍색에서 흰색으로 바뀝니다.심장을 제거하고 관류 폐를 취하여 수행할 다운스트림 분석에 따라 완전한 배지 또는 핵산 방부제 용액에 넣습니다. 설하 점막의 세포 집단을 분석하려면 동물의 머리를 분리하고 타액선을 제거하고 연조직을 부착하십시오. 하악 관절에 도달할 때까지 입의 양쪽을 절개하고 혀와 입의 바닥과 함께 하턱을 분리합니다.뭉툭한 쥐 이빨 집게를 사용하여 혀를 당겨 혀의 바닥이 입의 바닥과 만나는 부분을 절개합니다. 이 영역은 설하 점막을 구성합니다. 생검 펀치, 집게 및 가위를 사용하여 혀를 자르고 제거합니다.설하 점막 조직을 잘라내어 깨끗한 튜브에 넣습니다. 폐를 24웰 플레이트로 옮기고 깨끗한 가위로 폐를 의미합니다. 1ml의 소화 매체를 넣고 위아래로 여러 번 피펫팅하고 배양 후 40분 동안 37도 및 5%CO2에서 배양합니다.대부분의 세포가 조직에서 방출되었는지 확인하기 위해 피펫을 위아래로 다시 피펫합니다. 세포 현탁액을 40 마이크로 메쉬 세포 여과기로 옮기고 5ml의 PBA로 세척합니다. 2, 500 GS 5 분에 5 millimolar EDTA 분리기.Reus는 칼슘, 마그네슘 1밀리몰 EDTA 및 1% 태아 보잉 혈청이 없는 PBS로 구성된 1밀리리터 팩스, EDTA에 세포를 부유시킵니다. QU를 취하여 트립과 블루로 세포를 2배 희석하고 Reus를 현탁 세포를 10의 2배의 농도로 계수하여 밀리리터당 7개의 세포를 추가하고 튜브당 50마이크로리터를 추가합니다. 면역 표현형 분석을 위해 각 튜브에 2배 항체 혼합물 50마이크로리터를 추가합니다.사실로 세 번 씻은 후 어둠 속에서 얼음 위에서 30 분 동안 배양하십시오. EDTA는 200 마이크로 리터의 사실 EDTA에서 세포를 재현 탁시키고 세포 분석기에서 분석하며,이 공간을 포함하는 소화 매체를 사용하여 설하 조직의 세포 집단을 분석하는 데 동일한 절차를 사용할 수 있습니다. TLR 5 및 LC 4의 작용제인 정제된 플랫라인을 사용한 콜라겐분해효소 및 DS 1 설하 면역요법은 폐의 호중구 동원에 관여하는 케모카인과 사이토카인의 mRNA 수치를 유의하게 상향 조절하도록 유도했습니다.이것은 감염 중에도 관찰되었습니다. 폐로의 PMN 동원은 유세포 분석에 의해 확인되었습니다. TLR 5개 작용제를 사용한 설하 치료는 동물의 생존 증가 및 폐렴구균성 폐렴에 대한 보호와 상관관계가 있었습니다.우리는 설하 면역요법이 침습성 PNE 폐렴구균성 폐렴에 대한 라인 보호를 유도하는 효과적인 수단임을 보여주었습니다. 이것은 히스토 폐렴에 의해 생성되지 않는 재단사 5 주작동사인 lain의 설하 설치에 의해 달성되었습니다. lain의 설하 설치는 라인에서 chemokine C Xcl L 하나의 상향 조절을 유도했습니다.폐렴구균을 제거하는 데 중요한 세포 유형, TLR 작용제를 사용한 설하 면역 요법은 박테리아 전파 및 심각한 형태의 감염 발병을 방지하기 위해 감염을 단독으로 또는 항생제 치료와 같은 최신 요법과 병용하여 치료하는 데 사용할 수 있습니다. 설하근은 또한 백신을 전달하는 데 사용될 수 있으며 점막 및 전신 보호 면역을 유도하는 데 효과적인 것으로 나타났습니다. 이 전략은 호흡기 감염의 경우, 특히 폐렴의 경우 기본 질병을 예방할 수 있을 뿐만 아니라 비강 집락화가 진입 스포츠에서 박테리아를 차단할 수 있기 때문에 특히 중요합니다.전반적으로, 우리는 설하 경로가 호흡기 감염을 치료하거나 예방하기 위한 새로운 전략을 개발하기 위한 매력적인 대안이라고 믿습니다. 이 기술을 시도해 보시기 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

예방 및 치료 백신은 종종 노드와 면역 세포의 결과로 가난한 참여 림프로 인해 백신의 주 배수에 강한 면역 반응을 자극하는 데 실패합니다. 림프절 백신의 직접 주사에 의해, 소위 intralymphatic 주입은 백신 효능 강하게 개선 될 수 있으며, 백신의 투여 량을 저감 할 수있다.

마우스의 Intralymphatic 면역 및 예방 접종

시약의 기관 내 삽관 매개 (IMIT) 점안 호흡기 질환뿐만 아니라 폐에 직접 치료 시약을 주액하는 방법을 연구 우수한, 비 침습적 방법이다. 이 임상 시험에 적합한 신속하고 재현성이 높은 방법이다.

삽관 매개 기관 내 (IMIT) 떨어 뜨림 : 비 침습적, 폐 별 전달 시스템

백신이 어떻게 작용하는지에 대한 전반적인 지식이 부족합니다. 여기에서는 수지상 세포와 T 세포 면역에 특히 중점을 두고 백신에 대한 초기 숙주 면역 반응에 대한 통찰력을 얻기 위해 역유전학과 골수 키메라 마우스를 함께 사용할 것을 제안합니다.

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Immunostimulating 접한의 치료 후 림프 조직의 림프 수지상 세포 활성화 테스트 후속 추출에 대 한 실험 절차를 설명 합니다.

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설명 된 항 원 자주 나노 입자와 자극 B 세포 활성화에서 생체 외에서 그리고 vivo에서에서 그들의 사용의 준비가 이다. 일관 되 고 강력한 항 체 응답 새로운 땅콩 알레르기 모델의 개발을 주도. 항 원 리를 생성 하기 위한 프로토콜은 다른 항 원 및 예방 모델을 확장할 수 있습니다.

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여기 선물이 vivo에서 백신의 평가 위한 우아한 프로토콜 효과 호스트 면역 반응. 이 프로토콜은 바이러스 성, 세균성, 백신 모델 또는 기생 병원 균에 대 한 적응 될 수 있다.

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직접 경포당증 주입에 의해 마우스에 있는 심각한 폐 상해를 유도하는

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뉴질랜드 흰 토끼의 모성 예방 접종 연구에서 비강 내 예방 접종 및 우유 수집(Oryctolagus cuniculus)

본 연구에서는 기본 후두경을 사용하여 쥐에서 ALI를 발달시키는 비침습적 기기관내 삽입 기법이 입증되어 LPS가 폐에 정밀히 전달되도록 합니다. LPS는 후두경을 이용한 기관내관 을 통해 주입됩니다. 폐 손상의 규모는 여러 시점에서 평가됩니다.

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