Name: 말라리아 모기의 개발, 다산과 생존자에 성적인 의약품의 시험 효과에 대한 독성 시험 법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 학습하세요 말라리아 모기의 유충 발달, 성체 번식력 및 생존율에 대한 표유전적 약물 DZNep의 독성 효과를 평가하는 방법을. 이 기법은 모기 개체군 조절 전략 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

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DZNep.HCl을 제공해 준 Victor Marquez와 혈액 공급기를 제작해 준 Scotty Bolling에게 감사드립니다. An. gambiae의 Mopti 및 SUA2La 균주는 Malaria Research and Reference Reagent Resource Center(MR4)에서 얻었습니다. 이 연구는 Fralin Life Science Institute와 National Institutes of Health 1R21AI094289의 Igor V. Sharakhov에 대한 보조금의 지원을 받았습니다.

참고 : 프로토콜의 세 부분 유충 모기, 다산의 효과를 연구하는 성인 여성에 DZNep의 혈액 기반의 노출 DZNep 약물의 수성 노출을 설명하고 DZNep에 의해 SAH 가수 분해 효소 억제는 간단한 비색 기술을 사용하여 측정 하였다. 상기 분석의 개략도는도 1에 도시된다. 1. 미성숙 모기 개발 및 생존자 분석 실험 참고 :이 섹션에서는 모기 유충 개발 및 생존에 영향을 미치는 수용성 약물의 사용을 설명합니다. <ol><li> 해치 A. 28 ° 증류수 C DH (2 O) 및 후면 그들에게 2 차의 령 유충에서 gambiae 계란. </li><li> 여섯 웰의 DNase, RNAse가없는 세포 배양 접시를 타고 각 웰에 10 ml의 dH보다 2 O를 붓는다. </li><li> 2 차의 령에 모기 유충을 선택하고 잘 당 15 애벌레를 추가합니다. 판에 2 차의 령 유충을 추가하기 전에, P여분의 물을 제거하기 위해 2 ~ 3 초 동안 종이 타월에 그들을 UT. </li><li> 컬러 코딩 테이프와 라벨 우물은 실험을 랜덤합니다. 각 플레이트 (그림 2)에 시험 농도 당 2 개의 우물을 레이블. </li><li> dH보다 2 O. 1 ml의 0.3 mg을 용해시켜 DZNep 1mM의 DZNep 염산염 (MW = 298.73) 스톡 용액을 준비 0.5 μM과 5.0 μM의 최종 농도를 달성하기 위해 표시된 우물에 DZNep.HCl의 원액을 추가합니다. 참고 : 원액 4 저장할 수 있습니다 단기간 (한달에 1 일) -20에 대한 C를 ° 장기 (1 개월 이상)에 대한 ° C. 주의 : 전술 한 농도에 대한 스톡 용액을 첨가 크게 웰 물의 볼륨을 변경하지 않을 것이다. 그러나 더 높은 농도의 경우에는, 그 화합물의 불필요한 희석을 피하기 위해 유생 매질에 화합물을 용해시키는 것이 바람직하다. </li><li> 각 웰에 플레이크 물고기 음식의 동일한 금액을 추가합니다. 커버 플레이트의 28에서 그들을 품어 인큐베이터에서 C를 °. </li><li> 24 시간 노출 기간 이후 DZNep 처리 및 치료 유충 모기의 사망률을 기록합니다. 제거하고 죽은 애벌레를 폐기합니다. 모든 애벌레 죽을 때까지 매일이 녹음을 반복 또는 번데기 및 성인으로 등장. 그들은 번데기까지 유충의 크기는 격일로, 즉, 0 일, 2, 4, 6, 8을 기록한다. </li><li> 적절한 통계적 분석 소프트웨어를 사용하여 유생 사망률 데이터를 분석한다. 주 : 막대 그래프는 Microsoft Excel에서 사망률 데이터를 표현하는데 사용될 수있다. 다변량 분산 분석 (MANOVA)는 약물의 다른 용량은 모기 유충의 유의 한 차이 생존이 발생할 경우에 계시 등 JMP 또는 SPSS 같은 소프트웨어로 수행. </li></ol> 여성 모기에 인공 공급 장치를 통해 약물을 투여하여 2. 다산 분석 주 :이 섹션은 혈액에 약물의 추가 세부 사항ND 인공 피더 시스템을 사용하여 성인 모기 암컷에게 먹이. <ol><li> 제어 및 테스트 케이지에 대한 남성과 여성의 모기 동일한 번호로 성인 모기 케이지를 설정합니다. 여성까지 케이지 모두 면봉에 적신 10 % 설탕 솔루션을 제공 (3~5일은과 아노 펠 레스 gambiae 최적입니다) 공급에 대한 준비가되어 있습니다. </li><li> 2 시간 전에 혈액 공급에, 여성은 배고픈 보장하기 위해 면봉을 제거합니다. </li><li> 역 넓은 바닥 유리 깔때기 (직경 = 50mm, 길이 = 70mm) 및 산업용 접착제로 밀봉 주변의 플라스틱으로 구성이 인공 혈액 피더를 조립합니다. 유입과 물 유출에 대한 커넥터를 통해 두 개의 피더 &#39;출구 (직경 = 10mm)에 플라스틱 튜브 (직경 = 7 mm)를 연결합니다. &quot;제어&quot;와 같은 두 개의 피더 레이블 &quot;5 μM DZNep을.&quot; </li><li> 먹이에 대한 프로그램을 설정, 시중에서 판매하는 발열체를 사용하여. &quot;메뉴&quot;에서의 &quot;설정&quot;이동와 &quot;세트 포인트&quot;를 선택하고, 사전로드 된 프로그램이 나타납니다. &quot;SP1&quot;를 선택하고 (37)의 온도를 설정 ° C. 주 : 발열체 투여 혈액 일정한 온도로 유지되는 것을 보장한다. 추가 프로그램 설정 또는 다른 모기 종의 곤충을 위해 사용될 수있다. </li><li> 양동이에 물을 채우고 물에 가열 요소를 체험. </li><li> 파라 필름의 정사각형 조각 (50mm × 50 mm)를 잘라 얇은 막상 영화를 만들고 그것을 스트레칭. 파라 필름과 인공 피더의 바닥을 커버. 파라 필름 (50mm X 10mm)의 또 다른 조각을 잘라 늘려서 피더의 가장자리를 밀봉. </li><li> 튜브에 의해 급전선과 발열체를 연결 시스템을 조립한다. 완료되면, 시스템 전환 &quot;SP1&quot;를 선택합니다. 를 눌러 시스템을 시작하려면 &quot;입력&quot;. 주 : 물 (37)로 가열 얻을 것이다 C를 ° 그 온도로 유지. </li><li> 제 모니터물 양동이에 온도계를 사용하여 물을 전자 온도. 주 : 튜브 커넥터와 혈액의 온도가 37 ℃에서 유지되도록 시스템을 통해 물이 일정한 순환을 유지하는 데 도움 ° C. </li><li> 모든 혈액 유출 오염을 제거하는 데 사용되는 10 %의 표백제 용액으로 평평한 바닥 트레이를 입력합니다. </li><li> microcentrifuge 관에 제세동 양의 피 2 ㎖를 추가합니다. &quot;컨트롤&quot;로이 레이블. &quot;5 μM DZNep&quot; &quot;5 μM DZNep&quot;이라는 실험 튜브 DZNep 주식 솔루션 (단계 1.5 참조) .Add 6 μL으로 분류 실험 튜브의 과정을 반복 가볍게 여러 번 반전 혈액과 약물을 혼합한다. 실온에서 튜브 10 분을 품어. </li><li> 피펫을 사용하여, 대응 표시된 피더의 상단에 제어 및 테스트 혈액 2 ㎖를 추가합니다. 표백제 용액에 피펫을 폐기하십시오. 어두운 가방 케이지 커버와 f를 장려하기 위해 주기적으로 케이지에 공기를 호흡먹이에 대한 emales. </li><li> 모기는 약 30 분 동안 먹이를 보자. 공급이 완료되면, 피더 꺼내, 발열체를 끄고 파라 필름 스트립. 약 5 분 동안 표백제 솔루션의 공급을 적시 탈 물에 잘 헹구어. </li><li> 피더를 제거하고 48 시간 동안 케이지에 설탕 물에 면봉을 넣어. 달걀 누워을​​ 용이하게하기 위해 밤새 우리에서 물과 거름 종이를 포함하는 계란 요리를 놓습니다. 각각의 테스트 또는 제어 농도와 각 계란 요리 레이블. </li><li> 스테레오 현미경 계란의 수와 구조를 다음 날 계란 요리를 제거하고 검사합니다. Q-colors5 소프트웨어를 사용하여 이미지를 얻습니다. 계란의 수를 계산합니다. 테스트 및 제어 케이지에서 얻은 달걀의 수의 차이를 분석한다. 주 : 짝 t 검정 계란의 수 (p ≤0.05) 완전히 다르면 결정하는데 사용될 수있다. </li></ol> 모기 효소 억제 3. 생화학 적 분석약물에 의한 주 :이 부분은 성인 남성 및 여성 모기 SAH 가수 분해 효소 저해에 DZNep의 효과를 결정하는 지표로서 DTNB를 이용한 효소 활성 분석을 설명한다. <ol><li> dH보다 2 O. 1 L에 HPO 4 나 2 중 14.19 g을 첨가하여 0.1 M 나 2 HPO 4 (인산 나트륨) 용액을 준비 다음에,이 dH보다 O. 1 L로의 NaH 2 PO 4의 13.79 g을 첨가하여, 0.1 M의 NaH 2 PO 4 (인산이 수소 나트륨) 용액을 조제 </li><li> pH가 8.5로 0.1 M의 NaH 2 PO 4 용액으로 0.1 M 나 2 HPO 4 솔루션을 적정한다. 참고 :이 0.1 M 나 2 HPO 4 (PH 8.5)의 근무하는 솔루션이 될 것입니다. </li><li> 0.3 % 트리톤 X-100을 첨가함으로써 0.1 M 나 2 HPO 4 (PH 8.5)의 균질 용액을 준비한다. 참고 : 균질화 솔루션은 4 O ℃에서 저장 될 수있다 </li><li> 홍보epare 0.1 M 나 2 HPO 4 (PH 8.5) 10ml에 SAH의 6.15 mg을 용해하여 1.6 mM의 SAH (MW = 384.4) 솔루션입니다. </li><li> 0.1 M 나 2 HPO 4 (PH 8.5) 10ml에 DTNB 6.3 mg을 용해하여 1.6 mM의 DTNB (MW = 396.4) 솔루션을 준비합니다. 사용할 때까지 얼음에 신선한 DTNB 솔루션을 유지합니다. </li><li> 1ml의 DH의 2 O.에서 DZNep 0.3 mg을 용해하여 1 mM의 DZNep.HCl (MW = 298.73) 솔루션을 준비합니다 다음에,이 dH보다 O. 0.002 μM 1,000 μM 농도에서의 일련 DZNep 1mM의 용액을 희석 </li><li> DZNep에 의해 SAH 가수 분해 효소 억제를 측정하기 위해, 모기의 원유 효소 추출물을 준비 : 얼음처럼 차가운 0.1 M의 NaH 2 PO 4 (PH 8.5) 포함 0.3 % 트리톤 X-1 ml의 10 비 혈액 공급 모기 성충을 균질화 100, 유리 조직 균질기를 사용. 1.5 ㎖의 microcentrifuge 관에 균질을 전송합니다. </li><li> 4 ℃에서 10,000 XG에서 5 분 동안 균질을 원심 분리기. 청소에 뜨는을 전송1.5 ml의 microcentrifuge 관. SAH 생화학 적 분석을위한 효소 소스로 뜨는을 사용합니다. </li><li> 빈 치료를 위해 (즉, 더 DZNep, 아니 효소), 50 μL 1.6 mM의 SAH, 50 μL 1.6 mM의 DTNB, 100을 추가하지 ㎕의 0.1 M 나 2 HPO 96 웰의 개별 우물 4 (PH 8.5), 평평한 바닥 마이크로. </li><li> 제어 (즉, 아니 DZNep)의 경우, 50 μL 1.6 mM의 SAH, 50 μL 1.6 mM의 DTNB를 추가, 50 ㎕의 0.1 M 나 2 HPO 4 (PH 8.5) 50 μL 효소 개인 (SAH 가수 분해 효소는 조 추출물에서 얻은) 우물. </li><li> DZNep 치료의 경우, 50 μL 1.6 mM의 SAH, 50 μL 1.6 mM의 DTNB, 개별 우물에 50 μL 효소 50 ㎕를 선택 DZNep 농도를 추가합니다. 치료 및 제어 당 4 반복 실험을 준비합니다. </li><li> 96- 웰 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 20 초 간격으로 5 분간 405 nm에서 SAH 효소 샘플의 광학 밀도 (OD)를 읽는다. </li><li> 컨트롤에서 빈 OD 빼기ND OD 처리는 각 웰에서 얻은. 다음 식을 이용 SAH 가수 분해 효소 활성을 잔존 백분율을 계산 % 잔류 활성 = (OD 처리 / 제어는 OD) × 100. </li></ol>

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이 프로토콜의 성공적인 응용 프로그램에 중요한 몇 가지 단계가 있습니다. 유생 분석에서,주의 라벨을 정확하게하고 각 시험 농도를 복제 취해 져야한다. 테스트 샘플을 무작위 화하고 각각의 테스트 우물에 약물의 지정된 금액을 추가하면 설정이 실험의 중요한 부분입니다. 96 웰 마이크로 플레이트에 2 차 령 모기 유충을 추가하기 전에, 각 유충은 여분의 물을 제거하기 위해 2 ~ 3 초 동안 종이 타월에 배치 할 수 있습니다. 탈수를 방지하기 위해, 유충은 즉시 집게의 무딘 쌍을 사용하여 마이크로 우물에 전송해야합니다. 이는 각 웰 마이크로 플레이트에서 물의 양을 보장하고 의도 된 약물의 농도는 유지된다. 자신의 몸 길이를 측정하는 유충을 전송하는 경우, 그것은 고정을 유지하기 위해 몇 분 동안 얼음에 애벌레를 넣어하는 것이 좋습니다. 다른 화합물은이 프로토콜을 채택 할 경우, 각 케어 첨가 스톡 용액의 양을 결정하기 위해 취해 져야한다잘. 이러한 경우, 종래 직접 각 웰 마이크로 플레이트에서 유충을 물에 첨가 ...

말라리아는 세계의 곤충 관련 사망의 가장 많은 책임이있다. 추정 219,000,000가지 경우는 주로 아프리카 1 약 660,000 죽음의 결과로, 매년 전세계에서 발생합니다. 공동의 노력에도 불구하고, 말라리아 프로그램은 몇 가지 도전에 직면하고 있습니다. 살충 처리 bednets 프로그램 실내 잔류 분사 형태 키 구성 요소는 로컬 인구 살충제에 대한 내성이 이러한 노력을 방해한다. 살충제 저항성 모기 인구의 급속한 증가는 주로 자신의 환경 변화에 신속하게 적응하고 다른 틈새 3,4,5을 악용 할 수있는 말라리아 모기의 능력에 기인한다. 살충제 내성 기존 메커니즘을 극복하기 위해, 신규 살충제 대상 및 차세대 화합물의 탐사가 보증된다. 말라리아 m의 다양한 수명 단계에서 실험 살충제의 효능을 결정하기위한 간단한 단계별 프로토콜osquitoes 크게 이러한 노력을 강화한다. 세포주 및 동물 모델에서 약물 효과의 약리 연구는 세포 및 유기체의 유전 및 생리를 조절하는 데 유용한 도구로 후생 유전 학적 약물의 사용을 설립했다. DNA 메틸화 및 히스톤 변형은 하부 DNA 서열 (6)을 변경하지 않고 다세포 생물의 유전자 발현에 영향을 미치는 후생 유전 학적 메커니즘이다. 메틸화와 같은 번역 후 변형은 세포의 무결성 및 유전자 발현을 유지하는데 중요한 역할을하고, 몇 가지 기본적인 프로세스 7,8,9에 영향을 미칠 수있다. 일부 종의 곤충 연구는 oogenesis을 포함하는 과정에서 후성 유전학의 중요성을 강조하고 세포의 유지 보수 (10)뿐만 아니라, 투여 량 보정 (11) 줄기했다. 그러나, 질병 벡터 이러한 측면은 아직 탐험한다. 모기에이 시스템을 조절하는 화합물을 사용하는 것은에서 우리를 제공 할 수있다새로운 살충제 대상 경로에 명소. 3 Deazaneplanocin (DZNep)는 암의 다양한 형태에 미치는 영향은 12,13,14,15,16을 연구되어왔다 알려진 히스톤 메틸화 억제제이다. DZNep 간접적으로 히스톤 라이신 N의 -methyltransferase을 억제 안정적인 수용성 후생 유전 학적 약물 (EZH2), 포유 동물 세포에서 polycomb 억압 복잡한 2 (PRC2)의 구성 요소입니다. PRC2은 다세포 유기​​체에서 줄기 세포의 성장을 조절하는데 중요한 역할을하고, 히스톤 메틸화 PRC2 매개 된 유전자 침묵의 중요한 측면이다. 면역 결핍 쥐에서, DZNep가 미리 처리 된 세포는 17 이하 발암 것으로 밝혀졌다. 이 약물은 이러한 EZH2 18 연루되는 비 알코올성 지방간 질환 같은 다른 질병을 연구에 사용되어 가고있다. DZNep는 설립 된 S의 -adenosylhomocysteine ​​(SAH) 가수 분해 효소 억제제 19, 20입니다. SAH에서 가수 분해 효소의 억제 결과SAH의 축적은 다시 사용할 메틸 도너 그룹을 제한하여 메틸화 된 활성의 저해에 이르게. SAH는 대사 경로에서 곤충을 포함한 많은 유기체에 의해 이용되는 아미노산 유도체이다. 최근의 한 연구는 휴면에 영향을 곤충 (21)의 개발이 지연 될 수 있습니다 낮은 용량에서 그 DZNep을 보여 주었다. 여기서, 모기 다양한 수명 단계에서 수용성 화합물의 효과를 조사하기 위해 강력한 프로토콜이 개발되어있다. 이 프로토콜의 세 부분은 미숙 한 모기, 성인 혈액 수유 여성, 성인 남성과 여성 모기의 효소 활성에 수용성 화합물의 효과를 조사하는 방법 등이 포함되어 있습니다. 먼저, DZNep 미성숙 모기 발달과 생존을 연구하기 위해 물에 용해시킨다. 이 약물 노출에 10 배 증가에서 발생하는 차이를 비교하기 위해 두 농도에서 수행됩니다. 성인 여성 모기, DZNep에 약물의 효과를 탐색하려면제세동 양의 혈액에 추가하고 여성에 인공적으로 혈액을 공급한다. 그 후, 다산에 약물의 결과는 조사한다. 마지막으로, 효소 활성 분석은 남성 및 여성 성인 모기 SAH 가수 분해 효소 저해에 DZNep의 효과를 결정하는 지표로서 5,5&#39;- 디티 오비스 (2- 니트로 벤조산) (DTNB)을 사용하여 수행된다. 이 프로토콜은 말라리아 모기과 아노 펠 레스 gambiae로 개발되고 있지만, 쉽게 다른 모기 또는 곤충의 모든 종에 대한 관심의 화합물의 효과를 연구에 적용 할 수있다. 이 프로토콜에 자세히 기술은 효율적으로 물 또는 수성 매체에 제한 또는 전혀 용해도 약물에 적용되지 않을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>96웰 마이크로플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565561</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플레이트</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Sorvall 프레스코</td><td>76003758</td><td>다른 원심분리기 사용 가능</td></tr><tr><td>컬러 테이프 롤</td><td>Fisher</td><td>S68134</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Olympus</td><td>SZ</td><td></td></tr><tr><td>DTNB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>DZNep.HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SMLO305</td><td></td></tr><tr><td>계란 접시 컵</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>여과지</td><td>Fisher</td><td>09-795E</td><td></td></tr><tr><td>유리 공급기</td><td>Virginia Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 조직 균질화 장치</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>발열체</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0520091</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Percival scientific</td><td>I36VLC8</td><td>다른 인큐베이터를 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>마이크로센트리퓨지 튜브, 2&nbsp; ml</td><td>Axygen</td><td>22-283</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브, 1.5&nbsp; ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫</td><td>Eppendorf</td><td>4910 000.069</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-3154</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-8643</td><td></td></tr><tr><td>pH 미터&nbsp;</td><td>Mettler Toledo 7easy</td><td>S20</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 리더</td><td>Spectramax</td><td>M2</td><td></td></tr><tr><td>SAH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9384</td><td>-20 &#176에 보관; C</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마 알드리치</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

말라리아 모기의 개발, 다산과 생존자에 성적인 의약품의 시험 효과에 대한 독성 시험 법

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

살충 저항은 말라리아 제어 프로그램의 주요 문제가있다. 모기는 말라리아는 열대 지방에 편재하는 문제를 제어하게 신속 환경에서 다양한 변화에 적응. 살충제 내성 인구의 출현은 벡터 모기 제어를위한 새로운 약물 표적 경로 및 화합물의 탐사를 보증합니다. 성적인 약은 잘하지만 많은 곤충에 미치는 영향에 대해 알려진하지, 암 연구에 설립된다. 이 연구는 말라리아 벡터,과 아노 펠 레스 gambiae에, 3 Deazaneplanocin (DZNep), 암 치료를위한 실험 후생 유전 학적 약물의 독성 학적 효과를 조사하기위한 간단한 프로토콜을 제공합니다. 화합물이 치료를 컨트롤을 기준으로 성인 모기의 번식력을 감소하는 반면 사망률과 크기의 감소에서 농도 의존적​​ 증가는 DZNep에 노출 미숙 한 모기에서 관찰되었다. 또한, S의 약물 의존적 감소가 있었다 -치료를 제어 할 수 DZNep 상대에 노출 된 후 모기에 adenosylhomocysteine​​ (SAH) 가수 분해 효소 활동. 이러한 프로토콜은 차례로, 수용성 후생 유전 학적 약물 또는 화합물의 독성 학적 효과를 탐험 독특한 멀티 프롱 접근법을 설명, 실험 약물 여러 독성 엔드 포인트를 평가하는 간단한 단계별 절차 연구원 제공 벡터 모기와 다른 곤충에 대한 관심.

도 1은 분석의 개략도이다; 그것은이 문서에 나와있는 절차의 다양한 단계를 설명합니다. 프로토콜이 모기의 서로 다른 삶의 단계를 기반으로, 여기에 설명 된 실험에 따라야 할 특별한 순서가 없습니다. 사용자는 표본의 가용성에 따라, 동시에 하나 이상의 분석법을 수행하도록 선택할 수있다. 그림 2는 미성숙 모기 개발 및 생존 분석에 대해 설정 한 판을 보여줍니다. 시험 농도 및 반복 실험의 수는 사용자의 요구 및 약물의 가용성에 따라 변경 될 수있다. 미성숙 모기 분석에서, DZNep 1 mM의 스톡 용액을 0.5 μM 및 약물없는 인구 함유 웰과 제어 팬과 함께 5 μM의 최종 농도를 달성하기 위해 모기를 함유하는 물에 첨가 하였다. 실험은 입증이 더 유충과 번데기의 survDZNep 처리 된 우물에 비해 제어 우물에 ived. <strong...

모기의 발달, 번식력 및 생존에 대한 후성유전학적 약물 DZNep의 효과를 조사하기 위한 프로토콜이 개발되었습니다. 여기에서는 SAH 가수분해효소 억제를 측정하는 것 외에도 미성숙 모기에 대한 DZNep의 수성 노출 및 성체 모기에 대한 DZNep의 혈액 기반 노출 절차를 설명합니다.

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

다음 실험의 전반적인 목표는 말라리아 모기의 다양한 생활 단계에 대한 후성유전학적 약물의 효과를 조사하는 것입니다. 이것은 미성숙 모기 서식지에서 약물을 용해시켜 유충, 생존율 및 신체 크기에 미치는 영향을 확인함으로써 달성됩니다. 이 약물은 또한 포유류의 혈액에 첨가되어 성인 암컷 모기에게 공급되어 생식에 대한 약물의 효과를 테스트합니다.마지막으로, 약물에 의한 모기 효소의 억제를 테스트하기 위해 효소 분석을 수행합니다. 결과는 후성유전학적 변화가 말라리아 모기 생존에 미치는 영향을 보여주며, 생물학적 분석 분석을 기반으로 한 Conti의 경우 이 프로토콜에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 다인이 유망한 항암 후성유전학적 약물로 개발되고 있다는 것을 알게 되었을 때, 이 약물은 호르몬을 보존하는 동물인 히스토 변형의 메커니즘으로 인간 암세포의 세포사멸을 유도한다는 것을 알게 되었을 때, 우리는 말라리아 모기에 대한 효과 앱으로 일종의 맛을 보았습니다.먼저 별에서 두 번째에 있는 노벨리스 감비 모기 유충을 선택하고 종이 타월에 2-3초 동안 올려 여분의 수분을 제거합니다. 그런 다음 웰당 10빌라의 증류수가 들어 있는 6웰 뉴클레아제가 없는 세포 배양 플레이트의 웰당 유충 15마리를 부드럽게 추가합니다. 우물에 색상으로 구분된 테이프로 레이블을 지정하여 실험을 무작위화합니다.그런 다음 각 플레이트의 테스트 농도당 두 개의 웰에 라벨을 붙입니다. 다음으로, 0.3mg의 deasy nep을 용해하여 1밀리몰의 deasy NEP 염산염 원액을 준비합니다. 증류수 1ml에 Z NEP 염산염의 원액을 라벨이 부착된 웰에 첨가하여 0.5마이크로몰 및 5.0마이크로몰의 최종 농도를 달성합니다.앞서 언급한 농도에 대한 원액을 추가해도 우물 내 물의 양은 크게 변하지 않습니다. 그러나 농도가 훨씬 더 높은 경우, 화합물의 불필요한 희석을 피하기 위해 유충 배지에 화합물을 용해시키는 것이 좋습니다. 화합물을 첨가한 후 섭씨 28도에서 24시간 동안 유충을 먹이고 배양합니다.그런 다음 DZ NEP 처리 및 처리되지 않은 유충 모기의 폐사율을 기록합니다. 모든 유충이 죽거나 번데기가 되어 나올 때까지 이 녹음을 매일 반복합니다. 성인이 되면 매일 죽은 유충을 제거하고 버리십시오.또한 유충이 번식 분석을 수행하기 위해 새끼를 낳을 때까지 이틀에 한 번씩 유충의 크기를 기록합니다. 먼저 튜브로 피더와 발열체를 연결하는 인공 피더 시

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 인터뷰에서, 조지는 Plasmodium falciparum Dimo​​poulos 및 뎅그열 바이러스 감염을 방지하기 위해 모기에 의해 사용되는 생리적 메커니즘에 초점을 맞추고 있습니다. 설명이 방법은 주요 내화물 유전자에 대해 제공됩니다, 벡터 병원균에 대한 저항력을 부여하는 그 유전자는, 모기에 식별 방법과이 지식은 말라리아 기생충이나 뎅그열 바이러스를 가지고 수없는 유전자 변형 모기를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

더 나은 모스키토 구축 : A. gambiae 및 A. aegypti 모기에 말라리아와 뎅그열 발열 저항을 사용 유전자를 확인

이 비디오에서는 성인 암컷 모기에 대한 잠재적 살충제의 독성을 결정하기 위한 국소 테스트 분석을 시연합니다. 모기의 신경 전달을 치명적으로 억제하는 도파민 수용체 길항제를 사용하는 이 방법은 국소 살포 시 살충제의 독성 효과를 평가하는 방법을 설명합니다.

국소 검사 분석: 국소 적용으로 성인 암컷 모기에 대한 도파민 수용체 길항제의 살충 가능성을 평가하는 기술

이 비디오는 암컷 모기에 대한 새로운 작용 모드를 가진 테스트 화합물의 폐사율과 번식력을 평가하기 위한 혈액 공급 분석을 보여줍니다. 이 기술은 새로운 종류의 살충제를 스크리닝하여 모기의 저항성 개체군을 죽이고 질병 확산을 통제하는 데 도움이 됩니다.

모기 먹이 분석: 성체 암컷 모기의 폐사율 및 생식력에 대한 테스트 복합 효과를 평가하는 방법

인간 말라리아 기생충에 설치류 말라리아 기생충의 생활 주기 그리고 생물학의 눈에 띄는 유사성 때문에, 설치류 말라리아 모형은 말라리아 연구를 위해 필수불가결하게 되었습니다. 본 명세서에서, 우리는 야생형 및 형질전환 설치류 말라리아 종의 표현형 분석에 사용되는 가장 중요한 기술중 일부를 표준화하였다.

설치류 말라리아 기생충 무성 및 성적 혈액 단계 및 모기 단계의 현상형 분석

프로토콜 개발 larvicides, adulticides 및 endectocides의 새로운 클래스에 대 한 미 숙 하 고 성인 모기에 화학 물질의 독성 평가 대 한 설명 합니다. 프로토콜의 단일-지점 복용량 및 복용량 응답 분석 결과 접촉에 독성을 결정 하기 위해 또는 섭취를 통해 후속 평가에서 여러 화학의 높은 처리량 테스트...

모기에 소설 Insecticidal 화학 물질의 독성을 테스트 하기 위한 프로토콜

설명된 것은 계란을 계산하고 24개의 잘 조직 배양 판을 사용하여 개별 모기의 해치 비율을 결정하는 시간과 공간 절약 방법이며, 이는 실질적으로 fecundity 및 불임 검사의 규모와 속도를 증가시킬 수 있습니다.

24 잘 조직 배양 플레이트를 사용하여 Aedes aegypti에 대한 개선 된 Fecundity 및 불임 분석 (EAgaL 플레이트)

우리는 모기와 초파리에서 살충제 감수성을 측정하기위한 국소 적용 생물 분석의 방법론과 중요성을 설명합니다. 제시된 분석은 높은 처리량이며, 곤충 질량을 이용한다 - 따라서 농도 대신에 질량-상대화된 치사량을 계산할 수 있게 한다-그리고 다른 유사한 방법들보다 더 낮은 가변성을 가질 가능성이 있다.

모기 및 초파리에 대한 살충제 독성을 정량화하기위한 국소 응용 생물 검정

표준 막 공급 분석(SMFA)은 잠재적인 항말라리아 화합물의 평가 및 식별을 위한 황금 표준으로 간주됩니다. 이 인공 먹이 시스템은 Plasmodium falciparum 기생충의 강도와 유병률에 대한 이러한 화합물의 영향을 추가로 평가하기 위해 모기를 감염시키는 데 사용됩니다.

Anopheles 모기 벡터에서 플라스모듐 팔시파룸 감염 검출을 위한 표준 막 공급 분석

간단한 해부학적 구조를 감안할 때 Anopheles 고환은 정자 형성을 연구하기 위한 좋은 세포학적 모델을 제공합니다. 이 프로토콜은 이 생물학적 과정을 조사하는 데 사용되는 기술인 전체 마운트 형광 in situ 교잡과 정자 생산에 관여하는 유전자에 돌연변이가 있는 형질전환 균주의 표현형을 설명합니다.

Anopheles 모기의 정자 형성을 연구하기 위한 전체 장착 형광 In Situ 교잡

화학 유전학은 표적 유전자좌에서 다른 곁사슬을 포함하는 아미노산으로 게이트키퍼 잔기를 치환하는 것을 포함합니다. 여기에서 우리는 cdpk1 의 hypomorphic 대립 유전자를 포함하는 돌연변이 기생충을 생성하고 돌연변이 배경에서 기생충이 채택한 보상 경로를 확인했습니다.

식물 유사 키나아제의 저형성 대립유전자를 품고 있는 돌연변이 말라리아 기생충의 보상 경로 개발 이해

Plasmodium 성적 발달은 모기의 중장에서 발생합니다. 기생충의 성기를 표적으로 삼는 것은 전염을 차단하는 유망한 전략입니다. 당사는 접합자 형성 후 나노루시페라아제를 발현하는 형질전환 P. berghei인 Ookluc을 개발하여 투과 차단 화합물의 고처리량 스크리닝을 가능하게 했습니다. 이 기사에서는 Ookluc을 사용한 스크리닝 방법에 대해 자세히 설명합니다.

Ookluc: 투과 차단 화합물 식별을 위한 Plasmodium berghei 라인

학습하세요 말라리아 모기의 유충 발달, 성체 번식력 및 생존율에 대한 표유전적 약물 DZNep의 독성 효과를 평가하는 방법을. 이 기법은 모기 개체군 조절 전략 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

말라리아 모기의 개발, 다산과 생존자에 성적인 의약품의 시험 효과에 대한 독성 시험 법

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